Araştırma makalesi

N-Laktoil-fenilalanin, Lipid Metabolizmasını Düzenleyerek Diyabetik Kardiyomiyopati Fare Modelinde Kardiyak Fonksiyonu İyileştirir

21 görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/72633

⸱

1 Eylül 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Nanjing Drum Tower Hospital Clinical College, Nanjing University of Chinese Medicine, 2Affiliated Hospital of Medical School, Nanjing University, 3Institute of Advanced Synthesis, School of Chemistry and Molecular Engineering, Nanjing Tech University

Bu makalede

Özet

Bu protokol, N-laktoil-fenilalaninin diyabetik kardiyomiyopati, kardiyak lipid metabolizması ve kolesterol sentezi üzerindeki etkilerini, özellikle adenozin monofosfat-aktive protein kinaz alfa 1/3-hidroksi-3-metilglutaril-koenzim A redüktaz yoluna odaklanarak incelemek için in vivo ve in vitro yaklaşımları açıklamaktadır.

Özet

Diyabetik kardiyomiyopati (DCM), diyabetin en ciddi komplikasyonlarından biridir. Endojen bir metabolit olan N-laktoil-fenilalanin (Lac-Phe), kilo kaybını teşvik edebilir ve glikoz homeostazını iyileştirebilir. Bu çalışma, Lac-Phe'nin DCM üzerindeki terapötik etkisini araştırmayı ve altında yatan mekanizmayı daha ayrıntılı incelemeyi amaçlamıştır. DCM'li tip 2 diyabetik farelere Lac-Phe uygulanmıştır. Lac-Phe, kardiyak kontraktil fonksiyonu artırmış, patolojik remodelasyonu iyileştirmiş ve kalpte lipid birikimini azaltmıştır. In vitro ortamda, Lac-Phe'nin etkileri yüksek glikoz ve palmitik asit ile stimüle edilen H9c2 hücrelerinde incelenmiştir. Lac-Phe, H9c2 hücrelerinde kolesterol sentezini azaltarak lipid birikimini düşürmüştür. Mekanistik olarak Lac-Phe, adenozin monofosfatla aktive olan protein kinaz alfa 1'in (AMPKα1) fosforilasyonunu ve aktivasyonunu teşvik etmiştir. Ardından, aktive olan AMPKα1, aşağı akış hedefi olan 3-hidroksi-3-metilglutaril-koenzim A redüktazı (HMGCR) fosforile ederek inhibe etmiş; bu durum kolesterol sentezinin azalmasına ve nihayetinde H9c2 hücrelerindeki lipid metabolizması dengesizliğinin iyileşmesine yol açmıştır. Bu bulgular, Lac-Phe'nin DCM'deki H9c2 hücrelerinde lipid metabolizmasını AMPKα1/HMGCR yolu üzerinden iyileştirdiğini, böylece kardiyak kontraktil fonksiyonu artırdığını ve patolojik remodelasyonu hafiflettiğini göstermektedir. Lac-Phe, diyabetik kardiyomiyopati için potansiyel bir terapötik yaklaşım temsil edebilir.

Giriş

Diyabet, kalıcı hiperglisemi ile karakterize metabolik bir hastalıktır1. Son yirmi yılda diyabet, her yıl altı milyondan fazla insanın diyabet ve komplikasyonları nedeniyle ölmesiyle dünya çapında ilk on ölüm nedeninden biri haline gelmiştir2. Diyabete bağlı bir kardiyak patolojik durum olan diyabetik kardiyomiyopati (DCM), diyabetle ilişkili en ciddi komplikasyonlardan birini temsil eder3,4. Kalp yetmezliği için bağımsız bir risk faktörü olarak işlev görür ve kardiyak fibrozis ile kardiyomiyosit hipertrofisi dahil olmak üzere, nihayetinde hem diyastolik hem de sistolik disfonksiyona yol açan yapısal ve fonksiyonel miyokardiyal değişikliklerle karakterizedir5,6. β-blokerler, anjiyotensin dönüştürücü enzim inhibitörleri ve anjiyotensin II tip 1 reseptör blokerleri gibi birçok geleneksel kardiyovasküler tedavi şu anda DCM yönetiminde kullanılsa da7,8, klinik ortamlarda etkinlikleri suboptimal düzeyde kalmaktadır. DCM'nin altında yatan mekanizmalar derinlemesine çalışılmadığından9, şu anda bu hastalığı hedefleyen net bir tedavi stratejisi bulunmamaktadır10,11. DCM'nin klinik belirtileri, erken evrede asemptomatik diyastolik disfonksiyondan, geç evrede sistolik disfonksiyon ve klinik kalp yetmezliğine, hatta ölüme kadar ilerler12,13. Bu nedenle, bu durum için etkili tedavi seçeneklerinin araştırılması ve geliştirilmesine acil ihtiyaç vardır.

Dengesiz lipid metabolizması, DCM'nin temel bir özelliğidir14. DCM'de, kandaki serbest yağ asidi (FFA) seviyelerinin artması, kardiyomiyositler tarafından aşırı yağ asidi alımına yol açabilir15,16. Kardiyomiyositlerdeki yağ asidi metabolizması temel olarak yağ asidi oksidasyonuna bağlıdır. Zamanla, kardiyomiyositlerdeki yağ asidi oksidasyonu, alınan tüm yağ asitlerini tamamen metabolize etmek için yetersiz kalır ve fazla yağ asitleri ile bunların ara metabolitleri kardiyomiyositlerde birikir17. Bu aşırı lipid yükü lipotoksisiteyi tetikler, miyokardiyal enerji arzını bozar, kardiyak oksidatif stresi ve inflamatuar yanıtları teşvik ederek nihayetinde kardiyomiyositlerde ciddi hasara neden olur18,19. Bu nedenle, kardiyak lipid metabolizmasının aktif olarak düzenlenmesi, DCM için potansiyel bir terapötik hedef olabilir20.

N-laktoil-fenilalanin (Lac-Phe), egzersiz sonrası konsantrasyonu hızla artan endojen bir metabolittir21. Mekanistik olarak Lac-Phe, laktat ve fenilalaninin kondenzasyonu yoluylale sitozolik enzim karnozin dideptidaz 2 (CNDP2) tarafından sentezlenir. Bu biyosentetik yolak; makrofajlar, epitel hücreler ve fiziksel aktivite sonrası dolaşıma Lac-Phe salgılayan mezenkimal kök hücreler dahil olmak üzere çeşitli hücre tiplerine yaygın olarak dağılmıştır22. Lac-Phe'nin kronik uygulamalarının gıda alımını etkili bir şekilde azalttığı, obeziteyi ve vücut ağırlığını düşürdüğü ve glikoz homeostazını iyileştirdiği gösterilmiştir21. Yakın tarihli bir çalışma, Lac-Phe'nin omurilik yaralanması sonrası mikrogliya/makrofajların lipid metabolizma kapasitesini iyileştirebileceğini göstermiştir23. İlginç bir şekilde, çalışmalar tip 2 diyabet için birinci basamak bir ilaç olan metforminin hem akut hem de kronik uygulamasının Lac-Phe seviyelerini yükseltebildiğini ve Lac-Phe'nin metforminle ilişkili anti-obezite etkilerine aracılık ettiğini göstermektedir22. Ayrıca, Sha ve arkadaşları yakın zamanda Lac-Phe'nin mitokondriyal disfonksiyonu hafifleterek miyokardiyal hücre ölümünü azalttığını ve böylece transvers aortik konstriksiyon (TAC) kaynaklı kalp yetmezliğini iyileştirdiğini göstermiştir24. Uzamış hiperglisemi ve obezite, DCM'de lipid metabolizmasının disregülasyonuna katkıda bulunan önemli faktörlerdir25. Topluca, bu kanıtlar Lac-Phe'nin DCM üzerinde potansiyel bir terapötik etkiye sahip olabileceğini düşündürmektedir. Ancak, bugüne kadar Lac-Phe'nin spesifik olarak DCM'deki rolü araştırılmamıştır.

