Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Proteazların Yönlendirilmiş Evrimi için Optimize Edilmiş Maya Yüzeyi Ekran İş Akışı

331 görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/72559

⸱

4 Ağustos 2026

 ,  ,  , 
1Department of Bioengineering, The University of Texas at Dallas, 2Department of Biological Sciences, The University of Texas at Dallas, 3Center for Systems Biology, The University of Texas at Dallas

Bu makalede

Özet

Bu protokol, yüzey tabanlı bir seçim sistemi kullanarak Saccharomyces cerevisiae'de viral proteazların yönlendirilmiş evrimi için optimize edilmiş bir iş akışı sağlar. DNA insert kütüphanesi ve substrat kaseti tasarımını, yüksek dönüşüm verimliliği için optimize edilmiş elektroporasyonu, proteaz parçalanması için floresansla aktifleşen hücre sıralama temelli seçimi ve zenginleştirilmiş varyantların dizilenmesini özetlemektedir.

Özet

Yönlendirilmiş evrim, hızlı ve kontrollü bir laboratuvar ortamında doğal evrim sürecini taklit ederek istenen işlevlere veya özelliklere sahip proteinler evrimleştirir. Mutant protein kodlayan genlerin büyük bir havuzunun taraması, biyoteknoloji, tıp ve sentetik biyoloji alanlarında uygulamalar için istenen varyantların fonksiyonel seçimine olanak tanır. Bu protokolü kullanarak, Saccharomyces cerevisiae'de yöne yönelik evrim gerçekleştirerek doğal olmayan bir substrat dizisi için yüksek özgüllüğe sahip proteaz varyantları mühendislik yapıyoruz. Bu proteaz varyantlarını, floresans-aktive hücre sıralaması (FACS) ile istenen varyantların seçilmesini kolaylaştırmak için maya hücre yüzeyinde sergiliyoruz. Substrat kasetinin dört ana elemanı proteaz kütüphanesiyle birlikte eksprese edilir: (i) maya yapışma reseptörü alt birimi Aga2, (ii) seçim ve (iii) karşı seçim alt dizileri, (iv) epitop etiketi dizileri ve isteğe bağlı endoplazmik retikulum (ER) geri dönüş sinyal dizisi. Sadece seçili substrat dizisi bölünmüş maya hücreleri, floresan (phycoerythrin/fluorescein isothiosiyanate-etiketli) anti-epitop antikorları aracılığıyla çok renkli FACS kullanılarak izole edilir. Burada, DNA insert kütüphanesi tasarımı ve substrat kaset tasarımı, yüksek dönüşüm etkinliğine sahip maya hücresi elektroporasyonu (DNA mikrogramı başına 109 dönüştürücüye kadar), FACS tabanlı seçim, zenginleştirme ve evrimleşmiş varyantların dizilenmesini içeren optimize edilmiş, adım adım protokolün detaylarını sunuyoruz. Yöne yönelik evrim protokolümüzü, tütün etch virüsü nükleer dahil edilme proteazını (TEVp) doğal substrat dizisi ENLYFQ↓S'den yeni bir dizisi ENLYFE↓S'ye doğru keserek evrimleştirerek gösteriyoruz.

Giriş

Potyviridae ailesine ait sistein proteazlar, özellikle nükleer dahil etme A (NIa) proteazları, dizisine özgü endopeptidazların büyük ölçüde kullanılmamış bir kaynağını temsil eder. 3.800'den fazla karakterize edilmiş aile üyesi olan NIa proteazları, belirgin bir yedi amino-asit substrat dizisini ayırır. Potyviral ailesi, programlanabilir protein kontrol sistemleri mühendisliği, ortogonal proteaz tabanlı genetik devreler oluşturmak ve diziye özgü biyoteknolojik araçların geliştirilmesi için çeşitli proteazsetleri sunar 1,2. Bu doğal çeşitliliğe rağmen, yalnızca iki NIa proteazı, TEVp ve tütün damarı benekli virüsü proteazı (TVMVp), kapsamlı laboratuvar ve biyoteknolojik kullanım için kapsamlı şekilde karakterize edilmiş ve mühendislikyapmıştır 3,4. Bu sınırlı proteaz araç seti, ortogonal proteaz faaliyetleri gerektiren çok bileşenli devreler için tasarımalanını sınırlar 5, böylece NIa proteazlarının yönlendirilmiş evrim yoluyla daha da genişletilmesi ve karakterize edilmesi için çabaları motiveeder 6,7.

Maya yüzeyi ekranı, yönlendirilmiş evrim için en güçlü platformlardan biri olarak ortaya çıkmıştır ve floresansla aktive hücre ayırma (FACS) ile yüksek verimli protein kütüphanesi taramasını mümkün kılarkâ sağlar.6,7. Örneğin, maya endoplazmik retikulum sequestrasyon taraması (YESS) sistemi, S. cerevisiae 6,7'nin sekresi yolu aracılığıyla proteaz aktivitesini yüzeye göstermek için bağlar. YESS sistemi, yeni proteaz-substrat özgüllükleri mühendisliği için uygulanmış ve çoklu turlu yönlendirilmiş evrim kampanyaları için faydalılığını göstermiştir. Bu sistemde, proteaz varyantları, epitop belirteçleriyle birlikte bir bölünme substrat kaseti içeren bir füzyon proteiniyle birlikte eksprese edilir ve Aga1p yüzey ankrajı EBY100 maya suşunda eksprese edilir. Floresan antikorlarla diferansiyel etiketleme, hücre yüzeyinde gösterilen bölünmüş ve ayrılmamış alt tabaka kasetlerini ayrım yapar. Bu faaliyete bağlı görüntüleme mekanizması, 10,7 veya daha fazla varyantlı kütüphaneler için yinelemeli FACS tabanlıseçimle doğrudan uyumludur 6,7.

