Yöntem makalesi

Peristaltik Kaynaklı Makrofajların Mekanik Aktivasyonu

39 görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/72607

⸱

18 Ağustos 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, Texas A&M University

Bu makalede

Özet

Bu protokol, mechano-immunomodülasyon çalışmaları için patentli bir biyoreaktörün kurulumunu ve çalıştırılmasını sunmaktadır. Burada, fizyolojik kuvvetleri yeniden üreten özel bir biyoreaktör kullanarak, makrofajların mekanik stimülasyona karşı belirgin bir proinflamatuar yanıt verdiğini kanıtlıyoruz.

Özet

Enflamasyon, hem akut hem de kronik hastalıklara yol açan karmaşık bir süreçtir. Bu süreç, immün hücre aktivasyonuyla sonuçlanan kaskad şeklinde ilerleyen biyokimyasal ve biyofiziksel uyaranlar tarafından modüle edilir. Makrofajlar; kanser, fibroz ve otoimmün hastalıklar dahil olmak üzere birçok enflamatuar duruma dahil olan temel bir immün hücre tipidir. Makrofaj aktivasyonunu inceleyen geleneksel yöntemler, tanımlı sitokin veya kemokin uyaranlarıyla yapılan biyokimyasal stimülasyonu içerir ve makrofajları pro-enflamatuar veya anti-enflamatuar bir durumun sınırlarına kadar aktive eder. Yeni ortaya çıkan kanıtlar, dokulardaki biyokimyasal uyaranların yanı sıra biyofiziksel uyaranların da makrofaj aktivasyonunda rol oynadığını göstermektedir. Yaygın mekanik uyaranlardan biri olan peristaltiz; gastrointestinal sistemde, uterusta, gelişmekte olan hava yollarında ve üreterlerde meydana gelen, çok eksenli gerilme ve kayma gerilmesinden oluşan bir süreçtir. Burada, peristaltizinin makrofajları aktive edebileceği hipotezini test ettik. Bu protokolde, makrofajların mekanik aktivasyonunu incelemek için peristaltik bir biyoreaktörün kullanımı açıklanmaktadır. Makrofaj adezyonunu artırmak için polidimetilsiloksan membranlar fibronektin ile kaplanmıştır. Ölümsüzleştirilmiş fare kemik iliği türevli makrofajlar (iBMDM), fibronektin kaplı membranlara ekilmiş ve statik kontroller olarak tutulmuş veya 4 saat boyunca peristaltize maruz bırakılmıştır. Peristaltiz, şu genlerin ekspresyonunda belirgin farklılıklar oluşturarak makrofajları aktive etmiştir: Il6 (statik kontrollere kıyasla 50,9 kat; p < 0.0001, t-testi) ve Nos2 (statik kontrollere göre 19,8 kat; p = 0,0046). İlginç bir şekilde, şunlarda herhangi bir anlamlı değişiklik gözlemlenmemiştir: Chil3 (statik kontrollere göre 1,22 kat; Lütfen çevirmemi istediğiniz metni sağlayın. = 0,9726) veya Mrc1 (statik kontrollere göre 1,16 kat; p = 0.9810) statik kontrollere kıyasla, bunun mekaniklerin öncelikle proinflamatuar aktivasyonu tetiklediğini göstermektedir. Mevcut bulgular, özellikle birçok düz kas tabanlı dokuda yaygın olan peristaltik mekaniklere yanıt olarak, makrofajların mekanik-immünomodülasyonu kavramını desteklemektedir.

Giriş

Makrofajlar; fagositoz ve sitokin salınımı aracılığıyla konak savunmasında, doku yeniden şekillenmesinde ve inflamasyonun düzenlenmesinde temel roller oynayan doğuştan gelen bağışıklık hücreleridir.1,2,3,4... içindeki uyarılara bağlı olarak in vivo mikroçevre, diferansiye olmamış makrofajlar (M0) plastisiteyle proenflamatuar (M1) veya anti-enflamatuar/pro-rejeneratif (M2) fenotiplere doğru polarize olabilirler5,6. In vitro makrofaj polarizasyonunu yönlendiren karmaşık mekanizmaları daha iyi anlamak için, bu farklı stimülasyonları izole etmek amacıyla tipik olarak modeller kullanılır. Klasik olarak aktive olmuş M1 makrofajları tipik olarak indüklenir in vitro lipopolisakkarit (LPS) ve interferon gama (IFN-γ) gibi biyokimyasal stimülasyonlar aracılığıyla, indüklenebilir nitrik oksit sentaz (iNOS), interlökin-6 (IL6) ve tümör nekroz faktörü alfa (TNF-α) dahil olmak üzere enflamatuar mediyatörlerin ekspresyonunda artışla sonuçlanan7,8Alternatif olarak aktive edilmiş M2 makrofajlar, genellikle interlökin-4 (IL-4) ve interlökin-13'e (IL-13) maruz bırakılarak indüklenir; bu durum doku yeniden şekillenmesini ve yara iyileşmesi yanıtlarını teşvik eder.8,9M2 makrofajlar; farklı aktivasyon yolaklarına ve yüzey belirteç ekspresyon profillerine dayanarak M2a, M2b ve M2c fenotiplerine daha ayrıntılı olarak ayrılırlar.10,11Makrofaj polarizasyonunun biyokimyasal düzenlemesi her iki durumda da kapsamlı bir şekilde karakterize edilmiş olsa da in vivo ve in vitro sistemlerde makrofajlar, aynı zamanda önemli biyofiziksel uyaranlar içeren oldukça dinamik mikroortamlarda bulunur12Çözünür sitokinlere ve kemokinlere ek olarak makrofajlar; hücre dışı matrise ve hücre-hücre etkileşimlerine, substrat sertliğine, akışkan kayma gerilmesine, hidrostatik basınca ve döngüsel doku deformasyonuna maruz kalırlar.12,13,14Mekanosensitif hücreler olan makrofajlar, bu fiziksel ipuçlarına yanıt olarak inflamatuar fenotiplerini değiştirebilirler; bu durum, mekanobiyolojinin immün regülasyondaki önemini vurgulamaktadır.

Giderek artan bir literatür, in vitro izole mekanik uyaranların makrofaj aktivasyon durumlarını önemli ölçüde etkileyebildiğini göstermiştir (Şekil 1). Daha sert substratlara maruz kalmak, pro-rejeneratif bir fenotipi indükleyen daha yumuşak substratlara kıyasla M1 polarizasyonunu ve inflamatuar sitokin üretimini artırmıştır15,16,17,18,19,20. Benzer şekilde, akışkan kayma gerilmesi makrofaj fenotipini büyüklüğe bağlı olarak modüle eder; düşük seviyeli interstisyel sıvı akışı genellikle pro-rejeneratif aktivasyonu teşvik ederken21,2, arterlerde görülen değerlere benzer daha yüksek kayma gerilmeleri proinflamatuar yanıtları indükleyebilir23,24,25,26,27,28. Kas-iskelet, miyokard, pulmoner ve intestinal doku mekaniğini taklit etmek için tasarlanan in vitro siklik germe modelleri, uygulanan kuvvetin büyüklüğü, süresi, frekansı ve boyutuna bağlı olarak sonuçlar değişse de, inflamatuar mediyatörlerin ekspresyonunda artış olduğunu göstermiştir29,30,31,32. Ayrıca, makrofaj mekanosensitivitesi türlere ve hücre kaynaklarına göre farklılık göstermekte olup, bu durum mekanobiyoloji çalışmaları için uygun deneysel modeller seçmenin önemini vurgulamaktadır13,14.

