Yöntem makalesi

Candida albicans ve Streptococcus agalactiae Vajinal Birlikte Kolonizasyon Fare Modeli

58 görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/72557

⸱

21 Ağustos 2026

 , 
1Department of Immunology and Microbiology, University of Colorado Anschutz Medical Campus

Bu makalede

Özet

Bu protokol, farelerin vajinal bölgesinin Candida albicans ve Streptococcus agalactiae ile birlikte kolonize edilmesi yöntemini ayrıntılarıyla açıklamaktadır. Bu yöntem; polimikrobiyal etkileşimleri, konakçı-mikrop etkileşimlerini ve konakçının bu organizmalara verdiği tepkileri incelemek için kullanılabilir.

Özet

İnsan vajinal kanalından çeşitli mikroplar izole edilmektedir ve bu nişi mesken tutan organizmaların çoğu kommensal ve patojenik yaşam tarzları arasında geçiş yapabilmektedir. Topluluk kompozisyonu ve konak ortamı dahil olmak üzere çeşitli faktörler hastalık sonuçlarını etkiler; ancak bu sonuçları belirleyen mekanizmalar tam olarak anlaşılamamıştır. Bu makalede, kadın genital kanalını (FGT) kolonize eden patobiyontlar olan Candida albicans ve Streptococcus agalactiae (Grup B Streptococcus, GBS) ile gerçekleşen krallıklar arası etkileşimleri ve konak yanıtını araştırmak için bir fare modelini tanımlıyoruz. Ortaya çıkan kanıtlar, sıkça birlikte izole edilmeleri nedeniyle C. albicans kolonizasyonunun GBS taşıyıcılığı için bir risk faktörü olduğunu göstermektedir. Gebelik sırasında GBS kolonizasyonu, koryoamniyinit ve ölü doğum dahil olmak üzere olumsuz sonuçlara yol açabilir . GBS ayrıca in utero olarak fetüse veya doğum sırasında bir neonata bulaşabilir ve neonatal menenjitin önde gelen nedenlerinden biridir. Vajinal kanalın kolonizasyonu, GBS hastalığının kritik bir öncülüdür ve bu niş, bazıları C. albicans kolonizasyonundan etkilenebilen çok sayıda seçici baskı uygular. Bu protokol, C. albicans kolonizasyonunu kurmak için antibiyotik tedavisi ve tek doz 17β-estradiol kullanımını, ardından antibiyotiklerin kaldırılmasını ve GBS ile inokülasyonu içeren eş zamanlı C. albicans-GBS vajinal ko-kolonizasyon modelini tanımlamaktadır. Vajinal lümendeki mikrobiyal yükler, deney süresince lavaj yoluyla nicelendirilir ve FGT genelindeki yükler; vajina, serviks ve uterusun diseksiyonu, homojenizasyonu ve ekimiyle belirlenir. Bu yöntem, doğrudan ve dolaylı polimikrobiyal etkileşimlerin bu iki organizmanın yaşam tarzlarını ve patogenezini etkileme mekanizmalarının yanı sıra FGT'deki konak bağışıklık ortamının araştırılmasına olanak sağlayacaktır.

Giriş

Streptococcus agalactiae (Grup B Streptococcus, GBS), gastrointestinal ve vajinal kanallar dahil olmak üzere birden fazla polimikrobiyal bölgeyi kolonize eden Gram-pozitif bakteriyel bir patobiyonttur. Vajinal kolonizasyon genellikle asemptomatik seyretse de, hamilelik sırasında GBS vajinal kanaldan uterusa çıkabilir ve sağlam membranları geçerek amniyotik sıvının ve plasentanın enfeksiyonuna neden olabilir. Bu nedenle, olumsuz gebelik sonuçları, fetal enfeksiyon ve neonatal hastalıklar için birincil bir risk faktörüdür1,2. Yenidoğanlarda invaziv enfeksiyonların önde gelen nedenlerinden biri olması sebebiyle, transmisyon ve enfeksiyon riskini etkileyen faktörlerin karakterize edilmesi kritik önem taşır. Doğum sırasındaki antibiyotik profilaksisi, dikey transmisyonu ve yenidoğanlardaki erken başlangıçlı GBS hastalığını azaltabilir3,4; ancak bu uygulama, artan antibiyotik direnci oranları ve prenatal veya erken yaşamdaki antibiyotik yönetimiyle ilgili potansiyel uzun vadeli etkilerle ilişkilendirilmiştir5,6,7,8. Bu faktörler, daha hedefe yönelik önleyici ve terapötik müdahalelerin geliştirilmesini gerekli kılmaktadır.

Yeni kanıtlar, mikrobiyom kompozisyonunun ve polimikrobiyal etkileşimlerin homeostazı ve hastalık olasılığını etkilediğini göstermiştir9. İnsan vajinal mikrobiyomunda GBS baskınlığı, Lactobacillus bolluğunda bir azalma ile ilişkilendirilmiş ve kolonizasyon üzerinde in vitro ve in vivo olarak farklı etkiler yaratabilen tür ve suşa özgü etkileşimler gözlemlenmiştir 10,11. Daha önce araştırma grubumuz, GBS fitness'ının konakçı ve bakteriyel korelasyonlarını incelemek için bir GBS vajinal kolonizasyon fare modeli geliştirmiştir12. Bu süreç, farelerin tek doz 17β-östradiol ile tedavi edilmesini ve takip eden günde intravajinal GBS inokülasyonu yapılmasını içerir. Bu model; GBS yüzey proteinlerinin, düzenleyici sinyal ağlarının ve toksin salgılanmasının kolonizasyonun sürdürülmesindeki ve FGT dokularının istilasındaki önemini karakterize etmek için kullanılmıştır. Ayrıca, GBS'nin Akkermansia muciniphila ve Enterococcus faecalis dahil olmak üzere vajinal kanaldaki diğer bakterilerle karmaşık etkileşimler sergilediğini saptayarak13,14,15, GBS yaşam tarzının ve kalıcılığının komşu mikropların varlığından nasıl etkilendiğini ortaya koymuş bulunmaktayız.

