Proteazların Yönlendirilmiş Evrimi için Optimize Edilmiş Maya Yüzeyi Ekran İş Akışı

Medel B. Lim Suan Jr.; Zuhair Quadri; Soham R. Jorapur; P. C. Dave P. Dingal

doi:10.3791/72559

Yöntem makalesi

Proteazların Yönlendirilmiş Evrimi için Optimize Edilmiş Maya Yüzeyi Ekran İş Akışı

DOI:

10.3791/72559

⸱

4 Ağustos 2026

Medel B. Lim Suan Jr.¹ , Zuhair Quadri² , Soham R. Jorapur¹ , P. C. Dave P. Dingal¹^,²^,³

¹Department of Bioengineering, The University of Texas at Dallas, ²Department of Biological Sciences, The University of Texas at Dallas, ³Center for Systems Biology, The University of Texas at Dallas

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, yüzey tabanlı bir seçim sistemi kullanarak Saccharomyces cerevisiae'de viral proteazların yönlendirilmiş evrimi için optimize edilmiş bir iş akışı sağlar. DNA insert kütüphanesi ve substrat kaseti tasarımını, yüksek dönüşüm verimliliği için optimize edilmiş elektroporasyonu, proteaz parçalanması için floresansla aktifleşen hücre sıralama temelli seçimi ve zenginleştirilmiş varyantların dizilenmesini özetlemektedir.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yönlendirilmiş evrim, hızlı ve kontrollü bir laboratuvar ortamında doğal evrim sürecini taklit ederek istenen işlevlere veya özelliklere sahip proteinler evrimleştirir. Mutant protein kodlayan genlerin büyük bir havuzunun taraması, biyoteknoloji, tıp ve sentetik biyoloji alanlarında uygulamalar için istenen varyantların fonksiyonel seçimine olanak tanır. Bu protokolü kullanarak, Saccharomyces cerevisiae'de yöne yönelik evrim gerçekleştirerek doğal olmayan bir substrat dizisi için yüksek özgüllüğe sahip proteaz varyantları mühendislik yapıyoruz. Bu proteaz varyantlarını, floresans-aktive hücre sıralaması (FACS) ile istenen varyantların seçilmesini kolaylaştırmak için maya hücre yüzeyinde sergiliyoruz. Substrat kasetinin dört ana elemanı proteaz kütüphanesiyle birlikte eksprese edilir: (i) maya yapışma reseptörü alt birimi Aga2, (ii) seçim ve (iii) karşı seçim alt dizileri, (iv) epitop etiketi dizileri ve isteğe bağlı endoplazmik retikulum (ER) geri dönüş sinyal dizisi. Sadece seçili substrat dizisi bölünmüş maya hücreleri, floresan (phycoerythrin/fluorescein isothiosiyanate-etiketli) anti-epitop antikorları aracılığıyla çok renkli FACS kullanılarak izole edilir. Burada, DNA insert kütüphanesi tasarımı ve substrat kaset tasarımı, yüksek dönüşüm etkinliğine sahip maya hücresi elektroporasyonu (DNA mikrogramı başına 10⁹ dönüştürücüye kadar), FACS tabanlı seçim, zenginleştirme ve evrimleşmiş varyantların dizilenmesini içeren optimize edilmiş, adım adım protokolün detaylarını sunuyoruz. Yöne yönelik evrim protokolümüzü, tütün etch virüsü nükleer dahil edilme proteazını (TEVp) doğal substrat dizisi ENLYFQ↓S'den yeni bir dizisi ENLYFE↓S'ye doğru keserek evrimleştirerek gösteriyoruz.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Potyviridae ailesine ait sistein proteazlar, özellikle nükleer dahil etme A (NIa) proteazları, dizisine özgü endopeptidazların büyük ölçüde kullanılmamış bir kaynağını temsil eder. 3.800'den fazla karakterize edilmiş aile üyesi olan NIa proteazları, belirgin bir yedi amino-asit substrat dizisini ayırır. Potyviral ailesi, programlanabilir protein kontrol sistemleri mühendisliği, ortogonal proteaz tabanlı genetik devreler oluşturmak ve diziye özgü biyoteknolojik araçların geliştirilmesi için çeşitli proteaz^{setleri sunar} ^1,2. Bu doğal çeşitliliğe rağmen, yalnızca iki NIa proteazı, TEVp ve tütün damarı benekli virüsü proteazı (TVMVp), kapsamlı laboratuvar ve biyoteknolojik kullanım için kapsamlı şekilde karakterize edilmiş ve mühendislik^yapmıştır ^3,4. Bu sınırlı proteaz araç seti, ortogonal proteaz faaliyetleri gerektiren çok bileşenli devreler için tasarım^{alanını sınırlar 5}, böylece NIa proteazlarının yönlendirilmiş evrim yoluyla daha da genişletilmesi ve karakterize edilmesi için çabaları motive^eder ^6,7.

Maya yüzeyi ekranı, yönlendirilmiş evrim için en güçlü platformlardan biri olarak ortaya çıkmıştır ve floresansla aktive hücre ayırma (FACS) ile yüksek verimli protein kütüphanesi taramasını mümkün ^{kılarkâ sağlar.6,7}. Örneğin, maya endoplazmik retikulum sequestrasyon taraması (YESS) sistemi, S. cerevisiae ^6,7'nin sekresi yolu aracılığıyla proteaz aktivitesini yüzeye göstermek için bağlar. YESS sistemi, yeni proteaz-substrat özgüllükleri mühendisliği için uygulanmış ve çoklu turlu yönlendirilmiş evrim kampanyaları için faydalılığını göstermiştir. Bu sistemde, proteaz varyantları, epitop belirteçleriyle birlikte bir bölünme substrat kaseti içeren bir füzyon proteiniyle birlikte eksprese edilir ve Aga1p yüzey ankrajı EBY100 maya suşunda eksprese edilir. Floresan antikorlarla diferansiyel etiketleme, hücre yüzeyinde gösterilen bölünmüş ve ayrılmamış alt tabaka kasetlerini ayrım yapar. Bu faaliyete bağlı görüntüleme mekanizması, 10,⁷ veya daha fazla varyantlı kütüphaneler için yinelemeli FACS tabanlı^{seçimle doğrudan uyumludur} ^6,7.

Yönlendirilmiş evrimin temel önkoşullarından biri, hedeflenen dizi alanının yeterli kapsamını sağlamak için yeterli ölçekte varyant kütüphaneleri tanıtabilme yeteneğidir. Birden fazla amino asit pozisyonunu kapsayan site-doygunlaşma mutagenez kütüphaneleri için, kütüphanede getirilen çeşitliliğin sıralanmış popülasyonda iyi temsil edilmesini sağlamak için 10⁸ ila 10^{9 benzersiz} dönüştürücü dönüşüm verimi gereklidir. S. cerevisiae'ye dıştan DNA eklemek için farklı veri tabanlarına sahip birkaç yöntem vardır. Geleneksel kimyasal dönüşüm yöntemi, basitliği ve erişilebilirliği nedeniyle lityum asetat/tek zincirli taşıyıcı DNA/polietilen glikol (LiAc/ssDNA/PEG) kullanır. Ancak, genellikle DNA mikrogramı başına sadece 10⁴–10⁶ koloni oluşturan birim (CFU) dönüşüm etkinliğine ulaşır ve büyük kütüphane kampanyaları için gereken dizi varyasyonunun altında^kalır8. Buna karşılık, elektroporasyon yöntemi hücre zarını geçici olarak geçirimli hale getirmek ve DNA alımını kolaylaştırmak için yüksek voltajlı bir elektrik alanı uygular. Elektroporasyon, mevcut dönüşüm yöntemleri arasında tutarlı olarak en yüksek dönüşüm verimliliğini sağlar; optimize edilmiş protokoller 10⁸–10⁹ CFU⁹ verimini bildirir. S. cerevisiae'deki elektroporasyon verimliliğinin hücre büyüme fazı, DNA kütlesi ve tampon bileşimi konusunda kritik derecede hassas olduğu gözlemlenmiştir; bu da kütüphane ölçeğinde yönlendirilmiş evrim için yaygın olarak uyarlanmış^{bir çerçeve sağlamıştır9}.

Burada tanımlanan protokol, maya yüzeyi gösterimi için yaygın olarak benimsenen bir konak suşu olan S. cerevisiae suşunu EBY100 kullanır. EBY100, Boder ve Wittrup tarafından, galaktoz indüklenebilir GAL1 proteaz eksikliği olan ana suş BJ5465^10'un kromozomal AGA1 lokusuna entegre edilen bir AGA1 ifade kaseti tarafından geliştirilmiştir. Suş, ticari olarak ATCC'den temin edilebilir (katalog no. MYA-4941; depozitor K.D. Wittrup), genotip MATa AGA1::GAL1-AGA1::URA3 ura3-52 trp1 leu2-Δ1 his3-Δ200 pep4::HIS3 prb1Δ1.6R can1 GAL (URA+, leu−, trp−) taşıyor. Sonuç olarak, hem Aga1p hem de Aga2p-substrat kaset füzyonu aynı galaktoz indüklenebilir promotordan ifade edilir; bu da iki alt birimin birlikte indüklenmesini ve disülfüsle bağlantılı Aga1p–Aga2p kompleksine monte edilmesini sağlar; bu kompleks gösterilen füzyonu hücre duvarına sabitler.