Bu çalışmada, diyabetik kardiyomiyopatisi olan farelere dışarıdan Lac-Phe uygulanmasının, kardiyak kontraktil fonksiyonu etkili bir şekilde iyileştirdiğini ve kardiyak patolojik yeniden şekillenmeyi azalttığını bulduk. Lac-Phe'nin, lipid metabolizması dengesizliğinin düzenlenmesi yoluyla DCM'li farelerde kalp fonksiyonlarını iyileştirdiğini saptadık. Lac-Phe, DCM'li farelerin kardiyomiyositlerinde lipid damlacığı (LD) birikimini azalttı ve kalpteki kolesterol içeriğini düşürdü. Mekanistik olarak Lac-Phe, adenozin monofosfat-aktive protein kinaz alfa 1'in (AMPKα1) fosforilasyonunu ve aktivasyonunu teşvik ederek, böylece 3-hidroksi-3-metilglutaril-koenzim A redüktazın (HMGCR) fosforilasyonunu artırdı. HMGCR fosforilasyonu, enzim aktivitesini azaltarak kolesterol üretiminin düşmesini sağlar ve böylece kardiyomiyositlerdeki lipid metabolizması dengesizliğini iyileştirir. Bu sonuçlar, Lac-Phe ile DCM'nin potansiyel tedavisi için teorik bir temel oluşturmaktadır.

Protokol

The animal study protocol was approved by the Institutional Ethics Committee of Nanjing Drum Tower Hospital (Approval Number: 2025AE1065, 26 September 2025) and was conducted in accordance with the guidelines outlined in the Guidelines for the Care and Use of Laboratory Animals (8th Edition), published by the National Institutes of Health of the United States.

Animals

Thirty 5-week-old male C57BL/6J mice were used in this study. After 1 week of adaptive feeding, all mice were housed with access to food and water under an alternating 12 h day-night cycle at a temperature of 22°C ± 2°C and humidity of 40%–60%. An HFD combined with low-dose STZ was used to establish the DCM mouse model (Figure 1A). Four weeks after initiation of high-fat diet (HFD; 60% fat, 20% protein, and 20% carbohydrate) feeding, mice were fasted overnight and subsequently administered streptozotocin (STZ; 8 mg/mL dissolved in citrate buffer, pH 4.5) via intraperitoneal injection at a dosage of 35 mg/kg/day for three consecutive days. Control group mice were fed a control diet (10% fat, 20% protein, and 70% carbohydrate) and received equivalent volumes of citrate buffer. Following 15 additional weeks of high-fat diet maintenance, mice meeting both criteria, random blood glucose of ≥13.3 mmol/L and left ventricular ejection fraction (LVEF) of <55%, were defined as successfully established DCM models. These validated DCM mice were numbered and randomly assigned to the DCM and DCM + Lac-Phe groups using a random number table. Approximately half of the mice failed to develop the model; these animals were euthanized in accordance with animal ethics requirements. In brief, mice were divided into three groups: Control, DCM, and DCM + Lac-Phe (n = 10 for each group). All 10 mice per group underwent echocardiography, body weight measurement, and OGTT. Following the 28-day treatment period, hearts were collected for subsequent analyses. There were 10 mice in each group. Of these, three mice per group were used for transcriptome sequencing, three were used for transmission electron microscopy and histological staining, and three were used for protein expression analysis. The remaining mouse in each group was reserved as a backup. After successful establishment of the DCM model, Lac-Phe was dissolved in normal saline to a final concentration of 10 mg/mL. Mice in the DCM + Lac-Phe group received intraperitoneal Lac-Phe at 50 mg/kg/day in an injection volume of 5 mL/kg, once daily for 28 consecutive days. Mice in the Control and DCM groups were administered an equivalent volume of normal saline as vehicle control.

figure-protocol-1
Figure 1. Lac-Phe improves cardiac function and pathological remodeling in mice with diabetic cardiomyopathy. (A) Schematic of the HFD/STZ-induced DCM mouse model and Lac-Phe treatment protocol. (B) Body weights of mice in the Control, DCM, and DCM + Lac-Phe groups during the 4-week treatment period; n = 10 per group. (C) Oral glucose tolerance test (OGTT) in the indicated groups; n = 10 per group. (D) Representative echocardiographic images at 0, 2, and 4 weeks of treatment. (E,F) Quantification of left ventricular ejection fraction (LVEF) (E) and fractional shortening (FS) (F); n = 10 per group. (G) Representative hematoxylin and eosin (H&E)-stained heart sections. Scale bar = 1 mm. (H,I) Representative Masson’s trichrome staining of heart sections (H) and quantification of fibrotic area (I); n = 3 per group. Scale bar = 50 μm. (J,K) Representative wheat germ agglutinin (WGA) staining of heart sections (J) and quantification of relative cardiomyocyte area (K); n = 3 per group. Scale bar = 20 μm. Data are presented as the mean ± standard deviation. P < 0.05, **P < 0.001. Please click here to view a larger version of this figure.

Cardiac function

Following anesthesia with isoflurane inhalation, mice were secured in a supine position on a temperature-controlled platform (37°C). Left ventricular dimensions and mitral valve blood flow velocity during diastole and systole were measured using an echocardiography machine equipped with a 40 MHz transducer, from which LVEF and shortening fraction (FS) were calculated. Three consecutive cardiac cycles were collected from each mouse.

Cell treatment

H9c2 cells were cultured in Dulbecco’s modified Eagle’s medium supplemented with 10% fetal bovine serum and 1% penicillin–streptomycin at 37°C in a humidified atmosphere containing 5% CO₂. Cells were passaged every 2–3 days upon reaching 70%–80% confluence. For experiments, cells were seeded in 10 cm dishes and then divided into three groups: Control, high glucose/palmitic acid (HG/PA), and HG/PA + Lac-Phe. Cells in the HG/PA and HG/PA + Lac-Phe groups were first exposed to 0.25 mM palmitic acid and 50 mM glucose for 24 h. Thereafter, cells in the HG/PA + Lac-Phe group were treated with 10 μg/mL Lac-Phe for an additional 24 h while HG/PA exposure was maintained; cells in the HG/PA group received an equivalent volume of PBS under the same HG/PA conditions. In the p-AMPK inhibition experiments, 10 μM AMPK-IN-3 (dissolved in DMSO) was added simultaneously with Lac-Phe for 24 h, and the corresponding control groups received an equal volume of DMSO. For the atorvastatin experiments, H9c2 cells under HG/PA conditions were treated with 10 μM atorvastatin for 24 h, either alone or in combination with 10 μg/mL Lac-Phe.

Histological staining

After 28 days of Lac-Phe administration, mouse hearts were harvested and immersion-fixed in 4% paraformaldehyde (pH 7.4) for 24 h. Fixed cardiac tissues were paraffin-embedded and sectioned into 6-μm-thick slices. Tissue sections were stained with hematoxylin and eosin, wheat germ agglutinin, and Masson’s trichrome. All staining procedures were performed strictly following the manufacturers’ protocols. Whole-slide imaging was performed at 20× magnification using a high-resolution brightfield microscope equipped with a digital camera system.

Western blot analysis

Protein concentration was determined using the Bradford assay. Tissue lysates were resolved by SDS-PAGE on 10% (w/v) acrylamide gels and electrophoretically transferred to polyvinylidene difluoride membranes. Nonspecific binding sites were blocked with 5% bovine serum albumin for 2 h at room temperature. Membranes were then incubated overnight at 4°C with primary antibodies (diluted 1:1,000), followed by six washes with TBST (5 min each) on a shaker. The membranes were then incubated with horseradish peroxidase-conjugated secondary antibodies (diluted 1:5,000) for 2 h at room temperature, followed by another six washes with TBST (5 min each). Protein bands were visualized using an enhanced chemiluminescence reagent kit. Quantification of western blot results was performed by densitometric analysis using ImageJ software. All antibodies used in this study are listed in the Table of Materials.

Transcriptomics

Total RNA was isolated from cardiac tissue of C57BL/6J mice using TRIzol Reagent and RNeasy mini kits. RNA quality was evaluated using a 2100 bioanalyzer, demonstrating high RNA purity and integrity. RNA-seq libraries were prepared according to the VAHTS Universal V10 RNA-seq Library Prep Kit and sequenced using an Illumina NovaSeq 6000 System (single-read, 150 bp). Differentially expressed genes were identified using DESeq2, with an adjusted P value < 0.05 and an absolute log₂ fold change > 1 considered statistically significant. Gene Ontology (GO) enrichment analysis was conducted on differentially expressed genes, and the significance of enrichment of differentially expressed genes in GO terms was calculated using the hypergeometric distribution algorithm.

