Yöntem makalesi

Kıvrımlı Damarlarda ve Anevrizmalarda Endotelyal Hücre Fonksiyonunun Yüksek Çözünürlüklü Görüntülenmesi İçin 3B Yazıcıyla Üretilmiş Fedai Mürekkep Platformu

52 görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/72574

⸱

29 Eylül 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Cell and Tissue Morphodynamics, Cell Biology and Physiology Center, National Heart, Lung, and Blood Institute, National Institutes of Health, 2Biomedical Engineering and Physical Science Shared Resource, National Institute of Biomedical Imaging and Bioengineering, National Institutes of Health, 3Center for Biomedical Engineering Technology Acceleration, National Institute of Biomedical Imaging and Bioengineering, National Institutes of Health, 4Instrumentation Development and Engineering Application Solutions (IDEAS), National Institute of Biomedical Imaging and Bioengineering, National Institutes of Health

Bu makalede

Özet

Bu protokol; ekstrüzyon yazıcısı veya pastörize fedai mürekkebin elle uygulanması kullanılarak, kıvrımlı veya anevrizmatik segmentlere sahip kan damarlarının in vitro olarak nasıl tasarlandığını ve monte edildiğini, ayrıca hemodinamik akışın ve endotel hücre yanıtlarının nasıl analiz edildiğini detaylandırmaktadır.

Özet

Vasküler tortuosite ve anevrizmalar, çeşitli insan dokuları ve kan damarı türlerinde önemli sağlık riskleri oluşturur. Damar şeklindeki bu değişimler, endotelyal fonksiyonu önemli ölçüde etkileyen kan akış dinamiklerinde anomalilere yol açar. Bu vasküler hastalık durumlarının hayvan modelleri bazı vakalarda açıklayıcı olmuştur, ancak hem kurulmaları maliyetlidir hem de hayvan türünün fizyolojisi ile sınırlıdır. Buna yanıt olarak, in vitro 3D organ-on-a-chip (OOC) modelleri, insan hücrelerinde vasküler fonksiyonu ve endotelyal yanıtları değerlendirmek için güçlü bir araç seti haline gelmiştir. OOC modellerinin her birinin güçlü yönleri olsa da, fizyolojik kayma hızı ve basınç altında, kavisli damarlarda ve anevrizmalarda vasküler fonksiyonun temel bir göstergesi olan damar geçirgenliğini incelemek için erişilebilir bir sisteme ihtiyaç duyulmaktadır . Burada sunulan metodoloji, giriş seviyesi bir biyoyazıcı kullanarak ekonomik bir kavisli damar model sisteminde, insan endotelyal hücrelerinin akış anomalilerine verdiği yanıtların incelenmesine olanak tanır; bu sistem fizyolojik sıvı akış hızları, geçirgenlik çalışmaları, yüksek çözünürlüklü ışık mikroskopisi ve fizyolojik sertliğe sahip hücre dışı matris desteği ile uyumlu damarlar üretmektedir.

Giriş

Damar kıvrımlılığı ve anevrizmalar çeşitli hastalıkların ve sağlık risklerinin temel belirtileri olduğundan, kan damarı morfolojisi vasküler fonksiyonun önemli bir göstergesidir. Vasküler kıvrımlılık; Marfan1, Turner2 ve Loeys-Dietz3 gibi sendromlarda olduğu gibi konjenital olabilir veya hipertansiyon, diyabet, kanser ve muhtemelen ateroskleroz4,5,6 dahil olmak üzere birçok hastalığın bir belirtisi olarak yaşamın ilerleyen dönemlerinde gelişebilir. Karotis7, koroner8, femoral9, aortik10 ve serebral11 arterler dahil olmak üzere arteriyel dokuların anevrizmaları, spontan diseksiyon veya rüptür nedeniyle morbidite ve sağlık riskleri ile ilişkilidir. Vasküler kıvrımlılık ve anevrizmalar, akış düzensizliklerine ve buna bağlı endotelyal inflamasyona neden olmanın yanı sıra, altta yatan doku disfonksiyonu ve inflamasyonun göstergesi olabilir. Örneğin, yeni doğanlarda ve çocuklarda arteriyel kıvrımlılık sendromu; çocukluk çağı inmesi12, persistan pulmoner hipertansiyon ve aort diseksiyonunun4,13 klinik öngörüsüdür. Erişkinlerde retinal vaskülit, altta yatan inflamasyon çözüldükçe belirginliği azalan kıvrımlı retinal damarlarla kendini gösterir14. Kıvrımlılığın nasıl algılandığı ve hastalık ilerlemesini tetikleyen aberrant sinyallere nasıl dönüştürüldüğü aktif bir çalışma alanı olmaya devam etmektedir. Kan damarlarını döşeyen endotel hücrelerinin bu süreçte birincil sensörler olarak hareket ettiği düşünülmektedir. Vasküler kıvrımlılık veya anevrizmalar nedeniyle oluşan bozulmuş veya yavaş akış, kayma gerilmesini (shear stress) değiştirerek inflamatuar sinyallemede15 ve bariyer fonksiyonunda16 endotelyal değişiklikleri tetikler. Endotel hücreleri; primer siliya17, mekanosensitif adezyon proteinleri18,19 ve iyon kanalları20,21 içeren mekanizmalar aracılığıyla sıvı akışına karşı oldukça hassastır ve bu mekanizmalar sızıntıyı, inflamasyonu ve endotelyal yeniden programlamayı22,23,24 aktive edebilecek sinyallemeleri yürütür. Bu nedenle, kıvrımlı vasküler geometriye verilen endotelyal yanıtları inceleyen yöntemler, vasküler tedavilerin geliştirilmesi için önemlidir.

Vasküler hastalık durumlarındaki endotelyal fonksiyonlar, in vivo hayvan modelleri, çip-üstü-organ (OOC) sistemleri ve biyobasım yaklaşımları kullanılarak modellenmiştir. Fare modelleri, bilinen hastalık-gen ekspresyonunun kontrol edilmesine olanak tanır ve mural ve immün hücre katılımı dahil olmak üzere doku mimarisinin ve fizyolojisinin karmaşıklığını bünyesinde barındırır. Ateroskleroz25, Marfan sendromu26 ve çeşitli anevrizmaların27,28,29 fare modelleri, vasküler disfonksiyon ile ilişkili patolojilere dair öngörüler sağlar. Bu avantajlara rağmen, RNA sekanslama gibi toplu yöntemlerin dışında, endotelyal hücrelerin doğrudan gözlemlenmesi, deneysel olarak manipüle edilmesi ve kantifikasyonu zordur. Ayrıca, hayvan modelleri etik ve maliyet hususları barındırır ve türe özgü fizyoloji ile sınırlıdır.

Laminar ve türbülanslı akışa karşı insan endotel yanıtlarını incelemek için hem 2D33,34 hem de 3D35,36,37 sistemlerde çeşitli in vitro OOC yaklaşımları geliştirilmiştir30,31,32. Kapsamlı OOC literatürü38, büyük ölçüde spesifik biyomedikal soruları yanıtlayan tasarım özelliklerine sahip biyomedikal mühendislik tarafından yönlendirilmiştir. Birçok vasküler OOC modeli, damar mimarisini kontrol etmek için polidimetilsiloksan (PDMS) destekler kullanmaktadır38. Bu modeller, karmaşık geometrilerin yüksek çözünürlüklü kontrolünü sağlar ve karaciğer39, beyin40 ve akciğer41 dahil olmak üzere organ-damar etkileşimlerinin modellenmesine olanak tanır. Ancak, bazı kısıtlamalar devam etmektedir. PDMS ve benzeri polimerlerin makromoleküllere karşı düşük geçirgenliği, vasküler bariyer fonksiyonu çalışmalarını sınırlayabilir. Ayrıca, alternatif formülasyonlar 8–200 kPa43 gibi daha fizyolojik aralıklara ulaşabilse de, kürlenmiş çoğu PDMS'nin sertliği yaklaşık 0.8–10 MPa'dır42. Vasküler bazal membran sertliği tahminleri, damar tipine ve ölçüm metodolojisine bağlı olarak ~350 Pa44 ile ~70 kPa45 arasında değişmekte olup, sağlıklı vasküler bazal membranların çoğu 2–3 kPa aralığındadır46. Ateroskleroz ve hipertansiyon gibi vasküler hastalıklar kısmen artmış hücre dışı matris (ECM) sertliği ile ilişkili olduğundan47,48,49,50,51 ve endotel hücreleri ECM sertliğine yanıt verdiğinden, in vitro modellerde sertliğin fizyolojik aralıklarda kontrol edilmesi önemlidir. Daha yeni OOC yaklaşımları; karmaşık geometrilere izin veren fizyolojik substratlar kullanmakta52,53, organ fonksiyonunu39,54,55,56,57 veya immün-vasküler etkileşimleri58 yeniden oluşturmak için birden fazla hücre tipini bünyesine katmakta, hastaya özgü vasküler yapıları modellemekte59,60 ve preklinik ilaç geliştirmesini desteklemektedir61,62. Diğer hücre tipleriyle etkileşim içeren birçok mikrovasküler modelde, endotel hücreleri kendiliğinden nispeten kontrolsüz geometrilerde damarlar oluşturur63. Öte yandan, kontrollü akış altında tanımlanmış damar geometrilerine izin veren OOC sistemleri genellikle önemli mühendislik altyapısı, malzemeler ve uzmanlık gerektirmektedir53,64. Bu nedenle, fizyolojik olarak ilgili koşullar altında vasküler hücre davranış çalışmalarını kolaylaştırmak için uzman olmayanların da erişebileceği sağlam yöntemlere ihtiyaç vardır.

Fizyolojik ECM hidrojelleri ile uyumlu biyobaskı platformları, vasküler geometriler boyunca endotelyal fonksiyonun incelenmesi için çok yönlü in vitro modeller sunar65. Bu yaklaşımlar, ya endotelyal hücre içeren jellerin bir kan damarı şeklinde yönlendirilmiş depozisyonunu66 ya da ECM içine gömülü, daha sonra çözünebilen ve endotelyal hücrelerle ekilebilen bir lümen bırakan açık tübüler lümenler oluşturmak için feda edilebilir mürekkebi kullanır54. Jelatin, kolajen ve fibrin dahil olmak üzere biyolojik olarak uyumlu ECM substratları, vasküler bazal membran değerlerine (1–3 kPa67) yakın sertliklere ayarlanabilir ve in vivo kullanılanlara benzer vasküler geçirgenlik analizlerine izin verir. Bu yaklaşımlar, PDMS fabrikasyonu ile aynı şekil ve boyut çözünürlüğüne ulaşmasa da; kavisli, dallanmış ve stenotik damarlar oluşturulabilir52,66,68. Bu nedenle, söz konusu platformlar, kıvrımlı ve anevrizmal damarlar dahil olmak üzere vasküler geometrilerin modellenmesi için oldukça uygundur.

Burada sunulan yöntem; pnömatik ekstrüzyona dayalı bir 3D baskı yaklaşımı, üç boyutlu mikron ölçekli konumlandırma, baskı tablasının ve mürekkep içeren baskı kafasının sıcaklık kontrolü ve daha önce çip üzerinde renal-vasküler etkileşimler için geliştirilmiş bir feda edilebilir mürekkep kullanmaktadır67,69. Feda edilebilir mürekkep, istenen vasküler geometride basılır ve hemen ECM içine gömülür. Ardından gerçekleşen bir sıcaklık değişimi mürekkebi uzaklaştırarak, insan endotel hücreleri ile ekilen açık bir ECM lümeni bırakır. Temel ECM, hızlı jelleşmeyi ve trombin aracılı fibrin polimerizasyonunu mümkün kılan, aynı zamanda birçok vasküler bazal membrana uygun mekanik sertlik sağlayan jelatin ve fibrinden oluşur. Endotel yapışmasını teşvik etmek ve vasküler bazal membran bileşimini daha iyi taklit etmek için laminin veya fibronektin dahil ek ECM bileşenleri eklenebilir70,71,72. Sistem; metal destekler, silikon kauçuk contalar ve yüksek çözünürlüklü mikroskop lamelleri içeren, Luer-lock iğneler aracılığıyla bir sıvı pompasına bağlanmaya izin veren yeniden kullanılabilir Rose odacıkları içerisinde kurulur73. Alternatif olarak, üst ve alt plakalar polilaktik asit veya karbon fiber takviyeli malzeme kullanılarak 3D baskı ile üretilebilir. Kurulan sistem, fizyolojik sıvı akış hızlarının oluşturduğu basınçlara dayanıklıdır. Ayrıca, bir pastörizasyon prosedürü, feda edilebilir mürekkebin fiziksel özelliklerini değiştirmeden sterilitesini artırır. Ek olarak, iğne şablonu ve biyomürekkep yaklaşımı, bir biyoyazıcı olmadan anevrizma içeren düz damarların fabrikasyonuna olanak tanır. Ortaya çıkan endotelize tortuöz veya anevrizmal damarlar, fizyolojik akış altında yüksek çözünürlüklü ışık mikroskopisi ile yaklaşık bir hafta boyunca incelenebilir ve bu sayede değişmiş vasküler geometriye verilen akut endotel yanıtların araştırılmasına imkan sağlanır.