Mevcut model bakteriler arası etkileşimleri incelemek için uyarlanmış olsa da, diğer mikropların çalışılması için ek modifikasyonlar gerekmiştir. Mantarlar, vajinal mikrobiyomun yeterince incelenmemiş bir bileşenidir ve burada sunulan model ile mantar kolonizasyonunu ve mantar-bakteri etkileşimlerini in vivo inceleyecek bir araç geliştirmeyi hedefledik. İnsan vajinal kanalından en sık izole edilen mantar, bireylerin %70'inden fazlasını kolonize eden Candida albicans'tır16. C. albicans polimorfiktir ve tomurcuklanan maya ile filamentöz morfotipler arasında geçiş yapmak için morfojenize olabilir. Filamentasyon, belirgin bir gen ekspresyon repertuarı ile ilişkilidir17,18. Bu hif spesifik genlerin bazılarının, polimikrobiyal kolonizasyon bağlamında bir uygunluk avantajı sağladığı yakın zamanda rapor edilmiştir19,20,21.

Çeşitli çalışmalar, ...'nın birlikte izole edildiğini bildirmiştir C. albicans ve insan vajinal sürüntülerinde GBS; araştırma grubumuz yakın zamanda C. albicans ile kolonize olmuş bireylerde GBS taşıyıcılık oranlarının anlamlı derecede daha yüksek olduğunu bulmuştur22Geliştirmiş olduğumuz bir in vivo kommensal funguslar, bakteriler ve konakçı arasındaki üçlü etkileşimleri incelemek için bir sistem. Konvansiyonel farelerdeki fungal çalışmalar, bakterilerin aracılık ettiği kolonizasyon direncini aşmak ve kalıcı kolonizasyon sağlamak için tipik olarak antibiyotik tedavisi gerektirir23GBS'nin kolonize olma yeteneğini bozmadan bunu başarmak için, fareleri bir antibiyotik kokteyli ile tedavi ediyoruz ve ardından onlara ... ile inokülasyon yapıyoruz. C. albicansve kolonizasyon gerçekleştikten sonra, GBS'nin sonrasında kolonize olmasına izin vermek için antibiyotik maruziyetini kaldırıyoruz. Bu işlem, her ikisinin de... şeklinde optimize edilmiştir C. albicans ve GBS vajinal yolu benzer yüklerde ve benzer zaman çizelgelerinde kolonize eder; bu da vajinal yol içinde doğrudan etkileşimlerin gerçekleşmesine olanak tanır. Bu protokol, farelerin antibiyotiklerle ön işlemden geçirilmesi ve 17'nin iletilmesi için bir yöntemi açıklamaktadırβ-estradiol, hem fungus hem de bakteri ile kolonizasyon oluşturun ve sonraki analizler için lavaj ve doku örnekleri toplayın.

Protokol

Bu makalede sunulan hayvan çalışmaları, Colorado Üniversitesi Anschutz'un Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmış ve #00316 sayılı protokol uyarınca gerçekleştirilmiştir. Aşağıdaki zaman çizelgesinde, 0. gün S. agalactiae inokülasyonu yapılan günü ifade etmektedir.

1. İnokülasyondan önce antibiyotikleri uygulayın.

  1. Fare içme suyunda çözünmüş, her biri 50 mg/mL konsantrasyonda olan ampisilin, neomisin ve gentamisin içeren konsantre bir çözelti hazırlayın. Antibiyotik çözeltisini sterilize etmek için 0,22 µm filtre kullanın.
  2. Her 99 g suya 1 mL çözelti ekleyerek, antibiyotik çözeltisini fare içme suyuna 1:100 oranında seyreltin.
  3. 7 gün sonra, 1.1 ve 1.2 numaralı adımları tekrarlayarak suyu yenileyin.
  4. Deneye başlamadan önce antibiyotik uygulamasını en az 7–10 gün boyunca sürdürün, ancak toplam antibiyotik tedavi süresinin 14 günü aşmadığından emin olun.

2. Fare östrus döngülerini senkronize edin (gün -3).

  1. Fare başına 0,5 mg 17β-estradiol ve süspansiyonun tüp duvarlarına yapışmasını hesaba katmak için küçük bir fazlalığı steril 50 mL'lik konik bir tüpe ekleyin. Konik tüpün kapağını sıkıca kapatın ve topakları dağıtmak için kısa süreli vorteksleyin.
    DİKKAT: 17β-estradiol dermal veya mukoza yoluyla vücuda girebileceği için, bu reajeni dikkatli bir şekilde taşıyın ve uygun kişisel koruyucu ekipman kullanın.
  2. 0,45 µm'lik bir filtre kullanarak, her 0,5 mg 17β-estradiol için 100 µL susam yağını doğrudan 17β-estradiol içeren konik tüpe sterilize ederek ekleyin. Konsantrasyon 5 mg/mL'dir. Homojen bir süspansiyon oluşturmak için çözeltinin kapağını sıkıca kapatın ve iyice vorteksleyin.
  3. Pistonu 0,15 mL işaretine kadar çekerek ve piston aşağıya, luer lock ucu yukarıya bakacak şekilde destekleyerek steril 1 mL'lik şırıngaları (her fare için bir adet) hazırlayın.
  4. 17β-estradiol süspansiyonunu, steril 18G 1,5” iğne ile yeni bir steril 10 mL'lik şırıngaya çekin ve bunu hazırlanan 1 mL'lik şırıngaları 100 µL süspansiyon ile doldurmak için kullanın.
  5. Her bir 1 mL'lik şırınganın ucuna steril 26G 0,5” iğne takın.
  6. 0,5 mg 17β-estradiol içeren 100 µL susam yağı süspansiyonu hazırlayın ve C. albicans inokülasyonundan bir gün önce her bir fareye intraperitoneal enjeksiyon yoluyla bir doz uygulayın.