Makrofaj aktivasyon diyagramı; biyokimyasal, biyofiziksel uyaranlar; fenotipik değişiklikler; stres faktörleri.
Şekil 1...yı tasvir eden şema in vitro makrofajların proinflamatuar veya pro-rejeneratif durumlara aktivasyonundaki biyokimyasal ve biyofiziksel stimülasyonlar. Makrofajlar proinflamatuar bir duruma uyarılabilir in vitro kimyasal stimülasyonların (Lipopolisakkarit (LPS), İnterferon γ (IFN-γ)) eklenmesiyle veya kayma gerilmesi, artmış sertlik, yüksek döngüsel ve statik tek eksenli germe kaynaklı gerinim, kompresyon ve çok eksenli kompresyon kaynaklı gerinim dahil olmak üzere mekanik stimülasyonlara maruz bırakılarak. Makrofajlar, şu yöntemlerle pro-rejeneratif bir duruma stimüle edilebilir: in vitro kimyasal stimülasyonların, Interleukin-13 (IL-13) ve IL-4'ün eklenmesi. Ayrıca; salınımlı kayma gerilmesi, interstisyel akış, yumuşak substratlar veya düşük seviyeli tek eksenli döngüsel gerilme şeklinde mekanik stimülasyonlara maruz kaldıklarında pro-rejeneratif hale gelebilirler. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

İzole mekanik uyaranları bağımsız olarak araştırmanın yanı sıra, makrofajların in vivo ortamda genellikle eş zamanlı kuvvet kombinasyonlarına maruz kaldığı göz önüne alındığında, birleşik fiziksel kuvvetlerin etkisini incelemeye başlamak için bu çalışmanın üzerine koymak önemlidir. Peristaltizm, düz kas kasılması yoluyla üretilen eş zamanlı çok eksenli döngüsel gerinim ve akışkan kayma gerilmesinden oluşan böyle karmaşık bir mekanik ortamı temsil eder3. Bu mekanikler gastrointestinal sistem, gelişmekte olan hava yolları, vaskülatur, uterus ve üreterler dahil olmak üzere birden fazla organ sisteminde mevcuttur34,35,36. Önemli olan şudur ki; peristaltik fonksiyon, tamamı önemli ölçüde makrofaj aracılı inflamasyon içeren fibrozis, inflamatuar bağırsak hastalığı, kanser ve hava yolu yeniden şekillenme bozuklukları dahil olmak üzere inflamatuar hastalıklarda sıklıkla düzensizleşir3,37,38,39. Makrofajların bu hastalıklardaki tanınmış rolüne rağmen, peristaltik mekanik kuvvetlerin makrofaj aktivasyonunu doğrudan nasıl etkilediğinin anlaşılmasında kritik bir boşluk bulunmaktadır.

Bu protokol, fizyolojik olarak ilgili mekanik koşullar altında makrofaj mekanik-immünomodülasyonunu incelemek için bir peristaltik biyoreaktör sisteminin kullanımını açıklamaktadır. Geleneksel statik kültür sistemlerine veya tek kuvvetli mekanik stimülasyon platformlarına kıyasla bu yöntem, döngüsel çok eksenli gerilme ve sıvı kayma stresinin eş zamanlı olarak uygulanmasına olanak tanıyarak düz kas tabanlı dokuların in vivo mekanik mikroçevresini daha yakından taklit etmektedir. Bu protokolde, peristaltik koşullar altındaki biyoreaktörlerde kültüre edilen ölümsüzleştirilmiş fare kemik iliği kaynaklı makrofajlar (iBMDMs), M2 aktivasyonuna yönelik bir eğilim göstermezken artmış M1 aktivasyon markırları sergilemiştir. Bu bulgular, peristaltik mekaniğin makrofaj inflamatuar davranışını modüle etmek için yeterli olduğunu göstermekte ve dinamik düz kas kaynaklı kuvvetlere maruz kalan dokularda mekanik-immünomodülasyonun daha geniş konseptini desteklemektedir. Bu yöntem özellikle mekanobiyoloji, inflamasyon, doku mühendisliği, gastrointestinal fizyoloji, pulmoner gelişim, fibroz ve makrofajların karmaşık mekanik mikroçevreye maruz kaldığı diğer hastalıklar üzerinde çalışan araştırmacılar için uygundur. Dikkatli montaj, tutarlı kalibrasyon ve sürekli izleme ile kullanıcılar, tekrarlanabilir biyoreaktör performansı sağlayabilir ve bu tekniğin yaygın kısıtlamalarından kaçınabilirler.

Protokol

Bu protokol, mechano-immünomodülasyon çalışmaları için patentli40 bir biyoreaktör sisteminin kurulumunu ve çalıştırılmasını açıklamaktadır. Kullanılan reaktifler ve ekipmanlar Materyal Tablosunda listelenmiştir.

1. Hücre kültürü

  1. Ölümsüzleştirilmiş fare kemik iliği türevli makrofajları (iBMDMs), %10 ısıya inaktive edilmiş FBS, %1 HEPES tamponu, %1 Sodyum Piruvat ve %1 Penisilin-Streptomisin ile desteklenmiş tam RPMI 1640 içerisinde, 37 °C sıcaklıkta ve %5 CO2 takviyeli ortamda kültüre edin.

2. Polidimetilsiloksan (PDMS) üretimi

  1. Silikon elastomer kitinin bazını ve kürleme ajanını 10:1 (a/a) oranında tartın ve karıştırın.
  2. Homojen bir karışım elde etmek için karışımı 5 dk boyunca karıştırın.
  3. Karıştırılmış PDMS'yi, yükseklik 3 mm olana kadar dikkatlice 100 mm x 15 mm boyutunda kare bir Petri kabına dökün.
  4. PDMS içeren Petri kaplarını bir desikatöre yerleştirin.
  5. Hava kabarcıklarını gidermek için vakum altında 1 sa boyunca gaz giderme işlemi yapın.
  6. PDMS'yi desikatörden çıkarın ve hava kabarcığı kalmadığını onaylayın.
  7. Kürlenmemiş PDMS membranları 60 ˚ C'ye önceden ısıtılmış bir fırına aktarın ve 4 sa boyunca kürleyin.
  8. PDMS membranları fırından çıkarın ve tezgah üzerinde gece boyunca soğumaya bırakın.
  9. 18–24 sa sonra kürlenmiş PDMS membranları Petri kaplarından dikkatlice ayırın ve 70 mm x 40 mm x 3 mm boyutlarında PDMS membranlar oluşturacak şekilde kesin.