Bu sistemin temel bir avantajı, ışık mikroskobisi ile uyumlu olmasıdır. Bu protokol kullanılarak oluşturulan In vitro damarlar, çeşitli görüntüleme yöntemlerine uygundur ve özellikle dönen diskli veya lazer taramalı konfokal floresan mikroskobisi için oldukça elverişlidir. Görüntüleme koşulları seçilirken uzaysal ve zamansal çözünürlük, hassasiyet ve objektif merceğin çalışma mesafesi dikkate alınmalıdır. Bu sistemle oluşturulan çoğu damar için objektif merceğin, lamelden yaklaşık 100–300 µm derinliğe ulaşabilecek ve damarın orta noktasından görüntü alabilecek yeterli çalışma mesafesine sahip olması gerekir. Organeller ve hücre yapışmaları dahil olmak üzere endotelyal yapıların yüksek çözünürlüklü görüntülemesi ve akış altında fidüsyal boncukların izlenmesi gibi yüksek zamansal çözünürlük gerektiren canlı görüntüleme işlemleri için yüksek sayısal açıklıklı objektif mercekler gereklidir. Floresan tabanlı endotelyal bariyer ölçümleri gibi daha düşük foton yakalama verimliliği ile gerçekleştirilebilen bazı analizler, 10–20× hava objektif mercekler gibi daha düşük sayısal açıklıklı objektifler kullanılarak yapılabilir.

Protokol, fizyolojik sıvı akışını ve yüksek çözünürlüklü mikroskobiyi destekleyen bir in vitro sistemde, insan endotel hücrelerinden oluşan kıvrımlı ve anevrizmal damarların oluşturulmasını açıklamaktadır. İş akışı; damar tasarımını, hazne üretimini, feda edilebilir mürekkep hazırlama ve 3D baskıyı, ECM hazırlama ve mürekkebin uzaklaştırılmasını, endotel hücre ekimi ve akış altında kültürü, vasküler sızıntı değerlendirmesini, akış haritalamasını ve immünofloresan boyamayı içermektedir (Şekil 1).

Protokol

1. Kabın tasarımı

  1. Mikroskop uyumlu hazneye sığacak bir damar segmenti seçin. Rose haznesi için giriş ve çıkış rezervuarları arasında 1,6cm'den fazla mesafe bırakmayın.
  2. Kontrastlı BT anjiyografi (Şekil 2A), manyetik rezonans anjiyografi veya floroskopik anjiyografi görüntüsünü ImageJ/FIJI'ye veya başka bir görüntü analiz programına aktarın.
  3. Damarın aksiyel merkezi boyunca XY koordinatlarını tanımlamak için nokta ölçüm aracını kullanın. Koordinatları bir hesap çizelgesi programına aktarın (Şekil 2B).
    NOT: BT anjiyografiden türetilen STL dosyaları çoğu yazıcı yazılımına doğrudan aktarılabilir; ancak poligon tabanlı baskı, birden fazla geçiş gerektirebilir ve örgü benzeri damarlar oluşturabilir (Ek Şekil 1). Tek geçişli baskı için doğrudan G-code kullanın. Bu nedenle, G-code ile koordinat eşleme ve tasarım tercih edilir. Ek Dosyalar'daki örnek G-code'a bakın.
  4. Damar merkezini grafiksel başlangıç noktasına yerleştirmek için hesap çizelgesindeki XY koordinatlarını değiştirin. Gerekiyorsa, nihai baskının hazneye sığdığını doğrulamak için hazne sınırlarını aktarın.
  5. Damarı ilk baskı katmanında tasarlamak için damar XY koordinatlarını kullanın (Şekil 2C). Damar ile bitişik giriş ve çıkış rezervuarlarını içeren ilk katman yüksekliğini 200µm olarak ayarlayın.
  6. İğne yerleştirimini kolaylaştıracak giriş ve çıkış rezervuarları oluşturun. Giriş türbülansını minimize ederek sıvıyı damar girişine verimli bir şekilde yönlendirmek için uygun olduğunda elmas şeklinde rezervuarlar kullanın (Şekil 2).
  7. Rezervuarların damarla bitişik kalması için onları baskının ilk katmanına dahil edin. Giriş ve çıkış iğnelerini yerleştirmek için yeterli hacim sağlamak amacıyla taban katmanın üzerine 5–9 katman ekleyin. G-code tasarımı için aşağıdaki detaylar önemlidir:
    1. Sıcaklık kontrolü mevcut olduğunda, yazıcı yazılımını veya baskı dosyasının başındaki uygun G-code komutlarını kullanarak baskı kafasını ve baskı tablasını 37°C'ye ayarlayın.
    2. Birden fazla baskı kafası mevcut olduğunda, G-code içinde baskı kafasını veya ekstruderi belirtin. G-code'u mutlak koordinatları ve ekstrüzyon mesafelerini kullanacak şekilde yapılandırın.
    3. Katman yüksekliğini iğne boyutuna ve şekline, mürekkep akış basıncına ve baskı kafası hızına göre ayarlayın. Burada açıklanan örnekler için ilk katmanın üzerindeki her rezervuar katmanında 200µm katman yüksekliği kullanın.
    4. Rezervuarlar için 14–17psi karşı basınç ve 6mm/s (G-code: F360) baskı kafası hızı kullanın. Damar için baskı kafası hızını 15mm/s'ye (G-code: F900) çıkarın.
  8. Nihai damarı basmadan önce her yeni damar tasarımını haznesiz bir lam üzerinde test edin.

2. Feda edilebilir mürekkebin hazırlanması

  1. Steril bir manyetik karıştırıcı çubuk içeren, steril ve kapalı bir kapta %3,5 (w/v) çözelti hazırlamak için 60mL soğuk steril suya 2,1g polietilen oksit (PEO) ekleyin. 4°C'de en az 48 saat boyunca karıştırın ve tüm tozun çözündüğünü periyodik olarak doğrulayın.
    NOT: PEO çözeltisini hava sızdırmayan bir kapta 4°C'de 1 aya kadar saklayın.
  2. Steril bir manyetik karıştırıcı çubuk içeren, steril ve kapalı bir kapta %35'lik bir çözelti hazırlamak için 50mL soğuk steril suya 17,5g Pluronic F-127 ekleyin. 4°C'de en az 48 saat boyunca karıştırın ve tozun tamamen karıştığını periyodik olarak doğrulayın.
  3. Steril 50mL'lik konik bir tüpe 11,4mL soğuk %3,5 PEO ile 28,6mL soğuk %35 Pluronic F-127 ekleyin. Bir döner karıştırıcıda 4°C'de en az 24 saat boyunca karıştırın.
  4. Kabarcıkların çözeltiden yükselip çıkmasını sağlamak için tüpü 4°C'de gece boyunca dik konumda bekletin.
  5. Mürekkep içeren konik tüpü bir su banyosuna yerleştirin ve 63°C'de 3 saat boyunca inkübe edin. Genleşen havanın çıkmasına izin vermek için ısıtma sırasında kapağı hafifçe açık bırakın.
  6. Tüpü su banyosundan çıkarın ve oda sıcaklığına kadar yavaşça soğumasını bekleyin. Çözelti soğuduktan sonra kapağı sıkıca kapatın.
  7. Pastörize edilmiş mürekkebi 2 saat boyunca buz üzerinde bekletin ve kabarcık oluşturmadan ara ara nazikçe çalkalayın.
  8. Şırınga pistonunu çıkarın, iğne girişini kapatın ve şırıngayı kapasitesinin %60-70'i oranında doldurun. Pistonu yerleştirin, şırıngayı ters çevirin, iğne girişi kapağını çıkarın ve hapsolmuş tüm havayı tahliye edin.
    NOT: Dolu şırıngaları oda sıcaklığında 1 aya kadar saklayın.

3. Rose odasının imal edilmesi ve tesisatın hazırlanması

  1. Üst ve alt sıkıştırma plakalarını alüminyumdan imal edin veya sağlanan CAD/STL dosyalarını kullanarak plakaları 3D yazıcıyla basın (Şekil 2). Yüksek sayısal açıklıklı objektif merceğin erişimi için yeterince büyük, eğimli bir alt port ve lamları contaya karşı güvenli bir şekilde sıkıştıran vidalar için bir destek kenarlığı ekleyin.
    NOT: Alüminyum, ısıtmalı sahne mikroskobisi sırasında daha iyi ısı transferi sağlar. 3D yazıcıyla basılmış PLA veya karbon fiber takviyeli parçalar prototipleme için uygundur ancak daha düşük ısı transferi sağlayabilir ve tekrarlanan ısıtma işlemlerinde deforme olabilir.
  2. Silikon levhayı 38mm × 51mm boyutundaki sıkıştırma plakalarına uygun olacak şekilde kesin. 18mm'lik bir delme aparatı kullanarak merkezi izleme penceresini oluşturun.
  3. Seçilen vida çapına uygun delikleri delin. Kalan silikon kalıntılarını temizlemek için tamamlanan contayı suyla iyice durulayın.
  4. Metal sıkıştırma plakalarını, vidaları, somunları ve silikon contaları, kapalı bir alüminyum folyo poşeti içinde 20 dakikalık kuru döngüde otoklavlayın.
  5. 3D yazıcıyla basılmış plakaları 1 dk boyunca %70 etanol içinde bekletin. Plakaları steril bir alanda kurutun.
  6. Luer-lock konnektörler ve hat içi tüp kelepçeleriyle donatılmış 10–30cm uzunluğunda tüpler, uygun peristaltik pompa tüpleri, üç yollu bir musluk, bir darbe sönümleyici ve iki portlu bir medya rezervuarı hazırlayın (Şekil 3).
  7. Isıya dayanıklı tüpleri ve rezervuar bileşenlerini otoklavlayarak sterilize edin. Otoklavlanamayan bileşenleri etanola maruz bırakarak sterilize edin.

4. Hücre dışı matris reaktiflerini hazırlayın

  1. 80mg/mL'lik bir stok çözelti hazırlamak için 1g insan plazma fibrinojenine 37°C'de ısıtılmış 12.5mL PBS ekleyin. 37°C'de inkübe edin ve vortekslemeden ara ara nazikçe çalkalayın.
  2. Fibrinojenin çözülerek bulanık bir çözelti oluşturması için 1–2 saat bekleyin. Çözeltiyi steril tüplere paylaştırın ve −20°C'de 3 aya kadar saklayın.
  3. Manyetik karıştırma çubuğu içeren steril bir şişedeki 135mL steril PBS'ye 22.5g jelatin ekleyin. Tam çözünmeyi sağlamak için şişeyi periyodik olarak çalkalayarak 70°C'de 16 saat boyunca karıştırın.
  4. Jelatin çözeltisinin pH değerini 1M NaOH kullanarak pH 7.5'e ayarlayın. Çözeltiyi sıcakken vakum filtrelemesi yapın, paylaştırın ve 4°C'de 6 aya kadar saklayın.
    NOT: Filtrasyondan önce jelatinin şişmesi için en az 16 saat bekleyin. Filtre tıkanmasını en aza indirmek için vakum filtrasyonu sırasında çözeltiyi ve filtrasyon düzeneğini 37°C'de tutun.
  5. İnsan plazma trombini steril PBS içinde 1,000 U/mL olacak şekilde çözün. Nazikçe karıştırın, paylaştırın ve −20 °C'de 1 yıla kadar saklayın.
  6. 300mg transglutaminazı 5 mL PBS içinde çözün ve ara ara karıştırarak 37°C'de 1 saat inkübe edin. Çözeltiyi steril filtre ile yeni bir tüpe aktarın ve oda sıcaklığında muhafaza edin.
    NOT: Transglutaminaz çözeltisini her gün taze olarak hazırlayın. Toz transglutaminazı 4°C'de kurutulmuş olarak saklayın.
  7. 1M'lik bir çözelti hazırlamak için kalsiyum klorürü suyla çözün. Çözeltiyi steril filtreleyin ve oda sıcaklığında 1 yıla kadar saklayın.