Oil Red O staining and LD540 lipid staining

Cardiac tissue was embedded in OCT compound and then cut into 10-μm-thick sections. The frozen sections were equilibrated at room temperature for 30 min and fixed with 4% paraformaldehyde for 10 min. After washing with PBS, the sections were placed in 60% isopropyl alcohol for 15 s and covered with Oil Red O working solution for 30 min. The sections were then treated with 60% isopropyl alcohol for 15 s and washed three times with PBS. For LD540 lipid staining, H9c2 cells were washed with PBS and fixed with 4% paraformaldehyde for 10 min at room temperature. The cells were then incubated with 10 μM LD540 for 30 min at room temperature.

Transmission electron microscopy (TEM)

Fresh mouse heart tissues were cut into 1–2 mm3 pieces, fixed in electron microscope fixative at 4°C for 4 h, then washed with double-distilled water and immersed in ethanol solutions of progressively increasing concentrations. The samples were embedded, sectioned, and then observed under a transmission electron microscope.

Total cholesterol (TC) content

Total cholesterol (TC) levels in serum and H9c2 cell samples were measured using the Amplex Red Cholesterol and Cholesteryl Ester Assay Kit according to the manufacturer’s instructions.

Oral Glucose Tolerance Test (OGTT)

Mice were fasted for 14 h (from 19:00 to 9:00) and gavaged with glucose (20% stock, 2 g/kg). Blood glucose levels were determined using blood collected from the tail vein at 0, 15, 30, 60, and 120 min after gavage.

Cell counting kit-8 (CCK-8) measurement

CCK-8 was used to measure cell viability. H9c2 cells were seeded into 96-well plates at an initial density of 3 × 104 cells/well. After treatment with different concentrations of Lac-Phe under HG/PA conditions for 24 h, 10 μL of the kit reagent was added to 100 μL of culture medium per well, followed by incubation at 37°C for 4 h. The absorbance was measured at 450 nm using a multimode microplate reader to obtain the optical density (OD) value.

Molecular docking

The crystal structures of Lac-Phe and AMPKα1 were downloaded from PubChem26. The molecular docking process was carried out using CB-DOCK227.

Statistical analysis

All echocardiographic measurements, histological staining, and image quantifications were performed by investigators blinded to group assignment. All data analyses were performed using Prism and SPSS 20.0. Each experiment was repeated at least three times, and the data were presented as the mean ± standard deviation. Homogeneity of variance was assessed using Levene’s test. Normality was confirmed by graphical inspection of residuals. Comparisons among multiple groups were conducted using one-way analysis of variance, followed by Tukey's post hoc test for pairwise comparisons. For OGTT data, two-way repeated-measures ANOVA was used, with group as the between-subjects factor and time as the within-subjects factor, followed by Bonferroni's post hoc test. P < 0.05 was considered statistically significant.

Sonuçlar

Lac-Phe improves cardiac function in diabetic cardiomyopathy mice

We induced DCM in C57BL/6J mice using an HFD combined with STZ injections (Figure 1A) and randomly assigned the successfully established DCM mice to an untreated group (DCM group) and a Lac-Phe treatment group, with control C57BL/6J mice serving as the negative control. According to the study by Li et al.21, we selected 50 mg/kg as the therapeutic dose of Lac-Phe. After successful model establishment, the Lac-Phe treatment group received four weeks of exogenous Lac-Phe injections, while the untreated group received injections of an equivalent volume of saline. Compared with the DCM group, mice with diabetic cardiomyopathy treated with Lac-Phe exhibited a significant reduction in body weight after four weeks (Figure 1B). OGTT revealed that, compared with the negative control group, mice in the DCM group had significantly elevated blood glucose levels at all measured time points, indicating impaired glucose tolerance. In contrast, DCM mice treated with Lac-Phe showed improved glucose tolerance (Figure 1C). Echocardiographic analysis revealed that, compared with negative control mice, mice with DCM exhibited significantly reduced LVEF and FS (Figure 1D–F). Treatment with Lac-Phe increased LVEF and FS in DCM mice. Histopathological analysis using H&E staining showed pathological hypertrophy in the cardiac tissue of DCM mice compared with control mice (Figure 1G). Lac-Phe treatment markedly alleviated myocardial hypertrophy. Masson’s trichrome staining further demonstrated that Lac-Phe significantly alleviated myocardial fibrosis in DCM hearts (Figure 1H,I). WGA staining indicated that Lac-Phe significantly reduced the cross-sectional area of cardiomyocytes in DCM hearts (Figure 1J,K). These experiments demonstrate that exogenous administration of Lac-Phe effectively improves cardiac function and ameliorates pathological remodeling in mice with DCM.

Lac-Phe ameliorates dysregulated lipid metabolism in DCM

To further elucidate the mechanism of Lac-Phe in DCM, we performed transcriptomic analysis of mouse cardiac tissues. Following data acquisition, GO and KEGG pathway analyses were conducted. GSEA of the fatty acid metabolic process and KEGG pathway enrichment analysis indicated alterations in pathways related to lipid metabolism (Figure 2A,B). To further investigate how Lac-Phe functions in the hearts of DCM mice, we conducted TEM analysis (Figure 2C,D) to examine whether Lac-Phe treatment altered the ultrastructural morphology of the hearts of DCM mice. TEM imaging revealed a significant increase in LD density within the hearts of DCM mice compared with control mice, whereas Lac-Phe administration effectively reduced this LD density. Given the established significance of lipid metabolism dysregulation in DCM, we further assessed cardiac lipid accumulation using Oil Red O staining (Figure 2E,F). Histological analysis demonstrated markedly increased lipid accumulation in the hearts of DCM mice, whereas Lac-Phe treatment reduced this lipid accumulation. Lac-Phe treatment also reduced the TC level in the serum of DCM mice (Figure 2G). To select an appropriate dose of Lac-Phe for the in vitro experiments, we employed the CCK-8 assay to measure the viability of H9c2 cells treated with various concentrations of Lac-Phe under HG/PA conditions (Figure 2H). H9c2 cells treated with Lac-Phe at a concentration of 10 μg/mL under HG/PA conditions exhibited the highest survival rate among the tested concentrations. Thus, we selected 10 μg/mL Lac-Phe for the subsequent experiments. H9c2 cells exposed to HG/PA showed significant lipid accumulation, as demonstrated by LD540 staining and fluorescence quantification (Figure 2I,J), and TC content was also increased (Figure 2K). Lac-Phe treatment reversed these changes, significantly reducing both lipid accumulation and TC levels in H9c2 cells. Collectively, these experimental findings demonstrate that Lac-Phe effectively attenuates cardiac lipid accumulation and ameliorates lipid metabolism dysregulation in DCM mice and reduces lipid accumulation and TC levels in HG/PA-treated H9c2 cells.

figure-results-1
Figure 2. Lac-Phe ameliorates dysregulated lipid metabolism in diabetic cardiomyopathy. (A) Gene set enrichment analysis (GSEA) of the fatty acid metabolic process in the Control and DCM groups. (B) Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) pathway enrichment analysis comparing the DCM and DCM + Lac-Phe groups. (C) Representative transmission electron microscopy (TEM) images of cardiac tissues, with red arrows indicating lipid droplets (LDs). Scale bar = 2 μm. (D) Quantification of the mean number of LDs per 100 μm2; n = 3 per group. (E,F) Representative Oil Red O staining of cardiac tissues (E) and quantification of the relative Oil Red O-positive area (F); n = 3 per group. Scale bar = 20 μm. (G) Relative total cholesterol (TC) levels in serum from the indicated groups; n = 3 per group. (H) Cell viability measured by the CCK-8 assay in H9c2 cells treated with 0, 1, 5, 10, or 20 μg/mL Lac-Phe under HG/PA conditions. (I,J) Representative LD540 staining of H9c2 cells (I) and quantification of mean LD540 fluorescence intensity (J); n = 3 per group. Scale bars = 200 μm. (K) TC levels in H9c2 cells from the indicated groups; n = 3 per group. Data are presented as the mean ± standard deviation. *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.0001. Please click here to view a larger version of this figure.