3. PDMS membranın sterilizasyonu

  1. Bir biyogüvenlik kabini içinde, PDMS membranları %70 etanol ile durulayın ve doğrudan biyogüvenlik kabininin (BSC) yüzeyine yerleştirin (Ek Şekil 1).
  2. 10 dk boyunca UV ile sterilize edin, ardından PDMS membranı, UV'ye maruz kalan yüzeyi yukarı bakacak şekilde doku kültürü işleminden geçirilmemiş 90 mm'lik bir kültür kabına aktarın.
    NOT: Kontaminasyon riskini azaltmak için PDMS'nin yanlardan tutulduğundan emin olun ve ellerinizi asla PDMS'nin üzerinden geçirmeyin.
  3. Peristaltik deneyler için, PDMS membranları orijinal boyutlarında kullanın.
  4. Statik kültür koşulları için, her bir 70 mm x 40 mm boyutundaki PDMS membranı iki eşit 35 mm x 40 mm'lik yarıya bölün.

4. PDMS membranların fibronektin ile kaplanması

  1. Bir BSC içerisinde, membran başına 100 µL eklemeye yetecek miktarda, fosfat tamponlu salin (PBS) içinde steril 0,5 mg/mL fibronectin çözeltisi hazırlayın.
  2. Bu kaplama çözeltisinden 10 µL'yi her bir PDMS membranının merkezine, kaplanan bölgenin PDMS ile vida arasındaki membran temas alanı ile tam olarak hizalandığından emin olarak dağıtın.
    NOT: Çözeltiyi ince ve eşit bir tabaka halinde nazikçe yaymak için bir pipet ucu kullanın.
  3. Adsorpsiyonun gerçekleşmesi için kaplanmış PDMS membranlarını, kapakları açık bir şekilde kültür kabında 45 dk boyunca bekletin.
    NOT: Sürekli hava akışını sağlamak için BSC camını açık tutun.
  4. 45 dk sonra, her bir membrandaki kalan fibronectin çözeltisini aspire edin.
  5. Membranları 1 mL steril PBS ile nazikçe durulayın.

5. iBMDM hücrelerinin PDMS membran üzerine ekilmesi

  1. T25 flaskta kültüre edilen iBMDM hücreleri %70–80 konfluens düzeyine ulaştığında, hücreleri yüzeyden ayırmak için tripsinizasyon uygulayın.
  2. Bir hemositometre kullanarak hücre konsantrasyonunu belirleyin ve besiyerinde 10,0 cells/mL hücre yoğunluğu hazırlayın.
  3. Fibronektin ile kaplanmış her bir PDMS membran üzerine, membran başına 1 mL hazırlanan hücre süspansiyonunu ekleyin.
  4. Koşullar arasında paralel karşılaştırma yapabilmek için, her deneyde en az bir statik membran ve bir peristaltik membran ekimi yapın.
  5. Hem statik hem de peristaltik koşullarda hücrelerin yapışmasını sağlamak için, ekim yapılan PDMS membranları %5 CO2 içeren, 37 °C'ye ayarlanmış nemlendirilmiş bir inkübatörde en az 24 saat bekletin (Ek Şekil 1B).

6. Biyoreaktör

  1. Biyoreaktörü, biyoreaktör patentinde (US1252795)40 verilen bilgisayar destekli tasarım (CAD) dosyaları ve spesifikasyonları kullanarak imal edin veya yazarlardan önceden monte edilmiş bir ünite temin edin.

7. Arduino devresi kurulumu ve kalibrasyonu

  1. Devre kurulumu
    1. Potansiyometreler, dirençler, transistörler ve iletken kablolar kullanarak kontrol devresini, gösterildiği gibi bir breadboard üzerinde kurun Ekler Şekil 2.
    2. Arduino IDE'yi bilgisayara kurun ve yeni bir taslak açın.
    3. Motor hızını dakikada 5 devir (RPM) ve peristaltik pompayı 28 mL/dak olarak ayarlayın.
    4. Arduino kartını bilgisayara bağlayın aracılığıyla USB ve sağlanan kodu yükleyin Ek Dosya 1 IDE'deki Yükle butonunu kullanarak.
      NOT: Arduino LED'i yükleme sırasında turuncuya dönecek ve çalıştırmaya hazır olduğunda tekrar yeşil olacaktır. Yükleme tamamlandıktan sonra, Arduino güç verildiğinde programı otomatik olarak yürütecektir.
  2. Motor kalibrasyonu
    1. Motoru çalıştırın ve bir kronometre kullanarak 1 dakika boyunca dönüşleri sayın.
      NOT: 5 RPM'ye ulaşmak için Arduino kodundaki motor hızı parametresini gerektiği şekilde ayarlayın.
    2. İstenen hıza ulaşılana kadar, her ayarlamadan sonra kodu yeniden yükleyin.
  3. Pompa kalibrasyonu
    1. Pompayı 30 saniye boyunca çalıştırın ve 28 mL/dak akış hızını (~30 saniyede 14 g) doğrulamak için toplanan kütleyi ölçün.
    2. Potansiyometreyi ayarlayın ve 30 saniyelik çıktı tutarlı bir şekilde 14 g civarında olana kadar tekrarlayın.
  4. Hem motor hem de pompa kalibre edildikten sonra, bunları bir biyoreaktör ünitesiyle eşleştirin.
    NOT: Kalibre edilmiş motor–pompa–biyoreaktör düzeneği artık deneysel kullanım için hazırdır (Şekil 2).

Makrofaj kültürü düzeneği için biyoreaktör diyagramı; hücre çalışması sonuçları için görüntüleme ve PCR analizi.
Şekil 2Peristaltik biyoreaktör düzeneğinin ve aşağı akış analizinin şeması. iBMDM hücreleri, biyoreaktör içinde yer alan fibronektin kaplı bir PDMS membrana ekilir. 4 saatlik peristaltik etkide tutulma veya statik kontrol olarak bekletilmenin ardından hücreler; qPCR, immünofloresan boyama ve görüntüleme dahil olmak üzere alt analizler için hasat edilir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