Yönlendirilmiş evrimin temel önkoşullarından biri, hedeflenen dizi alanının yeterli kapsamını sağlamak için yeterli ölçekte varyant kütüphaneleri tanıtabilme yeteneğidir. Birden fazla amino asit pozisyonunu kapsayan site-doygunlaşma mutagenez kütüphaneleri için, kütüphanede getirilen çeşitliliğin sıralanmış popülasyonda iyi temsil edilmesini sağlamak için 108 ila 109 benzersiz dönüştürücü dönüşüm verimi gereklidir. S. cerevisiae'ye dıştan DNA eklemek için farklı veri tabanlarına sahip birkaç yöntem vardır. Geleneksel kimyasal dönüşüm yöntemi, basitliği ve erişilebilirliği nedeniyle lityum asetat/tek zincirli taşıyıcı DNA/polietilen glikol (LiAc/ssDNA/PEG) kullanır. Ancak, genellikle DNA mikrogramı başına sadece 104–106 koloni oluşturan birim (CFU) dönüşüm etkinliğine ulaşır ve büyük kütüphane kampanyaları için gereken dizi varyasyonunun altındakalır8. Buna karşılık, elektroporasyon yöntemi hücre zarını geçici olarak geçirimli hale getirmek ve DNA alımını kolaylaştırmak için yüksek voltajlı bir elektrik alanı uygular. Elektroporasyon, mevcut dönüşüm yöntemleri arasında tutarlı olarak en yüksek dönüşüm verimliliğini sağlar; optimize edilmiş protokoller 108–109 CFU9 verimini bildirir. S. cerevisiae'deki elektroporasyon verimliliğinin hücre büyüme fazı, DNA kütlesi ve tampon bileşimi konusunda kritik derecede hassas olduğu gözlemlenmiştir; bu da kütüphane ölçeğinde yönlendirilmiş evrim için yaygın olarak uyarlanmışbir çerçeve sağlamıştır9.

Burada tanımlanan protokol, maya yüzeyi gösterimi için yaygın olarak benimsenen bir konak suşu olan S. cerevisiae suşunu EBY100 kullanır. EBY100, Boder ve Wittrup tarafından, galaktoz indüklenebilir GAL1 proteaz eksikliği olan ana suş BJ546510'un kromozomal AGA1 lokusuna entegre edilen bir AGA1 ifade kaseti tarafından geliştirilmiştir. Suş, ticari olarak ATCC'den temin edilebilir (katalog no. MYA-4941; depozitor K.D. Wittrup), genotip MATa AGA1::GAL1-AGA1::URA3 ura3-52 trp1 leu2-Δ1 his3-Δ200 pep4::HIS3 prb1Δ1.6R can1 GAL (URA+, leu−, trp−) taşıyor. Sonuç olarak, hem Aga1p hem de Aga2p-substrat kaset füzyonu aynı galaktoz indüklenebilir promotordan ifade edilir; bu da iki alt birimin birlikte indüklenmesini ve disülfüsle bağlantılı Aga1p–Aga2p kompleksine monte edilmesini sağlar; bu kompleks gösterilen füzyonu hücre duvarına sabitler.

EBY100'ün maya ekran uygulamalarında yaygın kullanılmasına rağmen, bu suşun kütüphane ölçekli verimlerde elektroporelenmesi için yayımlanmış hiçbir protokol sistematik olarak optimize edilmemiştir. EBY100'e özgü parametreler, örneğin hasat sırasında optimal büyüme aşaması, alt kültür sırasında ortam bileşimi ve 600 nm'deki başlangıç optik yoğunluğu (OD 600) ile dönüşüm verimliliği arasındaki nicel ilişki, titizlikle karakterize edilip optimize edilecektir. Burada, EBY100'deki dönüşüm verimliliğinin, kültürün hasat sırasında OD600 ile monoton olarak arttığını ve geç log fazındaki hücrelerin erken log fazında hasat edilenlere göre çok daha yüksek dönüşüm oranları sağladığını bildiriyoruz. Kritik protokol parametrelerini değerlendirdik; aşılama sırasında başlangıçOD 600 değerleri, alt kültürler için 2 × maya ekstraktı Pepton Dekstroz (YPD) ortamının kullanımı, elektroporasyon tampon formülasyonları ve elektroporasyon sonrası büyüme koşulları dahil. Burada sunulan protokol, elektro yetkili EBY100 hücrelerinin hazırlanması ve yüksek verimli DNA kütüphanesi elektroporasyonu için optimize edilmiş, adım adım bir iş akışı sağlar (Şekil 1A–C, Şekil 2, Şekil 3A–D, Şekil 4A–E) ve dönüşüm oranlarını sürekli olarak 109 üzerinde tutarlı olarak sağlar CFU. Bu protokolü doğrulamak için, TEVp'yi dört FACS tabanlı seçim ve zenginleştirme turunda değiştirilmiş bölünme özelliğiyle mühendislik yapmak için kapsamlı bir yönlendirilmiş evrim kampanyası yürüttük. Zenginleştirilmiş proteaz varyantlarının dizilenmesi, proteazın substrat bağlama cebindeki hedeflenmiş kalıntılarda önemli çeşitlilik olduğunu doğruladı ve protokolün üretken evrim kampanyalarını desteklemek için yeterli kütüphane alanı kapsamı sağladığını gösterdi. Bu protokol, maya yüzeyi tabanlı yönlendirilmiş evrim ve FACS uyumlu, yüksek verimli proteazlar,antikorlar 9, kinazlar11 ve reseptör12 taraması için EBY100 kullanan araştırmacılar için geniş kapsamlı bir fayda sağlayacaktır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Rekombinant S. cerevisiae ile ilgili tüm deneyler, Dallas'taki Teksas Üniversitesi Kurumsal Biyogüvenlik ve Kimyasal Güvenlik Komitesi'nin politika ve prosedürlerine uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Rekombinant maya suşları, yerleşik kurumsal mikrobiyolojik uygulamalara uygun olarak Biyogüvenlik Seviye 1 (BSL-1) kapsamında işlendi. Elektroporasyon, kültür ve floresansla aktive hücre ayırtma (FACS) onaylı kurumsal biyogüvenlik prosedürlerine uygun olarak gerçekleştirildi. Maya kültürleri ve kirlenmiş tüketim maddeleri, kurumsal yönergelere uygun olarak dezinasyon edilip biyotehlike atıkları olarak bertaraf edilmiştir.