5. Lamineklerin hazırlanması ve aktive edilmesi

  1. Temiz lamelleri etanola batırın, ardından etanolün buharlaşması için lamelleri dikkatlice Bunsen beki alevinin üzerinden geçirin.
    UYARI: Etanol yanıcıdır. Toplu halde bulunan etanolü açık alevden uzak tutun ve alevle sterilizasyon işlemini uygun laboratuvar yangın güvenliği prosedürlerini kullanarak gerçekleştirin.
  2. Lamelleri, camı çatlatmadan veya kırmadan paslanmaz çelik bir rafa yerleştirin.
  3. Lamelleri, suda seyreltilmiş %0,5 (3-aminopropil) trimetoksisilana oda sıcaklığında 30–60 dk boyunca daldırın. İnkübasyon sırasında hafifçe çalkalayın.
    UYARI: (3-aminopropil) trimetoksisilanı uygun kimyasal koruyucu ekipman ve mühendislik kontrollerini kullanarak işleyin.
  4. Lamelleri, hafif çalkalama eşliğinde altı kez taze su ile yıkayın. Rafı taşırken lamellerin yerinden çıkmasını önleyin.
  5. Rafı sudan çıkarın, fazla suyu kurulama kağıdıyla alın ve 50°C'de 30 dk boyunca kurutun.
  6. PBS içinde %0,5 glutaraldehit hazırlarken lamellerin oda sıcaklığına soğumasını bekleyin.
    UYARI: Glutaraldehit toksik ve irritandır. Çözeltiyi, uygun kişisel koruyucu ekipman giyerek, uygun bir kimyasal çeker ocak içerisinde hazırlayın ve işleyin.
  7. Hava kabarcığı birikimini en aza indirmek ve homojen aktivasyonu sağlamak için lamelleri %0,5 glutaraldehit içinde 60 dk boyunca hafif çalkalama ile inkübe edin.
  8. Lamelleri üç kez steril su ile durulayın ve oda sıcaklığında havada kurumaya bırakın.
    NOT: Aktive edilmiş lamelleler vakumlu desikatörde 2 aya kadar saklanabilir.

6. Lamelleri hücre dışı matriks taban katmanı ile kaplayın

  1. 1× PBS, jelatin stoğu ve fibrinojen stoğunu 30–60 dk boyunca 37°C'de ısıtın.
  2. Steril 15 cm'lik bir Petri kabının içini temiz parafilm ile kaplayın, yüzeyi %70 etanol ile püskürtün, fazlalığı süzün ve yüzeyin biyogüvenlik kabininde hava ile kurumasını bekleyin.
  3. 15 mL'lik konik bir tüpe sırasıyla 1,68 mL sıcak PBS, 2,5 mL jelatin stoğu, 12,5 µL 1M CaCl₂, 625 µL fibrinojen stoğu ve 167 µL transglutaminaz çözeltisi ekleyin.
  4. ECM karışımını 30 dk boyunca 37°C'lik su banyosunda bekletin.
  5. Her bir lamel için 5 µL trombin stoğu içeren bir adet 1,7 mL'lik tüp hazırlayın.
  6. Trombin tüpüne 400 µL ECM hazırlığı ekleyin ve kabarcık oluşumunu minimize ederek bir kez pipetleyerek karıştırın.
  7. Karışımın 200 µL'sini hemen steril parafilmin üzerine boşaltın ve bir pens yardımıyla aktive edilmiş bir lameli damlanın üzerine yerleştirin. Tam kaplama sağlamak için hafifçe bastırın.
    NOT: Bu adımı, ECM karışımı ile trombini birleştirdikten sonra yaklaşık 20 saniye içinde tamamlayın.
  8. Petri kabının ağzını kapatın ve kaplanmış lamelleri önce oda sıcaklığında 10 dk, ardından nemlendirilmiş bir inkübatörde 37°C'de 2 saat inkübe edin.
  9. Parafilmi lamelden uzağa doğru bükerek her bir lameli parafilmden nazikçe soyun.
  10. Yeni kaplanmış lamelleri jel tarafı yukarı bakacak şekilde nemlendirilmiş bir inkübatördeki temiz bir Petri kabına yerleştirin ve 1 gün içinde kullanın.
  11. Alternatif olarak, kaplanmış lamelleri nemlendirilmemiş bir inkübatörde gece boyu inkübe edin ve 2 gün içinde kullanın.

7. Fedakâr mürekkebin biyobaskısını yapın ve ECM içinde kapsülleyin

  1. Mürekkebin ve baskı parametrelerinin istenen damar boyutlarını oluşturduğunu doğrulamak için damarı basmadan önce test baskıları gerçekleştirin. Baskı dosyasını yazıcı yazılımına yükleyin.
    NOT: %25 Pluronic F127/ %1 PEO mürekkebi ile kullanılan 32 G konik dağıtım iğnesi, burada açıklanan koşullar altında yaklaşık 150µm'ye kadar olan damar çaplarını güvenilir bir şekilde üretir. Cam üzerine basit çizgi baskıları yaparak baskı kafası hızını ve geri basıncı optimize edin.
  2. Alt sıkıştırma plakasını, ECM kaplı alt lamı, silikon contayı, üst lamı olmayan üst sıkıştırma plakasını ve iki vidayı monte edin. Düzeneneği kapalı bir 100 mm Petri kabına yerleştirin ve aynı gün kullanılana kadar 37 °C'de muhafaza edin.
  3. Baskı iğnesini mürekkep şırıngasına takın ve şırıngayı pnömatik ekstrüzyon yazıcısına yerleştirin. Baskı tablasını, baskı kafasını ve yanındaki ısıtma plakasını 37 °C'ye kadar önceden ısıtın.
  4. Bölüm 6'da açıklandığı gibi ECM matriksini hazırlayın ve 37 °C'lik su banyosunda tutun. Her Rose odası için 1,5 mL matriksi 5 mL'lik seriler halinde hazırlayın.
  5. Her oda için steril bir 1,7 veya 2 mL'lik tüpe 5 µL trombin stoğu yerleştirin. Biyogüvenlik kabininde ek olarak aktive edilmiş, kaplanmamış lamları hazır bulundurun.
  6. ECM kaplı lamı içeren odayı yazıcı tablasına yerleştirin ve XY başlangıç noktasına ortalayın. İğneyi, oda penceresinin merkezindeki ECM veya cam yüzeye temas edene kadar indirin ve bu konumu XYZ başlangıç noktası olarak tanımlayın.
  7. İğneyi kaldırın ve tamamen mürekkeple doldurmak ve görünür tüm kabarcıkları dışarı atmak için maksimum basınç uygulayın. İğne ucunu steril bir laboratuvar mendiliyle silin.
  8. Yüklenen G-kodu dosyasını kullanarak damar ve rezervuar geometrisini basın. Baskıdan hemen sonra iğneyi kaldırın ve odayı çıkarın.
  9. Basılan damarı kabarcıklar ve süreksizlikler açısından inceleyin. Bu kusurlardan herhangi birini içeren yapıları atın ve yeniden basın.
  10. Odayı 37 °C'lik ısıtma plakasına yerleştirin, vidaları ve üst sıkıştırma plakasını çıkarın ve 1 mL hazırlanmış ECM matriksini, bir kez pipetleyerek trombin alikotuyla karıştırın.
  11. Aktive edilmiş ECM karışımını, kabarcık oluşturmadan damar odasına aktarın ve hemen üzerine aktive edilmiş bir lamı yüzey aşağı gelecek şekilde yerleştirin. Üst sıkıştırma plakasını geri takın ve vidaları aşırı sıkmadan, tam oturduğu noktaya kadar sıkın.
  12. Tamamlanan odayı kapalı bir 100 mm Petri kabına yerleştirin ve 2 saat boyunca 37 °C'de inkübe edin.

8. Tel şablon kullanarak anevrizma oluşturma

  1. 21 gauge iğneleri silikon contanın karşıt taraflarından geçirin ve hizalayın.
  2. 0,0190 inç çapındaki 304 paslanmaz çelik tıbbi mandrel telini, 15 mL'lik konik bir tüp içindeki %1 BSA içeren PBS içinde sonikasyona tabi tutun. Teli çıkarın ve biyogüvenlik kabini içindeki steril bir Petri kabında havada kurumaya bırakın.
  3. BSA kaplı teli, contadaki her iki iğnenin içinden geçirin (Şekil 2). Sonraki rotasyonu kolaylaştırmak için dışarıda kalan uçlardan birini hafifçe bükün.
  4. Conta, iğne, tel ve klempli plaka düzeneğini folyo bir poşet içinde otoklavlayın.
  5. İğne/conta düzeneğini aktive edilmiş, ECM kaplı bir lamelle hizalayın.
  6. Pastörize Pluronic/PEO mürekkebi içeren bir şırıngaya 21 G iğne takın.
  7. Kamberin merkezindeki telin yan tarafına küçük bir damla feda edilebilir mürekkep damlatın. Sızdırmazlık sağlamak için her bir iğne-tel birleşim noktasına küçük bir damla mürekkep uygulayın.
  8. ECM karışımını hazırlayın ve kamberi Bölüm 7.10–7.12'de açıklandığı şekilde monte edin.
  9. ECM jel haline geldikten sonra, teli ECM ve feda edilebilir mürekkepteki tutuculuğundan kurtarmak için telin bükülmüş ucunu nazikçe döndürün. Teli cihazdan yavaşça geri çekin.
  10. Giriş iğnesini 200 µL'lik bir pipet kullanarak PBS ile doldurun ve PBS'nin lümenden boşalmasını sağlayın. İşlemi bir kez tekrarlayın ve Bölüm 9'a geçin.

9. Fedakarlık mürekkebini kap haznesinden boşaltın

  1. Antibiyotiklerle desteklenmiş soğuk (4 °C) PBS içeren bir rezervuara boruları bağlayın, üç yollu bir musluk ekleyin ve borunun ucunu erkek Luer-lock bağlantı parçası ve steril 23 G iğne ile sonlandırın.
  2. Besleme borusunu, PBS iğne ucundan çıkana kadar musluk şırıngasını kullanarak soğuk PBS ile doldurun. Boruyu klempleyin.
  3. İkinci bir boru parçasını PBS ile doldurun ve ucunu 23-G iğne ile sonlandırın. Boruyu klempleyin ve doldurma şırıngasını çıkarın.
  4. Besleme iğnesini conta üzerinden giriş rezervuarına, drenaj iğnesini ise çıkış rezervuarına yerleştirin. Yerleşimin doğruluğunu ters mikroskop veya stereomikroskop kullanarak onaylayın.
  5. Düzeneyi 4 °C'ye taşıyın ve besleme rezervuarını girişin 30 cm üzerine konumlandırın. Çıkış kısmını, bir atık kabı üzerinde, kap çıkış iğnesinin 5–10 cm altına yerleştirin.
  6. Klempleri serbest bırakın ve oda içerisinden en az 250 mL soğuk PBS geçirin. Yıkama sırasında sistemde sızıntı ve hava kabarcığı olup olmadığını kontrol edin.

10. Kap vessel lümenini ek ECM bileşenleri ile kaplayın ve ön işlemden geçirin

  1. Fibronektini 20 µg/mL'ye, laminini 10 µg/mL'ye veya bazal membran matriksini 3 mL PBS içerisinde 1:30 dilüsyonuna seyreltin.
  2. Seyreltilmiş ECM reaktifine taze hazırlanmış transglutaminaz ekleyin.
  3. Damarın hemen proksimalindeki tüplerin giriş ve çıkışa bağlı kalmasını sağlayın.
  4. ECM/transglutaminaz çözeltisini 1 mL'lik bir şırınga kullanarak damar boyunca yavaşça enjekte edin. 3 mL'nin tamamı damardan geçene kadar işlemi tekrarlayın.
  5. Konnektörleri klempleyin, girişi ve çıkışı steril Luer kapaklarla kapatın ve 37 °C'de 1 saatten bir geceye kadar inkübe edin.
  6. Damarı, penisilin/streptomisin içeren 100 mL komplet endotelyal medium ile yıkayın. Tüp konnektörlerini klempleyin ve çıkışları kapakla kapatın.
    NOT: Medium ile dolu damarı 4 °C'de 1 haftaya kadar saklayın. Lümen içerisinde hiç hava kabarcığı kalmadığından emin olun.

11. Kabı hücreselleştirin

  1. ECM damar şablonunu içeren hazneyi 37 °C'de 2 sa boyunca inkübe edin. Penisilin/streptomisin içeren komple endotelyal medyumu 37 °C'ye kadar ısıtın.
  2. Bir adet 10-cm'lik kültür kabındaki veya bir adet T75 flasktaki endotelyal hücreleri tripsinizleyin ve tripsini komplele medium ile nötralize edin. Süspansiyonu 15 mL'lik konik bir tüpe aktarın ve hücre sayımı için bir alikot alın.
  3. Hücreleri 1.000 × g hızında 5 dk boyunca santrifüj edin. Pellet'i, 5 × 106 hücre/mL konsantrasyonda 150 µL hücre süspansiyonu hazırlayacak şekilde resüspande edin.
  4. Çıkış borusunu steril bir atık rezervuarına bağlayın ve boru kenetini (clamp) kapalı tutun.
  5. Giriş borusunu sökün ve giriş iğne göbeğindeki kalıntı medyumu temizleyin. Damarı dikey tutun ve hücre süspansiyonunu iğne göbeğine pipetleyin.
  6. Hücre süspansiyonunun damara girmesi için çıkış kenetini açın. Süspansiyonun tamamı lümene girdikten sonra çıkışı tekrar kenetleyin.
  7. Giriş iğne göbeğine ılık, komplele medium ekleyin ve ardından steril bir Luer kapak ile kapatın. Çıkış borusunu sökün ve kapakla kapatın.
  8. Hazneyi düz konumda 37 °C'de 3 sa boyunca inkübe edin.
  9. Bölüm 11.5–11.8'deki adımları tekrarlayın ve hazneyi ters konumda 37 °C'de 3 sa boyunca inkübe edin.
  10. Damarı 1 mL komplele medium ile nazikçe yıkayın ve 37 °C'de 3 sa boyunca inkübe edin.
  11. Endotelyal tutunmayı mikroskopi ile doğrulayın, tutunmamış kalan hücreleri taze medium ile nazikçe yıkayarak uzaklaştırın ve 37 °C'de 12–24 sa boyunca inkübe edin.

