Candida albicans ve Streptococcus agalactiae Vajinal Birlikte Kolonizasyon Fare Modeli

Özet

Bu protokol, farelerin vajinal bölgesinin Candida albicans ve Streptococcus agalactiae ile birlikte kolonize edilmesi yöntemini ayrıntılarıyla açıklamaktadır. Bu yöntem; polimikrobiyal etkileşimleri, konakçı-mikrop etkileşimlerini ve konakçının bu organizmalara verdiği tepkileri incelemek için kullanılabilir.

Özet

İnsan vajinal kanalından çeşitli mikroplar izole edilmektedir ve bu nişi mesken tutan organizmaların çoğu kommensal ve patojenik yaşam tarzları arasında geçiş yapabilmektedir. Topluluk kompozisyonu ve konak ortamı dahil olmak üzere çeşitli faktörler hastalık sonuçlarını etkiler; ancak bu sonuçları belirleyen mekanizmalar tam olarak anlaşılamamıştır. Bu makalede, kadın genital kanalını (FGT) kolonize eden patobiyontlar olan Candida albicans ve Streptococcus agalactiae (Grup B Streptococcus, GBS) ile gerçekleşen krallıklar arası etkileşimleri ve konak yanıtını araştırmak için bir fare modelini tanımlıyoruz. Ortaya çıkan kanıtlar, sıkça birlikte izole edilmeleri nedeniyle C. albicans kolonizasyonunun GBS taşıyıcılığı için bir risk faktörü olduğunu göstermektedir. Gebelik sırasında GBS kolonizasyonu, koryoamniyinit ve ölü doğum dahil olmak üzere olumsuz sonuçlara yol açabilir . GBS ayrıca in utero olarak fetüse veya doğum sırasında bir neonata bulaşabilir ve neonatal menenjitin önde gelen nedenlerinden biridir. Vajinal kanalın kolonizasyonu, GBS hastalığının kritik bir öncülüdür ve bu niş, bazıları C. albicans kolonizasyonundan etkilenebilen çok sayıda seçici baskı uygular. Bu protokol, C. albicans kolonizasyonunu kurmak için antibiyotik tedavisi ve tek doz 17β-estradiol kullanımını, ardından antibiyotiklerin kaldırılmasını ve GBS ile inokülasyonu içeren eş zamanlı C. albicans-GBS vajinal ko-kolonizasyon modelini tanımlamaktadır. Vajinal lümendeki mikrobiyal yükler, deney süresince lavaj yoluyla nicelendirilir ve FGT genelindeki yükler; vajina, serviks ve uterusun diseksiyonu, homojenizasyonu ve ekimiyle belirlenir. Bu yöntem, doğrudan ve dolaylı polimikrobiyal etkileşimlerin bu iki organizmanın yaşam tarzlarını ve patogenezini etkileme mekanizmalarının yanı sıra FGT'deki konak bağışıklık ortamının araştırılmasına olanak sağlayacaktır.

Giriş

Streptococcus agalactiae (Grup B Streptococcus, GBS), gastrointestinal ve vajinal kanallar dahil olmak üzere birden fazla polimikrobiyal bölgeyi kolonize eden Gram-pozitif bakteriyel bir patobiyonttur. Vajinal kolonizasyon genellikle asemptomatik seyretse de, hamilelik sırasında GBS vajinal kanaldan uterusa çıkabilir ve sağlam membranları geçerek amniyotik sıvının ve plasentanın enfeksiyonuna neden olabilir. Bu nedenle, olumsuz gebelik sonuçları, fetal enfeksiyon ve neonatal hastalıklar için birincil bir risk faktörüdür^1,2. Yenidoğanlarda invaziv enfeksiyonların önde gelen nedenlerinden biri olması sebebiyle, transmisyon ve enfeksiyon riskini etkileyen faktörlerin karakterize edilmesi kritik önem taşır. Doğum sırasındaki antibiyotik profilaksisi, dikey transmisyonu ve yenidoğanlardaki erken başlangıçlı GBS hastalığını azaltabilir^3,4; ancak bu uygulama, artan antibiyotik direnci oranları ve prenatal veya erken yaşamdaki antibiyotik yönetimiyle ilgili potansiyel uzun vadeli etkilerle ilişkilendirilmiştir^5,6,7,8. Bu faktörler, daha hedefe yönelik önleyici ve terapötik müdahalelerin geliştirilmesini gerekli kılmaktadır.