1. Vektör ve insert hazırlama

  1. Potyviral proteaz kütüphanelerinin site-doygunlaşma mutagenezi yoluyla oluşturulması
    1. 30-50-mer, ileri ve geri oligonukleotidlerin üst üste binen dizi tasarım yazılımı kullanılarak tasarım, mutant bir proteaz kütüphanesi oluşturuldu. İlgili oligonukleotitteki wild-type kodonunu, mutageze için hedeflenen pozisyonlar için N, A, T, G veya C'yi temsil eden NNS dejenere kodonuyla değiştirin.
    2. Her ileri ve geri oligonukleotid çifti arasındaki 3′ örtüşmeyi 55–60 °C erime sıcaklığı (Tm) ile tasarlayın. İlk ve son oligonukleotidleri, kısıtlama noktalarının ötesinde maya yüzeyi görüntüleme vektörüyle 50 nt'lik bir örtüşme içerecek şekilde tasarlayın.
    3. Ekin en az bir ucunun, homolog rekombinasyonu kolaylaştırmak için doğrusal vektörün tam olarak bir ucu örtüşmesinisağlayacak şekilde emin olun. Bitişik oligonukleotidler arasındaki boşluklardankaçının 14.
    4. Oligonları deionize H2Oile 100 μM'ye yeniden süzülür. Steril 1,5 mL'lik bir tüpte, her oligodan 0,5 μL birleştirin ve nihai hacmi 200 μL (her oligo için nihai konsantrasyon 250 nM).
    5. Tablo 1'de listelenen bileşenlerle bir PCR reaksiyonu kurarak proteaz kütüphanesini bir araya getirin, Tablo 2'deki termodöngü koşullarını kullanın.
    6. İlk montaj edilmiş PCR ürünü şablon olarak kullanarak en dıştaki ön ve geri oligoları kullanarak ikinci bir PCR reaksiyonu kurun. Çarpımı Tablo 4'te gösterildiği gibi güçlendirin.
    7. İkinci PCR ürününü %1 agaroz jel ve etidiyum bromid (0,5 μg/mL) ile 240 V'da 30 dakika boyunca çalıştırın. Beklenen DNA uzunluğuna karşılık gelen bandı kesin.
      NOT: DIKKAT: Etidium bromid bir mutajendir ve uygun kişisel koruyucu ekipman (PPE) kullanılarak ele alınmalıdır; bunlar arasında laboratuvar önlüğü, nitril eldivenler ve koruyucu gözlük bulunur. Cilt temasından ve solumadan kaçının. Etidyum bromid içeren jeller, tamponlar ve tüketim malzemelerini kurumsal güvenlik yönergelerine uygun olarak tehlikeli kimyasal atık olarak bertaraf etmektir.
    8. Jel çıkarma kiti kullanarak arındırın. 50 μL deionize H2O içinde elyut yapın.
    9. Spektrofotometre kullanarak DNA konsantrasyonunu ölç. DNA'yı −20 °C'de sakla.
      NOT: 2. PCR'nin her 50 μL reaksiyonu yaklaşık 0,5–1,0 μg toplam DNA verir. Her elektroporasyon için 12 μg proteaz kütüphanesi (yani insert) gerektirdiğinden, reaksiyonları buna göre ölçeklendirin.
  2. Substrat kaset montajı
    1. LB-agar plakaları ve LB-kloramfenikol sıvı ortamı hazırlayın. Tariflere Tablo 5'e bakınız.
    2. Substrat kaset montajı için ileri ve geri yönde üst üste binen 30-mer oligonukleotidler seti tasarlayın. Her ters oligonukleotidin 5′ uçlarını ve sonraki parçanın ön oligonukleotitlerini 4 nükleotid ile eşleştirecek şekilde tasarlayın.
    3. Liyofilize oligonları deionize H2O kullanarak 100 μM'ye yeniden süspansiyon.
    4. Karışım reaktifleri Tablo 6'daki gibi.
    5. Tablo 7'deki döngü programını kullanarak oligo karışımını tavlayıp fosforile yapın.
    6. Sulandırılmış annellenmiş oligoları deionize H2O ile 4 kat artırarak nihai konsantrasyon 1,25 μM'ye ulaşır.
    7. Tavlanmış oligo karışımını vektörle (örneğin, pDD1523) birleştirin, Tablo 8'e göre.
    8. Tablo 9'daki bisiklet programını takip ederek Golden Gate montajını gerçekleştirin.
      NOT: Örneğin, pDD1523 plazmidi GAL1/10 promotorunun aşağısında bir tip IIS kısıtlama bölgesine (BsmBI) sahiptir. Başarılı montaj, substratkaseti 7'nin galaktoz indüksiyonuna olanak tanır.
    9. Ortaya çıkan plazmid E. coli'ye dönüştürülür.
    10. LB agar üzerinde ilgili antibiyotikle plaka hücreleri. 37 °C'de 16–18 saat kuluçka yapın.
    11. İzole kolonileri seçin ve 5 mL LB ortamına aşılayın. Gece boyunca (16–18 saat) 37 °C'de sarsıntı (220 rpm) ile kuluçka yapın.
    12. Gece kültürlerinden plazmid miniprep seti kullanarak plazmidleri çıkarın.
    13. Plazmid konsantrasyonunu spektrofotometre kullanarak ölçün, ardından dizileme için gönderin.
  3. Mayalı görüntüleme vektörünün doğrusallaştırılması
    1. Maya gösteri plazmidini lineerleştirin; örneğin, pDD1524'ü SphI ve PstI krestriksiyon enzimleriyle sindirerek substrat kasetini içeren maya ekran vektörünü elektroporasyon için hazırlayın. Tablo 10'da listelenen reaktifleri karıştırın ve 37 °C'de 1 saat kuluçka yapın.
    2. Kısıtlama sindirim ürününü %1 agaroz jel üzerinde 240 V'da 30 dakika çalıştırın. Beklenen DNA uzunluğuna uygun bandı alıp jel çıkarma kiti kullanarak arıtın.
      NOT: Her 50 μL kısıtlama sindirimi yaklaşık 0,5–1,0 μg toplam DNA verir. Her elektroporasyon 4 μg doğrusal vektör gerektirdiğinden, sindirim reaksiyonlarını buna göre ölçeklendirin.

2. Elektroporasyon

Not: Biyolojik materyaller ve reaktiflerle işlerken kurumsal güvenlik prosedürlerine uyun, uygun PPE giyin ve biyolojik ile kimyasal atıkları kurumsal yönergelere uygun olarak bertaraf edin.