12. Kabı akış altında kültüre edin

  1. 200 mL komple medyumu 1 saat boyunca ısıtın ve steril bir filtre ünitesi kullanarak vakum altında gazını giderin. Medyumu nemlendirilmiş bir CO₂ inkübatöründe tekrar ısıtın.
  2. Steril bir biyogüvenlik kabininde; medya rezervuar çıkışını ve üç yollu musluğu, pompa tüpünü, darbe sönümleyiciyi, isteğe bağlı hava kabarcığı tuzağını, giriş tüpünü, damar odasını, çıkış tüpünü ve dönüş tüpünü sırasıyla medya rezervuarına bağlayın (Şekil 3).
  3. Tüm akış devresini medyum ile doldurun ve hiç hava kabarcığı veya hava boşluğu kalmadığını doğrulayın.
    NOT: Yeniden bağlamadan önce konnektör ve iğne göbeklerini sıvı ile doldurun. Hücre ekimi yapılmış bir damara giren hava kabarcıkları, ani makaslama kuvvetleri nedeniyle endotel hücre kaybına neden olabilir.
  4. Düzeneği 37 °C'lik bir inkübatöre aktarın ve damarda 1 dyn/cm2 akış hızı başlatın. Bu akışı 12 saat boyunca sürdürün.
  5. Akışı 12–16 dyn/cm2 oluşturacak şekilde artırın ve downstream analizlerini gerçekleştirmeden önce 18–24 saat boyunca sürdürün. Damarınız için gerekli akış hızını hesaplamak için, basılı damar uzunluğunu ve ortalama çapını belirleyin. Çevrimiçi bir hesaplayıcı kullanarak, belirlenen parametreleri girin; dairesel bir kesit, %10 serumlu medya ve ihmal edilebilir tüp direnci (tüpler basılı damardan çok daha büyük bir çapa sahiptir) değerlerini tanımlayın.
    NOT: Damarı akış koşullandırmasından sonra mümkün olan en kısa sürede kullanın. 1 haftayı aşan kültürler, endotel hücreler arasında boşluklar oluşmasına neden olabilir; bu durum hücre kaybı veya endotel proteazlar tarafından ECM modifikasyonu ile ilişkili olabilir.

13. Vasküler sızıntı analizini gerçekleştirin

  1. 5 mg/mL final konsantrasyon elde etmek için 35 mL komple medyuma Alexa 647 ile işaretlenmiş BSA veya 10 kDa Alexa 647 dekstran ekleyin. Çözeltiyi 37 °C'ye ısıtın.
  2. Damarı, 250 ng/mL TNFα gibi test ajanı ile 1–2 saat ön inkübasyona tabi tutun ve aynı ajanı assay medyuma da ekleyin.
  3. 37 °C'lik bir su banyosu hazırlayın ve pompayı mikroskobun yanına yerleştirin. Mikroskobu, görüntüleme yazılımını ve tabla ısıtma sistemini çalıştırın; görüntülemeden önce tablayı 30 dakika boyunca 37 °C'de dengeleyin.
  4. İnkübatördeki akışı durdurun, kültür medyumu rezervuarını ayırın ve hazne ile ilgili tüpleri önceden ısıtılmış mikroskop tablasına aktarın.
  5. Pompayı, içinde işaretlenmemiş medyum bulunan cam bir mikropipet takılmış yaklaşık 20 cm'lik bir tübe bağlayın. Mikropipet tüpünü floresan raporlayıcı medyumun içine yerleştirin ve çıkış tüpünü bir toplama kabına koyun.
  6. Pompayı 0,2 mL/min'e karşılık gelen bir akış hızına ayarlayın ve görüntüleme hazır olana kadar akışı başlatmayın.
  7. Faz-kontrast görüntüleme kullanarak damar orta hattına odaklanın ve 647 floresan kanalına geçiş yapın. Akışı Bölüm 13.6'da belirlenen hızda başlatın ve beklenen yanıt süresine göre her 1–5 dakikada bir görüntüler alın.
  8. Elde edilen görüntülerden kymographlar oluşturun ve eşiklenmiş yoğunluk değerlerine doğrusal bir eğim uydurun. Sızıntıyı, raporlayıcının dış damar yüzeyinden dakikada katettiği µm cinsinden mesafe olarak raporlayın.

14. Akışkan akışını haritalandırın

  1. 10 µm floresan boncukları 1 dk boyunca vorteksleyin, ardından banyo sonikatörde 1 dk boyunca sonikasyona tabi tutun. Boncukları 10 mL tam besiyeri içerisinde 1.8 × 105beads/mL konsantrasyonuna seyreltin.
  2. Mikroskop tablasındaki akış sistemini, vasküler sızıntı deneyi için Bölüm 13'te açıklandığı şekilde yapılandırın. Bir çıkış toplama kabı ekleyin ve akış hızını 0.2 mL/min olarak ayarlayın.
  3. Uygun çalışma mesafesine sahip bir objektif kullanarak damarın merkezi düzlemine odaklanın. Pozlama süresi, detektör hassasiyeti, eksitasyon yoğunluğu ve ışık toplama verimliliğinin izin verdiği maksimum pratik frekansta görüntüler elde edin.
  4. Zaman ayarlı görüntü sekansını, parçacık görüntü velocimetrisi (particle image velocimetry) yazılımı kullanarak analiz edin.

15. Endotelleştirilmiş damarı fikse edin ve immünboyama yapın

  1. 10 mM CaCl₂ ve 10 mM MgCl₂ içeren PBS içinde 40 mL %4'lük paraformaldehit hazırlayın.
    UYARI: Paraformaldehit toksiktir. Paraformaldehit içeren çözeltileri, uygun kişisel koruyucu ekipman giyerek uygun bir kimyasal çeker ocak altında hazırlayın ve işlem yapın.
  2. Akışı durdurun, giriş borusunu kıskaçla kapatın, pompadan ayırın ve vasküler sızıntı analizi için kullanılan çekme borusuna bağlayın. Çekme borusunu fiksatifin içine yerleştirin ve yerçekimi yardımıyla damar içinden 35 mL geçmesini sağlayın.
  3. Boruyu kıskaçla kapatın ve damarı fiksatif içinde oda sıcaklığında 30 dk inkübe edin.
  4. Damarı yerçekimi yardımıyla %0,4 Triton, pH 6,1'de 20 mM PIPES, 138 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM MgCl₂, 2 mM EGTA ve 5,5 mM glukoz içeren 25 mL permeabilizasyon tamponu ile yıkayın. Boruyu kıskaçla kapatın ve oda sıcaklığında 10 dk inkübe edin.
  5. Damarı %1 BSA, %0,05 Tween 20, pH 7,4'te 20 mM Tris, 140 mM NaCl ve 5 mM KCl içeren bloklama tamponu ile yıkayın. Oda sıcaklığında 2 sa veya 4 °C'de gece boyu inkübe edin.
  6. Seçilen primer antikoru 100–500 µL bloklama tamponu içinde 1:50–1:500 oranında dilüe edin. Giriş borusunu çıkarın ve Bölüm 11'de hücre ekimi için açıklanan prosedürü kullanarak antikor çözeltisini tanıtın.
  7. Damarı 4 °C'de gece boyu inkübe edin.
  8. Giriş borusunu tekrar bağlayın ve damarı 20 mL PBS ile yıkayın.
  9. Uygun sekonder antikorları bloklama tamponunda 1:200–1:1.000 oranında dilüe edin ve gerektiğinde 1:250 oranında floresan falloidin ekleyin. Çözeltiyi Bölüm 15.6'da açıklanan prosedürü kullanarak tanıtın ve oda sıcaklığında 2 sa inkübe edin.
  10. Damarı 40 mL PBS ile yıkayın, boru kıskaçlarını kapatın ve boruyu tıpayın.
    NOT: Boyanmış damarı 4 °C'de saklayın ve 2 hafta içinde görüntüleyin.
  11. F-aktini floresan falloidinle, Golgi aygıtını anti-GM130 ile ve çekirdekleri DAPI ile boyayın.
  12. F-aktin stres liflerinin ortalama yönelimini belirlemek için phalloidin görüntülerini FibrilTool74 kullanarak analiz edin.
  13. Her bir çekirdeğin ve Golgi aygıtının kütle merkezleri arasındaki ekseni belirleyin. Elde edilen yönelimleri, daha önce açıklandığı üzere75 sayısal hesaplama yazılımında analiz edin ve grafiğe dökün.

Sonuçlar

Çeşitli tübüler dokuları yazdırmak için feda edilebilir mürekkebin kullanımı, özellikle böbrek tübülleri ile birlikte kan damarları üreten Lewis laboratuvarı başta olmak üzere birkaç grup tarafından iyi bir şekilde ortaya konmuştur67,76. Benzer yaklaşımlar alveol yapılarını77 ve vaskülarize tümörleri78 yazdırmak için kullanılmıştır. Burada, bu yaklaşımlar, fizyolojik sıvı akışı altında endotelyal yanıtları incelemek için vasküler geometriler oluşturmak üzere uyarlanmıştır (Şekil 2). Damar geometrileri, bir vasküler görüntüden bir koordinat haritasına ve ardından yazdırma yolunu tanımlamak için G-koduna dönüştürülmüştür (Şekil 2A–C). Ortaya çıkan bu yaklaşım, endotelyal fonksiyonun ve hücre iskeleti organizasyonunun kıvrımlı damarlar ve anevrizmalar tarafından nasıl değiştirildiğini incelemek için damar şablonlarının üretilmesini sağlamıştır (Şekil 2D–G). Makine servislerine erişim ihtiyacını ortadan kaldırmak için 3B yazdırılabilir bir Rose haznesi tasarımı da eklenmiştir (Şekil 2H). Damar yazdırma için örnek bir G-kodu dosyası Ek Dosya 1'de sunulmuş; karşılık gelen Rose haznesi ve sahne montajı CAD dosyaları ise sırasıyla Ek Dosya 2 ve Ek Dosya 3'te verilmiştir. STL tabanlı yazdırma, birden fazla yazıcı kafa geçişi gerektirebilir ve bu da ayrı lümenlere sahip örgü şeklinde damar geometrileriyle sonuçlanabilir (Ek Şekil 1). Ortaya çıkan platform, fizyolojik basınç ve akış hızlarını desteklerken ve yüksek çözünürlüklü mikroskopiye erişim sağlarken, minimum biyomühendislik uzmanlığına sahip vasküler hücre biyologları tarafından erişilebilir olacak şekilde tasarlanmıştır (Şekil 2I).

Damar üretimi ve hücreleştirme işlemlerinin ardından, kontrollü medya sirkülasyonunu sağlamak amacıyla damar düzeneği kapalı döngü bir perfüzyon sistemine entegre edildi (Şekil 3). Sistem; akış devresi boyunca sıralı olarak yerleştirilmiş bir peristaltik pompa, hazırlama şırıngasına bağlı üç yollu bir musluk, bir hava kabarcığı tuzağı, bir puls sönümleyici, damar düzeneği ve bir medya rezervuarından oluşmaktaydı (Şekil 3A). Bu konfigürasyon, sistem hazırlama, kabarcık giderme ve peristaltik pompanın oluşturduğu pulsasyonların sönümlenmesi için gerekli bileşenleri içerirken, medyanın mühendislik ürünü damar boyunca sürekli olarak sirküle etmesine olanak tanıdı. Kurulan sistem, Şekil 3B'de gösterildiği gibi damar düzeneği deneysel düzenek içerisine yerleştirilmiş halde çalıştırılabilir; bu da hücreleştirilmiş damarların kontrollü akış koşulları altında sonraki perfüzyon işlemleri için pratik bir konfigürasyon sağlar.

