Bu çalışma, dimetil sülfoksidin (DMSO) farelerde silika kaynaklı pulmoner inflamasyonu ve fibrozisi hafifletebileceğini öne sürmektedir. Transkriptomik ve deneysel analizler, koruyucu etkilerinin IL-6/STAT3 sinyal yolunun baskılanması ve MMP12 ekspresyonunun aşağı regülasyonu ile ilişkili olabileceğini göstermekte olup, silikozis tedavisi için potansiyel terapötik içgörüler sunmaktadır.
Hızlı rapor
Deneysel Silikoziste DMSO Kaynaklı Anti-Fibrotik Etkilerde IL-6/STAT3/MMP12 Sinyal Yolağının Potansiyel Rolü
Bu makalede
Özet
Özet
Bu çalışma, bir silikoz fare modelinde dimetil sülfoksitin (DMSO) anti-inflamatuar ve anti-fibrotik etkilerini incelemeyi ve böylece potansiyel terapötik değerini araştırmayı amaçlamaktadır.
İntranazal instilasyon yoluyla bir silikozis fare modeli oluşturulmuş ve DMSO tedavisi intraperitoneal enjeksiyon ile uygulanmıştır. Deney 1 aylık bir süre boyunca yürütülmüştür. Tüm farelerden akciğer dokuları toplanmış; bu dokuların bir kısmı transkriptomik analize tabi tutulmuş ve diferansiyel olarak eksprese edilen genler limma paketi kullanılarak belirlenmiştir. Gen fonksiyonlarını ve ilişkili yolakları incelemek amacıyla ClusterProfiler kullanılarak Gen Ontolojisi (GO) ve Kyoto Gen ve Genom Ansiklopedisi (KEGG) zenginleştirme analizleri gerçekleştirilmiştir. Kalan örnekler, hematoksilin ve eozin (HE) boyama ile Masson trikrom boyama ile histopatolojik değerlendirmeye tabi tutulmuş, transkriptomik sonuçları doğrulamak için ise Western blot analizi yapılmıştır.
Bu çalışma, DMSO'nun IL-6/STAT3-MMP12 sinyal eksenini modüle ederek silikozisteki fibrotik süreci hafifletebileceğini öne sürmektedir. Silika ile indüklenen silikozis fare modelinde DMSO, hastalıkla ilişkili kilo kaybını azaltmış ve kollajen birikimini düşürmüştür. Transkriptomik analiz, DMSO'nun fibrozis ile ilişkili birden fazla yolun aktivitesini baskıladığını göstermiş ve aralarında anlamlı derecede downregüle olan MMP12'nin de bulunduğu 51 temel gen belirlemiştir. Western blot analizi, IL-6 ve p-STAT3 seviyelerindeki belirgin düşüşle birlikte MMP12 ekspresyonunun azaldığını doğrulamış olup, bu durum IL-6/STAT3 yolunun MMP12 ekspresyonunun düzenlenmesinde kritik bir rol oynayabileceğini düşündürmektedir.
DMSO, IL-6/STAT3 sinyal yolunun aktivasyonunu inhibe ederek ve böylece MMP12 ekspresyonunu azaltarak, silikozisteki inflamatuar yanıtları ve pulmoner fibrozisi hafifletebilir.
Giriş
Silikozis, silika tozuna uzun süreli maruziyet sonucunda ortaya çıkan kalıcı pulmoner inflamasyon ve geri dönüşümsüz pulmoner fibrozis ile karakterize, mesleki pnömokonyozun temel biçimlerinden biridir12,3Bu silikozisin patogenezi oldukça karmaşıktır. Önceki çalışmalar, anormal makrofaj aktivasyonunun...4fibroblastların aşırı proliferasyonu, epitel-mezenkimal geçiş ve hücre dışı matris (ECM) bileşenlerinin anormal birikimi, fibrotik gelişimin kritik katkı sağlayıcılarıdır5,6Enflamatuar-fibrotik kısır döngünün temelinde yatan temel moleküler mekanizmalar henüz tam olarak anlaşılamamıştır. Özellikle, matriks metalloproteinaz (MMP) ailesi, hücre dışı matris (ECM) yeniden şekillenmesinde ve patolojik fibrozisin ilerlemesinde kritik bir rol oynamaktadır.7Bunlar arasında, makrofajlar tarafından spesifik olarak salgılanan; elastin, fibronektin ve tip IV kolajen gibi temel ECM bileşenlerini yıkan ve kronik obstrüktif akciğer hastalığı dahil olmak üzere fibrotik hastalıkların patogenezinde önemli bir rol oynayan matris metalloproteinaz 12 (MMP12) yer almaktadır.8Son çalışmalar, makrofajlardan türetilen MMP12'nin, pulmoner fibrozis sürecinde endotel hücrelerine zarar vererek fibrozisi daha da tetikleyebileceğini öne sürmektedir.9.
Çeşitli biyolojik aktivitelere sahip düşük molekül ağırlıklı bir bileşik olan Dimetil sülfoksit (DMSO)10, sistit dahil birçok inflamatuar hastalıkta anti-inflamatuar etkiler göstermiştir ve Amerika Birleşik Devletleri Gıda ve İlaç İdaresi tarafından interstisyel sistit tedavisi için onaylanmıştır11. Güncel çalışmalar, DMSO'nun inflamatuar faktörlerin salınımını inhibe ederek ve oksidatif stres yanıtlarını azaltarak fibrozis progresyonunu bir ölçüde yavaşlatabileceğini öne sürmektedir12. Ingrid Elisia ve arkadaşları tarafından yürütülen araştırma, DMSO'nun tam kan modellerindeki insan monositlerinde özellikle ERK1/2, p38 MAPK, JNK ve PI3K/Akt sinyal yolaklarının aktivasyonunu inhibe ettiğini ve böylece anti-inflamatuar etkilerini gösterdiğini rapor etmiştir13.
