Yöntem makalesi

Drosophila melanogaster'da DR-white Analizi Kullanarak DNA Çift Zincir Kırığı Onarımının Ölçülmesi

58 görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/72635

⸱

14 Ağustos 2026

 , 
1Department of Human Science, Georgetown University

Bu makalede

Özet

DR-white analizi, çok hücreli bir organizma olan Drosophila melanogaster'de DNA çift zincir kırığı onarım sonuçlarını tespit etmek için kullanılan çok yönlü bir genetik raporlayıcı analizidir.

Özet

DNA çift zincir kırığı (DSB) onarımına yönelik geleneksel çalışmalar sıklıkla biyokimyasal incelemeler veya tek hücreli sistemlerle (örneğin hücreler, maya) sınırlıdır. Çok hücreli bir organizmada DSB onarımı çalışmalarını kolaylaştırmak için Drosophila melanogaster'de DR-white analizi kullanıyoruz. DR-white analizi, I-SceI meganükleaz ekspresyonu ile kesilebilen tek bir I-SceI tanıma dizisi taşıyan, basit ancak çok yönlü bir DSB onarım raporlayıcı analizidir. I-SceI ekspresyonu konstitütif olarak, ısı şoku aracılığıyla veya diğer promotörler altında indüklenebilir; bu da dokuya veya gelişime özgü onarımların incelenmesine olanak tanır. Analizin temel bir avantajı, homolog rekombinasyon (HR), homolog olmayan uç birleşmesi (NHEJ) ve tek zincir tavlaması (SSA) içeren onarım sonuçlarını ayırt edebilmesidir. Bu makale, premeiyotik germ hattında DSB'lerin indüklenmesi ve progeny skorlaması yoluyla onarım olaylarının fenotipik olarak analiz edilmesine yönelik adım adım bir iş akışı da dahil olmak üzere, yerleşik DR-white analizi için ayrıntılı bir protokol sunmaktadır. Ayrıca, polimeraz zincir reaksiyonu (PCR), dizileme ve Tracking of Indels by DEcomposition (TIDE) R betiği ile onarım olaylarının moleküler analizini açıklamaktadır. Bu protokol, bir organizma modelinde DNA onarımının genetik ve moleküler mekanizmalarını araştırmak için kullanışlı bir araç sağlamaktadır.

Giriş

Genomik bütünlük sıklıkla DNA lezyonları tarafından tehdit edilir ve bunlar arasında çift zincir kırıkları (DSB'ler) özellikle toksiktir. Onarılmadıkları takdirde, bu kırıklar genetik kayba, kromozomal yeniden düzenlemelere ve hücre ölümüne yol açabilir1. Bu nedenle hücreler, DSB'leri onarmak için birden fazla yol geliştirmiştir. Homolog olmayan uç birleştirme (NHEJ), DSB'nin iki ucunu doğrudan bağlar ve kırılma bölgesinde potansiyel olarak indel oluşumuna neden olur; tek zincir tavlama (SSA), onarım için kırılma bölgesinin yanındaki tamamlayıcı dizileri kullanır ve kırılma bölgesinde delesyonlarla sonuçlanır; homolog rekombinasyon (HR) ise onarım için bir homolog diziyi şablon olarak kullanır2,3.

Tarihsel olarak, DSB onarım çalışmaları biyokimyasal analizlerle4 veya bakteriler5,6, maya7,8 ve memeli hücre kültürleri9,10 gibi tek hücreli sistemlerle sınırlı kalmıştır. Bu modeller, temel onarım proteinlerinin ve mekanizmalarının belirlenmesinde etkili olsa da, çok hücreli bir organizmanın biyolojik karmaşıkluğundan yoksundur. Drosophila melanogaster, DNA onarımını incelemek için popüler bir çok hücreli model sistem haline gelmiştir. Ancak, mevcut analizlerin çoğu belirli onarım yollarına göre düzenlenmiş11; P-elementi eksizyonu12 gibi büyük kromozomal aberasyonları kullanmakta; veya zaman alıcı moleküler analizler gerektirmektedir13. DR-white analizi, Drosophila içinde DNA onarımına yönelik basit, genetik bir raporlayıcı sağlayarak bu zorlukları gidermektedir14. Bu çalışma, yaygın olarak kullanılan DR-white analizini kullanarak DNA DSB onarımını ölçmek için genetik ve moleküler analizlerin gerçekleştirilmesine yönelik eksiksiz, pratik ve detaylı, adım adım bir iş akışı sunmaktadır.