Daha önce açıklanan kurban mürekkep yaklaşımlarına yapılan bir modifikasyon, mürekkebin baskı öncesinde pastörize edilmesiydi. Yayınlanmış mürekkep hazırlama protokollerinin uygulanması küflü kültürlerle sonuçlandığı için bu modifikasyon gerekli hale gelmişti. Bu uygulama için kullanılan diğer Pluronic bazlı mürekkeplerde olduğu gibi, %25 Pluronic F127/%1 PEO mürekkebi düşük sıcaklıklarda sıvı halde kalır ve sıcaklık arttıkça sıkı paketlenmiş misellerden oluşan bir jele dönüşür. Bu formülasyonun geçiş sıcaklığı şudur: 15°Cinkübatör sıcaklıklarında yapıların kalıplanması ve mürekkebin uzaklaştırılması için uygun olan 4°CSaf Pluronic'e benzer şekilde, bu materyal de baskı sıcaklığında belirgin bir kayma incelmesi sergilemektedir (Şekil 4A). Ancak, düşük sıcaklıklarda bile mürekkep, standart doku kültürü filtreleri ve vakum kullanılarak yapılan filtre sterilizasyonu için çok vizkozdur. Mürekkep, şu sıcaklıkta pastörizasyon ile sterilize edilebilse de 70°C 20 saniye boyunca bu sıcaklık veya daha yüksek sıcaklıklara maruz kalmak, mürekkebi geri döndürülemez şekilde değiştirir ve baskı sıcaklığındaki viskozitesini azaltır (veriler gösterilmemiştir). Daha düşük sıcaklıkta, daha uzun süreli pastörizasyon ise 63°C için >1 saatlik süre, mürekkebin baskıya uygun sıcaklıklardaki kompleks viskozitesini değiştirmeden mantarlar ve diğer mikroorganizmalar tarafından oluşturulan kontaminasyonu azaltır. 25 mm'lik koni-plaka geometrisi donanımlı bir reometre kullanılarak yapılan reolojik karakterizasyon, ham ve pastörize mürekkebin baskı sıcaklıklarında, bir dizi deformasyon hızı boyunca benzer viskozitelere sahip olduğunu göstermiştir (Şekil 4B), pastörizasyonun yazdırılabilirliği bozmadığını kanıtlamaktadır. Pastörize mürekkep ayrıca, endotelyal fonksiyonu değiştirebilen antimikotik ilaçlara ihtiyaç duymadan, damar kültürünün daha uzun süre sürdürülmesine olanak tanır.

Damar hücreselleştikten sonra, gösterildiği gibi, konfluen endotel hücreleri damarın tamamını kaplamalıdır. Şekil 5, maksimum yoğunluk projeksiyonu ile Şekil 5A ve ...'daki enine kesit Şekil 5BArdından, medya akışı fizyolojik makaslama hızlarına yükseltilebilir; bu hızlar, yaklaşık olarak dairesel damarlar için Hagen-Poiseuille denklemi kullanılarak tahmin edilebilir.79Uygulamada, istenen kayma gerilimine ulaşmak için gereken akış hızı, ortam viskozitesi ve mikroakışkan direnci dikkate alınarak tahmin edilebilir. Tipik bir 2B kültürde in vitro, 12 dyn/cm'de besiyeri akışı2çoğu endotel hücre tipinin akış ekseni boyunca yönlenmesini sağlar. Bu yanıt, F-aktinin floresan falloidin boyaması ile görselleştirilebilir (Şekil 5D,E) veya Golgi-nükleer aksın analizi yoluyla (Şekil 5D,F), her ikisi de daha önce açıklandığı üzere endotelyal polarizasyonla uyumlu anizotropik oryantasyon göstermektedir1840 dyn/cm değerini aşan kayma stresleri olmasına rağmen2 meydana gelmek in vivobu koşullar burada modellenmemiştir.

Damar geometrisindeki değişikliğin temel bir sonucu, endotel hücrelerinle birkaç sinyal yolu aracılığıyla yanıt verdiği akışkan akışının değişmesidir80,81. 4D Doppler ultrason82, 4D akış manyetik rezonans görüntülemesi83 ve lazer spekle görüntüleme84 dahil olmak üzere, kan akış hızını izlemek için çeşitli yöntemler mevcuttur. Bu teknikler önemli in vivo avantajlar sunsa da, tek bir damar boyunca yerel akış farklarını çözümlemek zorlayıcı olabilir. Bu platformun yüksek sayısal açıklıklı görüntüleme kapasitesi, doğrudan floresan parçacık takibine (Şekil 6B) ve parçacık görüntü hızölçer (PIV) kullanılarak damar eğriliğinin neden olduğu akış anomalilerinin yüksek mekansal çözünürlüklü haritalanmasına (Şekil 6C) olanak tanır. Örneğin, damarın iç eğriliği boyunca, dış eğriliğe kıyasla daha yavaş bir akış gözlemlenir (Şekil 6C); bu durum endotel yanıtların değişmesine katkıda bulunabilir85.

Konfluen bir damar oluşturulduktan sonra, lümenden dekstranlar veya proteinler gibi floresan işaretli makromoleküller perfüze edilerek açıklık ve bariyer fonksiyonu değerlendirilebilir. HUVEC ile kaplanmış açık damarlar, floresan işaretli dekstranların geçişine direnç gösterir (Şekil 6D,F). Buna karşılık, TNFα gibi bariyeri bozan stimülilere maruz kalmak damar sızıntısını artırır (Şekil 6H, J). Yerel sızıntı hızları, kimograf analizi kullanılarak görselleştirilebilir (Şekil 6E,G,I,K). Kimograf, X ekseninde mesafeyi ve Y ekseninde zamanı temsil ettiğinden, segmente edilmiş floresans yoğunluklarına uydurulan çizgilerin eğimleri nicelleştirilerek göreli sızıntı hızları karşılaştırılabilir (Şekil 6E,G,I,K). Bu analizler, yerel damar geometrisinin, tanımlanmış stimülilere yanıt olarak endotelyal bariyer fonksiyonunu nasıl etkilediğinin değerlendirilmesine olanak tanır.

Bu platformun temel bir avantajı, in vivo mümkün olanlara kıyasla geliştirilmiş mikroskobik erişim sağlamasıdır. Sistem ayrıca, özellikle aktin hücre iskeleti olmak üzere, endotelyal moleküler organizasyonun immünohistokimyasal analizini kolaylaştırır. Endotelyal hücreler çok incedir ve in vivo ortamda düz kas hücreleri ile çevrilidirler; bu durum, hücre iskeleti yapılarının özellikle endotelyum içindeki lokalizasyonunu zorlaştırabilir. Bu platform, endotelyal hücrelerdeki adezyon moleküllerinin ve filamanöz aktinin kolayca boyanmasını ve görüntülenmesini sağlar (Şekil 5) ve fizyolojik akış altında endotelyal polarizasyon ve bölünmenin değerlendirilmesi dahil olmak üzere in vivo ortamda zor olan çok bileşenli analizleri destekler (Şekil 5D–F). Bu analizlerin tek bir platformda birleştirilmesi; damar geometrisi, değişmiş akış, bariyer fonksiyonu, endotelyal moleküler organizasyon ve hücreler arası adezyon arasındaki ilişkilerin doğrudan incelenmesine olanak tanır.

figure-results-1
Şekil 1: Çip üzerinde 3B kan damarlarının basımı ve kullanımı için iş akışı. Çip üzerinde 3B kan damarları oluşturma ve kullanma protokollerinin akış şeması. Siyah daireler ilgili protokol numaralarını belirtir. Kutu renkleri, her bir protokolün uygulandığı veya örneğin inkübe edildiği sıcaklığı gösterir. İş akışı; damar şekli modelleme, mürekkep hazırlama, ekstraselüler matriks (ECM) hazırlama, hazne hazırlama, damar basımı, damarların yıkanması ve kaplanması, hücreselleştirme, akış kültürü, fonksiyonel analizler ve histolojik analizleri içerir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-2
Şekil 2: Damar basımı ve hazne tasarımı. Hastaya özgü vasküler geometrileri yeniden üretmek için in vivo vasküler görüntülerden damarlar tasarlanabilir. (A) Kontrastlı bilgisayarlı tomografi (BT) ile görüntülenen küçük koroner damar, Parekh ve ark. 86 izniyle yeniden üretilmiştir. Ölçek çubuğu = 2 mm. (B) Panel A'da gösterilen damarın bir bölümünden, FIJI'de nokta kaydı ile oluşturulan referans noktalarının koordinat haritası. (C) Yazıcı kontrol yazılımı kullanılarak koordinat haritasından oluşturulan G-kodu çıktısı. X-, Y- ve Z-koordinatları sağ alt köşede belirtilmiştir. (D) Biyobasılmış bir damar içeren Rose haznesinin şeması. Üst başparmak somunlu tasarım, 3D basılmış polilaktik asit (PLA) hazne ile uyumludur. (E) ECM kaplı bir lamel üzerine feda edilebilir biyomürekkep ile basılmış bir damar ve rezervuarlar içeren Rose haznesi. Ölçek çubuğu = 9 mm. (F) Anevrizma modeli için yapılandırılmış bir Rose haznesinin şeması. Giriş ve çıkış iğnelerinden geçirilen bir tel damar şablonu olarak hizmet eder ve tel üzerine biriktirilen feda edilebilir biyomürekkep anevrizma şablonu olarak hizmet eder. (G) ECM kaplı bir lamel üzerinde tel ve feda edilebilir biyomürekkep şablonunu içeren Rose haznesi. (H) İşlenmiş alüminyum bileşenlere alternatif sağlayan 3D basılmış PLA mikroskop tablası adaptörü (sol) ve Rose haznesi (sağ). Tabla adaptörü üzerindeki metal klempler adaptör plakasına sabitlenmiştir. Ölçek çubuğu = 30 mm. (I) Giriş ve çıkış iğneleri ve tüplerle birlikte mikroskop tablasına monte edilmiş alüminyum bir Rose haznesi içindeki basılmış ve yıkanmış damar. Ölçek çubuğu = 20 mm. Kısaltmalar: CT = bilgisayarlı tomografi; ECM = hücre dışı matriks; PLA = polilaktik asit. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-3
Şekil 3: Rose odasındaki hücresel damar için sıvı akış sistemi. (A) Hücresel damar içeren bir Rose odası boyunca sıvı akışını sağlamak için kullanılan tüp konfigürasyonunun şeması. Oklar akış yönünü göstermektedir. Numaralandırılmış bileşenler şunlardır: (1) peristaltik pompa, (2) hazırlama şırıngalı üç yollu musluk, (3) hava kabarcığı tutucu, (4) darbeli sönümleyici, (5) damar düzeneği ve (6) besiyeri rezervuarı. Kültür besiyeri ile temas eden tüm bileşenler kullanımdan önce sterilize edilir. (B) Bir doku kültürü inkübatörü içindeki Rose odasında yer alan hücresel damarı içeren sıvı akış sistemi. Numaralar, A panelinde gösterilen bileşenlere karşılık gelmektedir. Giriş ve çıkış iğneleri, stabilite için bantla sabitlenmiştir. Ölçek çubuğu = 40 mm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayınız.