  1. Tamponlar, plakalar ve ortamların hazırlanması (elektroporasyondan 2 gün önce)
    1. Büyüme ortamı hazırlamak (1 × YPD; 2 × YPD; Sentetik Dekstroz Kazamino Asitleri, SDCAA+; ve Sentetik Galaktoz Casamino Asitleri, SGCAA+), plakalar (YPD ve SDCAA), elektroporasyon tamponu ve Tablo 5'teki tariflere uygun steril su. 4 °C'de depolayın.
  2. EBY100 çizgili bir plakanın hazırlanması.
    1. Gliserol stokundan YPD agara EBY100 maya ile çıkar. 30 °C'de 2 gün boyunca yetiştirin.
    2. Tabakı büyümeden sonra 4 °C sıcaklıkta sakla.
      NOT: Çizgili bir plaka 1 aya kadar kullanılabilir kalır; Tabağa seri tarihini işaretle.
  3. EBY100 ön kültürü hazırlanması (elektroporasyondan 1 gün önce)
    1. 125 mL 1 × YPD'yi 500 mL Erlenmeyer şişesinde hazırlayın.
    2. 25 mL 1 × YPD'yi 50 mL konik bir tüpte hazırlayın. Mikropipet ucu kullanarak, 2 gün boyunca yetiştirilen plakadan EBY100 hücreleri toplayın. Sonra, maya hücrelerini pipet ucundan 1 × YPD içeren konik tüpe aktarın.
      NOT: Hücre çizgisi yaklaşık 1–2 mm uzunluğunda bir leke oluşturmalıdır.
    3. Mikropipet ucunu çıkarın ve konik tüpü vortex ile karıştırarak yeterli karıştırmayı sağlayın.
    4. 150 mL pre-kültür hazırlayarak, maya hücrelerini içeren 25 mL 1 × YPD'yi 125 mL 1 × YPD içeren 500 mL şişeye aktarın. Karıştırmak için dön.
    5. Spektrofotometre kullanarak, OD600'ü 1 cm yol uzunluğunda iki mikroküvet hazırlayarak ölçün: biri 1 mL 1 × YPD ile boş kontrol olarak, diğeri ise 1 mL pre-kültür ile
    6. Gece boyunca (16–20 saat) 30 °C'de 150 mL pre-kültür yetiştirin ve 270 rpm'de yörüngesel sallanma ile yapılır.
  4. İstenen başlangıçOD 600'de (elektroporasyon günü) alt kültürün hazırlanması
    1. Tablo 5'te açıklandığı gibi koşullandırma tamponu ve büyüme ortamını hazırlayın.
    2. Gece öncesi kültürün OD600'ünü ölçün (beklenen OD₆₀₀₀ 17–22). Spektrofotometrenin doğrusal aralığında olmak için pre-kültürün 1:20 seyreltmesini ölçebilirsiniz.
    3. 100 mL'lik bir alt kültürün aşılanması için gereken pre-kültür hacmini hesaplayın. 3.0–4.0 aralığında başlangıçta OD600 alt kültürü önerilir.
    4. Kültürü 100 mL 2 × YPD'de istenen başlangıç OD600'e kadar inceltin ve 500 mL Erlenmeyer şişesinde kullanın.
    5. 100 mL alt kültürünü 30 °C'de 270 rpm'de yörüngesel sallama ile 4 saat kuluçka edin.
  5. 4 saat kuluçka sırasında ortam hazırlanması
    1. Buz gibi elektroporasyon tamponu ve steril suyu hazır tutun (adım 2.1.1'den itibaren).
    2. Tablo 5'teki tarife göre 100 mL'lik koşullandırma tamponu hazırlanır. Her dönüşüm için 20 mL koşullandırma tamponu kullanın; Buna göre ölçeklendirin. Oda sıcaklığında (20–23 °C) saklanın.
      NOT: DIKKAT: Bakım tamponu ditiothreitol (DTT) ve lityum asetat (LiAc) içerir; bunlar cilt ve göz tahrişine neden olabilecek kimyasal tahriş edicilerdir. Uygun PPE'ler (laboratuvar önlüğü, nitril eldivenler ve koruyucu gözlükler) giyin ve bu reaktifleri kurumsal kimyasal güvenlik prosedürlerine uygun şekilde kullanın. Kullanılmayan çözeltileri ve harcanmış tamponları kurumsal yönergelere uygun olarak kimyasal atık olarak bertaraf etmelidir.
    3. Dış büyüme ortamı (50 mL) hazırlayın: 25 mL 2 × YPD ve 25 mL 1 M sorbitol karıştırın. Her dönüşüm için 8 mL dış büyüme ortamı kullanın. Oda sıcaklığında (20–23 °C) saklanın.
  6. 4 saat kuluçkadan sonra elektrokompetetif maya hücrelerinin hazırlanması.
    1. 100 mL alt kültürü iki 50 mL'lik konik tüpe ayırın. Hücreleri 4 °C ve 1.500 × g sıcaklıkta 3 dakika boyunca santrifüjle toplayın, ardından ortamı dekant edin. Hücreleri 2.6.4. adım tamamlanana kadar buzda tutun.
    2. Her hücre pelletini 25 mL buz gibi steril suyla nazikçe tekrar süzüldürün. 4 °C ve 1.500 × g'de 3 dakika boyunca santrifüj yapın, ardından medyayı boşaltın.
    3. 2.6.2. adımı tekrarlayın.
    4. Her hücre peletini 25 mL buz gibi soğuk elektroporasyon tamponu ile nazikçe yeniden askıya alın. 4 °C ve 1.500 × g'de 3 dakika boyunca santrifüj yapın, ardından ortamı dekant yapın.
    5. Hücreleri buzdan çıkarın ve her hücre pelletini 10 mL oda sıcaklığında (20–23 °C) koşullandırma tamponu ile nazikçe yeniden askıya alın. Sonra, tek bir 125 mL'lik Erlenmeyer şişesine biriktirin ve 30 °C'de 270 rpm'de yörüngesel sallanma ile 30 dakika kuluçka yapın.
    6. Hücreleri 50 mL'lik bir tüpe dök. Santrifüj 4 °C ve 1.500 × g'de 3 dakika boyunca koyun. Medyayı sordu.
    7. Hücre pelletini 50 mL buz gibi soğuk elektroporasyon tamponu ile nazikçe yeniden süspansiyona alın. 4 °C ve 1.500 × g'de 3 dakika boyunca santrifüj yapın, ardından medyayı dekantize edin.
    8. Hücre peletini yaklaşık 100–200 μL elektroporasyon tamponu ekleyerek son hacmi 1 mL'ye geri alarak yeniden askıya alın. Hücreleri elektroporasyona kadar buzda tutun.
      NOT: Elektro donanımlı hücreler dondurulabilir (yani –80 °C dondurucuya yerleştirilebilir) ve daha sonra elektroporasyon verimliliğinde önemli bir kayıp olmadan kullanılabilir.
  7. Elektroporasyon, büyüme ve kaplama
    1. Buz üzerinde 0,2 cm boşluklu önceden soğutma elektroporasyon küvet(leri).
    2. Yeniden askılanmış pelletin 380 μL'sini steril 1.5 mL bir tüpe aktarın. 4 μg plazmid DNA veya 4 μg linearize plazmid vektör ve 12 μg insert ile karıştırın. Nazikçe pipetle karıştırın.
      NOT: Elektroporlu hücre sayısını maksimize etmek için, vektör ve insert DNA konsantrasyonları ideal olarak 700–800 ng/μL olmalıdır. Konsantrasyonlar bundan azsa, vakum konsantratör kullanın.
    3. Süspansiyonu önceden soğutulan elektroporasyon küvet(lerine) aktarın. 5 dakika buzda kalın.
    4. 5 dakika sonra tüy içermeyen laboratuvar mendiliyle küvetin yanlarını silin, böylece elektroporasyon sırasında yay oluşumuna yol açabilir ve kalan nemi giderin. Küvetteki metal plakaların üzerindeki herhangi bir kabarcık veya hücreden kaçının, çünkü bunlar da yay oluşumuna yol açabilir. Küvetin soğuk sıcaklığını korumak için plaka elektrotlarına dokunmayın.
    5. 50 mL'lik konik bir tüpte 8 mL dış büyüme ortamı hazırlayın.
    6. Hücreleri şu ayarlarda elektroporle yapın: 2,5 kV voltaj, 25 μF kapasitans ve 200 Ω9 direnç. Kabul edilebilir zaman sabiti aralığı 2,8–4,5 ms'dir.
      NOT: DIKKAT: Elektroporasyon yüksek voltajlı elektrik darbeleri içerir. Küvetlerin doğru oturduğundan emin olun ve üreticinin çalışma talimatlarına uyun. Kurumsal yönergelere uygun olarak kullanılan elektroporasyon küvetlerini biyolojik tehlikeli atık olarak bertaraf etmelidir.
    7. Küveti hemen konik tüpten yaklaşık 200 μL dış büyüme ortamıyla doldurun ve elektroporlu hücreleri 50 mL konik tüpe aktarın. Küvette görünür bir sıvı kalmayana kadar 200–350 μL dış büyüme ortamı ekleyin.
    8. 50 mL'lik konik elektroporlu hücreler tüpünü 8 mL dış büyüme ortamında 30 °C'de 1 saat boyunca sarsmadan inkubasyon yapın. Tüpü her 15 dakikada bir ters çevirerek karıştırın.
    9. Hücreleri 1.500 × g, 25 °C'de 3 dakika boyunca santrifüjle toplayın. O zaman medyayı söndür.
    10. Hücreleri uygun maya bırakma ortamına geri alarak dönüştürülmüş hücreler için seçimi sürdürür. TRP1 seçim belirteci içeren plazmidler için, plazmidi tutan maya seçici olarak geri kazanmak için 250 mL SDCAA+ (triptofan içermeyen SDCAA+ hücrelerini yeniden askıya alın.
    11. Gece boyunca (16–20 saat) 30 °C'de kuluçka yapın ve 270 rpm'de yörünge sallanması yapılsın.