Lac-Phe increases HMGCR phosphorylation in the hearts of DCM mice and H9c2 cells

To identify potential targets through which Lac-Phe improves lipid metabolism, we screened DCM-associated proteins using GeneCards28 and predicted proteins potentially interacting with Lac-Phe using SwissTargetPrediction29 (Figure 3A). By comparing the results, we identified six potential target genes (Figure 3B). Analysis of these six genes revealed that HMGCR is a core regulator of cholesterol metabolism and also plays a central role in DCM (Figure 3C)30. To determine whether Lac-Phe regulates lipid metabolism via HMGCR, we first examined the p-HMGCR/HMGCR ratio in mouse hearts. Western blot analysis revealed that the p-HMGCR/HMGCR ratio was decreased in the hearts of DCM mice, whereas Lac-Phe treatment increased this ratio (Figure 3D,E). These findings are consistent with increased HMGCR phosphorylation and reduced HMGCR activity following Lac-Phe treatment. In vitro experiments showed that, under HG/PA conditions, the p-HMGCR/HMGCR ratio was decreased in H9c2 cells, whereas Lac-Phe treatment increased this ratio (Figure 3F,G). These results demonstrate that Lac-Phe increases HMGCR phosphorylation in the hearts of DCM mice and in HG/PA-treated H9c2 cells, supporting the involvement of HMGCR in the effects of Lac-Phe on lipid metabolism.

figure-results-2
Figure 3. Lac-Phe increases HMGCR phosphorylation in the hearts of mice with diabetic cardiomyopathy and in H9c2 cells. (A) Venn diagram showing the overlap between DCM-associated proteins and predicted Lac-Phe-associated proteins. (B) Six overlapping proteins associated with DCM and Lac-Phe. (C) Protein-protein interaction network showing HMGCR within the network of DCM-associated proteins. (D,E) Representative western blot images of p-HMGCR and HMGCR in cardiac tissues from the indicated groups (D) and quantification of the p-HMGCR/HMGCR ratio (E); n = 3 per group. (F,G) Representative western blot images of p-HMGCR and HMGCR in H9c2 cells from the indicated groups (F) and quantification of the p-HMGCR/HMGCR ratio (G); n = 3 per group. β-Tubulin was used as the loading control. Data are presented as the mean ± standard deviation. *P < 0.05. Please click here to view a larger version of this figure.

Lac-Phe combined with atorvastatin improves lipid metabolism in H9c2 cells

To further evaluate the effect of Lac-Phe on lipid metabolism via HMGCR, we used atorvastatin as a control. In vitro experiments showed that, under HG/PA conditions, combined treatment with Lac-Phe and atorvastatin produced a greater reduction in lipid accumulation than atorvastatin treatment alone. LD540 staining and fluorescence quantification demonstrated that combined treatment with Lac-Phe and atorvastatin reduced LD accumulation in H9c2 cells (Figure 4A,B). TC content measurement showed a similar effect (Figure 4C). Western blot analysis showed that combined treatment with Lac-Phe and atorvastatin significantly increased the p-HMGCR/HMGCR ratio (Figure 4D,E). These results indicate that combined Lac-Phe and atorvastatin treatment is associated with reduced lipid accumulation and TC levels and increased HMGCR phosphorylation in H9c2 cells.

figure-results-3
Figure 4. Lac-Phe combined with atorvastatin improves lipid metabolism in H9c2 cells. (A,B) Representative LD540 staining of H9c2 cells from the indicated treatment groups (A) and quantification of mean LD540 fluorescence intensity (B); n = 3 per group. Scale bar = 200 μm. (C) Total cholesterol (TC) levels in H9c2 cells from the indicated treatment groups; n = 3 per group. (D,E) Representative western blot images of p-HMGCR and HMGCR in H9c2 cells from the indicated treatment groups (D) and quantification of the p-HMGCR/HMGCR ratio (E); n = 3 per group. β-Tubulin was used as the loading control. Data are presented as the mean ± standard deviation. *P < 0.05, **P < 0.01, ****P < 0.0001. Please click here to view a larger version of this figure.

Lac-Phe increases AMPKα1 phosphorylation

To further explore the molecular mechanism by which Lac-Phe regulates HMGCR, we reanalyzed the mouse cardiac transcriptome data. Through KEGG analysis of the transcriptomic data, we identified 160 differentially enriched pathways between the DCM and Control groups and 89 differentially enriched pathways between the DCM and DCM + Lac-Phe groups (Figure 5A). Sixty pathways overlapped between these two comparisons. From these 60 overlapping pathways, we selected the AMPK pathway. AMPK plays a critical role in regulating lipid metabolism in DCM31. Furthermore, AMPK is upstream of HMGCR (Figure 5B). We hypothesized that Lac-Phe might regulate HMGCR by modulating AMPK, ultimately improving lipid metabolism. To test this hypothesis, we first performed molecular docking of AMPKα1 and Lac-Phe using CB-DOCK2. The molecular docking results showed that the best-ranked predicted binding conformation between Lac-Phe and AMPKα1 had an affinity of −7.6 kcal/mol (Figure 5C). These results suggest a potential interaction between Lac-Phe and AMPKα1 but do not establish direct intracellular binding. To determine whether Lac-Phe affects the AMPK pathway in DCM, we examined AMPKα1 phosphorylation in the hearts of DCM mice. Western blot analysis revealed that the p-AMPKα1/AMPKα1 ratio was decreased in the hearts of DCM mice, whereas Lac-Phe treatment increased this ratio (Figure 5D,E). In vitro experiments showed that, under HG/PA conditions, the p-AMPKα1/AMPKα1 ratio was decreased in H9c2 cells, whereas Lac-Phe treatment increased this ratio (Figure 5F,G). These findings indicate that Lac-Phe increases AMPKα1 phosphorylation in DCM mouse hearts and HG/PA-treated H9c2 cells.

figure-results-4
Figure 5. Lac-Phe increases AMPKα1 phosphorylation in the hearts of mice with diabetic cardiomyopathy and in H9c2 cells. (A) Venn diagram showing the overlap between pathway enrichment results for the DCM/Control and DCM + Lac-Phe/DCM comparisons. (B) Schematic illustrating AMPK and HMGCR phosphorylation and the associated inhibition of cholesterol synthesis. (C) Predicted three-dimensional molecular docking interaction between Lac-Phe and AMPKα1; binding affinity = −7.6 kcal/mol. (D,E) Representative western blot images of p-AMPKα1 and AMPKα1 in cardiac tissues from the indicated groups (D) and quantification of the p-AMPKα1/AMPKα1 ratio (E); n = 3 per group. (F,G) Representative western blot images of p-AMPKα1 and AMPKα1 in H9c2 cells from the indicated groups (F) and quantification of the p-AMPKα1/AMPKα1 ratio (G); n = 3 per group. GAPDH was used as the loading control. Data are presented as the mean ± standard deviation. *P < 0.05, **P < 0.01. Please click here to view a larger version of this figure.

AMPK inhibition attenuates Lac-Phe-mediated HMGCR phosphorylation and improvement of lipid metabolism in H9c2 cells

We then added a p-AMPK inhibitor to H9c2 cells receiving Lac-Phe treatment. The p-AMPK inhibitor decreased the p-AMPKα1/AMPKα1 ratio (Figure 6A,B) and reduced the p-HMGCR/HMGCR ratio (Figure 6C,D). These findings indicate that inhibition of AMPK phosphorylation is accompanied by reduced HMGCR phosphorylation during Lac-Phe treatment. The p-AMPK inhibitor also diminished the effect of Lac-Phe on lipid metabolism. LD540 staining and fluorescence quantification showed increased lipid accumulation in H9c2 cells treated with the p-AMPK inhibitor compared with cells receiving Lac-Phe without AMPK inhibition (Figure 6E,F). TC levels in H9c2 cells also increased following AMPK inhibition (Figure 6G). These results collectively support the involvement of AMPKα1/HMGCR signaling in the effects of Lac-Phe on lipid metabolism. Lac-Phe increased AMPKα1 phosphorylation, which was associated with increased HMGCR phosphorylation and reduced lipid accumulation and TC levels. Inhibition of AMPK attenuated these effects in H9c2 cells, supporting the hypothesis that Lac-Phe improves lipid metabolism through regulation of the AMPKα1/HMGCR pathway.

figure-results-5
Figure 6. AMPK inhibition attenuates the effects of Lac-Phe on HMGCR phosphorylation and lipid accumulation in H9c2 cells. (A,B) Representative western blot images of p-AMPKα1 and AMPKα1 in H9c2 cells treated with HG/PA, Lac-Phe, and/or AMPK-IN-3 as indicated (A) and quantification of the p-AMPKα1/AMPKα1 ratio (B); n = 3 per group. (C,D) Representative western blot images of p-HMGCR and HMGCR in H9c2 cells from the indicated treatment groups (C) and quantification of the p-HMGCR/HMGCR ratio (D); n = 3 per group. GAPDH and β-tubulin were used as loading controls in (A) and (C), respectively. (E,F) Representative LD540 staining of H9c2 cells from the indicated treatment groups (E) and quantification of mean LD540 fluorescence intensity (F); n = 3 per group. Scale bar = 200 μm. (G) Total cholesterol (TC) levels in H9c2 cells from the indicated treatment groups; n = 3 per group. Data are presented as the mean ± standard deviation. *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001. Please click here to view a larger version of this figure.