MMP ailesinin silikozisin fibrozis sürecinde kritik bir rol oynadığı gösterilmiş olsa da, DMSO'nun MMP ekspresyonunun düzenlenmesi yoluyla silikozisin patolojik ilerlemesini etkileyip etkileyemeyeceği kesin olarak kanıtlanmamıştır. Bu nedenle, mevcut çalışma, DMSO'nun anti-inflamatuar ve anti-fibrotik etkilerinin bir silikozis fare modelinde araştırılmasını temsil etmekte olup, DMSO müdahalesinin temel düzenleyici gen ağını ve moleküler mekanizmasını ortaya çıkarmayı ve MMP tabanlı yenilikçi tedavi stratejileri için teorik destek sağlamayı amaçlamaktadır.
Protokol
Bu çalışmada yürütülen tüm hayvan deneyleri, Anhui Bilim ve Teknoloji Üniversitesi Bilim ve Teknoloji Etik Kurulu tarafından onaylanmış (Onay No. GZ2025-048) ve Çin'in laboratuvar hayvan refahına ilişkin ulusal standartlarına (GB/T 35892-2018) kesin olarak uyulmuştur. Şekil 1 çalışma tasarımını göstermektedir.
Çözeltilerin hazırlanması
Silika süspansiyonunun hazırlanması:
Kristal silika (SiO₂, %80, partikül boyutu 1–5 µm) otoklavlanarak sterilize edildi. Steril silika tozu, daha sonra 10 mg/mL nihai konsantrasyon elde etmek için steril salin içerisinde dağıtıldı ve homojen bir partikül süspansiyonu sağlamak amacıyla uygulamadan hemen önce bir ultrasonik homogenizatör kullanılarak iyice homogenize edildi.
DMSO çözeltisinin hazırlanması:
Aseptik koşullar altında, yaklaşık %10 (v/v) DMSO çözeltisi hazırlamak için DMSO (≥99.9%) steril fizyolojik salin ile seyreltilmiş ve ultrasonik ajitasyon ile homojenize edilmiştir. Daha önce açıklandığı üzere14,15, her bir fareye 0.9 g/kg dozunda DMSO çözeltisi enjekte edilmiştir.
Deney hayvanları
Bu çalışmada, 8–12 haftalık 32 sağlıklı erkek C57BL/6J fare kullanılmış ve deneylerden önce 1 hafta boyunca aklimatize edilmiştir. Fareler, bilgisayar destekli bir randomizasyon yöntemi kullanılarak dört deney grubuna (grup başına n = 8) rastgele atanmıştır: kontrol, DMSO, silika ve silika+DMSO grupları. Örneklem büyüklüğü, aynı fare silikozis modelini kullanan önceki çalışmalara ve gruplar arasındaki histopatolojik ve moleküler farklılıkları tespit etmek için grup başına 8 hayvanın yeterli olduğunu gösteren ön deneysel deneyimlerimize dayanarak belirlenmiştir. Hayvanlar; kontrollü sıcaklık, 12 saatlik ışık/karanlık döngüsü, yem ve suya serbest erişimin olduğu standart laboratuvar koşullarında barındırılmıştır. Çalışma öncesinde insani sonlanma noktaları belirlenmiş olup, hiçbir hayvan erken ötanazi için önceden tanımlanmış kriterleri karşılamamıştır.
Silikozis modelinin oluşturulması ve ilaç müdahalesi
Silikozis, 60 µL steril kristal silika süspansiyonunun (10 mg/mL) tek doz intranazal instilasyonu ile indüklenmiştir. Anestezi indüksiyonunun ardından fareler sırtüstü pozisyona getirilmiştir. Derin ve yavaş solunum gözlemlendiğinde, silika süspansiyonunun 60 µL'si burun deliklerine dikkatlice damla damla instile edilmiş ve süspansiyonun akciğerlere spontan olarak solunması sağlanmıştır16. DMSO uygulama grubundaki farelere, ardışık bir ay boyunca, enjeksiyonlar arasında 3–4 günlük aralıklarla haftada iki kez sabit dozda DMSO çözeltisi intraperitoneal olarak enjekte edilmiştir. Kalan gruplardaki farelere bunun yerine eşit hacimde steril salin ile aynı şekilde işlem uygulanmıştır. Deney boyunca günlük vücut ağırlığı takibi yapılmıştır. Modellemeden 30 gün sonra tüm fareler ötanize edilmiş ve akciğer dokuları steril koşullar altında toplanmıştır. Ötanazi, anesteziyi indüklemek için intraperitoneal tribromoetanol (0,2 mL/10 g) uygulamasının ardından servikal dislokasyon ile gerçekleştirilmiştir. Akciğer dokularının bir kısmı transkriptom sekanslaması için sıvı azot içerisinde korunmuştur. Dokuların bir kısmı patolojik boyama öncesinde 48 saat boyunca %4 paraformaldehitte fikse edilmiş, kalan dokular ise sonraki moleküler deneyler için -80 °C'de saklanmıştır. Tüm hayvan işlemleri, kurumsal hayvan etiği kılavuzlarına uygun olarak yürütülmüştür.
Ashcroft fibrozis skoru da dahil olmak üzere histopatolojik değerlendirme, deneysel grup tahsisinden habersiz iki araştırmacı tarafından bağımsız olarak gerçekleştirilmiştir.
Pulmoner patolojik inceleme
Fikse edilmiş akciğer dokuları dehidre edildi, şeffaflaştırıldı ve parafin bloklara gömüldü, ardından 5 µm kalınlığında kesitler halinde dilimlendi.
hematoksilin ve eozin (HE) boyama: Kesitler 3–5 dk boyunca hematoksilin ile boyanmış, asidik çözeltide farklılaştırılmış, akan su altında mavileştirilmiş ve 5 dk boyunca eozin ile karşı boyanmıştır. Kademeli etanol ile dehidrasyonun ardından, kesitler ksilen ile şeffaflaştırılmış ve nötr reçine ile kapatılmıştır17.