3. Maya hücrelerinin indüksiyon, boyama ve akış sitometrik sıralaması

  1. Proteaz kütüphanesi ve substrat kasetinin indüksiyonu (sıralamadan 1 gün önce)
    1. OD600'ü 2.4.2. adımdaki olarak ölç, kesilen medyada transformantların gece boyunca büyümesinden sonra.
    2. Aliquot 12 mL maya dönüştürücüleri ve santrifüj 3.200 × g'de 5 dakika boyunca.
    3. Süpernatantı çıkarın ve hücre pelletini SGCAA+ indüksiyon ortamında OD600 0.5'e yeniden süspansiyona alın. Gerekli yeniden süspansiyon hacmini seyreltme denklemi kullanarak hesaplayın: C1V1 = C2V2.
    4. 125 mL'lik bir Erlenmeyer şişesine aktarın ve gece boyunca 18–24 saat boyunca 30 °C'de yörüngesel sallanma ile 270 rpm'de büyütün.
  2. Floresan antikor boyama (ayırma gününde)
    1. İndüksiyon sonrası hücrelerinOD 600'ünü ölçün. İki küvet kullanın: biri 1 mL SGCAA+, diğeri ise 950 μL SGCAA+ ile 50 μL hücre karışımı. Ölçülen OD600 değerini 20 ile çarparak indüksiyon sonrası hücrelerin gerçek OD600'ünü elde edin.
    2. Her örneği antikor boyama ve FACS ayırma için 3 ×10-7 hücreye normalize edin. Endüksiyon termosundan aktarılacak hücrelerin hacmini hesaplamak için C1V1 =C 2V2 kullanın.
      NOT: Dört noktalı NNS doygunluk mutagenezi için teorik kütüphane boyutu10-6 varyanttır. Kütüphaneyi yeterince örneklemek için en az 10 kat kütüphane boyutunu veya 107hücreyi taramak gerekir. Örneğin: isteniyorsa C1V1 = 3 × 107 hücre ve C2 = indüksiyon sonrası OD600 6 hücre (yani, 6 × 107 hücre/mL), 500 μL indüklenmiş hücreler aliquot (yani, V2 = 3 × 107 hücre / 6 × 107 hücre/mL = 500 μL).
    3. Hesaplanan hücre hacmini 1,5 mL'lik bir tüpe aktarın ve 5.000 × g değerinde 5 dakika boyunca santrifüj yapın.
    4. Üst yüzeyi çıkarıp 500 μL fosfatla tamponlanmış tuzlu (PBS) + %0,5 sığır serum albümini (BSA) ile yeniden süzülür.
    5. 5.000 × g üzerinde 5 dakika santrifüj yapın ve 3.2.4. adımı tekrarlayın.
    6. 5.000 × g'de 5 dakika boyunca santrifüj yapın ve bu arada 3.2.7 adımını tamamlayın.
    7. Anti-HA floressein izotiosiyanat (FITC) (0,5μg /10 7 hücre), anti-FLAG fikoeritrin (PE) (0,05μg/10 7 hücre) ve PBS + %0,5 BSA (100μL /10 7 hücre) içeren 1,5 mL tüpte antikor boyama karışımı hazırlayın. Tüpü buzda tutun.
    8. Üst maddeyi çıkarın ve leke karışımıyla tekrar askıya alın. 3 ×10-7 hücre başına 300 μL leke karışımı kullanın. Tüpü vortex yapmayın; Sadece ters çevir ya da flick.
    9. Hücreleri yeniden süzülmeden sonra 1 saat boyunca karanlıkta buzun üzerinde tutun.
  3. Boyama sonrası yıkama
    1. Santrifüjle boyanmış hücreler 5.000 × g 5 dakika boyunca. Süpernatantı çıkarın ve pelleti %0,5 BSA içeren PBS içinde yeniden süzülür ve 1 × 107hücre başına 0,5 mL ile (örneğin, 1 × 107 hücre için 500 μL veya 3 × 107 hücre için 1,5 mL) yeniden süzülür.
    2. Santrifüj 5.000 × g, 5 dakika. Üst sıvıyı çıkarın, 750 μL PBS + %0,5 BSA ile yeniden süzülün.
    3. Bir 750 μL PBS + %0,5 BSA daha 10 mL toplama tüpüne aktarın.
  4. FACS
    1. Yeni bir deney için sitometrenin gerekli başlatılması ve hazırlanması yapıldı.
    2. Üç nokta grafiki oluşturun. İlk nokta grafikinde, ileri saçılım alanı (FSC-A) kanalını göstermek için X ekseni adını ve yan dağılma alanı (SSC-A) kanalını göstermek için Y ekseni adını seçin.
      NOT: Bu, canlı hücrelerin seçimini kolaylaştıracaktır.
    3. FSC-A kanalını göstermek için X ekseni adını koruyun, Y ekseni kanalını ikinci nokta grafikinde ileri saçılım yüksekliği (FSC-H) gösterecek şekilde değiştirin.
      NOT: Bu, tekil seçimini kolaylaştıracaktır.
    4. PE kanalını göstermek için X ekseni adını, üçüncü nokta grafikinde FITC kanalını göstermek için ise Y ekseni adını seçin.
    5. Sitometrede negatif kontrol çalıştırın, 530/30 nm (FITC) ve 585/42 nm (PE) kanalları kullanılarak. 70 μm bir nozul ile 70 psi kılıf basıncıyla sıralama yapın. 4000–5000 olay/s hızında örnekler alın.
    6. İlk nokta grafikinde (FSC-A ile SSC-A) düşük FSC-A ve SSC-A sinyallerine sahip küçük parçacıkları ve kalıntıları elemek için ana sağlam maya hücrelerinin ana popülasyonunun etrafına bir çokgen kapısı çizin.
    7. FSC-H ile FSC-A arasındaki bir grafik üzerinde kapı tekillerini bu kapı içinde birleştirmek, FSC-H ile FSC-A arasında orantılı bir ilişki gösteren doğrusal popülasyonu seçerek alınır. Doğrusal dağılımdan sapan ve çiftler ile hücre agregalarına karşılık gelen olayları hariç tutun.
      NOT: PE ile FITC arasındaki üçüncü nokta grafiki, negatif kontrol için çapraz bir nokta kümesi gösterecektir (yani, sağlam substrat kasetini ifade eden maya hücreleri).
    8. Örnekler çalıştırın ve istenen PE/FITC değerlerine göre maya hücrelerini bir toplama tüp(ler)ine ayırın. Tüm varyantların yeterli temsili için teorik kütüphane boyutunun en az 10 katına karşılık gelen toplam hücre sayısını analiz edin (örneğin, teorik çeşitliliği ~1 × 106varyantına sahip bir kütüphane için ~1 × 107 hücreyi analiz edin).
    9. Sıralama kapısını negatif kontrol popülasyonunun PE/FITC diyagonalının altına yerleştirin.
      NOT: Daha katı kapılar istenen varyantların zenginleşmesini artırır ancak hücre iyileşmesini azaltır.
  5. FACS sonrası
    1. Santrifüj toplama tüp(leri) 3.200 × g 5 dakika boyunca kullanın. Süpernatantı dikkatlice çıkarın, 1 mL bırakın ve 5 mL PBS ile tekrar süsleyin.
      NOT: 1 mL süpernatan bırakın, çünkü alttaki hücre pelleti santrifüjleme sonrası görünmeyecektir.
    2. Santrifüj hücrelerini tekrar 3.200 × g'de 5 dakika boyunca koyun. Üst maddeyi çıkarın, 1 mL kalın. 4 mL SDCAA+ ile tekrar süzül.
    3. 250 mL Erlenmeyer şişesine 15 mL SDCAA+ ekleyin. 3.5.2 aşamasından askıya alınmış hücreleri bu şişeye aktarın.
    4. Gece boyunca 18–24 saat boyunca 30 °C'de kuluçka yapın ve yörünge sallanması 270 rpm'de gerçekleşir.
    5. Her yönlendirilmiş evrim turu için 3.1, 3.2, 3.3 ve 3.4 adımlarını tekrarlayın.