EBY100'ün maya ekran uygulamalarında yaygın kullanılmasına rağmen, bu suşun kütüphane ölçekli verimlerde elektroporelenmesi için yayımlanmış hiçbir protokol sistematik olarak optimize edilmemiştir. EBY100'e özgü parametreler, örneğin hasat sırasında optimal büyüme aşaması, alt kültür sırasında ortam bileşimi ve 600 nm'deki başlangıç optik yoğunluğu (_{OD 600}) ile dönüşüm verimliliği arasındaki nicel ilişki, titizlikle karakterize edilip optimize edilecektir. Burada, EBY100'deki dönüşüm verimliliğinin, kültürün hasat sırasında OD₆₀₀ ile monoton olarak arttığını ve geç log fazındaki hücrelerin erken log fazında hasat edilenlere göre çok daha yüksek dönüşüm oranları sağladığını bildiriyoruz. Kritik protokol parametrelerini değerlendirdik; aşılama sırasında başlangıç_{OD 600}değerleri, alt kültürler için 2 × maya ekstraktı Pepton Dekstroz (YPD) ortamının kullanımı, elektroporasyon tampon formülasyonları ve elektroporasyon sonrası büyüme koşulları dahil. Burada sunulan protokol, elektro yetkili EBY100 hücrelerinin hazırlanması ve yüksek verimli DNA kütüphanesi elektroporasyonu için optimize edilmiş, adım adım bir iş akışı sağlar (Şekil 1A–C, Şekil 2, Şekil 3A–D, Şekil 4A–E) ve dönüşüm oranlarını sürekli olarak 10⁹ üzerinde tutarlı olarak sağlar CFU. Bu protokolü doğrulamak için, TEVp'yi dört FACS tabanlı seçim ve zenginleştirme turunda değiştirilmiş bölünme özelliğiyle mühendislik yapmak için kapsamlı bir yönlendirilmiş evrim kampanyası yürüttük. Zenginleştirilmiş proteaz varyantlarının dizilenmesi, proteazın substrat bağlama cebindeki hedeflenmiş kalıntılarda önemli çeşitlilik olduğunu doğruladı ve protokolün üretken evrim kampanyalarını desteklemek için yeterli kütüphane alanı kapsamı sağladığını gösterdi. Bu protokol, maya yüzeyi tabanlı yönlendirilmiş evrim ve FACS uyumlu, yüksek verimli proteazlar,^{antikorlar 9}, kinazlar¹¹ ve reseptör¹² taraması için EBY100 kullanan araştırmacılar için geniş kapsamlı bir fayda sağlayacaktır.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rekombinant S. cerevisiae ile ilgili tüm deneyler, Dallas'taki Teksas Üniversitesi Kurumsal Biyogüvenlik ve Kimyasal Güvenlik Komitesi'nin politika ve prosedürlerine uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Rekombinant maya suşları, yerleşik kurumsal mikrobiyolojik uygulamalara uygun olarak Biyogüvenlik Seviye 1 (BSL-1) kapsamında işlendi. Elektroporasyon, kültür ve floresansla aktive hücre ayırtma (FACS) onaylı kurumsal biyogüvenlik prosedürlerine uygun olarak gerçekleştirildi. Maya kültürleri ve kirlenmiş tüketim maddeleri, kurumsal yönergelere uygun olarak dezinasyon edilip biyotehlike atıkları olarak bertaraf edilmiştir.

1. Vektör ve insert hazırlama

Potyviral proteaz kütüphanelerinin site-doygunlaşma mutagenezi yoluyla oluşturulması
1. 30-50-mer, ileri ve geri oligonukleotidlerin üst üste binen dizi tasarım yazılımı kullanılarak tasarım, mutant bir proteaz kütüphanesi oluşturuldu. İlgili oligonukleotitteki wild-type kodonunu, mutageze için hedeflenen pozisyonlar için N, A, T, G veya C'yi temsil eden NNS dejenere kodonuyla değiştirin.
2. Her ileri ve geri oligonukleotid çifti arasındaki 3′ örtüşmeyi 55–60 °C erime sıcaklığı (Tm) ile tasarlayın. İlk ve son oligonukleotidleri, kısıtlama noktalarının ötesinde maya yüzeyi görüntüleme vektörüyle 50 nt'lik bir örtüşme içerecek şekilde tasarlayın.
3. Ekin en az bir ucunun, homolog rekombinasyonu kolaylaştırmak için doğrusal vektörün tam olarak bir ucu örtüşmesini^{sağlayacak şekilde emin olun.} Bitişik oligonukleotidler arasındaki boşluklardan^{kaçının 14}.
4. Oligonları deionize H_2Oile 100 μM'ye yeniden süzülür. Steril 1,5 mL'lik bir tüpte, her oligodan 0,5 μL birleştirin ve nihai hacmi 200 μL (her oligo için nihai konsantrasyon 250 nM).
5. Tablo 1'de listelenen bileşenlerle bir PCR reaksiyonu kurarak proteaz kütüphanesini bir araya getirin, Tablo 2'deki termodöngü koşullarını kullanın.
6. İlk montaj edilmiş PCR ürünü şablon olarak kullanarak en dıştaki ön ve geri oligoları kullanarak ikinci bir PCR reaksiyonu kurun. Çarpımı Tablo 4'te gösterildiği gibi güçlendirin.
7. İkinci PCR ürününü %1 agaroz jel ve etidiyum bromid (0,5 μg/mL) ile 240 V'da 30 dakika boyunca çalıştırın. Beklenen DNA uzunluğuna karşılık gelen bandı kesin.
  NOT: DIKKAT: Etidium bromid bir mutajendir ve uygun kişisel koruyucu ekipman (PPE) kullanılarak ele alınmalıdır; bunlar arasında laboratuvar önlüğü, nitril eldivenler ve koruyucu gözlük bulunur. Cilt temasından ve solumadan kaçının. Etidyum bromid içeren jeller, tamponlar ve tüketim malzemelerini kurumsal güvenlik yönergelerine uygun olarak tehlikeli kimyasal atık olarak bertaraf etmektir.
8. Jel çıkarma kiti kullanarak arındırın. 50 μL deionize H₂O içinde elyut yapın.
9. Spektrofotometre kullanarak DNA konsantrasyonunu ölç. DNA'yı −20 °C'de sakla.
  NOT: 2^. PCR'nin her 50 μL reaksiyonu yaklaşık 0,5–1,0 μg toplam DNA verir. Her elektroporasyon için 12 μg proteaz kütüphanesi (yani insert) gerektirdiğinden, reaksiyonları buna göre ölçeklendirin.
Substrat kaset montajı
1. LB-agar plakaları ve LB-kloramfenikol sıvı ortamı hazırlayın. Tariflere Tablo 5'e bakınız.
2. Substrat kaset montajı için ileri ve geri yönde üst üste binen 30-mer oligonukleotidler seti tasarlayın. Her ters oligonukleotidin 5′ uçlarını ve sonraki parçanın ön oligonukleotitlerini 4 nükleotid ile eşleştirecek şekilde tasarlayın.
3. Liyofilize oligonları deionize H₂O kullanarak 100 μM'ye yeniden süspansiyon.
4. Karışım reaktifleri Tablo 6'daki gibi.
5. Tablo 7'deki döngü programını kullanarak oligo karışımını tavlayıp fosforile yapın.
6. Sulandırılmış annellenmiş oligoları deionize H₂O ile 4 kat artırarak nihai konsantrasyon 1,25 μM'ye ulaşır.
7. Tavlanmış oligo karışımını vektörle (örneğin, pDD1523) birleştirin, Tablo 8'e göre.
8. Tablo 9'daki bisiklet programını takip ederek Golden Gate montajını gerçekleştirin.
  NOT: Örneğin, pDD1523 plazmidi GAL1/10 promotorunun aşağısında bir tip IIS kısıtlama bölgesine (BsmBI) sahiptir. Başarılı montaj, substrat^{kaseti 7'nin} galaktoz indüksiyonuna olanak tanır.
9. Ortaya çıkan plazmid E. coli'ye dönüştürülür.
10. LB agar üzerinde ilgili antibiyotikle plaka hücreleri. 37 °C'de 16–18 saat kuluçka yapın.
11. İzole kolonileri seçin ve 5 mL LB ortamına aşılayın. Gece boyunca (16–18 saat) 37 °C'de sarsıntı (220 rpm) ile kuluçka yapın.
12. Gece kültürlerinden plazmid miniprep seti kullanarak plazmidleri çıkarın.
13. Plazmid konsantrasyonunu spektrofotometre kullanarak ölçün, ardından dizileme için gönderin.
Mayalı görüntüleme vektörünün doğrusallaştırılması
1. Maya gösteri plazmidini lineerleştirin; örneğin, pDD1524'ü SphI ve PstI krestriksiyon enzimleriyle sindirerek substrat kasetini içeren maya ekran vektörünü elektroporasyon için hazırlayın. Tablo 10'da listelenen reaktifleri karıştırın ve 37 °C'de 1 saat kuluçka yapın.
2. Kısıtlama sindirim ürününü %1 agaroz jel üzerinde 240 V'da 30 dakika çalıştırın. Beklenen DNA uzunluğuna uygun bandı alıp jel çıkarma kiti kullanarak arıtın.
  NOT: Her 50 μL kısıtlama sindirimi yaklaşık 0,5–1,0 μg toplam DNA verir. Her elektroporasyon 4 μg doğrusal vektör gerektirdiğinden, sindirim reaksiyonlarını buna göre ölçeklendirin.