3. Farelere C. albicans inokülasyonu yapın (gün -2).

  1. İnokülasyondan bir gün önce (17β-estradiol uygulamasının yapıldığı gün), 30 °C'lik bir inkübatörde 250 rpm hızla çalkalayarak Yeast Peptone Dextrose Broth içerisinde 5 mL'lik bir gece boyu C. albicans kültürü büyütün.
  2. İnokülasyon gününde, gece boyu büyütülen kültürden bir alikotu steril bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve 7–8 saniye boyunca veya bir pelet oluşana kadar ≤10,000 × g hızında santrifüjleyin.
  3. Süpernatantı uzaklaştırın ve peleti steril fosfat tamponlu salyende (PBS) yeniden süspande edin.
  4. Süspansiyonun konsantrasyonunu hesaplamak için bir hemositometre kullanın.
  5. Süspansiyondan bir alikotu yeni bir steril mikrosantrifüj tüpüne aktarın, yeniden peletleyin ve fare başına en az 10 µL nihai hacimde, 109 C. albicans hücre/mL nihai konsantrasyona ulaşacak şekilde taze steril PBS içinde süspande edin. Örneğin, konsantrasyon 2 × 108 hücre/mL ise ve 10 fare varsa, 500 µL'yi peletleyin ve 100 µL içinde yeniden süspande edin.
  6. Her bir fareye intravajinal olarak, PBS içinde 109 hücre/mL konsantrasyonda süspande edilmiş 10 µL C. albicans (107 hücre/fare) inoküle edin.
    1. Baskın olmayan elin baş ve işaret parmağıyla boyun derisini kavrayıp bileği, farenin sırtı avuç içine gelecek şekilde döndürerek her bir fareyi sabitleyin. Kuyruğu hareketsiz hale getirmek için yüzük ve serçe parmaklarını kullanın.
    2. Steril bir pipet ucuna 10 µL C. albicans süspansiyonu çekin. Ucun derinliğini farenin anatomisine göre ayarlayarak, uç yaklaşık 5–10 mm boyunca vajinal lümene yerleştirin.
    3. C. albicans inokulumunu vajinaya boşaltın ve pipet ucunu geri çekin.
    4. Boyun bölgesini bıraktıktan sonra, arka kısmı yükseltmek için fareyi kuyruğundan tutun. Fareyi yaklaşık 1 dakika boyunca veya C. albicans inokulumu artık görünmeyene kadar iki ön patisi üzerinde yürütün.

4. İçme suyunu değiştirin (gün -1).

  1. C. albicans inokülasyonundan bir gün sonra, bu süre S. agalactiae inokülasyonundan önceki güne denk gelecek şekilde, fareleri temiz kafeslere taşıyın.
  2. Farelere antibiyotiksiz taze su sağlandığından emin olun.

5. Vajinal lümendeki C. albicans yükünü nicelendirin (gün -1).

  1. -1. günde, fare başına bir steril mikrosantrifüj tüpü ve 100 µL steril PBS hazırlayın.
  2. Her bir fareyi adım 3.6.1'de açıklandığı şekilde sabitleyin.
  3. Steril bir pipet ucuna 50 µL PBS çekin. Pipet ucunu vajinal lümene yaklaşık 1–5 mm derinliğinde yerleştirin ve PBS'nin tamamını 3–5 kez yukarı aşağı çekerek pipetleyin. PBS'yi steril bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
  4. Toplam 100 µL lavaj sıvısı elde etmek için adım 5.3'ü tekrarlayın.
  5. Mikrosantrifüj tüpünü vorteksleyin, ardından steril PBS içinde 1:10.000'lik bir seyreltme ile 10 katlı seri dilüsyonlar gerçekleştirin.
  6. Seyreltilmiş süspansiyonlardan 10 µL ve seyreltilmemiş lavaj sıvısından 25 µL'yi Candida seçici kromojenik agar plaklarına ekin.
  7. Plakları 30 °C'de 48 saat inkübe edin. C. albicans kolonileri düzgün görünümlü, turkuaz veya yeşil renkte görünecektir.