4. Bireysel klonların plazmid kurtarılması ve dizilenmesi

  1. Bireysel koloniler yetiştirin
    1. 3.5.4 adımdan sonra 500 μL sıvı kültür ve 500 μL steril %50 gliserol karıştırarak %25 gliserol stok çözeltisi elde edilmesiyle gliserol stoku oluşturulur. Hücreleri iyice karıştırmak için vortex.
    2. –80 °C sıcaklıkta gece boyunca dondurucuda saklanın. Uzun süreli depolama için sıvı azot aktarın.
    3. Gliserol stokunu steril 1000 μL uçla kazıyıp 100 μL SDCAA+ ile karıştırın. Bu karışımı bir SDCAA plakasına yerleştirin ve 30 °C'de ters inkübe yapın.
    4. Kolonileri 3 gün sonra seçin ve gece boyunca 14 mL tüplerde 1.5 mL SDCAA+ ile yetiştirin.
  2. Plazmidleri çıkarmak için maya miniprep'i yapın
    1. Gece kültürünü 16.000 × g ile 1 dakika boyunca santrifüj ederek pellet edin ve maya plazmidi arıtma kitinden 200 μL Çözelti 1'e tekrar süzülün.
    2. 5 μL litik enzim çözeltisi (5 U/μL) ekleyin.
    3. 37 °C'lik bir kuluçka makinesinde, uçtan uca mikserde 4 saat kuluçka yapın.
    4. -80 °C'de 20 dakika dondurarak ve 42 °C'de 10 dakika su banyosunda eritilerek donma-erime döngüsü gerçekleştirin.
    5. Maya plazmidi arıtma kitinden 200 μL Çözelti 2 ekleyin, 2–3 kez ters çevirerek karıştırın ve 5 dakika bekletin.
    6. Maya plazmidi arıtma kitinden 400 μL Çözelti 3 ekleyin ve 2–3 kez ters çevirerek karıştırın. Santrifüj 16.000 × g'de 5 dakika boyunca koyun.
    7. Yüksek DNA bağlama kapasitesine sahip bir arıtma kitiyle plazmid DNA'sını arındırın.
      NOT: Lizlenmiş hücrelerden gelen büyük miktarda kesilen genomik maya DNA'sı nedeniyle, daha yüksek DNA bağlanma kapasitesine (35 μg) sahip silika bazlı bir sütun (daha düşük kapasiteli maya plazmidi DNA arıtma kolonu (5 μg) yerine kullanılmalıdır.15
    8. DNA konsantrasyonunu spektrofotometre kullanarak ölçün. DNA verimleri 10–30 ng/μL arasındadır.
  3. Arıtılmış plazmidleri kimyasal olarak yetkin E. coli hücrelerine dönüştürün
    1. Tablo 5'teki tarife göre SOC ortamı ve LB-kloramfenikol tabaklarını hazırlayın. Ayrıca, su banyosunu 42 °C'ye kadar önceden ısıtın.
    2. Her plazmid için 37 °C'de 20 dakika boyunca bir LB-kloramfenikol plakası ısıtın.
    3. –80 °C dondurucudan kimyasal olarak yetkin hücrelerden oluşan bir tüp çıkarın ve buzda çözebilirsiniz.
    4. Her plazmid için 30 μL yetkin hücre alıntısını buz üzerinde 1,5 mL bir tüpe gönderin.
    5. 3 μL plazmid pipetini yetkin hücrelere gönderin. Karıştırmak için çevirin ve buzun üzerinde 5 dakika bekletin.
    6. Hücreleri su banyosunda 42 °C'de 40 saniye boyunca kısa süreliğine kuluçka hale getirerek ısı şoku gerçekleştirin.
    7. 2 dakika buzda kuluçka yapın.
    8. Hücrelere 300 μL SOC ortamı ekleyin ve 37 °C'de 220 rpm'de 15 dakika kuluçka yapın.
    9. 50–100 μL plaka dönüştürülmüş yetkin hücrelerden önceden ısıtılmış plakalara yerleştirilir.
    10. Plakaları 37 °C'de ters 18 saat kuluçkaya geçirin.
  4. Koloni toplama
    1. 14 mL yuvarlak tabanlı kültür tüplerine 5 mL sıvı LB-kloramfenikol ortamı ekleyin.
    2. Steril 1000 μL uç kullanarak bir koloni seçin ve kültür tüpüne atın.
    3. Tüpleri 18 saat boyunca 37 °C'de (220 rpm, 30°–45° açı) bir silkeleyiciye yerleştirin.
  5. Bakteriyel sıvı kültürden plazmid ekstraksiyonu
    1. Sıvı kültürleri 3.200 × g ile 4 dakika boyunca santrifüjleyin. Süpernatantı boşalt.
    2. Gece kültürlerinden plazmid arıtma kiti kullanarak plazmidleri çıkarın.
    3. Spektrofotometre kullanarak arıtılmış plazmidlerin konsantrasyonunu ölçmek.
  6. Plazmidleri dizileme için gönderin
    NOT: Tüm plazmid nanopore dizileme veya alternatif olarak mutajendirilmiş bölgenin yanındaki primerle Sanger dizileme gibi hizmetleri kullanın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Verimli kütüphane yapısı, mutasyonel alanın yeterli kapsamını sağlamak için kritik öneme sahiptir. Nadir fonksiyonel varyantların kaybını önlemek için, dönüştürücü sayısı teorik kütüphane büyüklüğü × en az 10× ila 100 arasında olmalıdır. S. cerevisiae'deki dönüşüm verimliliği hücre konsantrasyonundan etkilendiği ve erken ve orta günlük faz hücrelerde en yüksek olduğuiçin elektroporasyondan önce ilk hücre yoğunluğunu optimize ettik. Maya kültürleri, başlan...