Masson trikrom boyama: Kesitler sırasıyla hematoksilen, Lichun Red–asit fuksin, fosfomolibdik asit ve Parlak Yeşil ile boyandı. Asidik diferansiyasyondan sonra kesitlerye su uzaklaştırıldı, ksilen ile saydamlaştırıldı ve nötr reçine ile kapatıldı18,19.
Transkriptom dizileme
Dört deneysel gruptaki fare akciğer dokuları, sakrifis sonrası hemen toplandı ve sıvı azot içerisinde şok donduruldu. Toplam RNA, üretici talimatlarına uygun olarak TRIzol reaktifi kullanılarak ekstre edildi. RNA konsantrasyonu ve saflığı değerlendirildi ve RNA bütünlüğü, yerleşik yazılıma sahip bir Bioanalyzer kullanılarak analiz edildi. RIN değerleri 8.0'dan büyük olan örnekler kabul edilebilir olarak değerlendirildi. Kütüphane hazırlama süreci; Oligo(dT) boncuklar kullanılarak poly(A) mRNA zenginleştirme, RNA fragmantasyonu, cDNA sentezi, adaptör ligasyonu ve PCR amplifikasyonunu içeriyordu. Sekanslama, Illumina platformunda gerçekleştirildi ve örnek başına yaklaşık 6.2–6.4 Gb temiz veri üretildi. Bu çalışmada üretilen tüm ham sekanslama verileri, GSE311671 erişim numarası ile Gene Expression Omnibus (GEO) veri tabanına kaydedilmiştir.
Temiz okumalar, STAR hizalayıcı kullanılarak Mus musculus referans genomuna (mm8) hizalandı. Gen ekspresyon seviyeleri, ham okuma sayıları olarak nicelleştirildi. Diferansiyel ekspresyon analizi, R'daki limma paketi kullanılarak gerçekleştirildi. Lineer modellemeden önce, ortalama-varyans ilişkisini tahmin etmek ve kesinlik ağırlıkları oluşturmak için ham sayı verileri voom fonksiyonu ile dönüştürüldü. Ham P değerleri, Benjamini-Hochberg (BH) yöntemi kullanılarak çoklu testler için düzeltildi ve |log₂FoldChange| > 1,5 ve yanlış keşif oranı (FDR) < 0,05 olan genler diferansiyel olarak eksprese olmuş kabul edildi. Fonksiyonel zenginleştirme analizleri, R'daki clusterProfiler paketi kullanılarak gerçekleştirildi. Anlamlı derecede zenginleşmiş biyolojik süreç (BP), hücresel bileşen (CC) ve moleküler fonksiyon (MF) kategorilerini belirlemek için gen ontolojisi (GO) zenginleştirme analizi yürütülürken, anlamlı derecede zenginleşmiş sinyal yolaklarını belirlemek için Kyoto gen ve genom ansiklopedisi (KEGG) yolak zenginleştirme analizi gerçekleştirildi. Zenginleştirme anlamlılığı hipergeometrik test kullanılarak değerlendirildi ve P değerleri Benjamini-Hochberg yöntemi kullanılarak çoklu karşılaştırmalar için düzeltildi. Düzeltilmiş P değeri (padj) < 0,05 olan GO terimleri ve KEGG yolakları anlamlı derecede zenginleşmiş olarak kabul edildi20,21,22,23.
Western blot tespiti
Taze fare akciğer dokusu toplandı ve uygun hacimdeki radyoimmünopresipitasyon analizi (RIPA) liz tamponu ile homojenize edildi. Santrifüj sonrası süpernatan toplandı ve protein konsantrasyonu BCA protein analiz kiti kullanılarak belirlendi. Numuneler daha sonra yükleme tamponu ile karıştırıldı ve 100 °C'de 10 dk ısıtıldı. Protein ayrımı, %10 sodyum dodesil sülfat poliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE) jellerinde 200 V akımda 30 dk boyunca gerçekleştirildi. Ardından proteinler, 300 mA sabit akımla 30 dk boyunca poliviniliden florür (PVDF) membranlara elektrotransfer edildi. Membran %5 yağsız süt ile bloklandı, ardından β-Actin (1:1500), IL-6 (1:1000), STAT3 (1:800), p-STAT3 (1:1500) ve MMP12 (1:800) karşıtı primer antikorlarla 4 °C'de gece boyunca inkübe edildi. Ertesi gün membran TBST ile yıkandı ve oda sıcaklığında 1 saat boyunca sekonder antikor ile inkübe edildi, ardından TBST ile ek yıkamalar yapıldı. Protein bantları kemilüminesans substrat kullanılarak görselleştirildi ve protein kantifikasyonu ImageJ yazılımı ile gerçekleştirildi.
Western blot analizi, her bir deney grubundan alınan üç bağımsız biyolojik replika kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Protein örnekleri bireysel fare akciğer dokularından hazırlanmış olup, her bir biyolojik replika bağımsız bir hayvanı temsil etmiştir.
İstatistiksel analiz
Tüm deneysel veriler GraphPad Prism 9.5 kullanılarak analiz edildi. Önceden normallik ve varyans homojenliği testleri gerçekleştirildi. İki grup karşılaştırması için Student’s t-testi, çoklu grup karşılaştırmaları için ise Tukey sonrası testi ile kombine edilmiş tek yönlü ANOVA kullanıldı. P ≤ 0.05 değeri istatistiksel olarak anlamlı kabul edildi.
Sonuçlar
DMSO, farelerde silika kaynaklı pulmoner fibrozisi hafifletir (Şekil 2)
Bir silikozis modelinde DMSO'nun patolojik süreçler ve akciğer dokusu değişiklikleri üzerindeki etkilerini değerlendirmek için dört deney grubu oluşturulmuştur (Şekil 2A). Vücut ağırlığı değişiklikleri 1 aylık bir süre boyunca izlenmiştir.