Yeni kanıtlar, mikrobiyom kompozisyonunun ve polimikrobiyal etkileşimlerin homeostazı ve hastalık olasılığını etkilediğini göstermiştir⁹. İnsan vajinal mikrobiyomunda GBS baskınlığı, Lactobacillus bolluğunda bir azalma ile ilişkilendirilmiş ve kolonizasyon üzerinde in vitro ve in vivo olarak farklı etkiler yaratabilen tür ve suşa özgü etkileşimler gözlemlenmiştir ^10,11. Daha önce araştırma grubumuz, GBS fitness'ının konakçı ve bakteriyel korelasyonlarını incelemek için bir GBS vajinal kolonizasyon fare modeli geliştirmiştir¹². Bu süreç, farelerin tek doz 17β-östradiol ile tedavi edilmesini ve takip eden günde intravajinal GBS inokülasyonu yapılmasını içerir. Bu model; GBS yüzey proteinlerinin, düzenleyici sinyal ağlarının ve toksin salgılanmasının kolonizasyonun sürdürülmesindeki ve FGT dokularının istilasındaki önemini karakterize etmek için kullanılmıştır. Ayrıca, GBS'nin Akkermansia muciniphila ve Enterococcus faecalis dahil olmak üzere vajinal kanaldaki diğer bakterilerle karmaşık etkileşimler sergilediğini saptayarak^13,14,15, GBS yaşam tarzının ve kalıcılığının komşu mikropların varlığından nasıl etkilendiğini ortaya koymuş bulunmaktayız.

Mevcut model bakteriler arası etkileşimleri incelemek için uyarlanmış olsa da, diğer mikropların çalışılması için ek modifikasyonlar gerekmiştir. Mantarlar, vajinal mikrobiyomun yeterince incelenmemiş bir bileşenidir ve burada sunulan model ile mantar kolonizasyonunu ve mantar-bakteri etkileşimlerini in vivo inceleyecek bir araç geliştirmeyi hedefledik. İnsan vajinal kanalından en sık izole edilen mantar, bireylerin %70'inden fazlasını kolonize eden Candida albicans'tır¹⁶. C. albicans polimorfiktir ve tomurcuklanan maya ile filamentöz morfotipler arasında geçiş yapmak için morfojenize olabilir. Filamentasyon, belirgin bir gen ekspresyon repertuarı ile ilişkilidir^17,18. Bu hif spesifik genlerin bazılarının, polimikrobiyal kolonizasyon bağlamında bir uygunluk avantajı sağladığı yakın zamanda rapor edilmiştir^19,20,21.

Çeşitli çalışmalar, ...'nın birlikte izole edildiğini bildirmiştir C. albicans ve insan vajinal sürüntülerinde GBS; araştırma grubumuz yakın zamanda C. albicans ile kolonize olmuş bireylerde GBS taşıyıcılık oranlarının anlamlı derecede daha yüksek olduğunu bulmuştur²²Geliştirmiş olduğumuz bir in vivo kommensal funguslar, bakteriler ve konakçı arasındaki üçlü etkileşimleri incelemek için bir sistem. Konvansiyonel farelerdeki fungal çalışmalar, bakterilerin aracılık ettiği kolonizasyon direncini aşmak ve kalıcı kolonizasyon sağlamak için tipik olarak antibiyotik tedavisi gerektirir²³GBS'nin kolonize olma yeteneğini bozmadan bunu başarmak için, fareleri bir antibiyotik kokteyli ile tedavi ediyoruz ve ardından onlara ... ile inokülasyon yapıyoruz. C. albicansve kolonizasyon gerçekleştikten sonra, GBS'nin sonrasında kolonize olmasına izin vermek için antibiyotik maruziyetini kaldırıyoruz. Bu işlem, her ikisinin de... şeklinde optimize edilmiştir C. albicans ve GBS vajinal yolu benzer yüklerde ve benzer zaman çizelgelerinde kolonize eder; bu da vajinal yol içinde doğrudan etkileşimlerin gerçekleşmesine olanak tanır. Bu protokol, farelerin antibiyotiklerle ön işlemden geçirilmesi ve 17'nin iletilmesi için bir yöntemi açıklamaktadırβ-estradiol, hem fungus hem de bakteri ile kolonizasyon oluşturun ve sonraki analizler için lavaj ve doku örnekleri toplayın.