2. Elektroporasyon

Not: Biyolojik materyaller ve reaktiflerle işlerken kurumsal güvenlik prosedürlerine uyun, uygun PPE giyin ve biyolojik ile kimyasal atıkları kurumsal yönergelere uygun olarak bertaraf edin.

Tamponlar, plakalar ve ortamların hazırlanması (elektroporasyondan 2 gün önce)
1. Büyüme ortamı hazırlamak (1 × YPD; 2 × YPD; Sentetik Dekstroz Kazamino Asitleri, SDCAA+; ve Sentetik Galaktoz Casamino Asitleri, SGCAA+), plakalar (YPD ve SDCAA), elektroporasyon tamponu ve Tablo 5'teki tariflere uygun steril su. 4 °C'de depolayın.
EBY100 çizgili bir plakanın hazırlanması.
1. Gliserol stokundan YPD agara EBY100 maya ile çıkar. 30 °C'de 2 gün boyunca yetiştirin.
2. Tabakı büyümeden sonra 4 °C sıcaklıkta sakla.
  NOT: Çizgili bir plaka 1 aya kadar kullanılabilir kalır; Tabağa seri tarihini işaretle.
EBY100 ön kültürü hazırlanması (elektroporasyondan 1 gün önce)
1. 125 mL 1 × YPD'yi 500 mL Erlenmeyer şişesinde hazırlayın.
2. 25 mL 1 × YPD'yi 50 mL konik bir tüpte hazırlayın. Mikropipet ucu kullanarak, 2 gün boyunca yetiştirilen plakadan EBY100 hücreleri toplayın. Sonra, maya hücrelerini pipet ucundan 1 × YPD içeren konik tüpe aktarın.
  NOT: Hücre çizgisi yaklaşık 1–2 mm uzunluğunda bir leke oluşturmalıdır.
3. Mikropipet ucunu çıkarın ve konik tüpü vortex ile karıştırarak yeterli karıştırmayı sağlayın.
4. 150 mL pre-kültür hazırlayarak, maya hücrelerini içeren 25 mL 1 × YPD'yi 125 mL 1 × YPD içeren 500 mL şişeye aktarın. Karıştırmak için dön.
5. Spektrofotometre kullanarak, OD_600'ü 1 cm yol uzunluğunda iki mikroküvet hazırlayarak ölçün: biri 1 mL 1 × YPD ile boş kontrol olarak, diğeri ise 1 mL pre-kültür ile
6. Gece boyunca (16–20 saat) 30 °C'de 150 mL pre-kültür yetiştirin ve 270 rpm'de yörüngesel sallanma ile yapılır.
İstenen başlangıç_{OD 600'de} (elektroporasyon günü) alt kültürün hazırlanması
1. Tablo 5'te açıklandığı gibi koşullandırma tamponu ve büyüme ortamını hazırlayın.
2. Gece öncesi kültürün OD_600'ünü ölçün (beklenen OD₆₀₀₀ 17–22). Spektrofotometrenin doğrusal aralığında olmak için pre-kültürün 1:20 seyreltmesini ölçebilirsiniz.
3. 100 mL'lik bir alt kültürün aşılanması için gereken pre-kültür hacmini hesaplayın. 3.0–4.0 aralığında başlangıçta OD₆₀₀ alt kültürü önerilir.
4. Kültürü 100 mL 2 × YPD'de istenen başlangıç OD_600'e kadar inceltin ve 500 mL Erlenmeyer şişesinde kullanın.
5. 100 mL alt kültürünü 30 °C'de 270 rpm'de yörüngesel sallama ile 4 saat kuluçka edin.
4 saat kuluçka sırasında ortam hazırlanması
1. Buz gibi elektroporasyon tamponu ve steril suyu hazır tutun (adım 2.1.1'den itibaren).
2. Tablo 5'teki tarife göre 100 mL'lik koşullandırma tamponu hazırlanır. Her dönüşüm için 20 mL koşullandırma tamponu kullanın; Buna göre ölçeklendirin. Oda sıcaklığında (20–23 °C) saklanın.
  NOT: DIKKAT: Bakım tamponu ditiothreitol (DTT) ve lityum asetat (LiAc) içerir; bunlar cilt ve göz tahrişine neden olabilecek kimyasal tahriş edicilerdir. Uygun PPE'ler (laboratuvar önlüğü, nitril eldivenler ve koruyucu gözlükler) giyin ve bu reaktifleri kurumsal kimyasal güvenlik prosedürlerine uygun şekilde kullanın. Kullanılmayan çözeltileri ve harcanmış tamponları kurumsal yönergelere uygun olarak kimyasal atık olarak bertaraf etmelidir.
3. Dış büyüme ortamı (50 mL) hazırlayın: 25 mL 2 × YPD ve 25 mL 1 M sorbitol karıştırın. Her dönüşüm için 8 mL dış büyüme ortamı kullanın. Oda sıcaklığında (20–23 °C) saklanın.
4 saat kuluçkadan sonra elektrokompetetif maya hücrelerinin hazırlanması.
1. 100 mL alt kültürü iki 50 mL'lik konik tüpe ayırın. Hücreleri 4 °C ve 1.500 × g sıcaklıkta 3 dakika boyunca santrifüjle toplayın, ardından ortamı dekant edin. Hücreleri 2.6.4. adım tamamlanana kadar buzda tutun.
2. Her hücre pelletini 25 mL buz gibi steril suyla nazikçe tekrar süzüldürün. 4 °C ve 1.500 × g'de 3 dakika boyunca santrifüj yapın, ardından medyayı boşaltın.
3. 2.6.2. adımı tekrarlayın.
4. Her hücre peletini 25 mL buz gibi soğuk elektroporasyon tamponu ile nazikçe yeniden askıya alın. 4 °C ve 1.500 × g'de 3 dakika boyunca santrifüj yapın, ardından ortamı dekant yapın.
5. Hücreleri buzdan çıkarın ve her hücre pelletini 10 mL oda sıcaklığında (20–23 °C) koşullandırma tamponu ile nazikçe yeniden askıya alın. Sonra, tek bir 125 mL'lik Erlenmeyer şişesine biriktirin ve 30 °C'de 270 rpm'de yörüngesel sallanma ile 30 dakika kuluçka yapın.
6. Hücreleri 50 mL'lik bir tüpe dök. Santrifüj 4 °C ve 1.500 × g'de 3 dakika boyunca koyun. Medyayı sordu.
7. Hücre pelletini 50 mL buz gibi soğuk elektroporasyon tamponu ile nazikçe yeniden süspansiyona alın. 4 °C ve 1.500 × g'de 3 dakika boyunca santrifüj yapın, ardından medyayı dekantize edin.
8. Hücre peletini yaklaşık 100–200 μL elektroporasyon tamponu ekleyerek son hacmi 1 mL'ye geri alarak yeniden askıya alın. Hücreleri elektroporasyona kadar buzda tutun.
  NOT: Elektro donanımlı hücreler dondurulabilir (yani –80 °C dondurucuya yerleştirilebilir) ve daha sonra elektroporasyon verimliliğinde önemli bir kayıp olmadan kullanılabilir.
Elektroporasyon, büyüme ve kaplama
1. Buz üzerinde 0,2 cm boşluklu önceden soğutma elektroporasyon küvet(leri).
2. Yeniden askılanmış pelletin 380 μL'sini steril 1.5 mL bir tüpe aktarın. 4 μg plazmid DNA veya 4 μg linearize plazmid vektör ve 12 μg insert ile karıştırın. Nazikçe pipetle karıştırın.
  NOT: Elektroporlu hücre sayısını maksimize etmek için, vektör ve insert DNA konsantrasyonları ideal olarak 700–800 ng/μL olmalıdır. Konsantrasyonlar bundan azsa, vakum konsantratör kullanın.
3. Süspansiyonu önceden soğutulan elektroporasyon küvet(lerine) aktarın. 5 dakika buzda kalın.
4. 5 dakika sonra tüy içermeyen laboratuvar mendiliyle küvetin yanlarını silin, böylece elektroporasyon sırasında yay oluşumuna yol açabilir ve kalan nemi giderin. Küvetteki metal plakaların üzerindeki herhangi bir kabarcık veya hücreden kaçının, çünkü bunlar da yay oluşumuna yol açabilir. Küvetin soğuk sıcaklığını korumak için plaka elektrotlarına dokunmayın.
5. 50 mL'lik konik bir tüpte 8 mL dış büyüme ortamı hazırlayın.
6. Hücreleri şu ayarlarda elektroporle yapın: 2,5 kV voltaj, 25 μF kapasitans ve 200 Ω⁹ direnç. Kabul edilebilir zaman sabiti aralığı 2,8–4,5 ms'dir.
  NOT: DIKKAT: Elektroporasyon yüksek voltajlı elektrik darbeleri içerir. Küvetlerin doğru oturduğundan emin olun ve üreticinin çalışma talimatlarına uyun. Kurumsal yönergelere uygun olarak kullanılan elektroporasyon küvetlerini biyolojik tehlikeli atık olarak bertaraf etmelidir.
7. Küveti hemen konik tüpten yaklaşık 200 μL dış büyüme ortamıyla doldurun ve elektroporlu hücreleri 50 mL konik tüpe aktarın. Küvette görünür bir sıvı kalmayana kadar 200–350 μL dış büyüme ortamı ekleyin.
8. 50 mL'lik konik elektroporlu hücreler tüpünü 8 mL dış büyüme ortamında 30 °C'de 1 saat boyunca sarsmadan inkubasyon yapın. Tüpü her 15 dakikada bir ters çevirerek karıştırın.
9. Hücreleri 1.500 × g, 25 °C'de 3 dakika boyunca santrifüjle toplayın. O zaman medyayı söndür.
10. Hücreleri uygun maya bırakma ortamına geri alarak dönüştürülmüş hücreler için seçimi sürdürür. TRP1 seçim belirteci içeren plazmidler için, plazmidi tutan maya seçici olarak geri kazanmak için 250 mL SDCAA+ (triptofan içermeyen SDCAA+ hücrelerini yeniden askıya alın.
11. Gece boyunca (16–20 saat) 30 °C'de kuluçka yapın ve 270 rpm'de yörünge sallanması yapılsın.