figure-results-4
Şekil 4: Fedakâr biyomürekkebin reolojik karakterizasyonu. (A) Pastörize edilmemiş %25 Pluronic F127/%1 polietilen oksit (PEO) mürekkebinin 5 °C, 10 °C, 14,4 °C, 15 °C ve 23 °C'de kayma hızının bir fonksiyonu olarak kayma viskozitesi. (B) 25 °C ve 37 °C'de pastörize edilmemiş ve pastörize edilmiş Pluronic F127/PEO mürekkebinin açısal frekansın bir fonksiyonu olarak kompleks viskozitesi. Kısaltma: PEO = polietilen oksit. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-5
Şekil 5: Fikse edilmiş ve boyanmış endotelleşmiş damarların görüntülenmesi ve kantitatif analizi. (A) İlk ekim ve düşük kayma gerilimi (1 dyn/cm2) altında kültürleme sonrası tamamen hücreleşmiş bir damarın spinning-disk konfokal floresan görüntülerinin maksimum yoğunluk projeksiyonu. Damar; VE-cadherin (yeşil), F-actin (kırmızı) ve DNA için DAPI (mavi) ile boyanmıştır. Ölçek çubuğu = 50 µm. (B) F-actin'i (kırmızı) işaretlemek için floresan phalloidin ile boyanmış, tamamen hücreleşmiş bir damarın spinning-disk konfokal floresan görüntü z-yığınının yeniden oluşturulmuş xz kesiti. Ölçek çubuğu = 50 µm. (C) 12 dyn/cm2 hızındaki akışın 24 saati sonrası tamamen hücreleşmiş bir damarın spinning-disk konfokal floresan görüntü z-yığınının maksimum yoğunluk projeksiyonu. F-actin, floresan phalloidin (kırmızı) ile işaretlenmiştir. Ölçek çubuğu = 100 µm. (D) 16 dyn/cm2 kayma gerilimi altında 24 saatlik kültür sonrası bir damar bölgesinin spinning-disk konfokal floresan görüntüsü. Damar; VE-cadherin (sarı), F-actin (macenta), Golgi markörü GM130 (yeşil) ve DNA için DAPI (mavi) ile boyanmıştır. Ok, akış yönünü göstermektedir. Ölçek çubuğu = 30 µm. (E) Panel D'deki F-actin kanalından FibrilTool74 kullanılarak elde edilen ortalama stres lifi yöneliminin temsili kantifikasyonu. Her biri 1.600 µm2 alana sahip 45 bölgeden oluşan bir ızgara analiz edilmiş ve ortalama lif yönelimleri akış yönüne göre radyal bir histogram olarak gösterilmiştir. (F) Endotel hücresi polarizasyonunun bir ölçüsü olarak panel D'den elde edilen çekirdek-Golgi ekseninin temsili kantifikasyonu. Her bir çekirdeğin merkezinden karşılık gelen Golgi aparatının merkezine uzanan vektörler, akış yönüne göre radyal bir histogram olarak çizilmiştir; n = 75 vektör. Kısaltma: DAPI = 4′,6-diamidino-2-phenylindole. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-6
Şekil 6: Sıvı akış ve vasküler sızıntı analizi. (A) B–K panellerindeki analizler için kullanılan damar geometrisinin şeması. Harfler, ilgili panellere karşılık gelen yaklaşık damar bölgelerini belirtir. (B) Kavisli bir damar bölgesi boyunca akış altında hareket eden floresan boncukları gösteren zaman ayarlı spinning-disk konfokal floresan görüntü dizisinin renk kodlu zamansal projeksiyonu. Renkler 1'den 100'e kadar olan kare numarasını belirtir; dış ve iç kavisler gösterilmiştir. (C) Kavisli damar bölgesi boyunca göreli akış hızını gösteren parçacık görüntü hızölçer (PIV) analizi. Renkler göreli hızı, oklar ise akış yönünü ve büyüklüğünü temsil eder. Ölçek çubuğu = 50 µm. (D–G) Alexa 647 ile işaretlenmiş 10 kDa dekstran perfüze edilmiş işlem görmemiş bir damarın temsili vasküler bariyer testi. (D,D′,D″) Sırasıyla 0, 70 ve 150. dakikalarda elde edilen düz bir damar bölgesi görüntüleri. Beyaz çizgi, E panelindeki kimograf için kullanılan bölgeyi belirtir. (E) D panelindeki düz bölgenin, kesikli çizginin eğimi olan 0,39 µm/min sızıntı hızını gösteren kimografı. (F,F′,F″) 0, 70 ve 150. dakikalarda elde edilen kavisli damar bölgesi görüntüleri. Beyaz çizgi, G panelindeki kimograf için kullanılan bölgeyi belirtir. Ölçek çubuğu = 150 µm. (G) F panelindeki kavisli bölgenin, kesikli çizginin eğimi olan 1,01 µm/min sızıntı hızını gösteren kimografı. (H–K) 250 ng/mL tümör nekroz faktörü alfa (TNFα) ile ön inkübasyon sonrası temsili vasküler bariyer testi. (H,H′,H″) Sırasıyla 0, 200 ve 400. dakikalarda elde edilen düz bir damar bölgesi görüntüleri. Beyaz çizgi, I panelindeki kimograf için kullanılan bölgeyi belirtir. Ölçek çubuğu = 250 µm. (I) H panelindeki düz damar bölgesinin kimograf analizi, kesikli çizginin eğimi olan 2,1 µm/min sızıntı hızını gösterir. (J,J′,J″) 0, 200 ve 400. dakikalarda elde edilen kavisli damar bölgesi görüntüleri. Beyaz çizgi, K panelindeki kimograf için kullanılan bölgeyi belirtir. Ölçek çubuğu = 250 µm. (K) J panelindeki kavisli damar bölgesinin kimograf analizi, kesikli çizginin eğimi olan 6,7 µm/min sızıntı hızını gösterir. D–K panellerindeki yıldızlar, kimografları oluşturmak için kullanılan çizgilerin karşılıklı uçlarını tanımlar. Kısaltmalar: PIV = parçacık görüntü hızölçer; TNFα = tümör nekroz faktörü alfa. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil 1: STL tabanlı yazıcı programlaması kullanılarak damar basımı. (A) Yazıcı kafasını iki geçiş yapmaya yönlendirerek örgü şeklinde bir damar yapısı oluşturan STL tabanlı yazıcı programlaması kullanılarak üretilen basılı bir damarın diferansiyel girişim kontrast görüntüsü. Ölçek çubuğu = 250 µm. (B) Alexa 647 ile etiketlenmiş sığır serum albümini (BSA) ile doldurulmuş, yıkanmış örgü damarın 3D render görüntüsü. Örgü halindeki iki şeridin lümenleri arasında bir boşluk görülmektedir. Ölçek çubuğu = 100 µm. Kısaltmalar: BSA = sığır serum albümini; STL = standart teselasyon dili. Lütfen bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.

Ek Dosya 1: Damar basımı için G-kodu. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Dosya 2: Rose odasının CAD çizimi. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Dosya 3: Sahne montaj adaptörünün CAD çizimi. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayınız.

Tartışma

Kıvrımlı damarlar, anevrizmalar ve dallanma noktaları dahil olmak üzere, bozunmuş akışla ilişkili vasküler geometrileri modellemek için sağlam bir sistem açıklanmaktadır. Bu yöntem, sınırlı biyomühendislik deneyimine sahip hücre biyologlarının erişebileceği bir platform dahilinde yüksek çözünürlüklü görüntülemeyi, akış haritalamayı ve vasküler bariyer fonksiyonunun değerlendirilmesini destekler. Birincil yaklaşım bir biyoyazıcı gerektirse de, ticari olarak mevcut ekstrüzyon tabanlı yazıcılar, açık kaynaklı sistemlerden çoklu baskı kafasına sahip daha gelişmiş platformlara kadar çeşitlilik göstermektedir. Temel yazıcı yetenekleri arasında baskı kafası ve mürekkep sıcaklığının kontrolü, hassas basınç düzenlemesi ve baskı tablası sıcaklığı yer almaktadır. Biyoyazdırılmış kıvrımlı ve dallanmış damarlara ek olarak yöntem, biyoyazıcı olmadan üretilebilen bir anevrizma modelini de içermektedir. Bu yaklaşımlar birlikte, hücre biyolojisi laboratuvarlarında yaygın olarak bulunan mikroskopi yöntemlerini kullanarak kıvrımlı damarlardaki endotelyal hücre fonksiyonlarının araştırılmasını kolaylaştırmaktadır.

Vasküler fonksiyonu incelemek için, her birinin kendine özgü güçlü yönleri ve sınırlamaları olan çok sayıda in vitro model sistemi mevcuttur87,88. Önceki çalışmalardan uyarlanan ve burada açıklanan sistem54,67,69, hastadan türetilen damar geometrilerinin doğrudan modellenmesine ve tek bir cihaz içerisinde vasküler kıvrımlılığın sistematik varyasyonuna izin verdiği için, vasküler tortuozitenin endotelyal fonksiyon üzerindeki etkilerini araştırmak için özellikle uygundur. Diğer yaklaşımlar, fizyolojik akış altında ölçeklendirilmiş damar yapıları oluşturmak için fotopolimerize edilebilir jelatin metakrilat kullanarak hasta koroner damarlarını modellemişlerdir60. Bu sistemler, hassas damar modellemesi, akış analizi ve tunica media tabakalarının dahil edilme potansiyeli sunar. Ancak, genel boyutları ve cam destek gereksinimleri, yüksek çözünürlüklü görüntülemeyi ve lokalize sızıntı deneylerini kısıtlayabilir. Buna karşılık, iPSC türevli endotelyal hücrelerin kendi kendine birleşmesine dayanan daha küçük sistemler, yüksek çözünürlüklü görüntülemeye olanak tanır ve hem endotelyal hem de vasküler düz kas hücrelerini içerebilir89. Ancak bu modeller, damar geometrisi üzerinde daha az kontrol sağlar ve yüksek akış ile kayma hızlarının oluşturulması zor olabilir. Bu nedenle, mevcut sistem, tanımlanmış damar geometrisini vasküler tortuozitenin yüksek çözünürlüklü görüntülemesiyle birleştiren pratik bir ara yaklaşımı temsil etmektedir.

Bu platformun temel bir avantajı, Şekil 6'da gösterildiği gibi, diğer deneysel değişkenler sabit tutulurken aynı örnek içinde yerel damar geometrisinin doğrudan karşılaştırılmasına olanak tanıyan, hem kavisli hem de düz bölgeler içeren damarlar üretme yeteneğidir. Bir diğer avantaj ise anjiyografi veya kontrastlı BT aracılığıyla elde edilen hasta kaynaklı damar görüntülerinin kullanılabilmesidir. Hasta damarlarının yeniden üretilmesindeki temel kısıtlama boyuttur. Çapı 150µm'den küçük olan damarların tekrarlanabilir şekilde basılması zordur; öte yandan, birkaç santimetreyi aşan damar segmentleri daha büyük montaj odacıkları gerektirir. Damar segmentleri ayrıca, taban matris katmanına basılabilmeleri ve mikroskobik görüntüleme sırasında objektif lensin çalışma mesafesi içinde tutulabilmeleri için üçüncü boyutta nispeten düz kalmalıdır.

Gelecekteki çalışmalarda, burada açıklanan sistem, damar geometrisinin patofizyolojiye katkıda bulunabildiği ateroskleroz gibi hastalıkları modellemek için daha da geliştirilebilir. Fizyolojik karmaşıklığı artırmak amacıyla genetiği değiştirilmiş endotel hücreleri veya düz kas hücreleri ve immün hücreler dahil ek hücre tipleri sisteme dahil edilebilir. Daha basit sistemlerde gösterildiği gibi, endotel tabakasının altına düz kas hücrelerinin eklenmesi, vasküler tortuozite ve hastalıklarındaki düz kas-endotel etkileşimlerine dair ek bilgiler sağlayabilir90. Ek modifikasyonlar, intravazasyonu68,91 ve tortuozitenin bu süreç üzerindeki etkisini araştırmak için tümör hücrelerini içerebilir. Platform ayrıca, bozulmuş akışın enflamatuar yanıtları nasıl değiştirdiğini92,93 ve potansiyel olarak COVID-1994 gibi enfeksiyonlarla ilişkili vasküler komplikasyonlara nasıl katkıda bulunduğunu incelemek için de kullanılabilir. Vasküler sistemin insan sağlığı ve hastalıklarındaki geniş rolü göz önüne alındığında, bu tür erişilebilir sistemler, çeşitli hastalık bağlamlarında endotel fonksiyonunun daha derinlemesine araştırılmasını kolaylaştırabilir.

Açıklamalar

İçerik tamamen yazarların sorumluluğundadır ve National Institutes of Health'in resmi görüşlerini temsil etmemektedir. Yazarlar, herhangi bir rakip finansal çıkar beyan etmediklerini bildirmektedirler.