8. Peristaltik biyoreaktörün montajı ve kurulumu

  1. Bileşenlerin hazırlanması
    1. Besiyeri şişesi, besiyeri kapağı, 3B yazıcıyla üretilmiş besiyeri şişe üstü, 3B yazıcıyla üretilmiş biyoreaktör üstü, 3B yazıcıyla üretilmiş biyoreaktör altı, 3B yazıcıyla üretilmiş vida sürücüsü, plastik kelepçeler (biyoreaktör başına üç adet), ayarlı pense, yan keski, 150 mm doku kültürü kapları, silikon gres ve 3B yazıcıyla üretilmiş motor desteği dahil olmak üzere gerekli tüm bileşenleri toplayın. Her bir parçayı BSC'nin içine yerleştirmeden önce %70 etanol ile püskürtün.
    2. DC motoru, peristaltik pompayı ve ek bir pompa hortumu parçasını BSC'nin içine yerleştirin.
    3. BSC kapağını kapatın ve tüm bileşenleri sterilize etmek için UV ışığını 10 dk boyunca açık tutun (Supplementary Figure 1C).
  2. Hücre tutunmasının ve canlılığının doğrulanması
    1. Hem ekim yapılmış statik hem de peristaltik PDMS membranları mikroskop altında inceleyin. Fibronectin kaplı PDMS yüzeylerde >%80 hücre tutunmasını onaylayın ve canlılık için hücre morfolojisini kontrol edin.
    2. Gerektiğinde, montajdan önce hücrelerin temsilci görüntülerini yakalayın.
  3. Statik kontrollerin hazırlanması
    1. Her bir statik membrandan 1 mL komplet RPMI besiyerini aspire edin.
    2. Her bir membrana 1 mL taze komplet RPMI besiyeri ekleyin.
    3. Kapları statik olarak etiketleyin ve inkübatöre geri yerleştirin.
  4. Peristaltik biyoreaktörün montajı
    1. Biyoreaktör kullanımı için ayrılan her bir besiyeri şişesine 15 mL besiyeri ekleyin.
    2. 3B yazıcıyla üretilmiş şişe üstleri (giriş/çıkış portlarını içeren) takılı olan besiyeri kapaklarını besiyeri şişelerine sabitleyin. Bunları kenara ayırın (Supplementary Figure 1D).
    3. Biyoreaktör tabanını monte edin.
      1. 3B yazıcıyla üretilmiş vida sürücüsünü biyoreaktör alt kısmının merkezi kuyusuna yerleştirin.
      2. DC motoru, biyoreaktör alt kısmındaki motor yuvasına yerleştirin.
      3. Motor tahrik milinin, 3B yazıcıyla üretilmiş vida sürücüsünün merkezi deliğine güvenli bir şekilde oturduğundan emin olun.
      4. Motoru stabilize etmek için motor tutucuyu konumuna kaydırın.
  5. Kısmen monte edilmiş biyoreaktörü, montaj tamamlandığında BSC'den inkübatöre transferi kolaylaştırmak için 150 mm'lik bir doku kültürü kabına yerleştirin (Supplementary Figure 1E).
  6. PDMS membranın vida sürücüsüyle temas edeceği vida sürücüsü kanallarına ince bir tabaka silikon gres uygulayın. Bu, vidanın kolayca dönmesini sağlayarak sürtünmeyi azaltır.
  7. Hücre ekilmiş PDMS membranın yerleştirilmesi
    1. Hücre ekilmiş peristaltik PDMS membranları dikkatlice inkübatörden BSC'ye transfer edin.
    2. Her bir membrandan besiyerini aspire edin ve membranı, hücre ekilmiş yüzeyi yukarı bakacak şekilde, greslenmiş vida sürücüsü ara yüzeyinin karşısına gelecek şekilde biyoreaktöre yerleştirin.
    3. Biyoreaktör üst kısmını, hücre odası girintisi PDMS membranla hizalanacak şekilde konumlandırın. Üst kısmı biyoreaktör alt kısmının kılavuz kanallarına kaydırın.
  8. Biyoreaktörün sabitlenmesi
    1. Biyoreaktör üst ve alt kısımlarını plastik kelepçeler ve yan keski kullanarak sabitleyin.
    2. Fazla kelepçe uzunluğunu yan keski ile kesin.
  9. Akışkan bağlantıları ve sistem kurulumu
    1. Peristaltik pompayı, metal konektörü motor konektörü ile aynı yöne bakacak şekilde hizalayın.
    2. Biyoreaktöre en yakın pompa hortumunu, biyoreaktör üst kısmındaki motora en yakın giriş portuna bağlayın. Hortumu giriş nozulunun üzerine tamamen itin.
    3. Bu hortumun diğer ucunu besiyeri şişesinin içine daldırın.
    4. Ek pompa hortumu parçasını kullanarak, bir ucu biyoreaktör üst kısmının çıkış nozuluna bağlayın ve diğer ucu, geri akış olmadan resirkülasyona izin vermek için besiyeri seviyesinin üzerinde, besiyeri şişesinin içine yerleştirin (Supplementary Figure 1F).
  10. İnkübasyon ve çalıştırma
    1. Tüm biyoreaktör düzeneğini (150 mm'lik kap içinde) inkübatörün içine yerleştirin (Supplementary Figure 1G) ve devre kartını/Arduino'yu dışarıda, güce bağlı tutun.
    2. Timsah klipleri bağlayın
      1. Pompa: pozitif pozitife, negatif negatife.
      2. Motor: devre tasarımına göre polariteyi ters çevirin.
    3. Daha sonraki örnek toplama işlemi için inkübatöre boş steril Petri kapları yerleştirin.
    4. Peristaltik biyoreaktör sisteminin, inkübatördeki standart kültür koşulları altında 4 sa selama (veya istenen süre boyunca) çalışmasına izin verin (Supplementary Figure 1H).

9. Biyoreaktörün sökülmesi

  1. Sisteme hava girmesini sağlamak ve biyoreaktördeki kalıntı medyayı tamamen boşaltmak için inkübatörü açın ve giriş tüpünü medya şişesinden kaldırın.
  2. Medya akışı durduğunda, mekanik hareketi durdurmak için motor ve/veya pompa kablolarını devre kartından ayırın.
  3. Tüm biyoreaktör düzeneğini BSC'ye taşıyın, tüpleri çıkarın, plastik kelepçeleri kesin ve biyoreaktör üst kapağını kaldırın.
  4. PDMS membran üzerindeki kalıntı medyayı aspire edin ve membranı hazırlık sırasında kullanılan aynı Petri kabına geri aktarın.
  5. Bir hücre kültürü mikroskobu altında hücre morfometrisini değerlendirerek hücre yapışmasını ve canlılığını kontrol edin, ardından gerektiği şekilde downstream analizlerine geçin.

10. Alt analizler

  1. qPCR örnekleme
    1. BSC içerisinde, 1,5 mL mikro santrifüj tüplerini hücre tipi ve deneysel koşul dahil olmak üzere örnek tanımlayıcılarıyla etiketleyin.
    2. Hem statik hem de peristaltik koşullar için hücre kültür mikroskobu kullanarak hücrelerin PDMS üzerinde hâlâ mevcut olduğunu doğrulayın.
    3. Her bir PDMS membranındaki kalıntı medyumu aspire edin.
    4. Buffer RLT'ye 1:10 oranında β‑merkaptoetanol ekleyerek RNA liziz tamponunu taze olarak hazırlayın.
    5. Hücreleri lize etmek için her bir PDMS membranına 370 µL Buffer RLT + β-merkaptoetanol ekleyin.
    6. Steril bir hücre kazıyıcı kullanarak, tüm hücreleri ayırmak için PDMS'nin hücre ekili bölgesini kuvvetlice kazıyın.
    7. Lizattan yaklaşık 350 µL'yi ilgili 1,5 mL tüpe aktarın.
    8. RNA ekstraksiyonuna geçin veya örnekleri daha sonra kullanana kadar -80 °C'de saklayın.
    9. BSC'yi dekontamine edin.
      NOT: Buffer RLT ve β-merkaptoetanol, ilgili SDS'lerine göre taşınmalı ve uygun atık konteynerlerine atılmalıdır.
  2. İmmünofloresan boyama
    1. Her bir membrana 1 mL %4 paraformaldehit (PFA) ekleyin ve oda sıcaklığında 20 dk inkübe edin.
    2. PFA'yı aspire edin ve belirlenmiş tehlikeli atık konteynerine atın.
    3. Kalıntı fiksatifleri uzaklaştırmak için her bir membrana 1 mL PBS ekleyin.
    4. Hedef markörlere uygun immünofloresan boyama protokolü ile devam edin.