Collectively, the findings from the in vivo and in vitro experiments support a proposed mechanism whereby Lac-Phe increases AMPKα1 and HMGCR phosphorylation, which is associated with reduced cholesterol levels and lipid accumulation and improved cardiac function and pathological remodeling in DCM. The proposed AMPKα1/HMGCR pathway underlying the effects of Lac-Phe is summarized schematically in Figure 7.

figure-results-6
Figure 7. Proposed mechanism by which Lac-Phe improves lipid metabolism in diabetic cardiomyopathy through the AMPK/HMGCR pathway. Schematic illustrating the proposed mechanism whereby Lac-Phe promotes AMPKα1 phosphorylation, followed by HMGCR phosphorylation, which is associated with reduced lipid droplet accumulation and lipotoxicity in diabetic cardiomyopathy. AMPK, AMP-activated protein kinase; HMGCR, HMG-CoA reductase; LD, lipid droplet. Please click here to view a larger version of this figure.

Data Availability:

The raw data supporting the findings of this study have been deposited in Zenodo and are publicly available at https://zenodo.org/records/21991371 

Tartışma

Bu çalışmada, Lac-Phe'nin DCM üzerindeki terapötik etkisini destekleyen kanıtlar sunuyoruz. Lac-Phe, DCM'de kardiyak yeniden şekillenmeyi ve kardiyak disfonksiyonu iyileştirirken, kardiyomiyositlerde kolesterol üretimini azaltmış ve lipid metabolizması dengesizliğini düzeltmiştir. Mekanistik olarak Lac-Phe, AMPKα1 fosforilasyonunu artırmıştır. Sonrasında, artan AMPKα1 fosforilasyonu, downstream hedefi olan HMGCR'nin artan fosforilasyonu ve inhibisyonu ile ilişkilendirilmiş; bu durum kolesterol sentezinde azalmaya ve nihayetinde kardiyomiyositlerde lipid metabolizması dengesizliğinin düzelmesine yol açmıştır. Özetle bu çalışma, Lac-Phe'nin DCM'de kardiyak lipid metabolizmasını AMPK/HMGCR sinyal yolu aracılığıyla iyileştirdiğini göstermektedir. Temel bulguların ve önerilen mekanizmanın şematik bir özeti Şekil 7'de sunulmuştur.

Lipid metabolizmasındaki dengesizlik, DCM'de miyokardiyal hasara katkıda bulunan temel faktörlerden biridir15. Kardiyomiyositlerde aşırı lipid birikimi lipotoksisiteye yol açarak kardiyomiyosit disfonksiyonuna ve patolojik kardiyak yeniden şekillenmeye neden olur16. Uzun süreli hiperglisemi ve obezite, lipid metabolizması bozukluklarına yol açan önemli faktörlerdir25. Lac-Phe'nin gıda alımını etkili bir şekilde azaltabilen, obeziteyi ve vücut ağırlığını düşüren ve glukoz homeostazını iyileştiren endojen bir madde olduğu gösterilmiştir21. Yakın tarihli raporlar ayrıca Lac-Phe'nin omurilik yaralanması sırasında mikroglia/makrofajlardaki lipid metabolizmasını düzenleyebildiğini göstermiş23 ve Lac-Phe'nin başka bir hastalık modelinde de lipid metabolizmasını düzenleyebildiğini kanıtlamıştır. Endojen bir metabolit olarak Lac-Phe'nin metabolik hastalıklardaki rolü büyük ilgi çekmiştir. Ancak, Lac-Phe'nin DCM'deki rolü henüz tam olarak araştırılmamıştır. Çalışmamız, DCM'de Lac-Phe'nin kardiyomiyosit lipid metabolizmasındaki rolünü ortaya koymuştur. Transkriptomik analiz yoluyla, Lac-Phe tedavisinin DCM farelerinin kalplerinde lipid metabolizmasıyla ilişkili yolaklardaki değişimlerle ilişkili olduğunu bulduk. Oil Red O boyaması ve TEM gözlemleri, Lac-Phe ile tedavi edilen DCM farelerinin kalplerinde lipid birikiminin azaldığını doğrulamıştır. Bu bulgular, Lac-Phe'nin kardiyak lipid birikimini azaltarak ve patolojik yeniden şekillenmeyi iyileştirerek DCM'de kardiyoprotektif etkiler gösterdiğini düşündürmektedir. In vitro deneyler ayrıca Lac-Phe uygulamasının, HG/PA koşullarına maruz kalan H9c2 hücrelerinde lipid birikimini hafiflettiğini göstermiştir.

HMGCR, mevalonat yolunda NADPH'ye bağımlı, hız sınırlayıcı bir enzimdir30. HMGCR, kolesterol biyosentezinde kritik bir adım olan HMG-CoA'nın mevalonata dönüşümünü katalize eder30,31,32. HMGCR, kardiyovasküler hastalıklar ve DCM ile ilgili terapötik bir hedef teşkil eder33. Klinik olarak, HMGCR inhibisyonu, kardiyovasküler riski azaltmak için kabul görmüş bir yaklaşımdır34. Deneysel verilerimiz, Lac-Phe'nin tip 2 diyabetik farelerin kalplerinde HMGCR fosforilasyonunu artırdığını, bunun da HMGCR aktivitesinin inhibisyonu ve kolesterol sentezinin azalmasıyla uyumlu olduğunu göstermektedir. In vitro çalışmalar, Lac-Phe uygulamalarının HG/PA koşullarına maruz kalan H9c2 hücrelerinde, kolesterol seviyelerinin azalmasıyla birlikte HMGCR fosforilasyonunu artırdığını göstermiştir. Kolesterol düşürücü ilaç atorvastatin ile kombine edilen Lac-Phe, incelenen deneysel koşullarda atorvastatinden tek başına daha güçlü etkiler üretmiştir. Atorvastatin ile tedavi edilen H9c2 hücrelerinde, Lac-Phe ilavesi HMGCR fosforilasyonunu artırmış ve lipid birikimini azaltmıştır. Bu bulgular, DCM'de kolesterol üretimini azaltmak ve lipid metabolizması dengesini yeniden sağlamak için Lac-Phe aracılığıyla HMGCR fosforilasyonunu hedeflemenin uygulanabilirliğini desteklemektedir. Bununla birlikte, Lac-Phe'nin DCM'li hastalar için güvenli ve etkili bir terapötik strateji sağlayıp sağlayamayacağı daha fazla araştırma gerektirmektedir.