Teşekkürler

Yazarlar, bu çalışmanın erken aşamalardaki bazı araştırmalarında verdikleri tavsiyeler için Harvard Üniversitesi'ndeki Jennifer Lewis laboratuvarı üyelerine ve geri bildirimleri ile tavsiyeleri için Waterman Laboratuvarı üyelerine teşekkür ederler.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
(3-Aminopropyl)trimethoxysilane (APTMS), 97%Sigma-Aldrich281778ECM tutunması öncesinde cam lamelin silanizasyonu ve aktivasyonu için kullanılır.
1mL steril şırıngaFisher Scientific14-823-434Reaktif iletimi, kap kaplama ve sıvı yönetimi için kullanılır.
1x Fosfat tamponlu salin (PBS)Thermo Fisher ScientificJ61196.APReaktif hazırlama, yıkama ve kap durulama için kullanılır.
10mL steril şırıngaFisher Scientific14-955-459Reaktif hazırlama ve sıvı transferi için kullanılır.
Kapaklı 15mL konik tüplerFisher Scientific05-538-59AReaktif hazırlama, hücre yönetimi ve çözelti depolama için kullanılır.
150mm polistiren Petri kabıFisher ScientificFB0875714Steril çalışma veya inkübasyon kabı olarak kullanılır.
21G iğneFisher Scientific14-817-227Kap şablonu hazırlama ve hazne erişimi için kullanılır.
23G iğneFisher Scientific14-817-237Durulama ve perfüzyon sırasında kap giriş ve çıkış bağlantıları için kullanılır.
27G şeffaf konik dağıtıcı iğneNordson7018417Fedakâr mürekkep ekstrüzyonu ve baskı sırasında hava kabarcıklarının görselleştirilmesi için kullanılır.
3mL steril şırıngaFisher Scientific14-955-459Sıvı transferi ve reaktif iletimi için kullanılır. Sağlanan numara 10 mL şırınga için de listelendiğinden katalog numarasını onaylayın.
304 paslanmaz çelik tıbbi mandrel teli, 0.0190 inç çapındaComponent SupplyGWX-0190-36Tel tabanlı anevrizma modelindeki düz lümen için çıkarılabilir şablon olarak kullanılır.
Kapaklı 50mL konik tüplerFisher Scientific05-526BReaktiflerin hazırlanması, karıştırılması, pastörizasyonu ve depolanması için kullanılır.
Alexa 488 anti-fare sekonder antikorThermo Fisher ScientificA32723TRİmmünboyama için kullanılan floresan sekonder antikor.
Alexa 555 anti-tavşan sekonder antikorThermo Fisher ScientificA-21428İmmünboyama için kullanılan floresan sekonder antikor.
Alexa 647 ile işaretlenmiş sığır serum albüminiThermo Fisher ScientificA34785Vasküler bariyer/sızıntı analizleri için kullanılan floresan makromoleküler izleyici.
Alexa 647 ile işaretlenmiş dekstran, 10 kDaThermo Fisher ScientificD22914Endotelyal bariyer fonksiyonunu ve vasküler sızıntıyı değerlendirmek için kullanılan floresan izleyici.
Alexa 647-falloidinThermo Fisher ScientificA22287Sitoskeletal görüntüleme ve oryantasyon analizi için F-aktini floresanla işaretlemek için kullanılır.
Albümin, sığır serumu, Fraksiyon V, yağ asidi içermeyenSigma-Aldrich126575-10GMBloklama ve protein içeren çözeltilerin hazırlanması için kullanılır.
Antibiyotik-Antimikotik, 100xThermo Fisher Scientific15240062ECM ve kültür medyumu için isteğe bağlı antimikrobiyal takviye.
Anti-GM130 antikoru, klon 4A3Sigma-AldrichMABT1363Endotelyal polarite analizi için Golgi aygıtını işaretlemek üzere kullanılan primer antikor.
Anti-VE-kadherin tavşan monoklonal antikoru, D87F2Abcam65707Endotelyal hücre-hücre bağlantılarını görselleştirmek için kullanılan primer antikor.
Kalsiyum klorürSigma-AldrichC7902ECM hazırlama ve fiksasyon tamponlarında kullanılır. Hedeflenen reaktifin susuz mu yoksa hidratlı kalsiyum klorür mü olduğunu doğrulayın.
Konnektör kitiWorld Precision Instruments504954Mikroakışkan perfüzyon devresini kurmak için kullanılan Luer-hortum konnektörleri.
Lamel boyama rafıElectron Microscopy Sciences72240Temizleme, silanizasyon, aktivasyon ve yıkama sırasında lamelleri tutmak için kullanılır.
D-(+)-GlikozSigma-AldrichG7021-100Gİmmünboyama sırasında kullanılan permeabilizasyon tamponunun bileşeni.
DAPIThermo Fisher Scientific62248Hücre görüntüleme ve polarite analizi için kullanılan floresan nükleer boya.
Dijital ısıtıcı tablaFisher Scientific11-475-028Montaj sırasında kap haznesini ve reaktifleri yaklaşık 37 °C'de tutmak için kullanılır.
EGTA tetrasodyum tuzuSigma-AldrichE8145-10GPermeabilizasyon tamponunda kullanılan şelatlayıcı ajan.
1/16 inç ID hortum için dişi tırtıklı Luer konnektörüScientific Commodities Inc.BB330AMikroakışkan devre içindeki hortumları bağlamak için kullanılır.
1/16 inç ID tırtıklı dişi Luer, CrystalVu QCFisher Scientific01-000-123Hortum ve kap haznesi bağlantıları için kullanılır.
FibrinojenSigma-AldrichF8630Kabı destekleyen hidrojeli oluşturmak için jelatin ve trombin ile birlikte kullanılan ECM bileşeni. Kaynağı doğrulayın: makale insan plazma fibrinojenini tanımlarken, sağlanan tabloda sığır plazması belirtilmiştir.
Sıvı darbe sönümleyiciDarwin MicrofluidicsSE-D1606-3NB-PC-31Peristaltik pompa tarafından oluşturulan pulsatil dalgalanmaları azaltmak için kullanılır.
Gıda endüstrisi yüksek sıcaklık silikon kauçuk şeritMcMaster-Carr8417K51Rose haznesi için contayı üretmek için kullanılır.
Domuz derisinden jelatin, jel gücü 300, Tip ASigma-AldrichG2500Kap lümenini çevreleyen hidrojeli oluşturmak için kullanılan ana ECM bileşeni.
Cam lamel, No. 1.5VWREN-MAS-25X25-1-5-CSYüksek çözünürlüklü mikroskopi substratı ve hazne yüzeyi.
Glutaraldehit, %25Electron Microscopy Sciences16220ECM tutunması öncesinde lamel aktivasyonu için seyreltilir.
Büyüme Kiti-BBEATCCPCS-100-040Endotelyal hücre kültürü için vasküler hücre bazal medyumu ile kullanılan takviye kiti.
Büyüme Kiti-VEGFATCCPCS-100-041Gerektiğinde vasküler hücre bazal medyumu ile kullanılan endotelyal büyüme takviyesi.
İnsan plazma fibronektiniSigma-AldrichFC010Endotelyal tutunmayı desteklemek için kullanılan isteğe bağlı lüminal ECM kaplaması.
Hatta hortum kelepçesiSigma-AldrichZ503371-1PAKHazne manipülasyonu ve inkübasyon sırasında hortum boyunca akışı durdurmak ve düzenlemek için kullanılır.
Ismatec Reglo Dijital peristaltik pompaMasterflex78018-12Hücreleştirilmiş kaplar boyunca kontrollü sıvı akışı oluşturmak için kullanılır.
LamininSigma-AldrichL2020-1MGEndotelyal adezyon ve polarizasyonun modifikasyonu için isteğe bağlı lüminal ECM kaplaması.
Luer-hortum kuplör çeşitleri kitiWorld Precision Instruments504954Hortumları, şırıngaları ve hazne giriş/çıkış bileşenlerini bağlamak için kullanılır. Konnektör kiti katalog numarasının aynısıdır; aynıysa tek girişi tutun.
Magnezyum klorür hekzahidratSigma-AldrichM2393-100GFiksasyon ve permeabilizasyon tamponlarının bileşeni.
1/16 inç ID hortum için erkek tırtıklı kayıcı Luer konnektörüScientific Commodities Inc.BB329AMikroakışkan hortum bağlantıları için kullanılır.
Erkek Luer bağlantı parçası, 1/16 inç IDWorld Precision Instruments13160-100Hortumları şırıngalara ve hazne bileşenlerine bağlamak için kullanılır.
MatrigelSigma-AldrichCLS356234-1EAEndotelyal tutunma için kullanılan isteğe bağlı lüminal ECM kaplaması.
Medya şişesi kapaklarıFisher Scientific05-719-310Akış devresi için steril kültür medyumu rezervuarları oluşturmak için kullanılan iki portlu kapaklar.
Nalgene Pharma-Grade silikon hortum, 1/16 inç IDThermo Fisher Scientific8600-0020Mikroakışkan perfüzyon ve durulama devrelerinde kullanılan esnek hortum.
ParafilmElectron Microscopy Sciences70990-125Lameller üzerindeki ECM kaplamalarının polimerizasyonu sırasında yapışmayan bir yüzey olarak kullanılır.
PBS, 10x, pH 7.4Thermo Fisher Scientific70011044Çalışma PBS çözeltilerini hazırlamak için kullanılan konsantre tampon.
Penisilin/StreptomisinThermo Fisher Scientific15140122Endotelyal kültür medyumu ve durulama çözeltilerinde kullanılan antibiyotik takviyesi.
PIPESSigma-AldrichP1851-25GPermeabilizasyon çözeltisinin tamponlama bileşeni.
Pluronic F-127Sigma-AldrichP2443Fedakâr baskı mürekkebinin termoya duyarlı bileşeni.
Erkek Luer'li polikarbonat üç yollu stopkokFisher ScientificNC9593742Perfüzyon devresindeki sıvı yollarını hazırlamak, değiştirmek ve kontrol etmek için kullanılır.
Polietilen oksit (PEO)Sigma-Aldrich372781Fedakâr mürekkep formülasyonunun polimer bileşeni.
Rotary karıştırıcıFisher Scientific88861050PEO/Pluronic fedakâr mürekkebini 4 °C'de karıştırmak için kullanılır.
Slayt ünitesi boyama kabıMSE SuppliesDWK90020Lamel yıkama, boyama veya reaktif inkübasyonu için kullanılır.
Kare kapak camı, No. 2, 25mm x 25mmSigma-AldrichCLS285525-1000EAHazne lameli; daha kalın No. 2 cam, kırılmaya karşı artırılmış direnç sağlar ve uygun hava veya su objektifleriyle uyumludur.
Paslanmaz çelik küt dağıtıcı iğne, 21 G, 1 inçComponent SupplyNE-212PLSıvı iletimi veya tel şablonlu kap modelinin inşası için kullanılır.
Steriflip vakum filtre üniteleriMilliporeSigmaSE1M179M6Ilık jelatini ve diğer uyumlu çözeltileri steril filtrelemek için kullanılır.
Steril plastik 5mL şırıngalarAlleviPSYR5-SPnömatik ekstrüzyon baskısı için fedakâr mürekkebi yüklemek için kullanılır.
Trombin, insan plazması, yüksek aktiviteSigma-Aldrich605195ECM jel oluşumu sırasında fibrin polimerizasyonunu başlatmak için kullanılır.
TransglutaminazMoo Gloo1201Jelatin/fibrin ECM'nin hazırlanması ve modifikasyonu sırasında kullanılan çapraz bağlayıcı enzim.
Triton X-100Sigma-Aldrich648466İmmünboyama öncesinde endotelyal hücre permeabilizasyonu için kullanılan deterjan.
TrypLE Express Enzimi, 1x, fenol kırmızıThermo Fisher Scientific12605010Kap ekimi öncesinde endotelyal hücreleri toplamak için kullanılan hücre ayırma reaktifi.
Tween 20Sigma-Aldrich11332465001İmmünboyama bloklama tamponunun deterjan bileşeni.
Vasküler Hücre Bazal MedyumuATCCPCS-100-030Endotelyal hücre kültürü ve perfüzyon deneyleri için kullanılan bazal medyum.