1. Biyoreaktörlerin ve ilişkili bileşenlerin temizlenmesi

  1. Biyoreaktörün giriş ve çıkış portları da dahil olmak üzere, besiyeri, hücreler veya PDMS membranlarla temas eden tüm biyoreaktör bileşenlerini %70 etanol ile püskürterek temizleyin.
  2. Besiyeri şişesinde kalan tüm besiyerini aspire edin, ardından iç kısmını bol miktarda %70 etanol püskürterek ve tekrar aspire ederek durulayın.
  3. Sterilize edilmiş tüm bileşenleri BSC'den çıkarın ve belirlenmiş temiz bir alanda saklayın.
  4. Besiyeri şişeleri için:
    1. %20 çamaşır suyu ile temizleyin, çalkalayın ve içeriği akan su altında lavaboya dökün.
    2. 1:10 oranında seyreltilmiş sirke ile fırçalayın; sabun ve ultrapure su ile yıkayın, ardından %70 etanol ile durulayıp ters şekilde kurumaya bırakın.
    3. Besiyeri kapaklarını ve pompa ek parçalarını %70 etanol ile temizleyin.
  5. Peristaltik pompaların temizlenmesi
    1. (1) %70 etanol, (2) ultrapure su veya (3) boş bir atık konteyneri içeren 250 mL'lik beherler hazırlayın.
    2. Pompayı kapalı bir akış yolu oluşturacak şekilde tüplerle bağlayın ve Arduino kontrollü devre kartını kullanarak çalıştırın.
    3. Pompayı önce 1 dk boyunca %70 etanol ile, ardından boş atık beherine boşaltmak üzere 1 dk boyunca ultrapure su ile çalıştırın.

Sonuçlar

Bu protokol, peristaltik mekanik kuvvetlerin makrofaj aktivasyonunu doğrudan nasıl modüle ettiğini belirlemek için tekrarlanabilir bir yöntemin gösterilmesini amaçlamıştır. Biyoreaktör deneylerinden önce, iBMDMs'lerin standart biyokimyasal stimülasyon koşullarına yanıt olarak uygun şekilde polarize oldukları doğrulanmıştır. Bu protokolün ardından, PDMS membranlar fibronektin ile kaplanmış ve iBMDMs ekilmiştir. Hücrelerin yapışması için 24 sa boyunca beklenmiş; ardından başarılı yapışma, membran yüzeyine tekdüze dağılım ve tedarikçi tanımında belirtilen düzensiz "sahanda yumurta" morfolojisi ile görülen canlılığı doğrulamak için görsel inceleme yapılmıştır (Şekil 3A,B). Kötü yapışma, düzensiz ekim veya hücre ayrılmasına dair kanıtlar gösteren membranlar, bu durumların tutarsız mekanik stimülasyon ve değişken alt akış sinyalleşmesine yol açabileceği nedeniyle deneylerin dışında tutulmuştur. Başarıyla ekim yapılan membranlar, ya peristaltik stimülasyona tabi tutulmak üzere biyoreaktör sistemine monte edilmiş ya da statik kontroller olarak tutulmuştur. 4 saatlik kültürün ardından, mekanik stimülasyon sonrası hücrelerin yapışık kaldığını doğrulamak için örnekler yeniden değerlendirilmiştir (Şekil 3C,D). Tüm koşullarda hücre tutulumu onaylandıktan sonra, makrofaj aktivasyonu qPCR ve immunofloresan boyama kullanılarak değerlendirilmiştir.

Proinflamatuar M1 ilişkili genlerin (Il6, Nos2 ve Cd40) yanı sıra M2 ilişkili genlerin (Chil3 ve Mrc1) ekspresyonundaki değişiklikleri değerlendirmek için qPCR analizi gerçekleştirildi (Tablo 1). Bu sonuçlar, peristaltik stimülasyonun makrofaj aktivasyonunu proinflamatuar bir fenotipe doğru teşvik ettiğini göstermiştir. Peristaltik kültür, statik kontrollere kıyasla Il6 ekspresyonunu 50,9 kat (p < 0,01, eşleştirilmemiş t-testi) ve Nos2 ekspresyonunu 19,8 kat (p = 0,046, eşleştirilmemiş t-testi) anlamlı şekilde artırmıştır (Şekil 4A). Cd40 ekspresyonu da 7,7 kat artış göstermiş olsa da bu değişim anlamlı değildi (p = 0,106, eşleştirilmemiş t-testi)(Şekil 4A). Buna karşılık, Chil3 (statik kontrollere göre 1,2 kat; p = 0,9726, eşleştirilmemiş t-testi) veya Mrc1 (statik kontrollere göre 1,16 kat; p = 0,9810, eşleştirilmemiş t-testi) genlerinde anlamlı bir değişiklik gözlenmemiştir (Şekil 4B). Birlikte değerlendirildiğinde, bu bulgular uygulanan peristaltik kuvvetlerin, alternatif aktivasyon yolaklarından ziyade öncelikli olarak proinflamatuar makrofaj aktivasyonunu teşvik ettiğini göstermektedir.

Makrofaj polarizasyonunu daha detaylı değerlendirmek için, pan-makrofaj belirteci F4/80'e ve M1 ile ilişkili belirteç CD40'a (Şekil 5A) veya M2 ile ilişkili belirteç YM1/YM2'ye (Şekil 5B) karşı antikorlar kullanılarak immünofloresan boyama gerçekleştirilmiştir. Koşullar arası karşılaştırma yapabilmek için örnekler DAPI ile karşı boyanmış ve aynı görüntüleme ayarları altında görüntülenmiştir. Her bir belirteç için ortalama floresan yoğunluğu (MFI) ölçülmüş ve aynı görüntü içindeki ilgili F4/80 sinyaline göre normalize edilmiştir. Peristaltik makrofajlar, statik kontrollere kıyasla %64,80'lik bir artışı temsil eden 1,74 ± 0,72 değerinde normalize edilmiş bir CD40 MFI göstermiştir, ancak bu artış istatistiksel olarak anlamlı bulunmamıştır (Şekil 5C). qPCR bulgularıyla uyumlu olarak, peristaltik stimülasyon sonrası normalize edilmiş YM1/YM2 ekspresyonunda anlamlı bir değişiklik gözlemlenmemiş ve statik kontrollere göre yalnızca %5'lik bir artış saptanmıştır (Şekil 5D). Bu temsili sonuçlar, protokolün yalnızca mekanik stimülasyon yoluyla ağırlıklı olarak proinflamatuar bir makrofaj yanıtını tekrarlanabilir şekilde indüklediğini göstermektedir.