Mito kondriyal enerji metabolizmasında kilit bir enzim olan AMPK, diyabet gibi metabolik hastalıkların çalışılmasında merkezi bir öneme sahiptir35,36. Fosforilasyon ve defosforilasyon düzenlemesi aracılığıyla AMPK, kardiyak lipid metabolizmasında kritik bir rol oynar. Fosforile AMPK, enzimin aktif formunu temsil eder37. p-AMPK, CPT-1'i düzenleyerek yağ asitlerinin FAO için mitokondriye girişini teşvik eder38. Önceki çalışmalarla tutarlı olarak39, sonuçlarımız artan AMPK fosforilasyonunun, artan HMGCR fosforilasyonu ve azalmış kolesterol sentezi ile ilişkili olduğunu göstermiştir. STZ ve HFD ile indüklenen DCM'ye sahip farelerde, kalıcı hiperglisemi kardiyak p-AMPK seviyelerinde değişikliklere yol açabilir40. Kardiyak fonksiyonların henüz değişmediği diyabetin erken evresinde, kardiyak p-AMPK seviyeleri etkilenmeden kalabilir10,37,41. 8 haftadan uzun süren kalıcı hiperglisemi ile seyreden ileri evre diyabette, patolojik kardiyak yeniden yapılanma başlar ve p-AMPK seviyeleri azalabilir10. AMPK aktivasyonunun korunması, DCM'yi önlemek için etkili bir strateji olarak önerilmiştir10,42. Tip 2 diyabet tedavisinde yaygın olarak kullanılan bir ilaç olan metforminin AMPK yolunu aktive ettiği gösterilmiştir; ancak kalp üzerinde nötr bir etkisinin olduğu bildirilmiştir43,44. İlginç bir şekilde, hem akut hem de kronik metformin uygulaması Lac-Phe seviyelerini artırabilir22. Bu gözlemler, Lac-Phe'nin AMPK aktivasyonu ile ilişkili metabolik sinyalizasyona katkıda bulunabileceği olasılığını ortaya çıkarmaktadır; ancak mevcut çalışma, ekzojen Lac-Phe'nin metforminden daha spesifik veya daha güvenli bir etki yarattığını kanıtlamamaktadır.

Çalışmamızda, Şekil 5D,E'de gösterildiği üzere, geç evre DCM modelinde AMPKα1 fosforilasyonunun belirgin şekilde azaldığı görülmüştür; bu bulgu önceki araştırmalarla42 tutarlıdır. Transkriptomik analiz, Lac-Phe ile tedavi edilen tip 2 diyabetli farelerin kalplerinde AMPK yolunu içeren değişiklikler ortaya koymuş ve western blot analizi, Lac-Phe tedavisinin ardından AMPKα1 fosforilasyonunda artış olduğunu göstermiştir. Moleküler docking, Lac-Phe ile AMPKα1 arasında potansiyel bir etkileşim olduğunu öne sürmüştür ki bu durum yakın tarihli bir çalışma ile23 uyumludur. Önemli bir nokta olarak, tek başına moleküler docking, Lac-Phe ile AMPKα1 arasında doğrudan hücre içi bağlanmayı kanıtlamaz. In vitro deneyler, AMPK inhibitörü ile yapılan tedavinin AMPKα1 fosforilasyonunu baskıladığını ve bunun HMGCR fosforilasyonunda azalma ile beraber seyrettiğini göstermiştir. AMPK inhibitörünün eklenmesinin ardından, Lac-Phe'nin etkileri azalmış; bu durum H9c2 hücrelerinde artan lipid birikimi ve yükselen kolesterol içeriği ile eş zamanlı olarak gerçekleşmiştir. Topluca bu sonuçlar, Lac-Phe'nin lipid metabolizması üzerindeki etkilerinde AMPKα1/HMGCR sinyal yolunun rol oynadığını desteklemektedir. Lac-Phe, artan HMGCR fosforilasyonu, azalan kolesterol seviyeleri ve azalan lipid birikimi ile ilişkili olan AMPKα1 fosforilasyonunu artırmıştır; AMPK'nın inhibisyonu ise bu etkileri hafifletmiştir.

Bu çalışmanın birkaç kısıtlılığı bulunmaktadır. İlk olarak, tüm hayvan deneyleri erkek fareler üzerinde yürütülmüştür. Lac-Phe'nin erkek C57BL/6J farelerde DCM üzerindeki terapötik etkisini göstermiş olsak da, cinsiyet kardiyovasküler hastalıkları etkileyen önemli bir faktördür45. Bu nedenle, Lac-Phe'nin dişi farelerde aynı etkilere sahip olup olmadığı bilinmemektedir. İkinci olarak, transkriptom dizilemesi tüm kalp örnekleri üzerinde gerçekleştirilmiştir; bu durum, Lac-Phe tedavisi sonrası kalpteki hücre tipine özgü değişiklikleri maskelemiş olabilir. Tek hücre dizilemesi, gözlemlenen etkilerin temelindeki hücresel ve moleküler heterojenlik hakkında daha derin bir bilgi sağlayabilir46,47 ve bu hipotezin daha fazla araştırılması için alternatif bir yaklaşım sunmaktadır. Son olarak, bu çalışmada kullanılan ultrason cihazının kısıtlılıkları nedeniyle, farelerde kardiyak diyastolik fonksiyonu değerlendiremedik. Bu nedenle, Lac-Phe'nin DCM üzerindeki terapötik etkilerini netleştirmek, potansiyel cinsiyete bağlı etkileri değerlendirmek, hücre tipine özgü yanıtları araştırmak, diyastolik fonksiyonu değerlendirmek ve gözlemlenen etkilerin temelindeki mekanizmaları daha fazla aydınlatmak için ileri çalışmalara ihtiyaç vardır. Özetle, bu çalışma Lac-Phe'nin DCM tedavisi için ilgi çekici potansiyel bir endojen metabolit olduğunu destekleyen kanıtlar sunmaktadır. Ayrıca bulgularımız, Lac-Phe'nin DCM sırasında AMPKα1/HMGCR yolu üzerinden kardiyomiyositlerdeki lipid birikimini azalttığına dair önerilen bir mekanizmayı desteklemektedir. Spesifik olarak Lac-Phe, AMPKα1 fosforilasyonunu artırmış; bu durum HMGCR fosforilasyonunun artmasıyla, kolesterol sentezinin ve lipid birikiminin azalmasıyla ve patolojik yeniden şekillenmenin iyileşmesiyle ilişkilendirilmiştir. Lac-Phe ve AMPKα1 arasındaki moleküler etkileşimi kurmak ve bu bulguların potansiyel translasyonel uygulamalarını belirlemek için daha fazla araştırma gereklidir.

Açıklamalar

Çıkar Çatışması:

Yazarların beyan edilecek bir çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