Analiz, vahşi tip kırmızı göz rengini sağlayan Drosophila white (w) geninin iki doğrudan tekrarını kullanır (Şekil 1). Her iki kopya da işlevsizdir: Birincisi olan Sce.white, vahşi tip bir SacI bölgesinde I-SceI meganükleaz tanıma dizisini taşıyan bir insersiyon içerir ve erken bir stop kodonu getirir; ikincisi olan iwhite ise hem 5' hem de 3' uçlarından kısalmış olup HR onarımı için kalıp görevi görür. İki white tekrarı arasında, vahşi tip kahverengi gövde rengini sağlayan bir Drosophila yellow transgeni (y+) bulunur. DR-white kaseti bir y w mutant arka planına entegre edildiğinden, DR-white sinekleri fenotipik olarak vahşi tip kahverengi gövdeli ve mutant beyaz gözlüdür.

DSB'ler, DR-white sineklerinin I-SceI transgeni taşıyan sineklerle çaprazlanmasıyla Sce.white bölgesinde indüklenebilir. Premeiyotik germ hattındaki DSB'lerin onarımı, bir test çaprazlamasının progeny'lerinin skorlanmasıyla ölçülebilir. NHEJ yoluyla onarım, ebeveyn tipi kahverengi gövdeli, beyaz gözlü fenotip ile sonuçlanırken (Şekil 1A), HR yoluyla onarım vahşi tip white dizisini geri getirir ve kahverengi gövdeli, kırmızı gözlü progeny'lerle sonuçlanır (Şekil 1B). DSB'nin SSA onarımı veya mitotik crossover, aradaki yellow transgeninin kaybına yol açarak sarı gövdeli, beyaz gözlü sineklerle sonuçlanır (Şekil 1C). Somatik hücrelerdeki onarım sonuçlarını analiz etmek için, özellikle DR-white analizinde işlem görmüş NHEJ'i ve HR onarımını tespit etmek amacıyla Tracking Indels by DEcomposition (TIDE) algoritmasını uyarladık15,16.

DR-white analizi, Drosophila'da önceden kurulmuş DNA onarım analizlerine kıyasla birçok avantaj sunar. Kırılmalar germ hattında oluşturulup onarıldığı için, onarım sonuçları fenotipik analiz yoluyla kolayca tespit edilebilir. Aynı zamanda, analiz son derece çok yönlüdür. Analiz temel olarak HR onarımını ölçmek için tasarlanmış olsa da, her üç onarım yolağını da tespit edebilir. Ayrıca iki ek fonksiyonel onarım şablonu da geliştirdik (Şekil 2). iwhite.mu şablonu 28 sessiz tek nükleotit polimorfizmi (SNP) içerir ve kırmızı gözlü döller üretir (Şekil 2A); bu durum, gen dönüşüm bölgesi (GCT) uzunluklarının ve farklılaşmış diziler arasındaki HR onarımının çalışmalarını kolaylaştırır14. iwhiteΔ9 şablonu, yaban tipi SacI bölgesinde dokuz baz çiftlik bir delesyon içerir ve turuncu gözlü döllerle sonuçlanır (Şekil 2B). Bu özellik, araştırmacıların farklı şablonlardan gelen HR onarımını takip etmelerine olanak tanır ki bu, DR-white analizine özgü bir özelliktir15.