3. Maya hücrelerinin indüksiyon, boyama ve akış sitometrik sıralaması

Proteaz kütüphanesi ve substrat kasetinin indüksiyonu (sıralamadan 1 gün önce)
1. OD_600'ü 2.4.2. adımdaki olarak ölç, kesilen medyada transformantların gece boyunca büyümesinden sonra.
2. Aliquot 12 mL maya dönüştürücüleri ve santrifüj 3.200 × g'de 5 dakika boyunca.
3. Süpernatantı çıkarın ve hücre pelletini SGCAA+ indüksiyon ortamında OD₆₀₀ 0.5'e yeniden süspansiyona alın. Gerekli yeniden süspansiyon hacmini seyreltme denklemi kullanarak hesaplayın: C₁V₁ = C₂V₂.
4. 125 mL'lik bir Erlenmeyer şişesine aktarın ve gece boyunca 18–24 saat boyunca 30 °C'de yörüngesel sallanma ile 270 rpm'de büyütün.
Floresan antikor boyama (ayırma gününde)
1. İndüksiyon sonrası hücrelerin_{OD 600'ünü} ölçün. İki küvet kullanın: biri 1 mL SGCAA+, diğeri ise 950 μL SGCAA+ ile 50 μL hücre karışımı. Ölçülen OD₆₀₀ değerini 20 ile çarparak indüksiyon sonrası hücrelerin gerçek OD_600'ünü elde edin.
2. Her örneği antikor boyama ve FACS ayırma için 3 ×^10-7 hücreye normalize edin. Endüksiyon termosundan aktarılacak hücrelerin hacmini hesaplamak için C₁V₁ =_{C 2}V₂ kullanın.
  NOT: Dört noktalı NNS doygunluk mutagenezi için teorik kütüphane boyutu^10-6 varyanttır. Kütüphaneyi yeterince örneklemek için en az 10 kat kütüphane boyutunu veya 107^hücreyi taramak gerekir. Örneğin: isteniyorsa C₁V₁ = 3 × 10⁷ hücre ve C₂ = indüksiyon sonrası OD₆₀₀ 6 hücre (yani, 6 × 10⁷ hücre/mL), 500 μL indüklenmiş hücreler aliquot (yani, V₂ = 3 × 10⁷ hücre / 6 × 10⁷ hücre/mL = 500 μL).
3. Hesaplanan hücre hacmini 1,5 mL'lik bir tüpe aktarın ve 5.000 × g değerinde 5 dakika boyunca santrifüj yapın.
4. Üst yüzeyi çıkarıp 500 μL fosfatla tamponlanmış tuzlu (PBS) + %0,5 sığır serum albümini (BSA) ile yeniden süzülür.
5. 5.000 × g üzerinde 5 dakika santrifüj yapın ve 3.2.4. adımı tekrarlayın.
6. 5.000 × g'de 5 dakika boyunca santrifüj yapın ve bu arada 3.2.7 adımını tamamlayın.
7. Anti-HA floressein izotiosiyanat (FITC) (0,5^μg/10 7 hücre), anti-FLAG fikoeritrin (PE) (0,05^{μg/10 7} hücre) ve PBS + %0,5 BSA (100^μL /10 7 hücre) içeren 1,5 mL tüpte antikor boyama karışımı hazırlayın. Tüpü buzda tutun.
8. Üst maddeyi çıkarın ve leke karışımıyla tekrar askıya alın. 3 ×^10-7 hücre başına 300 μL leke karışımı kullanın. Tüpü vortex yapmayın; Sadece ters çevir ya da flick.
9. Hücreleri yeniden süzülmeden sonra 1 saat boyunca karanlıkta buzun üzerinde tutun.
Boyama sonrası yıkama
1. Santrifüjle boyanmış hücreler 5.000 × g 5 dakika boyunca. Süpernatantı çıkarın ve pelleti %0,5 BSA içeren PBS içinde yeniden süzülür ve 1 × 107^{hücre başına} 0,5 mL ile (örneğin, 1 × 10⁷ hücre için 500 μL veya 3 × 10⁷ hücre için 1,5 mL) yeniden süzülür.
2. Santrifüj 5.000 × g, 5 dakika. Üst sıvıyı çıkarın, 750 μL PBS + %0,5 BSA ile yeniden süzülün.
3. Bir 750 μL PBS + %0,5 BSA daha 10 mL toplama tüpüne aktarın.
FACS
1. Yeni bir deney için sitometrenin gerekli başlatılması ve hazırlanması yapıldı.
2. Üç nokta grafiki oluşturun. İlk nokta grafikinde, ileri saçılım alanı (FSC-A) kanalını göstermek için X ekseni adını ve yan dağılma alanı (SSC-A) kanalını göstermek için Y ekseni adını seçin.
  NOT: Bu, canlı hücrelerin seçimini kolaylaştıracaktır.
3. FSC-A kanalını göstermek için X ekseni adını koruyun, Y ekseni kanalını ikinci nokta grafikinde ileri saçılım yüksekliği (FSC-H) gösterecek şekilde değiştirin.
  NOT: Bu, tekil seçimini kolaylaştıracaktır.
4. PE kanalını göstermek için X ekseni adını, üçüncü nokta grafikinde FITC kanalını göstermek için ise Y ekseni adını seçin.
5. Sitometrede negatif kontrol çalıştırın, 530/30 nm (FITC) ve 585/42 nm (PE) kanalları kullanılarak. 70 μm bir nozul ile 70 psi kılıf basıncıyla sıralama yapın. 4000–5000 olay/s hızında örnekler alın.
6. İlk nokta grafikinde (FSC-A ile SSC-A) düşük FSC-A ve SSC-A sinyallerine sahip küçük parçacıkları ve kalıntıları elemek için ana sağlam maya hücrelerinin ana popülasyonunun etrafına bir çokgen kapısı çizin.
7. FSC-H ile FSC-A arasındaki bir grafik üzerinde kapı tekillerini bu kapı içinde birleştirmek, FSC-H ile FSC-A arasında orantılı bir ilişki gösteren doğrusal popülasyonu seçerek alınır. Doğrusal dağılımdan sapan ve çiftler ile hücre agregalarına karşılık gelen olayları hariç tutun.
  NOT: PE ile FITC arasındaki üçüncü nokta grafiki, negatif kontrol için çapraz bir nokta kümesi gösterecektir (yani, sağlam substrat kasetini ifade eden maya hücreleri).
8. Örnekler çalıştırın ve istenen PE/FITC değerlerine göre maya hücrelerini bir toplama tüp(ler)ine ayırın. Tüm varyantların yeterli temsili için teorik kütüphane boyutunun en az 10 katına karşılık gelen toplam hücre sayısını analiz edin (örneğin, teorik çeşitliliği ~1 × 106^varyantına sahip bir kütüphane için ~1 × 10⁷ hücreyi analiz edin).
9. Sıralama kapısını negatif kontrol popülasyonunun PE/FITC diyagonalının altına yerleştirin.
  NOT: Daha katı kapılar istenen varyantların zenginleşmesini artırır ancak hücre iyileşmesini azaltır.
FACS sonrası
1. Santrifüj toplama tüp(leri) 3.200 × g 5 dakika boyunca kullanın. Süpernatantı dikkatlice çıkarın, 1 mL bırakın ve 5 mL PBS ile tekrar süsleyin.
  NOT: 1 mL süpernatan bırakın, çünkü alttaki hücre pelleti santrifüjleme sonrası görünmeyecektir.
2. Santrifüj hücrelerini tekrar 3.200 × g'de 5 dakika boyunca koyun. Üst maddeyi çıkarın, 1 mL kalın. 4 mL SDCAA+ ile tekrar süzül.
3. 250 mL Erlenmeyer şişesine 15 mL SDCAA+ ekleyin. 3.5.2 aşamasından askıya alınmış hücreleri bu şişeye aktarın.
4. Gece boyunca 18–24 saat boyunca 30 °C'de kuluçka yapın ve yörünge sallanması 270 rpm'de gerçekleşir.
5. Her yönlendirilmiş evrim turu için 3.1, 3.2, 3.3 ve 3.4 adımlarını tekrarlayın.