6. Farelere S. agalactiae inokülasyonu yapın (gün 0).

  1. İnokülasyondan bir gün önce (içme suyu değişiminin yapıldığı gün), şunların 3 mL'lik gece boyu kültürü hazırlanır: S. agalactiae statik 37 °C'de Todd Hewitt Broth (THB) içerisinde °C inkübatörü.
  2. İnokülasyon gününde, gece boyu kültürü 4 mL THB içerisinde 1:10 oranında seyreltin ve statik koşullarda 37°C'de inkübe edin. °orta log fazına ulaşana kadar (600 nm'de optik yoğunluk [OD600(0,4–0,5 aralığında) yaklaşık 1,5–2 saatte.
  3. Mid-log kültürünü steril 15 mL'lik konik bir tüpe aktarın ve 3.000 g'de santrifüjleyin. × g 5 dakika boyunca veya bir pelet oluşana kadar.
  4. Süpernatantı aspirasyon yoluyla uzaklaştırın, ardından peleti 300 µL içerisinde süspande edin. µL steril PBS.
  5. En az 100 adet hazırlamak için resüspande edilmiş peleti kullanın µL'nin S. agalactiae fare başına süspansiyon ve ek olarak 500 µSteril PBS içinde OD değerinde L600 0,4 (yaklaşık 108 koloni oluşturan birim [KOB]/mL; (10 fare için toplam ≥1,5 mL).
    NOT: Bazı S. agalactiae suşlar OD değerleri bakımından farklılık gösterebilir600-CFU/mL oranı. Hangi OD'nin600 10'a karşılık gelir8 önceden belirlenmiş CFU/mL.
  6. Süspansiyonu yeni, steril bir 15 mL konik tüpe aktarın ve 3.000'de santrifüjleyin × g 5 dakika boyunca veya bir pelet oluşana kadar.
  7. Süpernatantı aspire edin ve peleti 1/10 hacmindeki çözeltide yeniden süspande edin.th steril PBS'nin başlangıç hacminin (eğer süspansiyonun 1,5 mL'si pelitlemişse, 150 µL içinde yeniden süspande edin) µL). Bu süspansiyon 10 konsantrasyonunda olacaktır9 CFU/mL ve bakteriyel inokülüm olarak hizmet eder.
  8. Seri dilüsyon yapın ve 50 µL örneği ekim yapın µTodd Hewitt Agar üzerine inokülumdan L kadar ekleyin, ardından plakaları 37°C'de inkübe edin °Kesin inokülum konsantrasyonunu belirlemek için 24 saat boyunca C'de tutun.
  9. Her bir fareye intravajinal olarak 10 µL inoküle edin µL kadar S. agalactiae 10'luk PBS içinde süspande edilmiş9 CFU/mL (107 (fare başına CFU), 3.6.1–3.6.4. adımlarda kullanılan tekniğin aynısı kullanılarak.

7. Vajinal lümende C. albicans ve S. agalactiae yüklerini nicelendirin (+1. gün başlangıcı).

  1. S. agalactiae inokulasyonundan bir gün sonra başlayarak, 100 µL vajinal lavaj sıvısı toplayın ve 5.1–5.5 arasındaki adımlarda kullanılan tekniğin aynısını kullanarak seriyel dilüsyon yapın.
  2. Dilüe edilmiş süspansiyonlardan 10 µL ve dilüe edilmemiş lavaj sıvısından 25 µL'yi, hem Candida-selektif hem de StrepB-selektif kromojenik agar plaklarına çift paralel olarak ekin.
  3. Candida plaklarını 30 °C'de 48 saat boyunca inkübe edin. C. albicans kolonileri pürüzsüz, turkuaz veya yeşil renkte görünecektir.
  4. StrepB plaklarını 37 °C'de 24 saat boyunca inkübe edin. S. agalactiae kolonileri pürüzsüz, pembe veya eflatun renkte görünecektir.
  5. Vajinal lümendeki mikrobiyal yükü izlemek için 7.1–7.4 arasındaki adımları günlük olarak veya uygun bir zaman aralığında tekrarlayın.

8. Dişi genital kanal dokularındaki C. albicans ve S. agalactiae yüklerini belirleyin (deney son noktası).

  1. Dokuları (vajina, serviks ve uterus) toplamak için, her fare başına yaklaşık 0,4–0,5 g 1 mm zirkonya boncuk ve 500 µL steril PBS ile doldurulmuş üç adet 2 mL vidalı kapaklı tüp hazırlayın. Ayrıca, lavaj örneği toplamak için fare başına bir adet steril mikrosantrifüj tüpü ve 100 µL steril PBS hazırlayın. Doku ağırlıklarını hesaplarken referans olarak kullanmak üzere her bir vidalı kapaklı tüpün ağırlığını kaydedin.
  2. Fareyi, CO2 asfiksisi ve servikal dislokasyon gibi kurum tarafından onaylanmış bir yöntemle itlaf edin. Makas ve pensleri sterilize etmek için %70 etanol kullanın.
  3. Farenin arka ucunu kuyruğundan kaldırın ve 5.3–5.4 adımındaki tekniği kullanarak vajinal lavaj toplayın.
  4. Farenin abdomenini %70 etanol ile spreyleyin ve abdominal kaviteyi açmak için sterilize edilmiş makasları kullanın. Genital kanal dokularını açığa çıkarmak için pens yardımıyla deriyi geriye çekin ve gastrointestinal sistemi kenara kaydırın.
  5. Mesanenin yanı sıra uterusu kapatan visseral yağları ve membranları çıkarmak için sterilize edilmiş makasları kullanın. Uterus gövdesi ile her bir ovaryum arasından keserek uterus kornularını ovaryumlardan ayırın.
  6. Sterilize edilmiş pensler kullanarak, vajinal kanalı serviksin alt noktasından kavrayın. Tüm vajinal kanal görünür olana kadar kaldırın ve deri dokusuna temas etmemeye dikkat ederek, vulvaya mümkün olduğunca yakın bir noktadan sterilize edilmiş makaslarla transvers bir kesi yapın. Tüm genital kanalı çıkarın ve steril bir 10 cm Petri kabına yerleştirin.
  7. Vajina, serviks ve uterusu ayırmak için steril bir jiletle serviksin altına ve üstüne iki transvers kesi yapın. Her bir dokuyu, üzerinden ek 2–5 sagital ve transvers kesi yaparak ince parçalara ayırın. Her bir dokuyu kendisi için hazırlanmış ilgili vidalı kapaklı tüpe yerleştirin.
  8. Her bir vidalı kapaklı tüpü tartın ve 8.1 adımındaki değeri çıkararak her bir dokunun ağırlığını hesaplayın. Her tüpün kapağını sıkıca kapatın, 3.450 rpm'de 1 dakika boyunca boncukla parçalayın (bead-beat), tüpleri 1 dakika boyunca buz üzerinde bekletin ve ardından 3.450 rpm'de tekrar 1 dakika boyunca boncukla parçalayın.
  9. Her bir doku homojenatını ve lavaj örneğini 5.5–5.6 adımlarında açıklanan yöntemi kullanarak seri dilüsyonla ekim yapın. Plakaları 7.3–7.4 adımlarında açıklandığı şekilde inkübe edin.