Teknik destekleri için Nanjing Drum Tower Hospital Clinical College ve Nanjing Üniversitesi Tıp Fakültesi Bağlı Hastanesi'ndeki araştırmacılara ve personele içten teşekkürlerimizi sunarız. Bu araştırma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (Hibe No. 81870291 ve 82300384), Çin Doktora Sonrası Bilim Vakfı (Hibe No. 2023M731625) ve Jiangsu Eyaleti Doğa Bilimleri Vakfı'nın (Hibe No. BK20220175) hibeleri ile finanse edilmiştir. Ayrıca, Nanjing Tech Üniversitesi İleri Sentez Enstitüsü tarafından sağlanan kaynaklar ve iş birliği desteği için teşekkür ederiz.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
AMPK-IN-3 (p-AMPK inhibitörü)MedChemExpress (MCE)HY-132921Lac-Phe ile işlem görmüş hücrelerde AMPK sinyalini inhibe etmek için AMPK inhibisyon deneyleri sırasında 10 μM konsantrasyonda kullanılmıştır.
Amplex Red Kolesterol ve Kolesteril Ester Analiz KitiBeyotimeS0211SSerum ve H9c2 hücre örneklerindeki toplam kolesterol seviyelerini belirlemek için kullanılmıştır.
Anti-AMPKα1Cell Signaling Technology2532; RRID: AB_330331AMPKα1 western blot analizi için kullanılan primer antikor.
Anti-GAPDHCell Signaling Technology5174; RRID: AB_10622025GAPDH western blot analizi için kullanılan primer antikor.
Anti-HMGCRAbcamab174830; RRID: AB_2749818HMGCR western blot analizi için kullanılan primer antikor.
Anti-p-AMPKα1 (Thr172)Cell Signaling Technology2535; RRID: AB_331250Fosforile AMPKα1 western blot analizi için kullanılan primer antikor.
Anti-p-HMGCR (Ser872)Abcamab124350Fosforile HMGCR western blot analizi için kullanılan primer antikor.
Anti-tavşan IgG, HRP-bağlı antikorCell Signaling Technology7074; RRID: AB_2099233Western blot tespiti için 1:5.000 dilüsyonda kullanılmıştır.
Anti-β-tubulinCell Signaling Technology2128; RRID: AB_823664β-tubulin western blot analizi için kullanılan primer antikor.
AtorvastatinMedChemExpress (MCE)HY-17379HG/PA ile işlem görmüş H9c2 hücrelerinde lipid birikimi, toplam kolesterol seviyeleri ve HMGCR fosforilasyonu üzerindeki etkilerini değerlendirmek için tek başına veya Lac-Phe ile kombinasyon halinde kullanılmıştır.
Sığır serum albüminiSigma-AldrichA7906Western blot analizi sırasında nonspesifik bağlanmayı önlemek için %5 oranında kullanılmıştır.
Bradford analiz reaktifi/kitiThermo Fisher Scientific23200Western blot analizi öncesinde protein konsantrasyonunu belirlemek için kullanılmıştır.
C57BL/6J fareleri (5 haftalık, erkek)Model Animal Research Center of Nanjing UniversityN/AHFD/STZ ile indüklenen diyabetik kardiyomiyopati fare modelini oluşturmak için kullanılmıştır.
Hücre Sayım Kiti-8 (CCK-8)SharebioSB-CCK8Sİşlem sonrası H9c2 hücre canlılığını ölçmek için kullanılmıştır.
Sitrat tamponuKurum içi hazırlanmıştırN/ApH 4,5'te hazırlanmış olup STZ'yi çözmek için ve ilgili taşıyıcı kontrol olarak kullanılmıştır.
Kontrol diyeti (%10 yağ, %20 protein, %70 karbonhidrat)Research Diets, Inc.D12450JKontrol grubu fareler için diyet olarak kullanılmıştır.
D-(+)-GlikozSigma-AldrichN/AHG/PA hücre işlemi ve oral glikoz tolerans testi için kullanılmıştır.
Dimetil sülfoksit (DMSO)Sigma-AldrichD2650AMPK-IN-3 için çözücü ve ilgili taşıyıcı kontrol olarak kullanılmıştır.
Dulbecco’s modifiye Eagle’s medyumuGibco, Thermo Fisher Scientific11965092H9c2 hücreleri için bazal kültür medyumu olarak kullanılmıştır.
40 MHz transdüserli ekokardiyografi cihazıFUJIFILM VisualSonicsVevo 3100 LT; 40 MHz transdüserSol ventrikül boyutlarını ve mitral kapak kan akış hızını ölçmek, LVEF ve FS değerlerini türetmek için kullanılmıştır.
Elektron mikroskobu fiksatörüServiceBioG1102Taramalı elektron mikroskobu için taze fare kalp dokusunu fikse etmek için kullanılmıştır.
EtanolSigma-AldrichE7023Taramalı elektron mikroskobu örnek hazırlama sırasındadehidratasyon için kademeli olarak artan konsantrasyonlarda kullanılmıştır.
Fetal sığır serumuGibco, Thermo Fisher Scientific10099141H9c2 hücre kültür medyumu takviyesi olarak %10 oranında kullanılmıştır.
H9c2 hücre hattıSunncellRRID: CVCL_0286HG/PA ve Lac-Phe işlem deneyleri için in vitro kardiyak hücre modeli olarak kullanılmıştır.
Hematoksilin ve eosin boyasıServiceBioG1005-1/2Kardiyak dokunun histolojik değerlendirmesi için kullanılmıştır.
Yüksek yağlı diyet (%60 kcal yağ)Research Diets, Inc.D12492Diyabetik kardiyomiyopati fare modelini oluşturmak için düşük doz STZ ile birlikte kullanılmıştır.
Yüksek çözünürlüklü parlak alan mikroskobuLeicaDM2500Boyanmış kardiyak dokunun 20× büyütmede tüm lam görüntülemesi için kullanılmıştır.
ImageJNational Institutes of HealthN/AWestern blot sonuçlarının densitometrik kantifikasyonu için kullanılmıştır.
İzofluranSigma-Aldrich792632Fare ekokardiyografisi sırasında anestezi için kullanılmıştır.
İzopropil alkolSigma-AldrichI9516Dondurulmuş kardiyak kesitlerin Oil Red O boyaması sırasında %60 oranında kullanılmıştır.
LD540 lipid boyasıBeyotimeC2050S-1Hücre içi lipidleri boyamak için 10 μM konsantrasyonda kullanılmıştır.
Masson’s trikrom boyasıServiceBioG1006Kardiyak dokunun histolojik boyanması için kullanılmıştır.
N-laktoil-fenilalanin (Lac-Phe)MedChemExpress (MCE)HY-146098DCM farelerine uygulanmış ve HG/PA'ya maruz bırakılmış H9c2 hücrelerini tedavi etmek için kullanılmıştır.
Oil Red O çalışma çözeltisiServiceBioG1015-100MLDondurulmuş kardiyak doku kesitlerindeki lipidleri boyamak için kullanılmıştır.
Omni-ECL Verimli Işık Kemilüminesans KitiEpiZymeSQ203LWestern blotting sonrası protein bantlarının kemilüminesans görselleştirmesi için kullanılmıştır.
Palmitik asitSigma-AldrichP0500HG/PA ile işlem görmüş H9c2 hücre modelini oluşturmak için yüksek glikoz ile birlikte 0,25 mM oranında kullanılmıştır.
ParaformaldehitSigma-AldrichP6148%4'lük bir çözelti olarak hazırlanmış ve histolojik veya lipid boyaması öncesinde kardiyak dokuyu ve hücreleri fikse etmek için kullanılmıştır.
Penisilin-streptomisinGibco, Thermo Fisher Scientific15140122H9c2 hücre kültür medyumunda %1 oranında kullanılmıştır.
Fosfat tamponlu salin (PBS)Gibco, Thermo Fisher Scientific10010023Boyama prosedürleri sırasında yıkama için ve hücre tedavi deneylerinde ilgili taşıyıcı olarak kullanılmıştır.
PrismGraphPad SoftwareVersion 8.0Deneysel verilerin istatistiksel analizi için kullanılmıştır.
PVDF transfer membranı, 0,45 μmThermo Fisher Scientific88518Western blot analizi sırasında proteinlerin elektroforetik transferi için kullanılmıştır.
RNeasy Mini KitQIAGEN74104Fare kardiyak dokusundan toplam RNA izolasyonu/saflaştırması için kullanılmıştır.
Sodyum klorür çözeltisi, %0,9 (normal salin)Sigma-AldrichS8776Lac-Phe'yi çözmek için ve Kontrol ve DCM fareleri için taşıyıcı kontrol olarak kullanılmıştır.
SPSSIBMVersion 20.0Deneysel verilerin istatistiksel analizi için kullanılmıştır.
Streptozotosin (STZ)Sigma-AldrichS0130Diyabetik kardiyomiyopati fare modelini oluşturmak için HFD beslemesi ile birlikte uygulanmıştır.
TBS Tween-20 Tamponu (20×)Thermo Fisher Scientific28360Western blot analizi sırasında primer ve sekonder antikor inkübasyonundan sonra membranları yıkamak için kullanılmıştır.
Tissue-Tek O.C.T. BileşiğiSakura Finetek4583Oil Red O boyaması için dondurulmuş kesitler hazırlanmadan önce kardiyak dokuyu gömmek için kullanılmıştır.
Taramalı elektron mikroskobuHITACHIHT7800Fare kardiyak dokusundaki ultrastrüktürel değişiklikleri incelemek için kullanılmıştır.
TRIzol ReaktifiInvitrogen15596026Fare kardiyak dokusundan toplam RNA izolasyonu için kullanılmıştır.
VAHTS Universal V10 RNA-seq Kütüphane Hazırlama KitiVazymeNR616-01Transkriptomik analiz için RNA-seq kütüphaneleri hazırlamak için kullanılmıştır.
Buğday germ aglutinin (WGA)ServiceBioW7024Kardiyak dokunun histolojik değerlendirmesi için kullanılmıştır.