4. Bireysel klonların plazmid kurtarılması ve dizilenmesi

Bireysel koloniler yetiştirin
1. 3.5.4 adımdan sonra 500 μL sıvı kültür ve 500 μL steril %50 gliserol karıştırarak %25 gliserol stok çözeltisi elde edilmesiyle gliserol stoku oluşturulur. Hücreleri iyice karıştırmak için vortex.
2. –80 °C sıcaklıkta gece boyunca dondurucuda saklanın. Uzun süreli depolama için sıvı azot aktarın.
3. Gliserol stokunu steril 1000 μL uçla kazıyıp 100 μL SDCAA+ ile karıştırın. Bu karışımı bir SDCAA plakasına yerleştirin ve 30 °C'de ters inkübe yapın.
4. Kolonileri 3 gün sonra seçin ve gece boyunca 14 mL tüplerde 1.5 mL SDCAA+ ile yetiştirin.
Plazmidleri çıkarmak için maya miniprep'i yapın
1. Gece kültürünü 16.000 × g ile 1 dakika boyunca santrifüj ederek pellet edin ve maya plazmidi arıtma kitinden 200 μL Çözelti 1'e tekrar süzülün.
2. 5 μL litik enzim çözeltisi (5 U/μL) ekleyin.
3. 37 °C'lik bir kuluçka makinesinde, uçtan uca mikserde 4 saat kuluçka yapın.
4. -80 °C'de 20 dakika dondurarak ve 42 °C'de 10 dakika su banyosunda eritilerek donma-erime döngüsü gerçekleştirin.
5. Maya plazmidi arıtma kitinden 200 μL Çözelti 2 ekleyin, 2–3 kez ters çevirerek karıştırın ve 5 dakika bekletin.
6. Maya plazmidi arıtma kitinden 400 μL Çözelti 3 ekleyin ve 2–3 kez ters çevirerek karıştırın. Santrifüj 16.000 × g'de 5 dakika boyunca koyun.
7. Yüksek DNA bağlama kapasitesine sahip bir arıtma kitiyle plazmid DNA'sını arındırın.
  NOT: Lizlenmiş hücrelerden gelen büyük miktarda kesilen genomik maya DNA'sı nedeniyle, daha yüksek DNA bağlanma kapasitesine (35 μg) sahip silika bazlı bir sütun (daha düşük kapasiteli maya plazmidi DNA arıtma kolonu (5 μg) yerine ^{kullanılmalıdır.15}
8. DNA konsantrasyonunu spektrofotometre kullanarak ölçün. DNA verimleri 10–30 ng/μL arasındadır.
Arıtılmış plazmidleri kimyasal olarak yetkin E. coli hücrelerine dönüştürün
1. Tablo 5'teki tarife göre SOC ortamı ve LB-kloramfenikol tabaklarını hazırlayın. Ayrıca, su banyosunu 42 °C'ye kadar önceden ısıtın.
2. Her plazmid için 37 °C'de 20 dakika boyunca bir LB-kloramfenikol plakası ısıtın.
3. –80 °C dondurucudan kimyasal olarak yetkin hücrelerden oluşan bir tüp çıkarın ve buzda çözebilirsiniz.
4. Her plazmid için 30 μL yetkin hücre alıntısını buz üzerinde 1,5 mL bir tüpe gönderin.
5. 3 μL plazmid pipetini yetkin hücrelere gönderin. Karıştırmak için çevirin ve buzun üzerinde 5 dakika bekletin.
6. Hücreleri su banyosunda 42 °C'de 40 saniye boyunca kısa süreliğine kuluçka hale getirerek ısı şoku gerçekleştirin.
7. 2 dakika buzda kuluçka yapın.
8. Hücrelere 300 μL SOC ortamı ekleyin ve 37 °C'de 220 rpm'de 15 dakika kuluçka yapın.
9. 50–100 μL plaka dönüştürülmüş yetkin hücrelerden önceden ısıtılmış plakalara yerleştirilir.
10. Plakaları 37 °C'de ters 18 saat kuluçkaya geçirin.
Koloni toplama
1. 14 mL yuvarlak tabanlı kültür tüplerine 5 mL sıvı LB-kloramfenikol ortamı ekleyin.
2. Steril 1000 μL uç kullanarak bir koloni seçin ve kültür tüpüne atın.
3. Tüpleri 18 saat boyunca 37 °C'de (220 rpm, 30°–45° açı) bir silkeleyiciye yerleştirin.
Bakteriyel sıvı kültürden plazmid ekstraksiyonu
1. Sıvı kültürleri 3.200 × g ile 4 dakika boyunca santrifüjleyin. Süpernatantı boşalt.
2. Gece kültürlerinden plazmid arıtma kiti kullanarak plazmidleri çıkarın.
3. Spektrofotometre kullanarak arıtılmış plazmidlerin konsantrasyonunu ölçmek.
Plazmidleri dizileme için gönderin
NOT: Tüm plazmid nanopore dizileme veya alternatif olarak mutajendirilmiş bölgenin yanındaki primerle Sanger dizileme gibi hizmetleri kullanın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Verimli kütüphane yapısı, mutasyonel alanın yeterli kapsamını sağlamak için kritik öneme sahiptir. Nadir fonksiyonel varyantların kaybını önlemek için, dönüştürücü sayısı teorik kütüphane büyüklüğü × en az 10× ila 100 arasında olmalıdır. S. cerevisiae'deki dönüşüm verimliliği hücre konsantrasyonundan etkilendiği ve erken ve orta günlük faz hücrelerde en yüksek olduğu^{için elektroporasyondan} önce ilk hücre yoğunluğunu optimize ettik. Maya kültürleri, başlangıçta 1.0–_{4.0 arası OD 600}değerlerinde alt kültürlendi ve 4 saat (n = 2–4 bağımsız biyolojik deney) kuluçka altına alındı; ardından nihai OD₆₀₀değerleri S. cerevisiae büyüme eğrisine haritalanarak hücrelerin orta günlük büyüme aşamasında kaldığını doğruladı (Şekil 5A, Ek Şekil 1).

Bu kültürlerin 4 μg plazmid DNA ile elektroporasyonu (n = 2 bağımsız biyolojik deney), dönüşüm verimliliğinin başlangıç OD₆₀₀ koşullarında (tek yönlü ANOVA, p = 8.92 × 10⁻⁷) anlamlı şekilde farklılık gösterdiğini göstermiştir. OD₆₀₀ = 1.0'da başlatılan kültürlere göre, tüm yüksek başlangıç hücre yoğunlukları anlamlı derecede daha yüksek dönüşüm verimliliği üretmiştir (Dunnett'in çoklu karşılaştırma testi; OD₆₀₀ = 1.5, düzeltilmiş p = 0.0020; OD₆₀₀ ≥ 2.0, p < 0.0001 ayarlanmış), en yüksek dönüşüm verimliliği ise başlangıç_{OD 600'de} 4.0 olarak gözlemlenmiştir. Maya hücrelerinin homolog rekombinasyon yapma doğal yeteneğinden faydalanmak için, linearize plazmid vektörünün 4 μg ve insertin (yani proteaz kütüphanesinden) 12 μg elektroporasyonunu maya hücrelerine elektropor olarak yerleştirdik (n = 2 bağımsız biyolojik deney). Dönüşüm verimliliği, test edilen ilk OD₆₀₀ koşullarında (tek yönlü ANOVA, p = 0.0023) anlamlı şekilde farklılık göstermiştir. OD₆₀₀ = 1.0 ile başlatılan kültürlere göre, dönüşüm verimliliği OD₆₀₀ = 3.0 ( ayarlanmış p = 0.0018), 3.5 ( ayarlanmış p = 0.0062) ve 4.0 ( ayarlanmış p = 0.0024) (Dunnett'in çoklu karşılaştırma testi) seviyesinde anlamlı şekilde daha yüksekti. En yüksek dönüşüm verimliliğini orta dereceli bir başlangıç alt kültür yoğunluğunda gözlemledik (OD₆₀₀ = 3.0), bu da bu koşullarda hücre yetkinliği ile rekombinasyon verimliliği arasında optimal bir dengeyi gösterir (Şekil 5B). Sadece plazmid dönüşümüne kıyaken, doğrusal vektör ve proteaz kütüphanesi ekinin (n = 2 bağımsız biyolojik replikasyon) birlikte elektroporasyonu, test edilen ilk OD₆₀₀ koşullarında (log10 dönüşümlü dönüşüm verimliliklerinde iki yönlü ANOVA, p = 9.40 × 10⁻¹²) anlamlı şekilde daha yüksek dönüşüm verimliliği sağlamıştır). Ortalama olarak, ko-elektroporasyon, sadece plazmid dönüşümüne kıyasla dönüşüm verimliliğinde ortalama 121 kat artış (%95 CI, 63–233 kat) üretmiştir (Şekil 5B).

Mutant proteaz kütüphanesi ve substrat seçim kasetini içeren maya hücrelerinin FACS çalışması sırasında (Şekil 6A), hücreler ya kesilmiş bir kaset ya da karşı seçim substratını hala parçalayan bir proteaz (Q1), işlevsiz proteaz varyantlarını (Q2) veya yalnızca seçim alt tabakasını başarılı şekilde parçalayan proteaz varyantlarını (Q3) gösterir. Fonksiyonel olmayan varyantları ifade eden maya hücreleri, PE ve FITC grafiklerinde çapraz boyunca yayılmış baskın bir popülasyon olarak ortaya çıktı ve her iki sinyalin birlikte tutulmasını yansıtıyordu (Şekil 6A, Q2). Buna karşılık, seçilim substratını ayıran ve doğal (karşı seçim) substratı koruyan fonksiyonel varyantlar, yüksek PE ve orta-düşük FITC sinyal yoğunluğuyla karakterize edilen belirgin bir diyagonal olmayan popülasyon oluşturdu (Şekil 6A, Q3). Bu diyagonal dışı popülasyonu izole etmek için sıkı bir kapı stratejisi uygulamak, ardışık sıralama turlarında fonksiyonel varyantların kademeli zenginleşmesine yol^{açtı 10}. Bu zenginleşme, çapraz kümeden ayrılmış giderek belirgin bir hücre kümesi olarak görsel olarak gözlemlenir (Şekil 6B, soldan sağa). Belirgin bir diyagonal olmayan popülasyon gözlemlenmezse, bu düşük kütüphane kalitesi, yetersiz ifade veya optimal olmayan boyama koşullarını gösterebilir. Negatif kontrol olarak, Şekil 6C,D elektroporlu, indüklenmiş, lekelenmemiş maya hücrelerini ve ilgili FITC ile PE floresan histogramlarını gösterir.