Sonuçlar

GBS ve C. albicans vajinal kolonizasyonunu karakterize etmek için, farelere intravajinal olarak C. albicans suşu SC5314 veya PBS araç kontrolü enjekte edilmiş, ardından GBS suşu COH1 enjekte edilmiştir. Bu suş, yenidoğan invaziv hastalığı ve menenjit ile en sık ilişkilendirilen hipervirülent kapsüler serotip III, sekans tipi 17 izolatlarını temsil etmektedir1. İnokülasyondan bir gün sonra GBS ile kolonize olmayan fareler analiz dışı bırakılmıştır. Dört günlük bir deneysel süreç boyunca, sadece GBS ile kolonize olan fareler GBS'yi vajinal lümenden kademeli olarak temizlemiştir. C. albicans ile ko-kolonize olan farelerin çoğunluğu yüksek GBS yükünü korumaktadır (Şekil 1A,B). C. albicans ayrıca, temizlenmeden önce yaklaşık dört gün boyunca fare vajinal lümenini kolonize eder (Şekil 1C). Bu modeli kullanan önceki çalışmalar; vajina, serviks ve uterus dahil olmak üzere FGT dokularındaki GBS yüklerinin, ko-kolonize farelerde mono-kolonize hayvanlara kıyasla daha yüksek olduğunu göstermiştir22.

GBS kolonizasyon grafikleri; istatistiksel karşılaştırma, sağkalım eğrisi, CFU/mL log ölçekli veri analizi.
Şekil 1Grup B'nin Niceleme Analizi Streptococcus kolonizasyon CD-1 fareleri, şunlar ile kolonize edildi: C. albicans (SC5314) veya kontrol olarak fosfat tamponlu salin ile işlem görmüş, ardından GBS (COH1) ile vajinal inokülasyon uygulanmış.A) Vajinal lavaj sıvısındaki GBS yükleri, medyan değerler gösterilmiştir. (B) Vajinal lavaj sıvısında GBS tespiti ile değerlendirilen, zaman içindeki kolonize olan farelerin yüzdesi. (C) C. albicans vajinal lavaj sıvısındaki yükler, medyanlar gösterilmiştir. Üç bağımsız deney. grup başına n = 26-27 fare. * p < 0,05; ** p ≤ 0,01; *** p ≤ 0,01 çoklu karşılaştırma ile Hatalı giriş nedeniyle çevrilecek bir metin sağlanmamıştır. Lütfen çevirmemi istediğiniz kaynak metni paylaşın.-Holm-Sidak çoklu karşılaştırma testi ile testler (A) veya log-rank testi (B). Kısaltmalar: GBS = Grup B Streptococcus, Ca = Candida albicans, CFU = koloni oluşturan birimler. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

GBS vajinal kolonizasyonu, maternal-fetal ve neonatal sağlık için kritik bir risk oluşturmaktadır. Kolonizasyonun belirleyicilerini anlamak ve önleyici terapötikler geliştirmek için In vivo modellerle çalışmak zorunludur. Bu makalede, fareleri vajinal olarak GBS ve C. albicans ile ortak kolonize etmek, vajinal lümen ve FGT'deki mikrobiyal yükleri değerlendirmek ve daha ileri analizler için ilgili dokuları toplamak amacıyla kullanılan bir fare modelini tanımlıyoruz. Bu model, polimikrobiyal vajinal kolonizasyon bağlamında fungal-bakteriyel ve konakçı-mikrop etkileşimlerini incelemek için geliştirilmiştir. Araştırma grubumuz, C. albicans'ın GBS vajinal kolonizasyonunu ve yükselen enfeksiyonu desteklemesine katkıda bulunan mekanizmaları aydınlatmak için bu modelden yararlanmıştır22.