0. ve 4. saatlerde statik ve peristaltik karşılaştırmalı hücre dağılımı; mikroskop görüntü analizi.
Şekil 3Brightfield görüntüleri, peristaltizm öncesi ve sonrasındaki hücre adezyonunun görsel onayını göstermektedir. hem statik (A,C) ve peristaltizm (B,D) biyoreaktör kurulumu öncesindeki (t = 0 sa) ve deney tamamlandıktan sonraki (t = 4 sa) koşullar. Ölçek çubukları = 200 µm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Gen ekspresyonu sütun grafiği; statik ve peristaltik koşullarda M1 ve M2'deki kat değişimi.
Şekil 4Gen ekspresyon analizi, makrofajların proinflamatuar aktivasyonunu göstermektedir aracılığıyla peristaltik stimülasyon. ( gene ifadesindeki kat değişimiA) M1 belirteçleri Il6, Nos2, ve Cd40, ve (B) M2 belirteçleri Chil3 ve Mrc1. *p < 0.05, ****p < 0,001, ns = anlamlı değil. Tüm veriler ortalama ± SD olarak sunulmuştur; her grup için n = 3'tür. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Makrofaj polarizasyon deneyi; CD40, YM1/2 belirteçleri, floresan mikroskobu, veri analiz grafiği.
Şekil 5İmmünofloresan boyama, peristaltik aktivasyon sonrası makrofajların proinflamatuar aktivasyonunu doğrulamaktadır. Pan-makrofaj markörü F4/80 (yeşil) ve ya (A) M1 belirteçleri CD40 (pembe) veya (B) M2 işaretleyicileri YM1/YM2 (kırmızı). Ölçek çubukları = 20 µm. (C) F4/80'e normalize edilmiş CD40'ın ortalama floresan yoğunluğu (MFI) kantifikasyonu. (D) F4/80'e normalize edilmiş YM1/YM2 MFI kantifikasyonu. Tüm veriler ortalama ± SD olarak sunulmuştur; her grup için n = 3'tür. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

GenPrimerDizi (5′–3′)
GapdhFAGGTCGGTGAACGGATTTG
GapdhRGGTCGTTGATGGCAACA
Chil3FCAG GTC TGG CAA TTC TTC TGA A
Chil3RGTC TTG CTC ATG TGT GTA AGT GA
Nos2FGGA GTG ACG GCA AAC ATG ACT
Nos2RTCG ATG CAC AAC TGG GTG AAC
Mrc1FCTC TGT TCA GCT ATT GGA CGC
Mrc1RTGG CAC TCC CAA ACA TAA TTT GA
Il-6FTCTATACCACTTCACAAGTCGGA
Il-6RGAA TTG CCA TTG CAC AAC TCT TT
Cd40FTTGTTGACAGCGGTCCATCTA
Cd40RGCCATCGTGGAGGTACTGTTT

Tablo 1: qPCR ile analiz edilen genler için primer dizileri.

Ek Şekil 1: PDMS hazırlama, biyoreaktör montajı ve perfüzyon kurulumu için iş akışı. (A) BSC içinde PDMS hazırlama. (B) Hücre ekimi. (C) Biyoreaktör bileşenlerinin UV sterilizasyonu. (D) Biyoreaktör montajı. (E) Sabitlenmiş biyoreaktör. (F) Pompa bağlantısı. (G) 0. saatteki inkübatör kurulumu. (H) 4. saatteki inkübatör kurulumu. Lütfen bu dosyayı indirmek için buraya tıklayın.

Ek Figür 2: Breadboard, pompa, motor ve kablolama ile biyoreaktör devresi. Lütfen bu dosyayı indirmek için buraya tıklayın.

Ek Dosya 1: Biyoreaktör Arduino kodu. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

İnflamatuar hastalıklarda disregüle peristaltisin yaygınlığına rağmen, peristaltik kuvvetlerin makrofaj fonksiyonlarını nasıl etkilediğine dair mevcut anlayış hala sınırlıdır. Kayma gerilmesi ve siklik gerinim gibi bireysel mekanik stimülasyonların makrofaj aktivasyonunu modüle ettiği bilinse de, peristaltiyi birlikte oluşturan eşzamanlı çok eksenli gerinim ve sıvı akışının etkileri, makrofaj mekanobiyolojisi bağlamında kapsamlı bir şekilde araştırılmamıştır. Burada açıklanan protokol, bu bileşik mekanik kuvvetlerin fizyolojik olarak ilgili koşullar altında makrofaj inflamatuar davranışını nasıl düzenlediğini incelemek için tekrarlanabilir bir platform sunmaktadır. Bu sistem kullanılarak, 4 h boyunca peristaltik stimülasyona maruz bırakılmanın, Il6 ve Nos2 ekspresyonunun anlamlı derecede artmasıyla karakterize olan, ağırlıklı olarak proinflamatuar bir makrofaj fenotipini teşvik ettiği gösterilmiştir.

Önemli bir nokta olarak, makrofaj mekanosensitivitesi; uygulanan kuvvetin büyüklüğüne, frekansına ve süresine yüksek derecede bağımlıdır12,13,14. İzole mekanik stimülasyonları inceleyen önceki çalışmalar, makrofaj aktivasyon durumlarının bu parametrelere bağlı olarak önemli ölçüde farklılık gösterdiğini ortaya koymuştur. Bu nedenle, peristaltik mekaniğin indüklediği makrofaj yanıtlarının spektrumunu daha iyi tanımlamak için gelecek çalışmalar; değişmiş gerinimler ve kayma gerilmeleri ile mekanik stimülasyon altında geçen sürenin artırılmasını da içeren daha geniş bir peristaltik koşullar aralığını araştırmalıdır. Ayrıca, bu çalışma, tek başına sıvı kayma gerilmesi veya siklik gerinim yerine mekanik bir girdi olarak peristalsise odaklanmayı seçmiş olmamız nedeniyle sınırlıdır. Gelecekteki çalışmalar, tek bir platform titizliği kullanarak farklı mekanik girdilerin bir fonksiyonu olarak makrofaj aktivasyonunu keşfetmek için bu biyoreaktör platformundan yararlanabilir. Bu çalışmaların genişletilmesi, farklı doku bağlamlarında inflamatuar veya pro-rejeneratif fenotipleri teşvik eden mekanik eşiklerin belirlenmesine yardımcı olabilir.

Makrofajların mekanosensitivitesi aynı zamanda substrat sertliğine ve topografyasına oldukça bağımlıdır. Bu çalışma için seçilen PDMS sertliğinin, peristaltik kuvvetlerin etkilerinden bağımsız olarak makrofaj aktivasyonu üzerinde etkili olabileceğinin belirtilmesi önemlidir15,16,17,18,19. Sertliği bir değişken olarak kontrol etmek amacıyla, peristalsise maruz kalan makrofajlarımızı, statik koşullar altında aynı sertlikteki PDMS üzerindeki makrofajlarla karşılaştırdık. Gelecekteki çalışmalar; PDMS oranını değiştirerek, substrat için ek malzemeler kullanarak veya karşılaştırma amacıyla makrofajları 2D bir doku kültürü kabında kültüre ederek sertlik değişkenini daha da hassas bir şekilde kontrol edebilir. Ayrıca, PDMS topografyasını değiştirmemiş olsak da cihazımız bu değişkenin gelecekteki çalışmalarına olanak sağlamaktadır.