Protokol

Bu makalede sunulan hayvan çalışmaları, Colorado Üniversitesi Anschutz'un Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmış ve #00316 sayılı protokol uyarınca gerçekleştirilmiştir. Aşağıdaki zaman çizelgesinde, 0. gün S. agalactiae inokülasyonu yapılan günü ifade etmektedir.

1. İnokülasyondan önce antibiyotikleri uygulayın.

1. Fare içme suyunda çözünmüş, her biri 50 mg/mL konsantrasyonda olan ampisilin, neomisin ve gentamisin içeren konsantre bir çözelti hazırlayın. Antibiyotik çözeltisini sterilize etmek için 0,22 µm filtre kullanın.
2. Her 99 g suya 1 mL çözelti ekleyerek, antibiyotik çözeltisini fare içme suyuna 1:100 oranında seyreltin.
3. 7 gün sonra, 1.1 ve 1.2 numaralı adımları tekrarlayarak suyu yenileyin.
4. Deneye başlamadan önce antibiyotik uygulamasını en az 7–10 gün boyunca sürdürün, ancak toplam antibiyotik tedavi süresinin 14 günü aşmadığından emin olun.

2. Fare östrus döngülerini senkronize edin (gün -3).

1. Fare başına 0,5 mg 17β-estradiol ve süspansiyonun tüp duvarlarına yapışmasını hesaba katmak için küçük bir fazlalığı steril 50 mL'lik konik bir tüpe ekleyin. Konik tüpün kapağını sıkıca kapatın ve topakları dağıtmak için kısa süreli vorteksleyin.
   DİKKAT: 17β-estradiol dermal veya mukoza yoluyla vücuda girebileceği için, bu reajeni dikkatli bir şekilde taşıyın ve uygun kişisel koruyucu ekipman kullanın.
2. 0,45 µm'lik bir filtre kullanarak, her 0,5 mg 17β-estradiol için 100 µL susam yağını doğrudan 17β-estradiol içeren konik tüpe sterilize ederek ekleyin. Konsantrasyon 5 mg/mL'dir. Homojen bir süspansiyon oluşturmak için çözeltinin kapağını sıkıca kapatın ve iyice vorteksleyin.
3. Pistonu 0,15 mL işaretine kadar çekerek ve piston aşağıya, luer lock ucu yukarıya bakacak şekilde destekleyerek steril 1 mL'lik şırıngaları (her fare için bir adet) hazırlayın.
4. 17β-estradiol süspansiyonunu, steril 18G 1,5” iğne ile yeni bir steril 10 mL'lik şırıngaya çekin ve bunu hazırlanan 1 mL'lik şırıngaları 100 µL süspansiyon ile doldurmak için kullanın.
5. Her bir 1 mL'lik şırınganın ucuna steril 26G 0,5” iğne takın.
6. 0,5 mg 17β-estradiol içeren 100 µL susam yağı süspansiyonu hazırlayın ve C. albicans inokülasyonundan bir gün önce her bir fareye intraperitoneal enjeksiyon yoluyla bir doz uygulayın.