Sonuçlar, Silikoz grubundaki farelerin vücut ağırlığında sürekli bir azalma olduğunu, Silica+DMSO grubunun ise DMSO müdahalesinden sonra başlangıçtaki ağırlık kaybının ardından bir toparlanma gösterdiğini kanıtlamıştır (Şekil 2F). 30 günlük silika maruziyetinin ardından akciğer dokuları toplanmış ve HE boyama (Şekil 2B) ile Masson trikrom boyama (Şekil 2C) kullanılarak inflamasyon ve fibrozis değişiklikleri açısından değerlendirilmiştir. Pulmoner fibrozis, HE boyalı kesitlerde Ashcroft yöntemiyle24 skorlanmış ve Silica+DMSO grubunda Silica grubuna kıyasla daha düşük bir fibrozis skoru olduğu ortaya çıkmıştır (Şekil 2D). Masson boyaması, Silica grubundaki kollajen lif birikiminin yaygın ve yoğun olduğunu, akciğer doku alanının yaklaşık %40'ını kapladığını, bunun da kontrol grubunda gözlenen %10'dan daha yüksek olduğunu göstermiş ve silika maruziyetinin şiddetli pulmoner fibrozise yol açtığını ortaya koymuştur (Şekil 2E). Buna karşılık, Silica+DMSO grubundaki kollajen birikimi %20'ye düşmüş olup, bu durum DMSO'nun aşırı kollajen birikimini inhibe ederek silika kaynaklı pulmoner fibrozisi hafifletebileceğini göstermektedir.
Transkriptom analizi, silikaya maruz kalan farelerde DMSO tedavisi ile ilişkili diferansiyel eksprese olan genleri tanımlar
Dimetil sülfoksitin (DMSO) bir silikozis modelindeki anti-inflamatuar ve anti-fibrotik etkilerini incelemek için, deney farelerinden toplanan akciğer doku örnekleri üzerinde transkriptomik dizileme gerçekleştirilmiştir (Şekil 3). DEG'ler, |log2(kat değişimi)| > 1.5 ve düzeltilmiş P-değeri (yanlış keşif oranı [FDR]) < 0.05 olarak tanımlanan seçim kriterleri kullanılarak limma algoritması ile belirlenmiştir.
Transkriptom analizi, kontrol grubuyla karşılaştırıldığında, Silika grubunun 117'si yukarı regüle ve 15'i aşağı regüle olmak üzere 132 anlamlı derecede farklı ifade edilen gen sergilediğini göstermiştir (Şekil 3A). Özellikle, Saa3 ve MMP12 gibi genlerin belirgin şekilde yukarı regüle olduğu görülmüştür. Bu ekspresyon paterni, bireysel örnekler arasında tutarlı gen ekspresyon profillerini ortaya koyan hiyerarşik kümeleme ısı haritası analizi ile daha da desteklenmiştir (Şekil 3C).
Silika+DMSO ve Silika grupları arasındaki karşılaştırmada, 1.399'u yukarı yönlü regüle olmuş ve 1.655'i aşağı yönlü regüle olmuş olmak üzere toplam 3.054 anlamlı derecede farklı ifade edilen gen belirlenmiştir (Şekil 3B). İlgili ısı haritası (Şekil 3D), DMSO tedavisi sonrası Lcn2 ve MMP12 dahil olmak üzere genlerin belirgin aşağı yönlü regülasyonu ile birlikte önemli transkriptomik değişiklikler ortaya çıkarmıştır. Özellikle, Silika grubunda yukarı yönlü regüle olan MMP12, Saa3 ve Spp1 gibi temel genler, Silika+DMSO grubunda belirgin bir aşağı yönlü regülasyon göstermiştir. Bu bulgular, DMSO'nun pro-inflamatuar ve pro-fibrotik mediyatörlerin ekspresyonunu baskılayarak silikozis kaynaklı patolojiyi hafifletebileceğini düşündürmektedir.
IL-6/STAT3/MMP12 sinyal ekseni, silika kaynaklı pulmoner fibroziste DMSO'nun koruyucu etkilerinde rol oynuyor olabilir
Diferansiyel eksprese olan genler (DEG'ler) arasındaki ilişkileri araştırmak için, transkriptomik verilere dayalı bir gen etkileşim ağı oluşturulmuştur (Şekil 4A). MMP12'nin ağ içerisinde merkezi bir konumda olduğu görülmüştür. Protein düzeyindeki potansiyel ilişkileri daha ayrıntılı incelemek için, STRING veri tabanı kullanılarak tahmini bir protein-protein etkileşim (PPI) ağı oluşturulmuştur (Şekil 4B). STRING analizi, MMP12 ile IL-6, STAT3, SPP1 ve MMP19 dahil olmak üzere birkaç temel DEG arasında potansiyel fonksiyonel ilişkiler olduğunu öne sürmüştür. STRING farklı kaynaklardan gelen kanıtları entegre ettiği için, bu ilişkiler tahmini fonksiyonel ilişkilerdir.
IL-6, STAT3, p-STAT3 ve MMP12 protein ekspresyon seviyelerini belirlemek için Western blot analizi gerçekleştirilmiştir (Şekil 4C–F). Sonuçlar, Kontrol grubuyla karşılaştırıldığında, Silica grubunda IL-6 ve p-STAT3 protein ekspresyon seviyelerinin anlamlı derecede arttığını ve MMP12 protein ekspresyonunun da artış eğilimi gösterdiğini ortaya koymuştur. DMSO uygulamasının ardından, bu üç proteinin ekspresyon seviyeleri anlamlı şekilde azalmıştır. Özellikle, toplam STAT3 protein ekspresyonu tüm deneysel gruplarda nispeten tutarlı kalmıştır.
VERİ ERİŞİLEBİLİRLİĞİ:
Bu çalışmada üretilen tüm ham sekanslama verileri, GSE311671 erişim numarası ile Gene Expression Omnibus (GEO) veri tabanına kaydedilmiştir. Çalışmanın ham görüntüleri ek bir klasörde (Ek Dosya 1) mevcuttur.