Zenginleştirilmiş diyagonal olmayan popülasyon içinde, alt popülasyonlar FITC yoğunluğuna göre daha da çözülebilir. Orta FITC sinyali gösteren hücreler, düşük FITC sinyaline sahip hücrelerden ayrı olarak sıralanabilir. Bu farklı popülasyonların dizilenmesi, benzersiz mutasyon profilleri ortaya koymuştur (Tablo 11), farklı proteaz varyantlarıyla değişen bölünme verimliliklerinin ilişkili olduğunu göstermektedir.

figure-results-1
Şekil 1: Vektör ve Insert Hazırlığı. (A) Potyviral proteaz kütüphanelerinin site-doygunlaşma mutagenezi yoluyla oluşturulması. (B) Substrat kaseti montajı ve maya gösteri vektörüne entegrasyonu (pDD1523). (C) Kısıtlama sindirimiyle maya gösteri vektörünün (pDD1524) lineerleştirilmesi. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-2
Şekil 2: Substrat kaseti ve PCR ile amplifikasyonlu mutant proteaz kütüphanesinin yetkin EBY100 hücrelerine elektroporasyonu. (Kesik kutu) Hem proteaz hem de substrat kaseti içeren plazmidin in vivo dairesel hale gelmesi. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-3
Şekil 3: Maya hücrelerinin indüksiyon, boyama ve akış sitometrik sıralaması. (A) Proteaz kütüphanesi ve substrat kasetinin indüksiyonu. (B) Floresan antikor boyama: Anti-HA floressein izotiosiyanat (FITC) ve anti-FLAG fikoeritrin (PE) antikorlarıyla boyama. (C) Boyalı hücreler, Floresans-Aktiflenmiş Hücre Sıralaması (FACS) ile sıralanır. (D) FACS ile sıralanmış hücrelerin seçilme ortamında geri kazanılması. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-4
Şekil 4: Sıralanmış maya hücrelerinin plazmid geri kazanımı ve dizilenmesi. (A) Sıralanmış maya hücrelerinin kaplaması. (B) Bireysel maya kolonilerinden plazmid ekstraksiyonu. (C) Çıkarılmış plazmidlerin E. coli dönüşümü. (D) Bireysel E. coli kolonilerinden plazmid çıkarımı. (E) Çıkarılmış plazmidlerin nanogözenek dizilenmesi. DBCLS ve Helicase 11'den sırasıyla Bioicons (https://bioicons.com) aracılığıyla uyarlanmış ve Creative Commons Attribution 4.0 Uluslararası Lisansı (CC BY 4.0) şartları altında uyarlanmış şişe ve tüp simgeleri. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-5
Şekil 5: Farklı büyüme ortamlarında maya büyüme eğrileri ve 600 nm (OD₆₀₀) alt kültüründe başlangıç Optik Yoğunluğunun maya elektroporasyon verimliliği üzerindeki etkisi. (A) 1 × maya ekstraktı Pepton Dekstroz (YPD), 2 × YPD, Antibiyotiksiz Sentetik Dekstroz Casamino Asitleri Agar (SDCAA-) ve Antibiyotikli Sentetik Dekstroz Casamino Asitleri Agar (SDCAA+) içinde maya büyüme eğrileri. (B) Farklı alt kültür başlangıç_{OD 600'de} 4 μg plazmid vektörüyle elektroporlanmış maya dönüşüm verimliliği ve aynı başlangıç OD₆₀₀ değerlerinde linearize vektör (4 μg) ve proteaz kütüphane eki (12 μg) kullanılarak dönüşüm verimliliği. (A)'daki veriler, iki bağımsız biyolojik deneyden (n = 2) alınan OD₆₀₀ ± SD olarak sunulur. (B)'deki veriler, logaritmik y ekseninde elektroporasyon başına ortalama dönüştürücü sayısı olarak sunulur; bireysel biyolojik kopyalar daire şeklinde gösterilir (n = 2). Plazmid ve vektör-artı insert elektroporasyon optimizasyon deneylerinin istatistiksel anlamlılığı, log10 dönüşümlü elektroporasyon verimlilikleri üzerinde tek yönlü ANOVA kullanılarak belirlendi; ardından kontrol olarak OD₆₀₀ = 1.0 kullanılarak Dunnett'in çoklu karşılaştırma testi yapıldı. ns, önemli değil; p < 0.01 (**); p < 0.0001 (****). Sadece plazmid ile vektör artı insert dönüşüm verimliliği arasındaki farkın istatistiksel anlamlılığı, log10 dönüşümlü dönüşüm verimliliklerinde iki yönlü ANOVA kullanılarak belirlenmiştir. p < 0.0001 (****). Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-6
Şekil 6: Floresans-Aktifleşmiş Hücre Ayırma (FACS) bazlı maya klonlarının zenginlenmesi. (A) Kapı stratejisinin şematik temsili. Hücreler üç bölgeye ayrıldı: Q1, fikoeritrin (PE) düşük hücreler; Q2, PE-yüksek/floreskenin izotiyosiyanet (FITC) yüksek hücreler; ve Q3, düşük ve orta seviyeli FITC floresanslı PE-yüksek hücreler. Q3 içindeki hücreler zenginleştirme için toplandı. (B) Bir bağımsız evrimsel kampanyanın temsil FACS grafikleri, artan FITC kapı sıkılığı ile sıralı sıralama turlarını gösterir. Orta ve düşük FITC hücreleri dizileme için ayrı ayrı toplandı. Yüzdeler, kapalı popülasyon içindeki canlı, tek maya hücrelerinin oranını gösterir. (C) Elektroporlu, lekelenmemiş maya hücrelerini negatif kontrol olarak gösteren temsil FACS grafiki. (D) (C)'de gösterilen verilere karşılık gelen FITC-A (sol) ve PE-A (sağ) floresans yoğunluklarının histogramları. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 1: Proteaz kütüphanesinin birinci tur PCR amplifikasyonu için reaksiyon karışımı. Proteaz kütüphanesinin ilk tur amplifikasyonu için kullanılan PCR reaksiyonunun bileşimi, 50 μL reaksiyonundaki her reaktifan nihai konsantrasyonları ve miktarları dahil. Bu tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 2: Proteaz kütüphanesinin 1. tur PCR amplifikasyonu için döngü koşulları. Termal döngü programı, proteaz kütüphanesinin ilk tur PCR amplifikasyonu için kullanıldı. Bu tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 3: Proteaz kütüphanesinin ikinci tur PCR amplifikasyonu için reaksiyon karışımı. Proteaz kütüphanesinin ikinci tur amplifikasyonu için kullanılan PCR reaksiyonunun bileşimi, 50 μL reaksiyonundaki her reaktifan nihai konsantrasyonları ve miktarları dahil. Bu tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 4: Proteaz kütüphanesinin ikinci tur PCR amplifikasyonu için döngü koşulları. Termal döngü programı, proteaz kütüphanesinin ikinci tur PCR amplifikasyonu için kullanıldı. Bu tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 5: Mayanın elektroporasyonu ve büyümesi için medya ve reaktifler. Her kimyasal bileşenden 1 × ve 2 × Maya Ekstraktı Pepton Dekstroz (YPD), elektroporasyon tamponu, koşullandırma tamponu, büyüme ortamı, Antibiyotikli Sentetik Dekstroz Casamino Asitleri (SDCAA+), Antibiyotikli Sentetik Galaktoz Kazamin Asitleri (SGCAA+), Lizogeni Suyu (LB) ortamı, LB-kloramfenikol ortamı, Süper Optimal Et suyu (SOB) ortamı ve Katabolit baskılama (SOC) ile Süper Optimal Et Suyu formüle edilir. 2 M Sorbitol, 1 M ditiothreitol (DTT) ve 2 M lityum asetat (LiAc) gibi stok çözelti hazırlama talimatları da dahil edilmiştir. SDCAA, LB ve YPD agar plakalarının hazırlanması için ek talimatlar verilmektedir. Bu tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 6: Oligosların tavlanması ve fosforilasyonu için reaksiyon karışımı. Substrat kaset montajı için oligonukleotitlerin eşzamanlı tavlanması ve fosforilasyonu için kullanılan reaksiyon karışımının bileşimi. Bu tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 7: Oligosların tavlanması ve fosforilasyonu için döngüsel koşullar. Oligonukleotid tavlaması ve substrat kaset montajı için fosforilasyon için kullanılan sıcaklık programı. Bu tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 8: Altın Kapı montajı için reaksiyon karışımı, substrat kaseti ve vektör plazmid. Alt tabaka kasetini vektör plazmidine bağlamak için kullanılan Golden Gate montaj reaksiyonunun bileşimi. Bu tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 9: Altın Kapı montajı için substrat kaseti ve vektör plazmidinin döngü koşulları. Golden Gate montajı için kullanılan termal döngü programı. Bu tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 10: Vektör plazmidinin doğrusallaştırılması için reaksiyon karışımı. Kütüphane yapımından önce vektör plazmidini doğrusallaştırmak için kullanılan krestriksiyon sindirim reaksiyonunun bileşimi. Bu tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 11: ENLYFES'i parçalayan TEVp varyantlarının nanopore dizileme sonuçları. Dördüncü ve son FACS seansından sonra maya hücrelerinden plazmidler çıkarıldı. Her klondaki mutasyonlar, vahşi tip dizisine göre gösterilir. Bu tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil 1: Alt kültür sırasında başlangıç ve son EBY100 kültür yoğunluğu arasındaki ilişki. EBY100 kültürleri değişken başlangıç_{OD 600} değerlerinde alt kültüre geçirildi ve son OD₆₀₀ , aynı büyüme koşullarında (30 °C, 220 rpm) kuluçkadan sonra ölçüldü. Nihai kültür yoğunluğu, başlangıç OD₆₀₀ arttıkça doğrusal olarak arttı (R² = 0.969, p = 5.77 × 10⁻⁵). Veri noktaları, (n = 2–4) bağımsız biyolojik çoğaltmanın ± SD ortalamalarını temsil eder. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil 2: TEVp mutagenez kütüphanesinin rasyonel tasarımı. TEVp'nin (PDB ID: 1LVB) karikatür temsili, dört kalıntı (altın) P1 kalıntısından (mor) <5şuzakta ve site doygunluğu mutajezi için hedeflenmiştir. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yönlendirilmiş evrim, gelişmiş veya yeni biyokimyasal fonksiyona sahip proteinleri tanımlamak için çeşitlendirme ve seçilme döngülerini kullanarak yüksek verimli bir^{yöntemdir 17}. Bu protokolde, S. cerevisiae'de hücre-yüzey görüntüleme sistemi kullanarak proteaz-substrat tanımasını geliştirmek için optimize edilmiş bir iş akışını detaylandırıyoruz. Yüzey gösteri sistemi, proteaz aktivitesini tespit edilebilir floresans tabanlı fenotipe eşleyerek istenen klonların FACS tabanlı zenginleştirilmesini sağlar. Proteaz kütüphanesi ve substrat kaseti montajı, yüksek verimli elektroporasyon, FACS kapı ve sıralama ile proteaz varyantlarının nihai dizilenmesi için ayrıntılı adımları sunuyoruz.