3. Farelere C. albicans inokülasyonu yapın (gün -2).

1. İnokülasyondan bir gün önce (17β-estradiol uygulamasının yapıldığı gün), 30 °C'lik bir inkübatörde 250 rpm hızla çalkalayarak Yeast Peptone Dextrose Broth içerisinde 5 mL'lik bir gece boyu C. albicans kültürü büyütün.
2. İnokülasyon gününde, gece boyu büyütülen kültürden bir alikotu steril bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve 7–8 saniye boyunca veya bir pelet oluşana kadar ≤10,000 × g hızında santrifüjleyin.
3. Süpernatantı uzaklaştırın ve peleti steril fosfat tamponlu salyende (PBS) yeniden süspande edin.
4. Süspansiyonun konsantrasyonunu hesaplamak için bir hemositometre kullanın.
5. Süspansiyondan bir alikotu yeni bir steril mikrosantrifüj tüpüne aktarın, yeniden peletleyin ve fare başına en az 10 µL nihai hacimde, 10⁹ C. albicans hücre/mL nihai konsantrasyona ulaşacak şekilde taze steril PBS içinde süspande edin. Örneğin, konsantrasyon 2 × 10⁸ hücre/mL ise ve 10 fare varsa, 500 µL'yi peletleyin ve 100 µL içinde yeniden süspande edin.
6. Her bir fareye intravajinal olarak, PBS içinde 10⁹ hücre/mL konsantrasyonda süspande edilmiş 10 µL C. albicans (10⁷ hücre/fare) inoküle edin.
   1. Baskın olmayan elin baş ve işaret parmağıyla boyun derisini kavrayıp bileği, farenin sırtı avuç içine gelecek şekilde döndürerek her bir fareyi sabitleyin. Kuyruğu hareketsiz hale getirmek için yüzük ve serçe parmaklarını kullanın.
   2. Steril bir pipet ucuna 10 µL C. albicans süspansiyonu çekin. Ucun derinliğini farenin anatomisine göre ayarlayarak, uç yaklaşık 5–10 mm boyunca vajinal lümene yerleştirin.
   3. C. albicans inokulumunu vajinaya boşaltın ve pipet ucunu geri çekin.
   4. Boyun bölgesini bıraktıktan sonra, arka kısmı yükseltmek için fareyi kuyruğundan tutun. Fareyi yaklaşık 1 dakika boyunca veya C. albicans inokulumu artık görünmeyene kadar iki ön patisi üzerinde yürütün.

4. İçme suyunu değiştirin (gün -1).

1. C. albicans inokülasyonundan bir gün sonra, bu süre S. agalactiae inokülasyonundan önceki güne denk gelecek şekilde, fareleri temiz kafeslere taşıyın.
2. Farelere antibiyotiksiz taze su sağlandığından emin olun.

5. Vajinal lümendeki C. albicans yükünü nicelendirin (gün -1).

1. -1. günde, fare başına bir steril mikrosantrifüj tüpü ve 100 µL steril PBS hazırlayın.
2. Her bir fareyi adım 3.6.1'de açıklandığı şekilde sabitleyin.
3. Steril bir pipet ucuna 50 µL PBS çekin. Pipet ucunu vajinal lümene yaklaşık 1–5 mm derinliğinde yerleştirin ve PBS'nin tamamını 3–5 kez yukarı aşağı çekerek pipetleyin. PBS'yi steril bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
4. Toplam 100 µL lavaj sıvısı elde etmek için adım 5.3'ü tekrarlayın.
5. Mikrosantrifüj tüpünü vorteksleyin, ardından steril PBS içinde 1:10.000'lik bir seyreltme ile 10 katlı seri dilüsyonlar gerçekleştirin.
6. Seyreltilmiş süspansiyonlardan 10 µL ve seyreltilmemiş lavaj sıvısından 25 µL'yi Candida seçici kromojenik agar plaklarına ekin.
7. Plakları 30 °C'de 48 saat inkübe edin. C. albicans kolonileri düzgün görünümlü, turkuaz veya yeşil renkte görünecektir.