Şekil 1: Çalışma tasarımının şeması. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: DMSO, silikozisli farelerde pulmoner fibrozisi hafifletir. (A) Deneysel tasarımın şematik diyagramı. Farklı renklerdeki oklar farklı uygulama rejimlerini temsil etmektedir. (B) Akciğer dokusunun hematoksilin ve eosin boyaması. 200× büyütmede ölçek çubuğu 50 µm; 400× büyütmede ölçek çubuğu 20 µm'dir. (C) Akciğer dokusunun Masson boyaması (mavi: kollajen lifleri; kırmızı: kas lifleri). 200× büyütmede ölçek çubuğu 50 µm; 400× büyütmede ölçek çubuğu 20 µm'dir. (D). HE boyama sonuçlarına dayalı olarak farklı grupların fibrozis skorları. n = 8, P ≤ 0.0001. (E) Farklı grupların akciğer dokusundaki Masson boyamasının göreceli kollajen alanı. n = 8, P ≤ 0.0001. (F) Farelerin 30 gün içindeki vücut ağırlığı değişimleri. Veriler ortalama ±± SEM olarak sunulmuştur. Çoklu veri setlerinin karşılaştırması tek yönlü varyans analizi (ANOVA) kullanılarak yapılmış ve post hoc testler Tukey yöntemi ile gerçekleştirilmiştir. n = 8, P(zaman) ≤ 0.0001, P(grup) ≤ 0.0001. N: Kontrol grubu; S: Silika grubu; SD: Silika + DMSO grubu; D: DMSO grubu. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Transkriptom dizileme, DMSO'nun silikozu hafifletmedeki gen düzenlemesini ortaya koymaktadır. (A,B) Silika (S) grubu ile Kontrol (N) grubu ve Silika + DMSO (SD) grubu ile Silika (S) grubu arasındaki farklı eksprese edilen genlerin yanardağ grafiği. (C,D) Silika (S) grubunun Kontrol (N) grubu ile karşılaştırılması ve Silika + DMSO (SD) grubunun Silika (S) grubu ile karşılaştırılmasına ait ısı haritası. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: DMSO, IL-6 ve STAT3 protein ekspresyonunu azaltır. (A) Anlamlı derecede farklı eksprese edilen genlerin ağ diyagramı. (B) MMP12 ve ilgili genlerin STRING ağ etkileşim diyagramı. (C–F) β-Actin, IL-6, MMP12, STAT3 ve p-STAT3 protein ekspresyonunun Western blot analizi. Western blotting yoluyla β-Actin, IL-6 (*P = 0.0257, *P = 0.0195), MMP12 (**P = 0.0013, *P = 0.0318), STAT3 (P = 0.3205, P = 0.2347) ve p-STAT3 (*P = 0.0123, **P = 0.0096) proteinlerinin gri değer analizi. İmmunoblotting analizi üç paralel örnekte (n = 3) gerçekleştirilmiştir. N: Kontrol grubu; S: Silika grubu; SD: Silika + DMSO grubu; D: DMSO grubu. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Dosya 1: Bu çalışmanın ham verileri.Lütfen bu dosyayı indirmek için buraya tıklayın.
Tartışma
Silikozis, kalıcı inflamasyon ve akciğer fonksiyonlarını ve hastanın yaşam kalitesini önemli ölçüde bozan progresif pulmoner fibrozis ile karakterize olan, dünya çapındaki en ciddi mesleki akciğer hastalıklarından biri olmaya devam etmektedir25. Bu çalışmada, silika ile indüklenmiş bir fare modeli kullanarak, dimetil sülfoksit'in (DMSO) erken evredeki potansiyel koruyucu etkilerini sistematik olarak inceliyoruz. Buradaki bulgular, DMSO tedavisinin inflamatuar hücre infiltrasyonunu azalttığını ve fibrotik patolojik değişiklikleri hafiflettiğini göstermekte; bu da DMSO'nun silikozisin erken evrelerinde modülatör bir rol oynayabileceğini düşündürmektedir. Önceki deneysel çalışmalar, DMSO'nun hem sıçanlarda hem de farelerde pulmoner fibrozise karşı koruyucu etkiler gösterdiğini kanıtlamıştır. Haschek ve ark., altta yatan moleküler mekanizmalar belirsiz kalsa da, DMSO'nun deneysel hayvan modellerinde pulmoner fibrotik değişiklikleri azalttığını bildirmiştir26. Bu bulgularla uyumlu olarak, transkriptomik ve protein ekspresyon analizlerimiz, DMSO'nun inflamatuar sinyal yollarını modüle ederek silika kaynaklı pulmoner fibrozisi hafifletebileceğini öne sürmekte ve böylece potansiyel anti-fibrotik aktivitesine dair ek mekanistik bilgiler sağlamaktadır.
Yüksek doku geçirgenliğine sahip polar aprotik bir çözücü olan DMSO27, interstisyel sistit, romatoid artrit ve osteoartrit dahil olmak üzere inflamasyonla ilişkili çeşitli bozukluklarda uygulanmış, iyi belgelenmiş antiinflamatuar ve analjezik özelliklere sahiptir28,29,30. Ek olarak, önceki çalışmalar DMSO'nun deneysel hayvan modellerinde pulmoner fibrozisi ve akciğer hasarını azalttığını göstermiş; bu durum, DMSO'nun muhtemelen antiinflamatuar ve serbest radikal süpürücü özellikleri aracılığıyla fibrotik akciğer hastalıklarına karşı koruyucu etkilere sahip olduğunu ortaya koymuştur26. Moleküler düzeyde DMSO'nun, LPS ile stimüle edilmiş RAW264.7 makrofajlarında NF-κB ve MAPK sinyal yollarını baskıladığı ve bunun sonucunda IL-6 ekspresyonunun azaldığı rapor edilmiştir31. Özellikle, yüksek dozlarda DMSO sistemik toksisiteye neden olabilir ve 8 g/kg'ı aşan dozlarda çoklu organ hasarı bildirilmiştir14; bu nedenle, terapötik etkileri ve toksisiteyi değerlendirmek için düşük dozlu, tekrarlanan bir uygulama protokolü benimsenmiştir.