Kaynaklar

  1. Pan KL, Hsu YC, Chang ST, Chung CM, Lin CL. The role of cardiac fibrosis in diabetic cardiomyopathy: from pathophysiology to clinical diagnostic tools. Int J Mol Sci. 2023;24(10):8604.
  2. Saeedi P, et al. Global and regional diabetes prevalence estimates for 2019 and projections for 2030 and 2045: results from the International Diabetes Federation Diabetes Atlas, 9th edition. Diabetes Res Clin Pract. 2019;157:107843.
  3. Zou R, et al. PGAM5-mediated PHB2 dephosphorylation contributes to diabetic cardiomyopathy by disrupting mitochondrial quality surveillance. Research. 2022;2022:0001.
  4. Jia G, DeMarco VG, Sowers JR. Insulin resistance and hyperinsulinaemia in diabetic cardiomyopathy. Nat Rev Endocrinol. 2016;12(3):144–53.
  5. Low Wang CC, Hess CN, Hiatt WR, Goldfine AB. Clinical update: cardiovascular disease in diabetes mellitus: atherosclerotic cardiovascular disease and heart failure in type 2 diabetes mellitus—mechanisms, management, and clinical considerations. Circulation. 2016;133(24):2459–502.
  6. Liu P, Zhang Z, Chen H, Chen Q. Pyroptosis: mechanisms and links with diabetic cardiomyopathy. Ageing Res Rev. 2024;94:102182.
  7. Park JJ. Epidemiology, pathophysiology, diagnosis and treatment of heart failure in diabetes. Diabetes Metab J. 2021;45(2):146–57.
  8. Gilca GE, et al. Diabetic cardiomyopathy: current approach and potential diagnostic and therapeutic targets. J Diabetes Res. 2017;2017:1310265.
  9. Nakamura K, et al. Pathophysiology and treatment of diabetic cardiomyopathy and heart failure in patients with diabetes mellitus. Int J Mol Sci. 2022;23(7):3587.
  10. Han X, et al. Cardiomyocyte OTUD1 drives diabetic cardiomyopathy via directly deubiquitinating AMPKα2 and inducing mitochondrial dysfunction. Nat Commun. 2025;16(1):666.
  11. Jia G, Hill MA, Sowers JR. Diabetic cardiomyopathy: an update of mechanisms contributing to this clinical entity. Circ Res. 2018;122(4):624–38.
  12. Yao Y, Yang B, Shi J. TiO(x)(OH)(4-2x) nanosheets with catalytic antioxidative activity alleviate oxidative injury in diabetic cardiomyopathy. J Am Chem Soc. 2025;147(4):3885–95.
  13. Seferovic PM, et al. Diabetic myocardial disorder: a clinical consensus statement of the Heart Failure Association of the ESC and the ESC Working Group on Myocardial & Pericardial Diseases. Eur J Heart Fail. 2024;26(9):1893–903.
  14. Wang H, et al. Inhibition of fatty acid uptake by TGR5 prevents diabetic cardiomyopathy. Nat Metab. 2024;6(6):1161–77.
  15. Zhao Y, et al. Ferroptosis: roles and molecular mechanisms in diabetic cardiomyopathy. Front Endocrinol. 2023;14:1140644.
  16. Nakamura M. Lipotoxicity as a therapeutic target in obesity and diabetic cardiomyopathy. J Pharm Pharm Sci. 2024;27:12568.
  17. Nakamura M, et al. Glycogen synthase kinase-3α promotes fatty acid uptake and lipotoxic cardiomyopathy. Cell Metab. 2019;29(5):1119–34.e12.
  18. Ritchie RH, Abel ED. Basic mechanisms of diabetic heart disease. Circ Res. 2020;126(11):1501–25.
  19. Thakur M, Tupe RS. Lipoxin and glycation in SREBP signaling: insight into diabetic cardiomyopathy and associated lipotoxicity. Prostaglandins Other Lipid Mediat. 2023;164:106698.
  20. Dhar A, et al. A comprehensive review of the novel therapeutic targets for the treatment of diabetic cardiomyopathy. Ther Adv Cardiovasc Dis. 2023;17:17539447231210170.
  21. Li VL, et al. An exercise-inducible metabolite that suppresses feeding and obesity. Nature. 2022;606(7915):785–90.
  22. Xiao S, et al. Lac-Phe mediates the effects of metformin on food intake and body weight. Nat Metab. 2024;6(4):659–69.
  23. Ying W, et al. N-lactoyl-phenylalanine modulates lipid metabolism in microglia/macrophage via the AMPK-PGC1α-PPARγ pathway to promote recovery in mice with spinal cord injury. J Neuroinflammation. 2025;22(1):167.
  24. Sha L, et al. N-Lac-Phe ameliorates myocardial cell death by improving mitochondrial dysfunction, ultimately improving TAC-induced heart failure. Cardiovasc Drugs Ther. 2026;40:1391–401.
  25. Ke J, Pan J, Lin H, Gu J. Diabetic cardiomyopathy: a brief summary on lipid toxicity. ESC Heart Fail. 2023;10(2):776–90.
  26. PubChem. PubChem. Available from: https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/. Accessed August 15, 2026.
  27. Liu Y, Yang X, Gan J, et al. CB-Dock2: improved protein-ligand blind docking by integrating cavity detection, docking and homologous template fitting. Nucleic Acids Res. 2022;50(W1):W159–W164.
  28. GeneCards. GeneCards: the Human Gene Database. Version 6.1, June 17, 2026.
  29. Daina A, Michielin O, Zoete V. SwissTargetPrediction: updated data and new features for efficient prediction of protein targets of small molecules. Nucleic Acids Res. 2019;47(W1):W357–W364.
  30. Jo Y, DeBose-Boyd RA. Post-translational regulation of HMG CoA reductase. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2022;14(12):a041253.
  31. Steinberg GR, Hardie DG. New insights into activation and function of the AMPK. Nat Rev Mol Cell Biol. 2023;24(4):255–72.
  32. Istvan ES, Deisenhofer J. Structural mechanism for statin inhibition of HMG-CoA reductase. Science. 2001;292(5519):1160–4.
  33. Beaudry D, et al. Statin therapy in cardiovascular diseases other than atherosclerosis. Curr Atheroscler Rep. 2007;9(1):25–32.
  34. Koch CG. Statin therapy. Curr Pharm Des. 2012;18(38):6284–90.
  35. Dewanjee S, et al. Autophagy in the diabetic heart: a potential pharmacotherapeutic target in diabetic cardiomyopathy. Ageing Res Rev. 2021;68:101338.
  36. Madonna R, et al. Empagliflozin inhibits excessive autophagy through the AMPK/GSK3β signalling pathway in diabetic cardiomyopathy. Cardiovasc Res. 2023;119(5):1175–89.
  37. Madhavi YV, et al. Targeting AMPK in diabetes and diabetic complications: energy homeostasis, autophagy and mitochondrial health. Curr Med Chem. 2019;26(27):5207–29.
  38. Fang C, et al. The AMPK pathway in fatty liver disease. Front Physiol. 2022;13:970292.
  39. Liu S, et al. AICAR-induced activation of AMPK inhibits TSH/SREBP-2/HMGCR pathway in liver. PLoS One. 2015;10(5):e0124951.
  40. Zhou H, et al. Empagliflozin rescues diabetic myocardial microvascular injury via AMPK-mediated inhibition of mitochondrial fission. Redox Biol. 2018;15:335–46.
  41. Lu QB, et al. METRNL ameliorates diabetic cardiomyopathy via inactivation of cGAS/STING signaling dependent on LKB1/AMPK/ULK1-mediated autophagy. J Adv Res. 2023;51:161–79.
  42. Wang D, et al. FGF1(ΔHBS) prevents diabetic cardiomyopathy by maintaining mitochondrial homeostasis and reducing oxidative stress via AMPK/Nur77 suppression. Signal Transduct Target Ther. 2021;6(1):133.
  43. He L. Metformin and systemic metabolism. Trends Pharmacol Sci. 2020;41(11):868–81.
  44. Yang F, et al. Metformin inhibits the NLRP3 inflammasome via AMPK/mTOR-dependent effects in diabetic cardiomyopathy. Int J Biol Sci. 2019;15(5):1010–9.
  45. Regitz-Zagrosek V, Gebhard C. Gender medicine: effects of sex and gender on cardiovascular disease manifestation and outcomes. Nat Rev Cardiol. 2023;20(4):236–47.
  46. Evrony GD, Hinch AG, Luo C. Applications of single-cell DNA sequencing. Annu Rev Genomics Hum Genet. 2021;22:171–97.
  47. Verboom K, et al. Smarter single cell total RNA sequencing. Nucleic Acids Res. 2019;47(16):e93.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Kolesterol SenteziAMPK AktivasyonuHMGCR nhibisyonuPatolojik RemodellemeGlikoz Homeostaz
Video yakında
Bize ulaşın
Kütüphaneye tavsiye et

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Telif hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.