6. Farelere S. agalactiae inokülasyonu yapın (gün 0).

1. İnokülasyondan bir gün önce (içme suyu değişiminin yapıldığı gün), şunların 3 mL'lik gece boyu kültürü hazırlanır: S. agalactiae statik 37 °C'de Todd Hewitt Broth (THB) içerisinde °C inkübatörü.
2. İnokülasyon gününde, gece boyu kültürü 4 mL THB içerisinde 1:10 oranında seyreltin ve statik koşullarda 37°C'de inkübe edin. °orta log fazına ulaşana kadar (600 nm'de optik yoğunluk [OD₆₀₀(0,4–0,5 aralığında) yaklaşık 1,5–2 saatte.
3. Mid-log kültürünü steril 15 mL'lik konik bir tüpe aktarın ve 3.000 g'de santrifüjleyin. × g 5 dakika boyunca veya bir pelet oluşana kadar.
4. Süpernatantı aspirasyon yoluyla uzaklaştırın, ardından peleti 300 µL içerisinde süspande edin. µL steril PBS.
5. En az 100 adet hazırlamak için resüspande edilmiş peleti kullanın µL'nin S. agalactiae fare başına süspansiyon ve ek olarak 500 µSteril PBS içinde OD değerinde L₆₀₀ 0,4 (yaklaşık 10⁸ koloni oluşturan birim [KOB]/mL; (10 fare için toplam ≥1,5 mL).
   NOT: Bazı S. agalactiae suşlar OD değerleri bakımından farklılık gösterebilir₆₀₀-CFU/mL oranı. Hangi OD'nin₆₀₀ 10'a karşılık gelir⁸ önceden belirlenmiş CFU/mL.
6. Süspansiyonu yeni, steril bir 15 mL konik tüpe aktarın ve 3.000'de santrifüjleyin × g 5 dakika boyunca veya bir pelet oluşana kadar.
7. Süpernatantı aspire edin ve peleti 1/10 hacmindeki çözeltide yeniden süspande edin.^th steril PBS'nin başlangıç hacminin (eğer süspansiyonun 1,5 mL'si pelitlemişse, 150 µL içinde yeniden süspande edin) µL). Bu süspansiyon 10 konsantrasyonunda olacaktır⁹ CFU/mL ve bakteriyel inokülüm olarak hizmet eder.
8. Seri dilüsyon yapın ve 50 µL örneği ekim yapın µTodd Hewitt Agar üzerine inokülumdan L kadar ekleyin, ardından plakaları 37°C'de inkübe edin °Kesin inokülum konsantrasyonunu belirlemek için 24 saat boyunca C'de tutun.
9. Her bir fareye intravajinal olarak 10 µL inoküle edin µL kadar S. agalactiae 10'luk PBS içinde süspande edilmiş⁹ CFU/mL (10⁷ (fare başına CFU), 3.6.1–3.6.4. adımlarda kullanılan tekniğin aynısı kullanılarak.

7. Vajinal lümende C. albicans ve S. agalactiae yüklerini nicelendirin (+1. gün başlangıcı).

1. S. agalactiae inokulasyonundan bir gün sonra başlayarak, 100 µL vajinal lavaj sıvısı toplayın ve 5.1–5.5 arasındaki adımlarda kullanılan tekniğin aynısını kullanarak seriyel dilüsyon yapın.
2. Dilüe edilmiş süspansiyonlardan 10 µL ve dilüe edilmemiş lavaj sıvısından 25 µL'yi, hem Candida-selektif hem de StrepB-selektif kromojenik agar plaklarına çift paralel olarak ekin.
3. Candida plaklarını 30 °C'de 48 saat boyunca inkübe edin. C. albicans kolonileri pürüzsüz, turkuaz veya yeşil renkte görünecektir.
4. StrepB plaklarını 37 °C'de 24 saat boyunca inkübe edin. S. agalactiae kolonileri pürüzsüz, pembe veya eflatun renkte görünecektir.
5. Vajinal lümendeki mikrobiyal yükü izlemek için 7.1–7.4 arasındaki adımları günlük olarak veya uygun bir zaman aralığında tekrarlayın.