Bu protokolün temel güçlü yönü, geniş bir inflamasyon çalışmaları yelpazesine uyarlanabilir olmasıdır. Bu çalışma ölümsüzleştirilmiş kemik iliği kaynaklı makrofajları (iBMDM'ler) kullansa da sistem; primer makrofajlara, monositlere, doku yerleşik makrofajlara veya çok hücreli ko-kültür sistemlerine kolayca uyarlanabilir. Örneğin, gastrointestinal kanal, uterus veya üreterlerin hücresel mikroçevresini daha iyi taklit etmek için epitelyal, stromal veya düz kas hücreleri sürece dahil edilebilir. Ayrıca, PDMS membrana uygulanan kaplama değiştirilerek hücre dışı matris kompozisyonu hedeflenen dokuya göre özelleştirilebilir. Bu çalışmada, peristaltik stimülasyon sırasında iBMDM adezyonunu sürdürmek için fibronectin gerekli olmuşken, kollajen I ve kollajen IV kaplamalar önemli düzeyde hücre kopmasına neden olmuştur. Bununla birlikte, optimal matris kaplamaları makrofaj kaynağına veya ko-kültür konfigürasyonuna bağlı olarak farklılık gösterebilir. Sonuç olarak, tekrarlanabilir mekanik stimülasyon ve alt analizleri sağlamak için önerilen kontrol noktalarında hücre adezyonunun dikkatle doğrulanması kritik önem taşır.

En yaygın arızaları önlemeye yardımcı olan rutin bakım da dahil olmak üzere, bu protokolün başarılı bir şekilde uygulanması için çeşitli teknik hususlar büyük önem taşımaktadır. Biyoreaktörün plastik kelepçeler kullanılarak düzgün şekilde monte edilmesi ve sızdırmaz hale getirilmesi özellikle kritiktir; çünkü yetersiz sızdırmazlık, medya sızıntısına, değişmiş kayma gerilmesi ve gerinim profillerine, kontaminasyon riskine veya hücre canlılığı kaybına yol açabilir. Ayrıca, tekrarlanabilir peristaltik stimülasyonun sürdürülmesi için pompaların ve motorların stabil kalibrasyona ihtiyacı vardır ve pompa tüplerinin etanol ile ultrapure suyla düzenli olarak yıkanması kalıntı birikimini önler. Son olarak, PDMS membranlara ekilen hücrelerin, biyoreaktöre yerleştirilmeden önce düzgün şekilde tutunduğu ve %80 konfluense ulaştığı kontrol edilmelidir. Topluca değerlendirildiğinde, bu sorun giderme adımları ve sistem kısıtlamaları; tekrarlanabilir biyoreaktör performansını sağlamak için dikkatli montaj, tutarlı kalibrasyon ve sürekli izlemenin gerekliliğini vurgulamaktadır.

Genel olarak bu protokol, karmaşık dinamik mekanik ortamlar altında mekanik-immünomodülasyonun araştırılması için çok yönlü ve fizyolojik olarak ilgili bir platform sunmaktadır. Siklik çok eksenli gerilme ve akışkan kayma gerilmesinin eş zamanlı uygulanmasına olanak tanıyan bu sistem, geleneksel tek kuvvetli in vitro modellerin kapsamını genişletmekte ve düz kas güdümlü dokularda inflamasyonun incelenmesi için değerli bir araç sağlamaktadır. Bu yaklaşım; gastrointestinal hastalıkların, fibrozis ve kanserin yanı sıra makrofajların dinamik mekanik mikroortamlara maruz kaldığı diğer patolojilerin araştırılmasında geniş çapta uygulanabilir.

Açıklamalar

Yazarların beyan edecek herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

Bu çalışma, National Science Foundation'ın 2440798 numaralı ödülü tarafından finanse edilmiştir. Şekil 1 ve Şekil 2, BioRender.com'un lisanslı bir versiyonu ile oluşturulmuştur.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
0.25% Trypsin-EDTAFisher25200056
1.5 mL mikro santrifüj tüpleriUSA Scientific1615-5510
100 mm x 15 mm Petri kaplarıFisher50-190-0276
150 mm kültür kaplarıFisherFB012925
4% paraformaldehitSanta Cruzsc-281692
90 mm kültür kaplarıFisherFB012923
Alexa Fluor 488 Anti-F4/80 antikoruAbcamab204266
Alexa Fluor 647 Anti-CD40 antikoruAbcamab275158
Arduino UnoAmazonB008GRTSV6
BreadboardAmazon
RLT TamponuQiagen79216
Hücre kazıyıcıFisher353087
DAPIMilliporeSigma50-874-10001
DesikatörMilliporeSigmaZ119008
Yan keskiAmazon
Fetal sığır serumuInnovative Biosciences11-01-500
FibronektinMilliporeSigmaF1141-1MG
HEPES tamponuFisher (Gibco)15630080
iBMDMApplied Biological Materials Inc. (abm)T0673
Motor RobotshopFT-SPARK16-360
PE Anti-Ym-1 + Ym-2 antikoruAbcamab211621
Penisilin-StreptomisinFisher15140122
Peristaltik pompaDigiKey1150
Fosfat tamponlu salinFisher14190250
PLA filamentAmazonB0D7ZYCVTY
Potansiyometre B1K 1K OhmAmazon‎B0CZ747F6F
RPMI 1640Fisher11875085
Silikon gresAmazonB000XBH9HI
KargaburnuAmazon
Sodyum PiruvatCytiva HycloneSH3023901
Sylgard 184 Silikon elastomer kitiFisherNC9285739
T-25 kültür flaskıFisher229331
TransistörDigiKeyIRF520NPBF-ND
Kablolama/Timsah KliplerAmazon
Kablo bağı 18 inçAmazon
β-merkaptoetanolFisherAC125472500