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Yönlendirilmiş evrim, gelişmiş veya yeni biyokimyasal fonksiyona sahip proteinleri tanımlamak için çeşitlendirme ve seçilme döngülerini kullanarak yüksek verimli biryöntemdir 17. Bu protokolde, S. cerevisiae'de hücre-yüzey görüntüleme sistemi kullanarak proteaz-substrat tanımasını geliştirmek için optimize edilmiş bir iş akışını detaylandırıyoruz. Yüzey gösteri sistemi, proteaz aktivitesini tespit edilebilir floresans tabanlı fenotipe eşleyerek istenen kl...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar rekabet eden çıkarlar belirtmemektedir. Bu protokolü destekleyen ham veriler, Nanopore dizileme FASTQ dosyaları, akış sitometrisi (FCS) dosyaları ve şekiller ile tablolar oluşturmak için kullanılan kaynak veriler ile plazmidler pDD1523 ve pDD1524 dahil olmak üzere Zenodo'ya depolanmış ve 10.5281/zenodo.20746804 adresinde halka açık

Teşekkürler

Dingal laboratuvarının tüm üyelerine tavsiyeleri, uzmanlıkları ve tartışmaları için teşekkür ederiz. Ayrıca UTD Flow Cytometry Core'a altyapı ve destek için teşekkür ederiz. M.B.L., UTD Eugene McDermott Lisansüstü Bursu tarafından desteklenmektedir. Bu araştırma, UTD Startup Fund ve Ulusal Sağlık Enstitüleri-NIGMS tarafından P.C.D.P.D. (R35GM150967) laboratuvarına verilen ödüllerle desteklendi.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Reaktanlar
10 mM dNTP KarışımıNEBN0447SPCR reaksiyonları (Tablo 1, 3)
10X PBS, pH 7.4FisherBP3994Boyama tamponu tabanı (Adımlar 3.2–3.3)
5X Q5 Reaksiyon TamponuNEBB9027SAyrı ayrı satılır; ayrıca Q5 polimerazla birlikte bulunur
Agar, BactoBD Difco281230-500gSDCAA agar plakaları (Tablo 5); 15 g/L
Agaroz (Düşük-EEO/Çok Amaçlı/Moleküler Biyoloji Sınıfı)Fisher BioReagentsBP160-500Jel Elektroforezi
Anti-FLAG PE AntikoruBioLegend637309FACS boyama; PE konjuge anti-FLAG
Anti-HA Tag Antikoru [FITC]GenScriptA01621FACS boyama; FITC konjuge anti-HA
Bacto Casamino AsitleriBD Difco223120SDCAA+, SGCAA+, SCAA ortamı (Tablo 5); 5 g/L
Bacto Pepton / TriptonRPIT60060-10000.0LB/SOB ortamı hazırlanması; YPD'de 20 g/L (Tablo 5)
BSA, Bovin Serum Albumini, Fraksiyon VSigma-Aldrich126575-10GMPBS'de %0.5; boyama tamponu (Adımlar 3.2–3.3)
BsmBI-v2 (200 U)NEBR0739SAlt kasetin Golden Gate montajı (Tablo 8)
Kalsiyum klorür çözeltisi (1M)Sigma-Aldrich21115-100mLElektroporasyon tamponu: 1 mM son (Tablo 5)
ColiRollers® Plakalama BoncuklarıSigma-Aldrich71013-3Reaktif şişelere yerleştirerek ve 121ºC, 15 psi'de 15 dakika boyunca otoklav ile sterilize edin.
D-GalaktozThermo FisherA12813.30250 g; SGCAA+ indüksiyon için %20 w/v stoğu (Tablo 5)
D-SorbitolThermo Fisher1327300.10Elektroporasyon tamponu (1 M) ve büyüme ortamı (Tablo 5)
Dekstroz (D-Glukoz), anhidratSigma-AldrichG8270-1KGYPD, SDCAA+, %20 w/v dekstroz stoğu (Tablo 5)
Difco Maya Azot Tabanı w/o Amino AsitlerSigmaY0626-250GSDCAA/SGCAA'da 6.7 g/L (Tablo 5)
Difco YPD Besiyeri (ön karıştırılmış)BD242820-500gÖn yapılmış YPD alternatifi; 500 g
DL-Ditiyotitrol (DTT)Sigma-AldrichD0632-1GKoşullandırma tamponu: 10 mM son; 250 μL alın, −20°C'de saklayın
E.Z.N.A. CyclePure PCR Saflaştırma KitiOmega Bio-tekD6492-02PCR ürünü temizliği
E.Z.N.A. Jel Çıkarma KitiOmega Bio-tekD2500-01PCR ve kısıtlama sindiriminden sonra jel saflaştırması (Adımlar 1.1.8, 1.3.2)
E.Z.N.A. Plazmid DNA Mini Kit IOmega Bio-tekD6942-02Plazmid saflaştırması (Adım 4.2)
Gliserol (≥99%)FisherBP229-4Gliserol stokları için %50 v/v stoğu (Adım 4.1.1)
Kanamycin Sülfat FisherBP906-5SDCAA+ ve SGCAA+: 50 μg/mL son; Sigma K0879-5G'nin yerini alır
KLD Enzim KarışımıNEBM0554SKinaz-Ligaz-DpnI; yönlendirilmiş mutagenez
KLD Reaksiyon TamponuNEBB0554AKLD Enzim Karışımı ile kullanılır
LB Besiyeri (Lennox)Sigma-AldrichL3022-1KGE. coli sıvı kültürü
Lityum Asetat Dihidrat (LiOAc·2H2O)Thermo FisherA17921.30Koşullandırma tamponu: 0.1 M son; DTT'den önce ekleyin (Tablo 5)
Luria Agar (Luria-Bertani Agar)RPIL24020-2000.0E. coli plakası; Sigma LB Agar Lennox L2897-1KG'nin yerini alır
OmniPur Kasamino AsitleriSigma2240-500GMAlternatif kasamino asit kaynağı
pDD1523Zenodo10.5281/zenodo. 20746804pCTCon2-TRP-CEN/ARS-Gal10-SPAga2-BsaI; Gal1-Aga2-sfGFP
pDD1524Zenodo10.5281/zenodo. 20746804pCTCon2-Aga2-6xHis-ENLYFQS-FLAG-ENLYFES-HA-ERS
Penisilin-Streptomisin Çözeltisi, 100XCorning30-002-CISDCAA+, SGCAA+: 1X son
PstI-HF (5000 U)NEBR3140SVektör lineerleştirmesi (Tablo 10); HF versiyonunu kullanın
Q5 HF DNA PolimerazNEBM0492SYüksek sadakatli polimeraz; Q5 Hot Start'a alternatif
Q5 High GC ArttırıcıNEBB9028AYüksek GC içeriği PCR reaksiyonları için