Kaynaklar

  1. Franken R, et al. Increased aortic tortuosity indicates a more severe aortic phenotype in adults with Marfan syndrome. Int J Cardiol. 2015;194:7-12.
  2. Morris SA, et al. Vertebral artery tortuosity in Turner syndrome: is tortuosity a component of the aortopathy phenotype J Cardiovasc Magn Reson. 2014;16(Suppl 1):P115.
  3. Morris SA. Arterial tortuosity in genetic arteriopathies. Curr Opin Cardiol. 2015;30(6):587-593.
  4. Ciurică S, et al. Arterial tortuosity. Hypertension. 2019;73(5):951-960.
  5. Penta R, Ambrosi D. The role of the microvascular tortuosity in tumor transport phenomena. J Theor Biol. 2015;364:80-97.
  6. Bullitt E, et al. Abnormal vessel tortuosity as a marker of treatment response of malignant gliomas: preliminary report. Technol Cancer Res Treat. 2004;3(6):577-584.
  7. Fattahi M, et al. Influence of parent vessel feature on the risk of internal carotid artery aneurysm rupture via computational method. Sci Rep. 2023;13(1):1-12.
  8. Kawsara A, et al. Management of coronary artery aneurysms. JACC Cardiovasc Interv. 2018;11(13):1211-1223.
  9. Sokhal BS, Ma Y, Rajagopalan S. Femoral artery aneurysms. Br J Hosp Med. 2022;83(12).
  10. Golledge J. Abdominal aortic aneurysm: update on pathogenesis and medical treatments. Nat Rev Cardiol. 2019;16(4):225-242.
  11. Toader C, et al. Cerebral aneurysm: filling the gap between pathophysiology and nanocarriers. Int J Mol Sci. 2024;25(22):11874.
  12. Wei F, et al. Arterial tortuosity: an imaging biomarker of childhood stroke pathogenesis Stroke. 2016;47(5):1265-1270.
  13. Moceri P, et al. Arterial tortuosity syndrome: early diagnosis and association with venous tortuosity. J Am Coll Cardiol. 2013;61(7):783.
  14. Zhang X, et al. The relationship between retinal vascular tortuosity and retinal vasculitis. J Ophthalmic Inflamm Infect. 2025;15:65.
  15. Cuhlmann S, et al. Disturbed blood flow induces RelA expression via c-Jun N-terminal kinase 1: a novel mode of NF-κB regulation that promotes arterial inflammation. Circ Res. 2011;108(8):950-959.
  16. Sunderland K, Jiang J, Zhao F. Disturbed flow's impact on cellular changes indicative of vascular aneurysm initiation, expansion, and rupture: a pathological and methodological review. J Cell Physiol. 2022;237(1):278-300.
  17. Luu V, et al. Role of endothelial primary cilia as fluid mechanosensors on vascular health. Atherosclerosis. 2018;275.
  18. Vion AC, et al. Endothelial cell orientation and polarity are controlled by shear stress and VEGF through distinct signaling pathways. Front Physiol. 2021;11:623769.
  19. Petzold T, et al. Focal adhesion kinase modulates activation of NF-kappaB by flow in endothelial cells. Am J Physiol Cell Physiol. 2009;297(4):C814-C822.
  20. Thodeti CK, et al. TRPV4 channels mediate cyclic strain-induced endothelial cell reorientation through integrin-to-integrin signaling. Circ Res. 2009;104(9):1123-1130.
  21. Beech DJ. PIEZO force sensing in vascular biology: an explosion of new knowledge, concepts and opportunity. Adv Sci (Weinh). 2025;12(41):e11774.
  22. Tamargo IA, et al. Flow-induced reprogramming of endothelial cells in atherosclerosis. Nat Rev Cardiol. 2023;20(11):738-753.
  23. Chiu JJ, Chien S. Effects of disturbed flow on vascular endothelium: pathophysiological basis and clinical perspectives. Physiol Rev. 2011;91(1):327-387.
  24. Nakajima H, Mochizuki N. Flow pattern-dependent endothelial cell responses through transcriptional regulation. Cell Cycle. 2017;16(20):1893-1901.
  25. Zhao Y, et al. Small rodent models of atherosclerosis. Biomed Pharmacother. 2020;129:110426.
  26. Curry-Koski T, Curtin LP, Esfandiarei M, Thomas TC. Cerebral microvascular density, blood-brain barrier permeability, and support for neuroinflammation indicate early aging in a Marfan syndrome mouse model. Front Physiol. 2024;15:1457034.
  27. Thompson JW, et al. In vivo cerebral aneurysm models. Neurosurg Focus. 2019;47(1).
  28. Golledge J, Krishna SM, Wang Y. Mouse models for abdominal aortic aneurysm. Br J Pharmacol. 2022;179(5):792-810.
  29. Noval Rivas M, Arditi M. Kawasaki disease: pathophysiology and insights from mouse models. Nat Rev Rheumatol. 2020;16(7):391-405.
  30. He L, et al. Endothelial shear stress signal transduction and atherogenesis: from mechanisms to therapeutics. Pharmacol Ther. 2022;235:108152.
  31. Wang X, et al. Endothelial mechanobiology in atherosclerosis. Cardiovasc Res. 2023;119(8):1656-1675.
  32. Humphrey JD, Schwartz MA. Vascular mechanobiology: homeostasis, adaptation, and disease. Annu Rev Biomed Eng. 2021;23:1-27.
  33. Wang C, Lu H, Schwartz MA. A novel in vitro flow system for changing flow direction on endothelial cells. J Biomech. 2012;45(7):1212-1218.
  34. Sedlak J, Clyne A. Application of shear stress to endothelial cells using a parallel plate flow chamber. Methods Mol Biol. 2023;2600:81-90.
  35. Zhu J, et al. Advances in tissue engineering of vasculature through three-dimensional bioprinting. Dev Dyn. 2021;250(12):1717-1738.
  36. Kinstlinger IS, Miller JS. 3D-printed fluidic networks as vasculature for engineered tissue. Lab Chip. 2016;16(11):2025-2043.
  37. Werschler N, Quintard C, Nguyen S, Penninger J. Engineering next generation vascularized organoids. Atherosclerosis. 2024;398:118529.
  38. Shakeri A, et al. Engineering organ-on-a-chip systems for vascular diseases. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2023;43(12):2241-2255.
  39. Xie X, et al. Customizable microfluidic origami liver-on-a-chip (oLOC). Adv Mater Technol. 2022;7(5):2100677.
  40. Kawakita S, et al. Organ-on-a-chip models of the blood-brain barrier: recent advances and future prospects. Small. 2022;18(39):e2201401.
  41. Bai H, Ingber DE. What can an organ-on-a-chip teach us about human lung pathophysiology Physiology. 2022;37(5).
  42. Seghir R, Arscott S. Extended PDMS stiffness range for flexible systems. Sens Actuators A Phys. 2015;230:33-39.
  43. Hasler J, et al. Development and characterization of a tunable PDMS substrate model for investigating elastic properties and mechanical stretching in intervertebral disc cells. JOR Spine. 2025;8(4):e70140.
  44. Uroz M, et al. Differential stiffness between brain vasculature and parenchyma promotes metastatic infiltration through vessel co-option. Nat Cell Biol. 2024;26(12):2144-2153.
  45. Wood JA, Liliensiek SJ, Russell P, Nealey PF, Murphy CJ. Biophysical cueing and vascular endothelial cell behavior. Materials. 2010;3(3):1620-1639.
  46. Peloquin J, Huynh J, Williams RM, Reinhart-King CA. Indentation measurements of the subendothelial matrix in bovine carotid arteries. J Biomech. 2011;44(5):815-821.
  47. McQueen A, Warboys CM. Mechanosignalling pathways that regulate endothelial barrier function. Curr Opin Cell Biol. 2023;84:102213.
  48. Hahn C, Orr AW, Sanders JM, Jhaveri KA, Schwartz MA. The subendothelial extracellular matrix modulates JNK activation by flow. Circ Res. 2009;104(8):995-1003.
  49. Xu Z, et al. Matrix stiffness, endothelial dysfunction and atherosclerosis. Mol Biol Rep. 2023;50(8):7027-7041.
  50. Lemarié CA, Tharaux PL, Lehoux S. Extracellular matrix alterations in hypertensive vascular remodeling. J Mol Cell Cardiol. 2010;48(3):433-439.
  51. Huveneers S, Daemen MJAP, Hordijk PL. Between Rho(k) and a hard place: the relation between vessel wall stiffness, endothelial contractility, and cardiovascular disease. Circ Res. 2015;116(5):895-908.
  52. Stankey PP, et al. Embedding biomimetic vascular networks via coaxial sacrificial writing into functional tissue. Adv Mater. 2024;36(36):e2401528.
  53. Sundaram S, et al. Sacrificial capillary pumps to engineer multiscalar biological forms. Nature. 2024;636(8042):361-367.
  54. Kroll KT, et al. A perfusable, vascularized kidney organoid-on-chip model. Biofabrication. 2024;16(4).
  55. Strobel HA, Moss SM, Hoying JB. Vascularized tissue organoids. Bioengineering. 2023;10(2):124.
  56. Servais B, et al. Engineering brain-on-a-chip platforms. Nat Rev Bioeng. 2024;2(8):691-709.
  57. Osaki T, Sivathanu V, Kamm RD. Engineered 3D vascular and neuronal networks in a microfluidic platform. Sci Rep. 2018;8(1):5168.
  58. Maharjan S, Cecen B, Zhang YS. 3D immunocompetent organ-on-a-chip models. Small Methods. 2020;4(9):2000235.
  59. Fang JS, et al. A microphysiological system HHT-on-a-chip platform recapitulates patient vascular lesions. Nat Commun. 2026.
  60. Catano JA, et al. A patient-specific 3D printed carotid artery model integrating vascular structure, flow, and endothelium responses. Adv Healthc Mater. 2026;15(4):e02478.
  61. Li Z, Hui J, Yang P, Mao H. Microfluidic organ-on-a-chip system for disease modeling and drug development. Biosensors. 2022;12(6):370.
  62. Leung CM, et al. A guide to the organ-on-a-chip. Nat Rev Methods Primers. 2022;2(1):33.
  63. Campisi M, et al. 3D self-organized microvascular model of the human blood-brain barrier with endothelial cells, pericytes and astrocytes. Biomaterials. 2018;180:117-129.
  64. Miller JS, et al. Rapid casting of patterned vascular networks for perfusable engineered three-dimensional tissues. Nat Mater. 2012;11(9):768-774.
  65. Kong Z, Wang X. Bioprinting technologies and bioinks for vascular model establishment. Int J Mol Sci. 2023;24(1):891.
  66. Kolesky DB, et al. 3D bioprinting of vascularized, heterogeneous cell-laden tissue constructs. Adv Mater. 2014;26(19):3124-3130.
  67. Lin NYC, et al. Renal reabsorption in 3D vascularized proximal tubule models. Proc Natl Acad Sci U S A. 2019;116(12):5399-5404.
  68. Park W, et al. 3D bioprinted multilayered cerebrovascular conduits to study cancer extravasation mechanism related with vascular geometry. Nat Commun. 2023;14(1):7696.
  69. Kolesky DB, Homan KA, Skylar-Scott MA, Lewis JA. Three-dimensional bioprinting of thick vascularized tissues. Proc Natl Acad Sci U S A. 2016;113(12):3179-3184.
  70. Xiao Y, Liu Q, Han HC. Buckling reduces eNOS production and stimulates extracellular matrix remodeling in arteries in organ culture. Ann Biomed Eng. 2016;44(9):2840-2850.
  71. Arnaoutova I, George J, Kleinman HK, Benton G. The endothelial cell tube formation assay on basement membrane turns 20: state of the science and the art. Angiogenesis. 2009;12(3):267-274.
  72. Qiu Y, et al. Microvasculature-on-a-chip for the long-term study of endothelial barrier dysfunction and microvascular obstruction in disease. Nat Biomed Eng. 2018;2(6):453-463.
  73. Rose GG, Pomerat CM, Shindler TO, Trunnell JB. A cellophane-strip technique for culturing tissue in multipurpose culture chambers. J Biophys Biochem Cytol. 1958;4(6):761-764.
  74. Boudaoud A, et al. FibrilTool, an ImageJ plug-in to quantify fibrillar structures in raw microscopy images. Nat Protoc. 2014;9(2):457-463.
  75. Fischer RS, et al. Contractility, focal adhesion orientation, and stress fiber orientation drive cancer cell polarity and migration along wavy ECM substrates. Proc Natl Acad Sci U S A. 2021;118(22):e2021135118.
  76. Wolf KJ, et al. Perfusable 3D models of ureteric bud and collecting duct tubules. Cell Biomater. 2026;2(3):100297.
  77. Ren B, et al. Study of sacrificial ink-assisted embedded printing for 3D perfusable channel creation for biomedical applications. Appl Phys Rev. 2022;9(1).
  78. Hynes WF, et al. Examining metastatic behavior within 3D bioprinted vasculature for the validation of a 3D computational flow model. Sci Adv. 2020;6(35):eabb3308.
  79. Pisano A. From tubes and catheters to the basis of hemodynamics: viscosity and Hagen-Poiseuille equation. In: Physics for Anesthesiologists and Intensivists: From Daily Life to Clinical Practice. Springer; 2021:89-98.
  80. Gerhardt H, Betsholtz C. How do endothelial cells orientate EXS. 2005;(94):3-15.
  81. Baeyens N, et al. Endothelial fluid shear stress sensing in vascular health and disease. J Clin Invest. 2016;126(3):821-828.
  82. Lee J. Hemodynamics in Doppler ultrasonography. Ultrasonography. 2024;43(6):413.
  83. Kamada H, et al. Blood flow analysis with computational fluid dynamics and 4D-flow MRI for vascular diseases. J Cardiol. 2022;80(5):386-396.
  84. Postnov DD, Tuchin VV, Sosnovtseva O. Estimation of vessel diameter and blood flow dynamics from laser speckle images. Biomed Opt Express. 2016;7(7):2759.
  85. Dessalles CA, Leclech C, Castagnino A, Barakat AI. Integration of substrate- and flow-derived stresses in endothelial cell mechanobiology. Commun Biol. 2021;4:764.
  86. Parekh P, Agrawal N, Vasavada A, Vinchurkar M. Extreme coronary artery tortuosity in association with tortuosity of the systemic arteries: a rare and challenging situation for the interventionist. BMJ Case Rep. 2014;2014:bcr2014204725.
  87. Vetter J, Palagi I, Waisman A, Blaeser A. Recent advances in blood-brain barrier-on-a-chip models. Acta Biomater. 2025;197:1-28.
  88. Liu Y, Lin L, Qiao L. Recent developments in organ-on-a-chip technology for cardiovascular disease research. Anal Bioanal Chem. 2023;415(18):3911-3925.
  89. Cuenca MV, et al. Engineered 3D vessel-on-chip using hiPSC-derived endothelial- and vascular smooth muscle cells. Stem Cell Reports. 2021;16(9):2159-2168.
  90. van Engeland NCA, et al. A biomimetic microfluidic model to study signalling between endothelial and vascular smooth muscle cells under hemodynamic conditions. Lab Chip. 2018;18(11):1607-1620.
  91. Sobrino A, et al. A tissue-engineered 3D microvessel model reveals the dynamics of mosaic vessel formation in breast cancer. Cancer Res. 2020;80(19).
  92. Riddle RB, Jennbacken K, Hansson KM, Harper MT. A multicellular vessel-on-a-chip model reveals context-dependent roles for platelets in inflammation and inflammatory hemostasis. Blood Vessels Thromb Hemost. 2024;1(2):100007.
  93. Rickman M, et al. Disturbed flow increases endothelial inflammation and permeability via a Frizzled-4-β-catenin-dependent pathway. J Cell Sci. 2023;136(6):jcs260449.
  94. Shevchuk O, et al. Vessel-on-a-chip: a powerful tool for investigating endothelial COVID-19 fingerprints. Cells. 2023;12(9):1297.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

3B Yazdırılmış DamarlarVasküler TortuositeDamar AnevrizmalarıOrgan-on-ChipDamar GeçirgenliğiFizyolojik Kayma HızıIşık Mikroskobu
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.