Konak-mikrop etkileşimlerini anlamak için hayvan modelleri başarıyla kullanılmıştır; ancak, polymikrobiyal toplulukların bu modellere dahil edilmesi birçok benzersiz zorluk teşkil edebilir. Bu modelin geliştirilmesindeki temel hedefler, fungal kolonizasyonu sağlamak, C. albicans'ın hif oluşturması için zaman tanımak ve herhangi bir mikrop konak tarafından temizlenmeden önce kolonizasyon dinamiklerini izlemek amacıyla GBS ile inokülasyon yapmaktı. Polimorfik bir fungus olan C. albicans, hifal morfogenezi başlatarak konakla ilgili bir dizi çevresel sinyale yanıt verebilir17. GBS ile hifaya özgü etkileşimlerin FGT'deki simbiyozu yönlendirdiğine dair biriken kanıtlar nedeniyle, bu  modelde in vivo filamentasyon önceliklendirilmiştir. Represif TetO promotörünün kontrolü altında NRG1 eksprese eden bir C. albicans suşu kullanan araştırma grubumuz, GBS'nin hifa formuna sabitlenmiş C. albicans ile, maya formuna sabitlenmiş olana kıyasla daha yüksek ko-agregasyon ve daha yüksek epitelyal adezyon sergilediğini daha önce göstermiştir22. C. albicans ile ko-agregasyon ve insan vajinal epitelyal hücreleri ile ilişkilendirme, GBS'nin bu konak ortamındaki uygunluğunun (fitness) önemli belirleyicileridir. Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa ve çeşitli Streptococcus türleri dahil olmak üzere ek bakterilerin , C. albicans'daki morfogenez ilişkili gen ekspresyonunu modüle ettiği ve hifalarla tercihen etkileşime girdiği gösterilmiştir24. Gelecekte, in vivo filamentasyonun etkileri, fareleri hifa veya maya formuna sabitlenmiş C. albicans suşları ile kolonize etmek için bu model kullanılarak araştırılabilir.

İçeren mevcut fare modelleri C. albicans intravajinal inokülasyonlar öncelikli olarak vulvovajinal kandidiyazise (VVK) odaklanmıştır25 ve semptomatik enfeksiyonla ilişkili hiperenflamatuar durumun karakterize edilmesinde kullanılmıştır26Bu makalede açıklanan modelimiz, bir kolonizasyon durumunu daha yakından temsil etmektedir. Araştırma grubumuzun önceki çalışmaları, bu modelin kullanılmasıyla birlikte, şunlarla gerçekleşen ko-kolonizasyonun... C. albicans pro-enflamatuar sitokinler IL-6, CXCL1, CXCL2 ve TNF'nin bolluğunu azaltırα yalnızca GBS ile kolonizasyona kıyasla ve birlikte kolonize edilmiş farelerdeki bu protein seviyelerinin, naif hayvanlardakilerle benzer olduğu22Bu durum, vajinal lümende fungal filamentasyon olmasına rağmen, VVC'nin karakteristik özelliği olan hiperenflamatuar ortamın gözlemlenmediğini göstermektedir. Outbred CD-1 farelerinin, muhtemelen fungal büyümenin yeterli immün aracılı kontrolü nedeniyle, VVC'ye karşı dirençli oldukları bildirilmiştir.27Ayrıca, CD-1 fareleri, intravajinal GBS inokülasyonu üzerine, yaklaşık bir hafta içinde bakteriyel popülasyonu kontrol altına almaya yetecek düzeyde güçlü bir immün sinyalizasyon başlatır; ancak ... yokluğunda C. albicans28,29,30, daha önce diğer fare suşlarında GBS vajinal kolonizasyonunu araştırmış olmamıza rağmen12Bu makalede açıklanan model, her ikisinin de geçici doğasını yansıtmaktadır C. albicans ve insanlarda gözlemlenen GBS kolonizasyonu. Ek olarak, pH ve mikrobiyom kompozisyonu açısından insanlar arasında yüksek değişkenlik vardır. Bu model, nötre yakın pH koşullarına (~6,5) sahiptir31CD-1 vajinal mikrobiyotasında baskın olan türler şunlardır: Enterobacteriaceae ve Proteus türler13ve bunlar, GBS ile aynı vajinal mikrobiyal topluluk durum tipleriyle ilişkilidir9,32.

Farelerin fungal inokülasyon öncesinde antibiyotiklerle ve tek doz 17β-estradiol ile tedavi edilmesiyle, ortamı C. albicans için almaya hazır hale getirerek kolonizasyonu kolaylaştırıyoruz. Estradiol tedavisi, inokülasyon anında östrus evresini ve dolayısıyla lokal immün ortamı senkronize ederek deneyler arası tekrarlanabilirliği ayrıca artırmaktadır. Fareleri, nötrofil bolluğunun azaldığı ve FGT'de fungal yükü artırdığı gösterilmiş olan proöstrus evresinde C. albicans inokülasyonu yapacak şekilde senkronize ediyoruz33,34. Deneysel zaman çizelgesinin başında antibiyotiklerin kaldırılıp yerine taze içme suyu konulması, yalnızca GBS kolonizasyonunu kolaylaştırmakla kalmaz, aynı zamanda yerli mikropların vajinal kanalı yeniden doldurmasına da olanak tanır. Ayrıca, estradiol tedavisini erken dönemde tek bir dozla sınırlamak, sürekli estradiol uygulamasının kolonizasyonu artırdığı gösterilmiş olsa da12, farelerin tipik östrus döngüsü dinamiklerine geri dönmelerini sağlar. Fare FGT'sindeki immün hücre kompozisyonu östrus döngüsü boyunca değişiklik gösterir ve mukozal immün yanıtlar seks steroid hormonlarına karşı oldukça duyarlıdır35,36,37. Böylece, mikrobiyal kolonizasyonun konak ortam üzerindeki etkilerini spesifik olarak incelemek için tekrarlanan estradiol uygulamasının kafa karıştırıcı değişkeninden kaçınmış oluyoruz.