Kaynaklar

  1. Mass E, Nimmerjahn F, Kierdorf K, Schlitzer A. Tissue-specific macrophages: how they develop and choreograph tissue biology. Nat Rev Immunol. 2023;23(9):563-579.
  2. Kumar V, Kumar V. Macrophages: the potent immunoregulatory innate immune cells. In: Macrophage Activation - Biology and Disease. London: IntechOpen; 2019. doi:10.5772/intechopen.88013.
  3. Ross EA, Devitt A, Johnson JR. Macrophages: the good, the bad, and the gluttony. Front Immunol. 2021;12:708186.
  4. Sreejit G, Fleetwood AJ, Murphy AJ, Nagareddy PR. Origins and diversity of macrophages in health and disease. Clin Transl Immunology. 2020;9(12):e1222.
  5. Locati M, et al. Diversity, mechanisms, and significance of macrophage plasticity. Annu Rev Pathol. 2020;15:123-147.
  6. Mosser DM, Edwards JP. Exploring the full spectrum of macrophage activation. Nat Rev Immunol. 2008;8(12):958-969.
  7. Boutilier AJ, Elsawa SF. Macrophage polarization states in the tumor microenvironment. Int J Mol Sci. 2021;22(13):6995.
  8. Orecchioni M, Ghosheh Y, Pramod AB, Ley K. Macrophage polarization: different gene signatures in M1 (LPS+) versus classically and M2 (LPS−) versus alternatively activated macrophages. Front Immunol. 2019;10:1084.
  9. Huang X, Li Y, Fu M, Xin HB. Polarizing macrophages in vitro. Methods Mol Biol. 2018;1784:119-126.
  10. Gharavi AT, et al. The role of macrophage subtypes and exosomes in immunomodulation. Cell Mol Biol Lett. 2022;27(1):83.
  11. Peng Y, et al. Regulatory mechanism of M1/M2 macrophage polarization in the development of autoimmune diseases. Mediators Inflamm. 2023;2023:8821610.
  12. Clevenger AJ, Jha A, Moore E, Raghavan SA. Manipulating immune activity of macrophages: a materials and mechanics perspective. Trends Biotechnol. 2025;43(1):33-49.
  13. Khanmohammadi M, Mirzaalikhan Y, Baratchi S. Immunity in motion: the role of mechanics in macrophage biology. Cell Chem Biol. 2025;32(12). doi:10.1016/j.chembiol.2025.11.004.
  14. Adams S, et al. Mechano-immunomodulation: mechanoresponsive changes in macrophage activity and polarization. Ann Biomed Eng. 2019;47(11):2213-2231.
  15. Meizlish ML, et al. Mechanosensing regulates tissue repair program in macrophages. Sci Adv. 2024;10(11):adk6906.
  16. Lee M, Du H, Winer DA, Clemente-Casares X, Tsai S. Mechanosensing in macrophages and dendritic cells in steady-state and disease. Front Cell Dev Biol. 2022;10:1044729.
  17. Chen M, et al. Substrate stiffness modulates bone marrow-derived macrophage polarization through NF-κB signaling pathway. Bioact Mater. 2020;5(4):880-890.
  18. Blakney AK, Swartzlander MD, Bryant SJ. The effects of substrate stiffness on the in vitro activation of macrophages and in vivo host response to poly(ethylene glycol)-based hydrogels. J Biomed Mater Res A. 2012;100A(6):1375-1386.
  19. Sridharan R, Cavanagh B, Cameron AR, Kelly DJ, O'Brien FJ. Material stiffness influences the polarization state, function and migration mode of macrophages. Acta Biomater. 2019;89:47-59.
  20. Previtera ML, Sengupta A. Substrate stiffness regulates proinflammatory mediator production through TLR4 activity in macrophages. PLoS One. 2015;10(12):e0145813.
  21. Song C, et al. Microfluidic three-dimensional biomimetic tumor model for studying breast cancer cell migration and invasion in the presence of interstitial flow. Chin Chem Lett. 2019;30(5):1038-1042.
  22. Li R, et al. Interstitial flow promotes macrophage polarization toward an M2 phenotype. Mol Biol Cell. 2018;29(16):1927-1940.
  23. Son H, et al. Shear stress induces monocyte/macrophage-mediated inflammation by upregulating cell-surface expression of heat shock proteins. Biomed Pharmacother. 2023;161:114566.
  24. Zhou H, Scatena M, Tu LN, Giachelli CM, Nigam V. Monocyte adhesion to and transmigration through endothelium following cardiopulmonary bypass shearing is mediated by IL-8 signaling. Front Cardiovasc Med. 2024;11:1454302.
  25. Jui E, et al. Shear stress induces a time-dependent inflammatory response in human monocyte-derived macrophages. Ann Biomed Eng. 2024;52(11):2690-2705.
  26. Castro-Núñez L, Dienava-Verdooold I, Herczenik E, Mertens K, Meijer AB. Shear stress is required for the endocytic uptake of the factor VIII-von Willebrand factor complex by macrophages. J Thromb Haemost. 2012;10(9):1929-1937.
  27. Cheng C, et al. Atherosclerotic lesion size and vulnerability are determined by patterns of fluid shear stress. Circulation. 2006;113(23):2744-2753.
  28. Seneviratne AN, et al. Low shear stress induces M1 macrophage polarization in murine thin-cap atherosclerotic plaques. J Mol Cell Cardiol. 2015;89(Pt B):168-172.
  29. Bonito V, de Kort BJ, Bouten CVC, Smits AIPM. Cyclic strain affects macrophage cytokine secretion and extracellular matrix turnover in electrospun scaffolds. Tissue Eng Part A. 2019;25(17-18):1312-1325.
  30. Ballotta V, Driessen-Mol A, Bouten CVC, Baaijens FPT. Strain-dependent modulation of macrophage polarization within scaffolds. Biomaterials. 2014;35(18):4919-4928.
  31. Dziki JL, et al. The effect of mechanical loading upon extracellular matrix bioscaffold-mediated skeletal muscle remodeling. Tissue Eng Part A. 2018;24(1-2):128-139.
  32. Wehner S, et al. Mechanical strain and TLR4 synergistically induce cell-specific inflammatory gene expression in intestinal smooth muscle cells and peritoneal macrophages. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 2010;299(5):G1187-G1197.
  33. Clevenger AJ, et al. Rapid prototypable biomimetic peristalsis bioreactor capable of concurrent shear and multiaxial strain. Cells Tissues Organs. 2023;212(1):57-72.
  34. Huizinga JD. Gastrointestinal peristalsis: joint action of enteric nerves, smooth muscle, and interstitial cells of Cajal. Microsc Res Tech. 1999;47(4):239-247.
  35. Kunz G, Leyendecker G. Uterine peristaltic activity during the menstrual cycle: characterization, regulation, function and dysfunction. Reprod Biomed Online. 2002;4(Suppl 3):5-9.
  36. Hosseini G, et al. A computational model of ureteral peristalsis and an investigation into ureteral reflux. Biomed Eng Lett. 2018;8(1):91-101.
  37. Clevenger AJ, et al. Peristalsis-associated mechanotransduction drives malignant progression of colorectal cancer. Cell Mol Bioeng. 2023;16(4):315-330.
  38. Leyendecker G, Kunz G, Wildt L, Beil D, Deininger H. Uterine hyperperistalsis and dysperistalsis as dysfunctions of the mechanism of rapid sperm transport in patients with endometriosis and infertility. Hum Reprod. 1996;11(7):1542-1551.
  39. Iwakiri K, et al. Mechanisms underlying excessive esophageal acid exposure in patients with gastroesophageal reflux disease. Esophagus. 2017;14(3):213-218.
  40. Raghavan S, Crawford LZ. 3D rapid prototypable tunable peristalsis bioreactor. United States patent. 2022: US12522795.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Bioengineeringperistalsismacrophagesinnate immunitymechanobiology
Bize ulaşın
Kütüphaneye tavsiye et

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Telif hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.