Transkriptomik ve histopatolojik analizleri entegre ederek, DMSO tedavisinin silikaya maruz kalan farelerde pulmoner inflamasyonu ve fibrozisi azalttığını ve buna IL-6 ekspresyonundaki azalmanın eşlik ettiğini gözlemledik. Transkriptomik profilleme, DMSO tedavisi sonrası MMP12 ekspresyonunda bir azalma olduğunu da göstermiştir. Ağırlıklı olarak makrofajlar tarafından salgılanan MMP1232; TGF-β1, EGR1 ve CYR61 dahil olmak üzere pro-fibrotik yolların düzenlenmesi yoluyla silikozis, KOAH ve bleomisin kaynaklı akciğer hasarının fibrotik ilerleyişinde rol oynamaktadır33,34,35. Mevcut çalışmada, MMP12'de gözlenen azalma, bu proteinin DMSO tedavisi ile ilişkili anti-inflamatuar ve anti-fibrotik etkilerdeki potansiyel rolüne işaret etmektedir. Önemli bir nokta olarak MMP12, fibrozis çözünmesi sırasında aşırı hücre dışı matris birikintilerinin degradasyonunu kolaylaştırarak doku yeniden şekillenmesini ve skar temizlenmesini desteklemektedir36.
Makrofajlar, silika kaynaklı silikoziste pro-inflamatuar sitokin üretiminin temel itici güçleridir37. Aktive olmuş makrofajlar, inflamasyon ve fibrozise katkıda bulunan IL-6 ve TNF-α salgılarlar38. IL-6, JAK–STAT yolunu, özellikle de STAT3'ü aktive etmek için gp130 reseptör kompleksiyle etkileşime girer; böylece makrofaj fenotipini etkileyerek pro-fibrotik süreçleri teşvik eder39,40,41,42. Bu çalışmada, DMSO tedavisi IL-6, STAT3 ve MMP12 ekspresyon seviyelerini önemli ölçüde azaltmış olup, bu durum DMSO'nun IL-6/STAT3 aksını modüle edebileceğini ve MMP12'yi dolaylı olarak downregüle edebileceğini göstermektedir. Önceki çalışmalar, IL-6–STAT3 aksının çeşitli pulmoner fibrozis modellerinde merkezi bir düzenleyici rol oynadığını ve sürekli aktivasyonunun fibrozis şiddeti ve hastalık ilerlemesi ile yakından ilişkili olduğunu kanıtlamıştır43,44. STAT3, inflamatuar yanıtları fibrotik yeniden şekillenmeye bağlayan önemli bir sinyal merkezi olarak önerilmiştir ve aktivasyonu MMP12'yi regüle ederek transkripsiyonel aktivitesini artırabilir45. Ayrıca, STAT3 sinyali makrofaj polarizasyonunda yer alarak makrofajların pro-inflamatuar M1 fenotipinden pro-fibrotik M2 fenotipine geçişini tetikler46,47, M2 makrofajlar ise MMP12'nin birincil hücresel kaynaklarından birini temsil eder48. Bu nedenle, mevcut çalışmada gözlemlenen STAT3 ve MMP12'nin eş zamanlı downregülasyonu, DMSO'nun MMP12 ekspresyonunu en azından kısmen STAT3 sinyalizasyonunun modülasyonu yoluyla azaltabileceğini düşündürmektedir. Ancak, mevcut çalışmanın öncelikle transkriptomik profilleme ve in vivo validasyon kombinasyonuna dayalı potansiyel moleküler mekanizmaları belirlemek amacıyla tasarlandığı belirtilmelidir. IL-6, STAT3 ve MMP12'deki koordineli değişimler, DMSO'nun anti-fibrotik etkilerinde IL-6/STAT3/MMP12 sinyal ekseninin yer aldığını desteklese de, mevcut kanıtlar STAT3 aktivasyonu ile MMP12 regülasyonu arasında doğrudan bir nedensellik ilişkisi kurmamaktadır. Bu nedenle, bu sinyal yolu içindeki doğrudan düzenleyici etkileşimleri daha fazla netleştirmek için ek mekanistik çalışmalara ihtiyaç vardır.
Bu çalışmanın birkaç kısıtlılığı bulunmaktadır. İlk olarak, bu çalışmanın sonuçları bir fare silikozis modelindeki histopatolojik ve protein ekspresyon analizleri ile birleştirilmiş transkriptomik profillemeye dayanmaktadır. Bu bulgular IL-6/STAT3/MMP12 sinyal aksının etkisini desteklese de, STAT3 aktivasyonu ile MMP12 regülasyonu arasında doğrudan bir nedensel ilişki kurmamaktadır. İkinci olarak, makrofaj tabanlı in vitro çalışmalar ve IL-6/STAT3 yolu ile MMP12'nin genetik veya farmakolojik manipülasyonunu kullanan kurtarma deneylerini içeren mekanistik doğrulama gerçekleştirilmemiştir. Ayrıca, DMSO'nun yerleşik tedavilerle doğrudan karşılaştırılmasını sınırlayacak şekilde, hiçbir pozitif anti-fibrotik kontrol dahil edilmemiştir. Mekanistik doğrulamayı ve pirfenidon veya nintedanib gibi klinik olarak ilgili anti-fibrotik ilaçları içeren gelecek çalışmalar, DMSO'nun silikozisteki moleküler mekanizmasını ve terapötik potansiyelini daha da aydınlatacaktır.