Yönlendirilmiş evrimin en önemli adımlarından biri, yeterli kütüphane çeşitliliği ve potansiyel mutasyonların kapsamını^{sağlamaktır 17}. Elektroporasyon verimliliği deneylerimiz, 3.0 değerli başlangıç alt kültürü_{OD 600'ün}en yüksek dönüşüm verimliliğini verdiğini, 10⁹ CFU'nun üzerinde olduğunu göstermektedir. Bu ölçek, optimize edilmiş maya elektroporasyonu ile elde edilir ve geleneksel kimyasal dönüşüm yöntemlerinin büyük ölçüde üstün olup, büyük kombinatoryal kütüphanelerin yeterli kapsamını^sağlar ^8,9. Doğru FACS kapı ve sıralaması, istenen bölünme özelliklerini gösteren hücrelerden spesifik olmayan kesinti gösterenlerden ayırmak için gereklidir. FACS tabanlı seçimin birden fazla turunda, kapı stratejisi istenen proteaz varyantları için seçici olarak zenginleştirmek amacıyla giderek daha katı hale gelir. Eğer kapı çok genişse, istenmeyen hücreler istenen varyantlarla birlikte sıralanabilir. Sıkı kapı (örneğin, turlar boyunca FITC sinyalinin giderek daha düşük eşik değerleri), hücre popülasyonunun yeni hedef substrat^{dizisi 10'a} doğru daha yüksek özbaşlılık ve aktiviteye sahip proteaz varyantları için zenginleşmesini sağlar. Önceki^kampanyalar ^7,18 ile tutarlı olarak, TEVp'nin substrat bağlanma cebinde P1 kalıntısı Q (T146, D148, H167, S170) ile etkileşime giren dört kalıntının NNS-kodon mutagenezi yaptık (Ek Şekil 2). Şekil 6B'de gösterilen FACS grafikleri, kapı stratejisi ve zenginleştirme iş akışını gösteren tek bir temsilci sıralama deneyini temsil eder. İlginç bir şekilde, kampanyamızın sonuçları farklı bir amino asit mutasyonu setine sahip TEVp varyantları ortaya çıkardı (Tablo 11). Bu sonuçlar, proteaz evriminin temel bir özelliğini destekler: birden fazla evrimsel yol aynı hedefe götürebilir.

Deneyler yapılırken modifikasyonlar ve sorun giderme stratejileri gerekebilir. Örneğin, elektroporasyon sırasında, belirtildiğinde buz üzerinde çalışmak ve her adımda hücre pelletlerini dikkatlice yeniden süspansiyona geçirmek, hücrelerin elektroporasyondan önce canlı ve sağlıklı olmasını sağlar. Maya hücreleri, elektroporasyon aşamaları boyunca büyüme iyileşme aşamasına kadar hassas kalır. Ayrıca, maya hücresi flokulyasyonunu önlemek için FACS kılıfı sıvısının modifiye edilmesi gerekebilir. Kılıf sıvısı, FACS makinelerinde yaygın olarak kullanılır ve bakteriyel ve mantar büyümesini engelleyen koruyucu maddeler içerebilir. Bu nedenle, kılıf sıvısı, hücre ölümünü önlemek için saf PBS ile değiştirilebilir.

Maya yüzeyi görüntüleme sistemi, sekretör yolu başarılı bir şekilde geçmek için doğru katlanmış proteinlere ihtiyaç duyar. Bazı proteaz varyantları, yanlış katlanma nedeniyle aktivite kaybedebilir ve FACS seçimi sırasında spesifik olmayan bölünme veya arka plan floresansı nedeniyle yanlış pozitiflere yol açabilir. Yanlış pozitif kaynakları, bu tür plazmid tabanlı kampanyalar için dikkat çekilmesi gerekir. Çünkü bölünme C-terminal epitop etiketinin kaybı olarak okunduğundan, bu etiketi bozan herhangi bir mutasyon, gerçek bir bölünme olayı ile aynı düşük FITC fenotipini verir; Bu tür etiket mutasyonları, büyük ölçekli homolog rekombinasyon sırasında ortaya çıkar ve ardışık sıralama turlarında zenginleşebilir. Sabit substrat kasetinin kromozomal entegrasyonunun bu sorunu azalttığı son zamanlarda^{gösterilmiştir 19}. Protokol, vektörün (substrat kasetini içeren) sabit tutulmasıyla birlikte bir insert kütüphanesi kullanımına dayanır. Bu nedenle, hem proteaz hem de substrat kütüphanelerini evrimleştirmek isteyenler için bu protokol uygun değildir.

YESS platformu, proteaz-substrat^{özgüllüğünü 18} yeniden programlamak için genel bir yol öncüsü oldu. Son gelişmeler arasında: YESS2.0^7'de titrasyonabilen enzim/substrat kontrolünün eklenmesi, yeni nesil dizileme ile bağlantı sağlama, yüksek çözünürlüklü özgüllük profili²⁰ mümkün kılma ve raporlayıcıların kromozom olarak entegre edilmesi ile ifade gürültüsü ve yanlış pozitifleri^{azaltmak 19}. destekli sürekli evrim gibi diğer ortogonal stratejiler de terapötik hedefler için proteaz özelliğinin mühendisliğinde^{uygulanmıştır 21}. Bu araçlar, TEV proteaz mühendisliğinin ötesinde uygulamalar bulmuştur; örneğin, SARS-CoV-2 ana proteazının yüksek çözünürlüklü profillenmesi ve inhibitör tasarım^22'yi yönlendirmesi gibi. Böyle bir kampanyanın önemli belirleyicisi, EBY100 S. cerevisiae suşunda sistematik olarak optimize edilmemiş olan büyük kombinatoryal kütüphaneleri kapsayacak kadar dönüştürücü üretmektir (>10⁹). EBY100'ün 10⁹ CFU üzerindeki dönüşümünü tetikleyen büyüme aşaması ve elektroporasyon koşullarını tanımlayarak bu protokol, bu darboğazı ortadan kaldırır ve milyonlarca varyantın kapsamlı FACS tabanlı taramasını mümkün kılar.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar rekabet eden çıkarlar belirtmemektedir. Bu protokolü destekleyen ham veriler, Nanopore dizileme FASTQ dosyaları, akış sitometrisi (FCS) dosyaları ve şekiller ile tablolar oluşturmak için kullanılan kaynak veriler ile plazmidler pDD1523 ve pDD1524 dahil olmak üzere Zenodo'ya depolanmış ve 10.5281/zenodo.20746804 adresinde halka açık