Bu çalışmada sunulan veriler C. albicans SC5314 suşunu ve GBS COH1 suşunu temsil etmektedir. Mikoloji alanında sıkça kullanılması, bu arka plan için mevcut genetik araçların bolluğu ve in vitro ile in vivo biyolojisi ve dinamiği hakkındaki yerleşik bilgi birikimi nedeniyle modeli kurmak için SC5314'ü seçtik. Araştırma grubumuz ayrıca C. albicans 529L suşunun FGT'deki GBS yükünü artırabildiğini göstermiştir22. GBS COH1 suşu, antimikrobiyal direnç ve neonatal invaziv hastalıklarla ilişkili olan serotip III sekans tipi 17 soyunun bir temsilcisi olarak kullanılmıştır1,2. Bu model, vajinal lavaj ve dokulardaki GBS ve C. albicans bolluğunu belirlemek için selektif ve diferansiyel besiyerleri kullanır. Bu modelin diğer bakteriyel ve fungal türlerle kullanımı için uygun selektif büyüme koşullarının optimize edilmesi gerekecektir.

Fungus-bakteri etkileşimleri, mikrobiyal yaşam tarzlarının önemli düzenleyicileri olarak ortaya çıkmaktadır38,39. Çeşitli çalışmalar, bu etkileşimlerin kommensalizmi ve virülans potansiyelini önemli ölçüde şekillendirebileceğini göstermiştir. Ek olarak, konak ortamı benzersiz baskılar uygular ve metabolik programlama, transkripsiyon faktörü regulonları ve antimikrobiyal direnç profilleri gibi faktörleri etkileyebilir. Bu nedenle, mikropların birbirleriyle nasıl etkileşime girdiğini karakterize etmek için temsilci in vivo modeller kullanmak esastır. Bu makalede açıklanan fare modeli, ilgilenilen bakteri ve fungusların vajinal kolonizasyonunun mikrobiyal yükleri, gen ifadesini ve konak yanıtını nasıl etkileyebileceğini incelemek için kullanılabilir.

Açıklamalar

Yazarların bildirecekleri herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

Tesis yöneticisi ve özverili vivaryum personeli dahil olmak üzere, Colorado Üniversitesi Anschutz bünyesindeki Laboratuvar Hayvan Kaynakları Ofisi'ne teşekkür ederiz. Bu çalışma, K.S.D.'ye verilen NIH R01AI153332 ve R21AI188719 numaralı hibeler tarafından desteklenmektedir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
0.22 µm filtreSigma-AldrichSLGSR33SB
0.45 µm filtreSigma-AldrichSLHAR33SB
1 mL luer lock şırıngaMcKesson16-S1C
1.0 mm zirkonya boncuklarResearch Products International9835
10 mL luer lock şırıngaMcKesson16-S10C
17β-estradiolSigma-AldrichE8875DİKKAT: 17β-estradiol cilt ve mukoza yüzeylerinden emilebilir. Uygun kişisel koruyucu donanım (KKD) kullanın ve kullanım sırasında dikkatli olun.
18G 1.5" iğneBD305196
2 mL vidalı kapaklı tüpFisher Scientific02-681-374
26G 0.5" iğneMcKesson16-N2605
AgarAlpha BiosciencesA01-102
AmpisilinResearch Products InternationalA40040
CHROMagar CandidaCHROMagarCA222
CHROMagar StrepBCHROMagarSB282
GentamisinVWR Life Science0304
NeomisinResearch Products InternationalN20040
Fosfat tamponlu salinFisher ScientificBP2944
Susam yağıSigma-AldrichS3547
Todd Hewitt BrothResearch Products InternationalT47500
Yeast Peptone Dextrose BrothBD242810