Sonuç olarak bulgular, DMSO'nun muhtemelen IL-6/STAT3/MMP12 sinyal eksenini modüle ederek, silika kaynaklı silikozisindeki makrofaj aracılı inflamasyonu ve fibrozisi hafiflettiğini göstermektedir. Bu bulgular, DMSO'nun anti-fibrotik etkilerinde IL-6/STAT3/MMP12 sinyal ekseninin potansiyel rolünü destekleyen ön kanıtlar sunmakta ve MMP12'yi gelecekteki araştırmalar için potansiyel bir moleküler hedef olarak vurgulamaktadır.
Açıklamalar
Yazarların beyan edilecek bir çıkar çatışması yoktur.
Teşekkürler
Yazarlar, teknik destekleri için Anhui Shendong Biotechnology Development Co., Ltd. platformuna, Profesör Deyong Ge'ye ve Lei Xu'ya içtenlikle teşekkür ederler.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| 10% SDS-PAGE | Servicebio | G2177 | |
| BCA Protein Analiz Kiti | Servicebio | G2026 | |
| C57BL/6J fareler | Changzhou Cavens Laboratory Animal Co., Ltd. | No: SCXY(Su)2011-0003 | |
| Kristalin silika | Sigma Aldrich | No.S5631 | |
| DMSO | Servicebio | GC203006 | |
| IL-6 | Affinity Biosciences | DF6087 | |
| yükleme tamponu | Bioteke | P0015L | |
| MMP12 | Servicebio | GB115475 | |
| p-STAT3 | Servicebio | GB150001 | |
| RIPA liz tamponu | Servicebio | G2002 | |
| Sekonder antikor | Servicebio | GB23303 | |
| yağsız süt | Servicebio | GC310001 | |
| STAT3 | Servicebio | GB11176 | |
| β-Actin | Servicebio | GB11001 |
Kaynaklar
- Leung, C. C., Yu, I. T. S., Chen, W. Silicosis. Lancet. 379 (9830), 2008-2018 (2012).
- Fazio, J. C., et al. Silicosis among immigrant engineered stone (quartz) countertop fabrication workers in California. JAMA Intern Med. 183 (9), 991-998 (2023).
- Tian, Y., et al. Nebulized inhalation of LPAE-HDAC10 inhibits acetylation-mediated ROS/NF-κB pathway for silicosis treatment. J Control Release. 364, 618-631 (2023).
- Hoy, R. F., Chambers, D. C. Silica-related diseases in the modern world. Allergy. 75 (11), 2805-2817 (2020).
- Zhou, Q., et al. Activation of Sirtuin3 by honokiol ameliorates alveolar epithelial cell senescence in experimental silicosis via the cGAS-STING pathway. Redox Biol. 74, 103224 (2024).
- Yang, S., et al. Single-cell transcriptome sequencing–based analysis: Probing the mechanisms of glycoprotein NMB regulation of epithelial cells involved in silicosis. Part Fibre Toxicol. 20, 29 (2023).
- Robert, S., et al. Involvement of matrix metalloproteinases (MMPs) and inflammasome pathway in molecular mechanisms of fibrosis. Biosci Rep. 36 (4), e00360 (2016).
- Dorjay Tamang, J. S., et al. An overview of matrix metalloproteinase-12 in multiple disease conditions, potential selective inhibitors, and drug designing strategies. Eur J Med Chem. 283, 117154 (2025).
- Zhou, X., et al. Macrophage-derived MMP12 promotes fibrosis through sustained damage to endothelial cells. J Hazard Mater. 461, 132733 (2024).
- De Abreu Costa, L., et al. Dimethyl sulfoxide (DMSO) decreases cell proliferation and TNF-α, IFN-γ, and IL-2 cytokine production in cultures of peripheral blood lymphocytes. Molecules. 22 (11), 1789 (2017).
- Kawasaki, Y., Katayama, H., Kato, S. Effectiveness of DMSO intravesical therapy for lower urinary symptoms of primary amyloidosis localized in the urinary bladder: A case report. Hinyokika Kiyo. 59 (7), 453-456 (2013).
- Taghavi, S., et al. Dimethyl sulfoxide as a novel therapy in a murine model of acute lung injury. J Trauma Acute Care Surg. 97, 32-38 (2024).
- Elisia, I., et al. DMSO represses inflammatory cytokine production from human blood cells and reduces autoimmune arthritis. PLoS One. 11 (3), e0152538 (2016).
- Aita, K., et al. Apoptosis in murine lymphoid organs following intraperitoneal administration of dimethyl sulfoxide (DMSO). Exp Mol Pathol. 79 (3), 265-271 (2005).
- Gad, S. C., et al. Tolerable levels of nonclinical vehicles and formulations used in studies by multiple routes in multiple species with notes on methods to improve utility. Int J Toxicol. 35 (2), 95-178 (2016).
- Li, B., et al. A suitable silicosis mouse model was constructed by repeated inhalation of silica dust via nose. Toxicol Lett. 353, 1-12 (2021).
- Zhou, X., et al. ANXA9 facilitates S100A4 and promotes breast cancer progression through modulating STAT3 pathway. Cell Death Dis. 15 (4), 260 (2024).
- Dong, L., et al. Hypoxic hUCMSC-derived extracellular vesicles attenuate allergic airway inflammation and airway remodeling in chronic asthma mice. Stem Cell Res Ther. 12, 4 (2021).
- Gentile, G., Tambuzzi, S., Boracchi, M., Andreola, S., Zoja, R. Paradoxal dyeing affinity's inversion of the connective tissue at Goldner's Masson trichrome staining as a peculiar characteristic of compressed and exsiccated cadaveric skin. Leg Med (Tokyo). 52, 101905 (2021).
- Yu, G., Wang, L. G., Han, Y., He, Q. clusterProfiler: An R package for comparing biological themes among gene clusters. OMICS. 16 (5), 284-287 (2012).
- Wu, T., et al. clusterProfiler 4.0: A universal enrichment tool for interpreting omics data. Innovation (Camb). 2 (3), 100141 (2021).