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dingal laboratuvarının tüm üyelerine tavsiyeleri, uzmanlıkları ve tartışmaları için teşekkür ederiz. Ayrıca UTD Flow Cytometry Core'a altyapı ve destek için teşekkür ederiz. M.B.L., UTD Eugene McDermott Lisansüstü Bursu tarafından desteklenmektedir. Bu araştırma, UTD Startup Fund ve Ulusal Sağlık Enstitüleri-NIGMS tarafından P.C.D.P.D. (R35GM150967) laboratuvarına verilen ödüllerle desteklendi.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Reagents
10 mM dNTP Mix	NEB	N0447S	PCR reactions (Tables 1, 3)
10X PBS, pH 7.4	Fisher	BP3994	Staining buffer base (Steps 3.2–3.3)
5X Q5 Reaction Buffer	NEB	B9027S	Sold separately; also included with Q5 polymerase
Agar, Bacto	BD Difco	281230-500g	SDCAA agar plates (Table 5); 15 g/L
Agarose (Low-EEO/Multi-Purpose/Molecular Biology Grade)	Fisher BioReagents	BP160-500	Gel Electrophoresis
Anti-FLAG PE Antibody	BioLegend	637309	FACS staining; PE-conjugated anti-FLAG
Anti-HA Tag Antibody [FITC]	GenScript	A01621	FACS staining; FITC-conjugated anti-HA
Bacto Casamino Acids	BD Difco	223120	SDCAA+, SGCAA+, SCAA media (Table 5); 5 g/L
Bacto Peptone / Tryptone	RPI	T60060-10000.0	LB/SOB media preparation; 20 g/L in YPD (Table 5)
BSA, Bovine Serum Albumin, Fraction V	Sigma-Aldrich	126575-10GM	0.5% in PBS; staining buffer (Steps 3.2–3.3)
BsmBI-v2 (200 U)	NEB	R0739S	Golden Gate assembly of substrate cassette (Table 8)
Calcium chloride solution (1M)	Sigma-Aldrich	21115-100mL	Electroporation buffer: 1 mM final (Table 5)
ColiRollers® Plating Beads	Sigma-Aldrich	71013-3	Sterilize by putting in reagent bottles and autoclaving at 121ºC, 15 psi, for 15 mins.
D-Galactose	Thermo Fisher	A12813.30	250 g; 20% w/v stock for SGCAA+ induction (Table 5)
D-Sorbitol	Thermo Fisher	1327300.10	Electroporation buffer (1 M) and outgrowth media (Table 5)
Dextrose (D-Glucose), anhydrous	Sigma-Aldrich	G8270-1KG	YPD, SDCAA+, 20% w/v dextrose stock (Table 5)
Difco Yeast Nitrogen Base w/o Amino Acids	Sigma	Y0626-250G	6.7 g/L in SDCAA/SGCAA (Table 5)
Difco YPD Broth (pre-mixed)	BD	242820-500g	Pre-made YPD alternative; 500 g
DL-Dithiothreitol (DTT)	Sigma-Aldrich	D0632-1G	Conditioning buffer: 10 mM final; aliquot 250 μL, store −20°C
E.Z.N.A. CyclePure PCR Purification Kit	Omega Bio-tek	D6492-02	PCR product cleanup
E.Z.N.A. Gel Extraction Kit	Omega Bio-tek	D2500-01	Gel purification post-PCR and restriction digest (Steps 1.1.8, 1.3.2)
E.Z.N.A. Plasmid DNA Mini Kit I	Omega Bio-tek	D6942-02	Plasmid purification (Step 4.2)
Glycerol (≥99%)	Fisher	BP229-4	50% v/v stock for glycerol stocks (Step 4.1.1)
Kanamycin Sulfate	Fisher	BP906-5	SDCAA+ and SGCAA+: 50 μg/mL final; replaces Sigma K0879-5G
KLD Enzyme Mix	NEB	M0554S	Kinase-Ligase-DpnI; site-directed mutagenesis
KLD Reaction Buffer	NEB	B0554A	Used with KLD Enzyme Mix
LB Broth (Lennox)	Sigma-Aldrich	L3022-1KG	E. coli liquid culture
Lithium Acetate Dihydrate (LiOAc·2H₂O)	Thermo Fisher	A17921.30	Conditioning buffer: 0.1 M final; add before DTT (Table 5)
Luria Agar (Luria-Bertani Agar)	RPI	L24020-2000.0	E. coli plating; replaces Sigma LB Agar Lennox L2897-1KG
OmniPur Casamino Acids	Sigma	2240-500GM	Alternative casamino acids source
pDD1523	Zenodo	10.5281/zenodo. 20746804	pCTCon2-TRP-CEN/ARS-Gal10-SPAga2-BsaI; Gal1-Aga2-sfGFP
pDD1524	Zenodo	10.5281/zenodo. 20746804	pCTCon2-Aga2-6xHis-ENLYFQS-FLAG-ENLYFES-HA-ERS
Penicillin-Streptomycin Solution, 100X	Corning	30-002-CI	SDCAA+, SGCAA+: 1X final
PstI-HF (5000 U)	NEB	R3140S	Vector linearization (Table 10); use HF version
Q5 HF DNA Polymerase	NEB	M0492S	High-fidelity polymerase; alternative to Q5 Hot Start
Q5 High GC Enhancer	NEB	B9028A	For high GC-content PCR reactions
Q5 Hot Start DNA Polymerase	NEB	M0491L	PCR assembly and amplification (Tables 1, 3)
rCutSmart Buffer (10X)	NEB	B6004S	Supplied with PstI-HF and SphI-HF (Table 10)
SalI-HF	NEB	R3138L	Additional restriction enzyme
SOC Medium	NEB	B9020S	Post-transformation recovery
Sodium Chloride (NaCl)	Fisher	S271-1	LB / SOB media preparation
Sodium Hydroxide (NaOH)	Fisher	S318-500	Media pH adjustment
Sodium Phosphate Dibasic (Na₂HPO₄)	Sigma-Aldrich	S9763-500G	SDCAA plates, SCAA media: 38 mM (Table 5)
Sodium Phosphate Monobasic, anhydrous	VWR (BDH)	BDH4542-1KGP	SDCAA plates, SCAA media: 62 mM; replaces NaH₂PO₄·H₂O monohydrate
SphI-HF (1000 U)	NEB	R3182S	Vector linearization in tandem with PstI-HF (Table 10)
Streptomycin	Life Technologies / Sigma	S6501-5g	Antibiotic
T4 DNA Ligase Buffer (10X)	NEB	B0202S	Table 6
T4 Polynucleotide Kinase (500 U)	NEB	M0201S	Table 6
T7 DNA Ligase (3000 U/mL)	NEB	M0318S	Table 8
Yeast Extract	RPI	Y20020-5000.0	YPD (10 g/L) and LB/SOB media
Zymolyase (1000 U)	Zymo Research	E1004-A	Yeast cell wall digestion for plasmid extraction (Step 4.2.2)
Zymoprep Yeast Plasmid Miniprep II	Zymo Research	D2004	Yeast plasmid extraction; includes Solutions 1, 2, 3 (Step 4.2)
ZymoPURE II Plasmid Midi Kit	Zymo Research	D4201-B	Mid-scale plasmid prep; for larger-volume preparations
Equipment and Consumables
Disposable Cuvettes, 1.5 mL	Fisher	14-955-127	For measuring OD600 of liquid cultures
Erlenmeyer Flask, 125 mL	VWR	10536-912	Pre-culture and conditioning incubation
Erlenmeyer Flask, 250 mL	VWR	10536-914	Yeast subculture
Erlenmeyer Flask, 250 mL	VWR	75809-646	Wide-mouth variant
Erlenmeyer Flask, 500 mL	VWR	10536-926	Main pre-culture flask (Step 2.3.1, 2.4.3)
Falcon 50 mL Conical Tubes	Falcon	352070	Cell washes, centrifugation throughout protocol
Flow Cytometry Sorter: BD Fusion	BD Biosciences	FACSAria Fusion Flow Cytometer (catalog number not applicable)	For Fluorescence-Activated Cell Sorting (FACS)
Gene Pulser/MicroPulser Electroporation Cuvettes, 0.2 cm gap	Bio-Rad	1652086	For electroporation of electrocompetent EBY100
GenePulser Xcell Electroporation System	Bio-Rad	1652660	INSTRUMENT; 2.5 kV, 25 μF, 200 Ω (Step 2.7.6)
New Brunswick Innova 40R - Benchtop Orbital Shaker	Eppendorf	M12990084	For yeast liquid culture incubation
Petri Dishes, 100 mm	Fisher	FB0875712	YPD and SDCAA agar plates
SpectraMax QuickDrop UV-Vis Spectrophotometer	Molecular Devices	SpectraMax QuickDrop	For measuring OD600 of liquid cultures and DNA concentration
Vacufuge plus	Eppendorf	2231001204	For concentrating DNA
Software
BD FACSDiva (Version: 8.0)	BD Biosciences	https://www.bdbiosciences.com/en-us/products/software/instrument-software/bd-facsdiva-software	Collection of tools for flow cytometer and application setup, data acquisition, and data analysis
Benchling (Version: Web-based platform, continuous release)	Benchling, Inc.	https://www.benchling.com/	Sequence design software
SnapGene (Version: 8.0.1)	SnapGene, Inc.	https://www.snapgene.com/	Sequence design software

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Bioengineering protease mutagenesis directed evolution yeast surface display Potyviridae Saccharomyces cerevisiae electroporation flow cytometry

Proteazların Yönlendirilmiş Evrimi için Optimize Edilmiş Maya Yüzeyi Ekran İş Akışı

Bu makalede

Özet

Özet

Giriş

Protokol

Sonuçlar

Tartışma

Açıklamalar

Teşekkürler

Malzemeler

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

İlgili makaleler