8. Dişi genital kanal dokularındaki C. albicans ve S. agalactiae yüklerini belirleyin (deney son noktası).

1. Dokuları (vajina, serviks ve uterus) toplamak için, her fare başına yaklaşık 0,4–0,5 g 1 mm zirkonya boncuk ve 500 µL steril PBS ile doldurulmuş üç adet 2 mL vidalı kapaklı tüp hazırlayın. Ayrıca, lavaj örneği toplamak için fare başına bir adet steril mikrosantrifüj tüpü ve 100 µL steril PBS hazırlayın. Doku ağırlıklarını hesaplarken referans olarak kullanmak üzere her bir vidalı kapaklı tüpün ağırlığını kaydedin.
2. Fareyi, CO₂ asfiksisi ve servikal dislokasyon gibi kurum tarafından onaylanmış bir yöntemle itlaf edin. Makas ve pensleri sterilize etmek için %70 etanol kullanın.
3. Farenin arka ucunu kuyruğundan kaldırın ve 5.3–5.4 adımındaki tekniği kullanarak vajinal lavaj toplayın.
4. Farenin abdomenini %70 etanol ile spreyleyin ve abdominal kaviteyi açmak için sterilize edilmiş makasları kullanın. Genital kanal dokularını açığa çıkarmak için pens yardımıyla deriyi geriye çekin ve gastrointestinal sistemi kenara kaydırın.
5. Mesanenin yanı sıra uterusu kapatan visseral yağları ve membranları çıkarmak için sterilize edilmiş makasları kullanın. Uterus gövdesi ile her bir ovaryum arasından keserek uterus kornularını ovaryumlardan ayırın.
6. Sterilize edilmiş pensler kullanarak, vajinal kanalı serviksin alt noktasından kavrayın. Tüm vajinal kanal görünür olana kadar kaldırın ve deri dokusuna temas etmemeye dikkat ederek, vulvaya mümkün olduğunca yakın bir noktadan sterilize edilmiş makaslarla transvers bir kesi yapın. Tüm genital kanalı çıkarın ve steril bir 10 cm Petri kabına yerleştirin.
7. Vajina, serviks ve uterusu ayırmak için steril bir jiletle serviksin altına ve üstüne iki transvers kesi yapın. Her bir dokuyu, üzerinden ek 2–5 sagital ve transvers kesi yaparak ince parçalara ayırın. Her bir dokuyu kendisi için hazırlanmış ilgili vidalı kapaklı tüpe yerleştirin.
8. Her bir vidalı kapaklı tüpü tartın ve 8.1 adımındaki değeri çıkararak her bir dokunun ağırlığını hesaplayın. Her tüpün kapağını sıkıca kapatın, 3.450 rpm'de 1 dakika boyunca boncukla parçalayın (bead-beat), tüpleri 1 dakika boyunca buz üzerinde bekletin ve ardından 3.450 rpm'de tekrar 1 dakika boyunca boncukla parçalayın.
9. Her bir doku homojenatını ve lavaj örneğini 5.5–5.6 adımlarında açıklanan yöntemi kullanarak seri dilüsyonla ekim yapın. Plakaları 7.3–7.4 adımlarında açıklandığı şekilde inkübe edin.

Sonuçlar

GBS ve C. albicans vajinal kolonizasyonunu karakterize etmek için, farelere intravajinal olarak C. albicans suşu SC5314 veya PBS araç kontrolü enjekte edilmiş, ardından GBS suşu COH1 enjekte edilmiştir. Bu suş, yenidoğan invaziv hastalığı ve menenjit ile en sık ilişkilendirilen hipervirülent kapsüler serotip III, sekans tipi 17 izolatlarını temsil etmektedir¹. İnokülasyondan bir gün sonra GBS ile kolonize olmayan fareler analiz dışı bırakılmıştır. Dört günlük bir deneysel süreç b...

Tartışma

GBS vajinal kolonizasyonu, maternal-fetal ve neonatal sağlık için kritik bir risk oluşturmaktadır. Kolonizasyonun belirleyicilerini anlamak ve önleyici terapötikler geliştirmek için In vivo modellerle çalışmak zorunludur. Bu makalede, fareleri vajinal olarak GBS ve C. albicans ile ortak kolonize etmek, vajinal lümen ve FGT'deki mikrobiyal yükleri değerlendirmek ve daha ileri analizler için ilgili dokuları toplamak amacıyla kullanılan bir fare modelini tanımlıyoruz. Bu model, polimikrobiyal vajinal kolon...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
0.22 µm filtre	Sigma-Aldrich	SLGSR33SB
0.45 µm filtre	Sigma-Aldrich	SLHAR33SB
1 mL luer lock şırınga	McKesson	16-S1C
1.0 mm zirkonya boncuklar	Research Products International	9835
10 mL luer lock şırınga	McKesson	16-S10C
17β-estradiol	Sigma-Aldrich	E8875	DİKKAT: 17β-estradiol cilt ve mukoza yüzeylerinden emilebilir. Uygun kişisel koruyucu donanım (KKD) kullanın ve kullanım sırasında dikkatli olun.
18G 1.5" iğne	BD	305196
2 mL vidalı kapaklı tüp	Fisher Scientific	02-681-374
26G 0.5" iğne	McKesson	16-N2605
Agar	Alpha Biosciences	A01-102
Ampisilin	Research Products International	A40040
CHROMagar Candida	CHROMagar	CA222
CHROMagar StrepB	CHROMagar	SB282
Gentamisin	VWR Life Science	0304
Neomisin	Research Products International	N20040
Fosfat tamponlu salin	Fisher Scientific	BP2944
Susam yağı	Sigma-Aldrich	S3547
Todd Hewitt Broth	Research Products International	T47500
Yeast Peptone Dextrose Broth	BD	242810