Kaynaklar

  1. Adams MJ, Antoniw JF, Beaudoin F. Overview and analysis of the polyprotein cleavage sites in the family Potyviridae. Mol Plant Pathol. 2005;6:471–487.
  2. Lim Suan MB et al. Identification and engineering of highly functional potyviral proteases in cells using co-evolutionary models. Nat Commun. 2026;17:3257. doi: 10.1038/s41467-026-69961-5.
  3. Kapust RB, Waugh DS. Controlled intracellular processing of fusion proteins by TEV protease. Protein Expr Purif. 2000;19:312–318.
  4. Nallamsetty S et al. Efficient site-specific processing of fusion proteins by tobacco vein mottling virus protease in vivo and in vitro. Protein Expr Purif. 2004;38:108–115.
  5. Chen Z, Elowitz MB. Programmable protein circuit design. Cell. 2021;184:2284–2301.
  6. Sanchez MI, Ting AY. Directed evolution improves the catalytic efficiency of TEV protease. Nat Methods. 2020;17:167–174.
  7. Denard CA et al. YESS 2.0, a tunable platform for enzyme evolution, yields highly active TEV protease variants. ACS Synth Biol. 2021;10:63–71.
  8. Gietz RD, Schiestl RH. High-efficiency yeast transformation using the LiAc/SS carrier DNA/PEG method. Nat Protoc. 2007;2:31–34.
  9. Benatuil L, Perez JM, Belk J, Hsieh CM. An improved yeast transformation method for the generation of very large human antibody libraries. Protein Eng Des Sel. 2010;23:155–159.
  10. Boder ET, Wittrup KD. Yeast surface display for screening combinatorial polypeptide libraries. Nat Biotechnol. 1997;15:553–557.
  11. Lau WL et al. Using yeast surface display to engineer a soluble and crystallizable construct of hematopoietic progenitor kinase 1 (HPK1). Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Commun. 2021;77:22–28.
  12. Kieke MC et al. Selection of functional T cell receptor mutants from a yeast surface-display library. Proc Natl Acad Sci U S A. 1999;96:5651–5656.
  13. Ma H, Kunes S, Schatz PJ, Botstein D. Plasmid construction by homologous recombination in yeast. Gene. 1987;58:201–216.
  14. Varadarajan N, Cantor JR, Georgiou G, Iverson BL. Construction and flow cytometric screening of targeted enzyme libraries. Nat Protoc. 2009;4:893–901.
  15. Haas CM, Francino-Urdaniz IM, Steiner PJ, Whitehead TA. Identification of SARS-CoV-2 S RBD escape mutants using yeast screening and deep mutational scanning. STAR Protoc. 2021;2:100869. doi: 10.1016/j.xpro.2021.100869.
  16. Ito H, Fukuda Y, Murata K, Kimura A. Transformation of intact yeast cells treated with alkali cations. J Bacteriol. 1983;153:163–168.
  17. Bloom JD, Arnold FH. In the light of directed evolution: pathways of adaptive protein evolution. Proc Natl Acad Sci U S A. 2009;106:9995–10000.
  18. Yi L et al. Engineering of TEV protease variants by yeast ER sequestration screening (YESS) of combinatorial libraries. Proc Natl Acad Sci U S A. 2013;110:7229–7234.
  19. Martinusen SG et al. Modular and integrative activity reporters enhance biochemical studies in the yeast ER. Protein Eng Des Sel. 2024;37. doi: 10.1093/protein/gzae008.
  20. Li Q et al. Profiling protease specificity: combining yeast ER sequestration screening (YESS) with next generation sequencing. ACS Chem Biol. 2017;12:510–518.
  21. Packer MS, Rees HA, Liu DR. Phage-assisted continuous evolution of proteases with altered substrate specificity. Nat Commun. 2017;8:956. doi: 10.1038/s41467-017-01055-9.
  22. Yaghi RM, Andrews CL, Wylie DC, Iverson BL. High-resolution substrate specificity profiling of SARS-CoV-2 Mpro; comparison to SARS-CoV Mpro. ACS Chem Biol. 2024;19:1474–1483.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Biyom hendislikSay 234Say 234Bo De erSayproteazmutajenezPotyviridaeSaccharomyces cerevisiaeelektroporasyonak sitometrisi

Bu makale yayımlandı

Video yakında

Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.