- Gene Ontology Consortium. The Gene Ontology resource: Enriching a GOld mine. Nucleic Acids Res. 49 (D1), D325-D334 (2021).
- Kanehisa, M., Furumichi, M., Sato, Y., Inoshiguro-Watanabe, M. KEGG: Integrating viruses and cellular organisms. Nucleic Acids Res. 49 (D1), D545-D551 (2021).
- Ashcroft, T., Simpson, J. M., Timbrell, V. Simple method of estimating severity of pulmonary fibrosis on a numerical scale. J Clin Pathol. 41 (4), 467-470 (1988).
- Liu, T., et al. Whole transcriptome sequencing identifies key lncRNAs, circRNAs, and mRNAs for exploring the pathogenesis and therapeutic target of mouse pneumoconiosis. Gene. 901, 148169 (2024).
- Haschek, W. M., Baer, K. E., Rutherford, J. E. Effects of dimethyl sulfoxide (DMSO) on pulmonary fibrosis in rats and mice. Toxicology. 54 (2), 197-205 (1989).
- Reimer, L., et al. Low-dose DMSO treatment induces oligomerization and accelerates aggregation of α-synuclein. Sci Rep. 12, 3737 (2022).
- Colucci, M., et al. New insights into dimethyl sulfoxide (DMSO) effects on experimental in vivo models of nociception and inflammation. Pharmacol Res. 57 (6), 419-425 (2008).
- Obara, K., et al. Dimethyl sulfoxide enhances acetylcholine-induced contractions in rat urinary bladder smooth muscle by inhibiting acetylcholinesterase activities. Biol Pharm Bull. 46 (2), 354-358 (2023).
- Moss, N. P., et al. A prospective, randomized trial comparing intravesical dimethyl sulfoxide (DMSO) to bupivacaine, triamcinolone, and heparin (BTH) for newly diagnosed interstitial cystitis/painful bladder syndrome (IC/PBS). Neurourol Urodyn. 42 (3), 615-622 (2023).
- Han, H., Kang, J. K., Ahn, K. J., Hyun, C. DMSO alleviates LPS-induced inflammatory responses in RAW264.7 macrophages by inhibiting NF-κB and MAPK activation. BioChem. 3 (2), 91-101 (2023).
- Shapiro, S. D. Matrix metalloproteinase degradation of extracellular matrix: Biological consequences. Curr Opin Cell Biol. 10 (5), 602-608 (1998).
- Kang, H. R., et al. Transforming growth factor (TGF)-β1 stimulates pulmonary fibrosis and inflammation via a Bax-dependent, Bid-activated pathway that involves matrix metalloproteinase-12. J Biol Chem. 282 (10), 7723-7732 (2007).
- Matute-Bello, G., et al. Essential role of MMP-12 in Fas-induced lung fibrosis. Am J Respir Cell Mol Biol. 37 (2), 210-221 (2007).
- Niu, H., et al. Matrix metalloproteinase 12 modulates high-fat diet-induced glomerular fibrogenesis and inflammation in a mouse model of obesity. Sci Rep. 6, 20171 (2016).
- Huang, Q., et al. Regulation of liver fibrosis by matrix metalloproteinase/tissue inhibitor of metalloproteinase and research advances in related therapeutic drugs. J Clin Hepatol. 38 (6), 1420-1425 (2022).
- Cao, Z., et al. A novel pathophysiological classification of silicosis models provides some new insights into the progression of the disease. Ecotoxicol Environ Saf. 202, 110834 (2020).
- Mao, N., et al. Glycolytic reprogramming in silica-induced lung macrophages and silicosis reversed by Ac-SDKP treatment. Int J Mol Sci. 22 (18), 10063 (2021).
- Pedroza, M., et al. Interleukin-6 contributes to inflammation and remodeling in a model of adenosine-mediated lung injury. PLoS One. 6 (7), e22667 (2011).
- Ataie-Kachoie, P., Pourgholami, M. H., Morris, D. L. Inhibition of the IL-6 signaling pathway: A strategy to combat chronic inflammatory diseases and cancer. Cytokine Growth Factor Rev. 24 (2), 163-173 (2013).
- Robinson, M. B., et al. IL-6 trans-signaling increases expression of airways disease genes in airway smooth muscle. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 309 (2), L129-L138 (2015).
- Garbers, C., Rose-John, S. Dissecting interleukin-6 classic and trans-signaling in inflammation and cancer. Methods Mol Biol. 2691, 207-224 (2023).
- Chakraborty, D., et al. Author correction: Activation of STAT3 integrates common profibrotic pathways to promote fibroblast activation and tissue fibrosis. Nat Commun. 12, 7259 (2021).
- O'Donoghue, R. J. J., et al. Genetic partitioning of interleukin-6 signalling in mice dissociates Stat3 from Smad3-mediated lung fibrosis. EMBO Mol Med. 4 (9), 939-951 (2012).
- Gao, Y., Zhou, X., Zhou, Y., Zhao, L. IL-9 and its receptor promote the progression of chronic obstructive pulmonary disease by activating macrophages through the STAT3 pathway. J China Med Univ. 52, 921-927 (2023).
- Wang, Y., et al. Xuanfei Baidu decoction protects against macrophage-induced inflammation and pulmonary fibrosis via inhibiting IL-6/STAT3 signaling pathway. J Ethnopharmacol. 283, 114701 (2022).
- Liu, T., Zhang, Z., Shen, W., Wu, Y., Bian, T. MicroRNA let-7 induces M2 macrophage polarization in COPD emphysema through the IL-6/STAT3 pathway. Int J Chron Obstruct Pulmon Dis. 18, 575-591 (2023).
- Guo, X., et al. Involvement of M2 macrophage polarization in PM2.5-induced COPD by upregulating MMP12 via IL4/STAT6 pathway. Ecotoxicol Environ Saf. 283, 116793 (2024).