Kaynaklar

  1. Megli CJ et al. Virulence and pathogenicity of group B Streptococcus.: virulence factors and their roles in perinatal infection. Virulence. 2025;16(1):2451173.
  2. Manuel G et al. Group B streptococcal infections in pregnancy and early life. Clin Microbiol Rev. 2025;38(1):e00154-22.
  3. Verani JR, McGee L, Schrag SJ. Prevention of perinatal group B streptococcal disease: revised guidelines from CDC, 2010. MMWR Recomm Rep. 2010;59(RR-10):1-36.
  4. Prevention of group B streptococcal early-onset disease in newborns: ACOG Committee Opinion Summary, Number 797. Obstet Gynecol. 2020;135(2):489-92.
  5. Hsu CY et al. Global patterns of antibiotic resistance in group B Streptococcu.s: a systematic review and meta-analysis. Front Microbiol. 2025;16:1541524.
  6. Sabroske EM et al. Evolving antibiotic resistance in group B Streptococci. causing invasive infant disease: 1970-2021. Pediatr Res. 2023;93(6):2067-71.
  7. Azad MB et al. Impact of maternal intrapartum antibiotics, method of birth and breastfeeding on gut microbiota during the first year of life: a prospective cohort study. BJOG. 2016;123(6):983-93.
  8. Duong QA, Curtis N, Zimmermann P. The association between prenatal antibiotic exposure and adverse long-term health outcomes in children: a systematic review and meta-analysis. J Infect. 2025;90(1):106377.
  9. Mejia ME, Robertson CM, Patras KA. Interspecies interactions within the host: the social network of group B Streptococcus. Infect Immun. 2023;91(4):e00440-22.
  10. De Gregorio PR, Juárez Tomás MS, Leccese Terraf MC, Nader-Macías MEF. Preventive effect of Lactobacillus reuteri .CRL1324 on group B Streptococcus vaginal colonization in an experimental mouse model. J Appl Microbiol. 2015;118(4):1034-47.
  11. Shiroda M, Aronoff DM, Gaddy JA, Manning SD. The impact of Lactobacillus. on group B streptococcal interactions with cells of the extraplacental membranes. Microb Pathog. 2020;148:104463.
  12. Patras KA, Doran KS. A murine model of group B Streptococcus .vaginal colonization. J Vis Exp. 2016;(117):e54708.
  13. Burcham LR et al. Interrelated effects of zinc deficiency and the microbiome on group B streptococcal vaginal colonization. mSphere. 2022;7(4):e00264-22.
  14. Marroquin SM, Cohen S, Neely MN, Doran KS. Akkermansia muciniphila impacts group B Streptococcus. vaginal colonization. mBio. 2026;17(6):e02868-25.
  15. Job AM, Doran KS, Spencer BL. A group B streptococcal type VII-secreted LXG toxin mediates interbacterial competition and colonization of the murine female genital tract. mBio. 2024;15(10):e02088-24.
  16. Beigi RH et al. Vaginal yeast colonization in nonpregnant women: a longitudinal study. Obstet Gynecol. 2004;104(5 Pt 1):926-30.
  17. Noble SM, Gianetti BA, Witchley JN. Candida albicans cell-type switching and functional plasticity in the mammalian host. Nat Rev Microbiol. 2017;15(2):96-108.
  18. Schille TB et al. Commensalism and pathogenesis of Candida albicans .at the mucosal interface. Nat Rev Microbiol. 2025;23(8):525-40.
  19. Liang SH et al. The hyphal-specific toxin candidalysin promotes fungal gut commensalism. Nature. 2024;627(8004):620-7.
  20. Fróis-Martins R et al. Dynamic expression of candidalysin facilitates oral colonization of Candida albicans. in mice. Nat Microbiol. 2025;10(10):2472-85.
  21. Mauk KE et al. Commensal colonization of Candida albicans. in the mouse gastrointestinal tract is mediated via expression of candidalysin and adhesins. Microbiol Spectr. 2025;13(9):e00567-25.
  22. Cohen S et al. A fungal pathobiont promotes Streptococcus .vaginal persistence and pathogenesis through physical and metabolic interactions. Cell Host Microbe. 2026;34(6):1118-34.e7.
  23. Koh AY. Murine models of Candida .gastrointestinal colonization and dissemination. Eukaryot Cell. 2013;12(11):1416-22.
  24. Allison DL et al. Candida.-bacteria interactions: their impact on human disease. Microbiol Spectr. 2016;4(3):VMBF-0030-2016.
  25. Yano J, Fidel PL Jr. Protocols for vaginal inoculation and sample collection in the experimental mouse model of Candida .vaginitis. J Vis Exp. 2011;(58):e3382.
  26. Ardizzoni A, Wheeler RT, Pericolini E. It takes two to tango: how a dysregulation of the innate immunity, coupled with Candida. virulence, triggers VVC onset. Front Microbiol. 2021;12:692491.
  27. Yano J, Noverr MC, Fidel PL Jr. Vaginal heparan sulfate linked to neutrophil dysfunction in the acute inflammatory response associated with experimental vulvovaginal candidiasis. mBio. 2017;8(2):e00211-17.
  28. Patras KA et al. Group B Streptococcus. CovR regulation modulates host immune signaling pathways to promote vaginal colonization. Cell Microbiol. 2013;15(7):1154-67.
  29. Patras KA, Rösler B, Thoman ML, Doran KS. Characterization of host immunity during persistent vaginal colonization by group B Streptococcus. Mucosal Immunol. 2015;8(6):1339-48.
  30. Spencer BL et al. Characterization of the cellular immune response to group B streptococcal vaginal colonization. J Innate Immun. 2025;17(1):566-78.
  31. Miao J, Willems HME, Peters BM. Exogenous reproductive hormones nor Candida albicans. colonization alter the near neutral mouse vaginal pH. Infect Immun. 2021;89(2):e00550-20.
  32. Rosen GH et al. Group B Streptococcus. and the vaginal microbiota. J Infect Dis. 2017;216(6):744-51.
  33. Latorre MC et al. Vaginal neutrophil infiltration is contingent on ovarian cycle phase and independent of pathogen infection. Front Immunol. 2022;13:1031941.
  34. Gómez-Oro C et al. Progesterone promotes CXCL2-dependent vaginal neutrophil killing by activating cervical resident macrophage-neutrophil crosstalk. JCI Insight. 2024;9(20):e177899.
  35. Winkler I et al. The cycling and aging mouse female reproductive tract at single-cell resolution. Cell. 2024;187(4):981-998.e25.
  36. Seavey MM, Mosmann TR. Estradiol-induced vaginal mucus inhibits antigen penetration and CD8+ T cell priming in response to intravaginal immunization. Vaccine. 2009;27(17):2342-9.
  37. Li S et al. Estrogen action in the epithelial cells of the mouse vagina regulates neutrophil infiltration and vaginal tissue integrity. Sci Rep. 2018;8(1):11247.
  38. Cohen S, Ost KS, Doran KS. Impact of interkingdom microbial interactions in the vaginal tract. PLoS Pathog. 2024;20(3):e1012018.
  39. MacAlpine J, Robbins N, Cowen LE. Bacterial-fungal interactions and their impact on microbial pathogenesis. Mol Ecol. 2023;32(10):2565-81.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Grup B StreptococcusDi i Genital YolAlemler Aras Etkile imlerAntibiyotik TedavisiMikrobiyal Y k KantifikasyonuKonak mm n Yan t
Video yakında
Bize ulaşın
Kütüphaneye tavsiye et

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Telif hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.