Protokol

1. DR-white analizi

  1. Genetik çaprazlamalar (Şekil 3A)
    NOT: Standartlar için Drosophila kültürleme ve genetik protokolleri için bakınız "Sinek itme: Drosophila genetiğinin teorisi ve pratiği" Ralph J. Greenspan tarafından17Stok genotip bilgileri şurada sağlanmıştır: Materyaller Tablosu.
    1. Sinekleri 25 °C'de, 12 saatlik ışık/karanlık döngüleri ile standart ortamda muhafaza edin Drosophila aktif maya serpilmiş gıda.
    2. 8-10 DR- çaprazlayarak beş adet ısı şoku tüpü hazırlayın.beyaz bakire dişiler, [bir] ... taşıyan 3-5 erkeğe I-SceI transgen (Çaprazlama 1, Şekil 3A) flakon başına.
      NOT: Farklı I-SceI transgenler uygulamaya bağlı olarak kullanılabilir. Bu protokolde, hsp70-I-SceI ısı şoku indüksiyonu için transgen kullanılmıştır11Sızıntıyı önlemek için I-SceI önceki nesillerdeki ekspresyonda, DR- sisteminin sağlandığından emin olmak önemlidirbeyaz ve I-SceI transgenler yalnızca bu nesilde aynı sinekte birleştirilir.
    3. Aynı gün, a için genişletme şişelerini hazırlayın y w stok. Bunlar test sinekleri olacaktır. Yaklaşık 60–80 test çaprazlaması için üç genişletme şişesi yeterlidir.
    4. Isı şoku flakonlarını kültüre edin ve y w genleşme şişelerinde 25 °C'de 3 gün boyunca.
    5. Üçüncü günde, ısı şoku tüplerini ters çevirin ve y w yedek set olarak hizmet edecek taze gıda içeren genişletme şişeleri.
  2. Isı şoku/DSB indüksiyonu
    NOT: Isı şokuyla indüklebilir bir sistem kullanılmıyorsa I-SceI transgen için 1.2.5 adımına geçiniz; bu işlem genellikle 1.1.5 adımından 3 gün sonra gerçekleştirilir.
    1. Tüm yavruların maternal-zigotik geçiş sürecini tamamladığından emin olmak için ısı şoku tüplerini 25 °C'de 3 saat bekletin.
    2. Orijinal vialleri 38 °C'lik bir su banyosunda 1 saat boyunca ısı şokuna tabi tutun. Larvaların su hattının üzerine çıkmaması için su seviyesinin en azından pamuk topunun altıyla aynı hizada olduğundan emin olun.
    3. Su banyosu sıcaklığını her 15 dakikada bir izleyin ve 38 ± 0,5 °C aralığında tutun; çünkü indüksiyon ve onarım sonuçları, ısı şokunun süresine ve sıcaklığına bağlıdır.
    4. Flakonları 25 °C'ye getirin.
    5. Ertesi gün, fazla nemi emmesi için gıdaya katlanmış bir laboratuvar mendilinin 1/3'ünü ekleyin. Gıda kuruysa, laboratuvar mendiline yaklaşık 100 µL su ekleyin. Şunları ekleyin: bir pamuk topu y w genleşme şişeleri
    6. Isıl şoka maruz bırakılmış şişeleri, sinekler çıkana kadar veya ek 6 gün boyunca 25 °C'de kültüre edin.
    7. Çevirme işleminden 3 gün sonra yedek tüpleri ve genişletme şişelerini temizleyin. Yedeğin içine bir pamuk topu ekleyin. y w berraklaştırma işleminden yaklaşık 4 gün sonra genişletme şişeleri.
      NOT: Gerektiğinde, yedek tüpler 1.2.1 ile 1.2.6 arasındaki adımlarda olduğu gibi ısı şokuna tabi tutulabilir ve aşağıda açıklandığı şekilde işlenebilir.
  3. Test melemleri
    1. DR- taşıyan ısı şokuna uğratılmış sinekleri toplayınbeyaz ve I-SceI çıkış başladıktan sonraki 4–5 gün boyunca transgenler, gelişim evresi yanlılığını azaltmaya başlar.
      NOT: DR- taşıyan ve ısı şokuna başarıyla maruz bırakılmış sineklerbeyaz ve I-SceI embriyonik ve larval onarım olayları nedeniyle mozaik gözlerle birlikte bulunan transgen, yetişkin dokularına gelişmiştir. Mozaikliğin düzeyi, germ hattı onarım olaylarıyla her zaman ilişkili değildir ve bu nedenle testleme çaprazlamaları için deneysel sinekler seçerken (adım 1.3.3) belirleyici bir faktör olmamalıdır.
    2. Topla y w 5 gün boyunca bakire dişiler. Beklenen numune sayısı başına 5 bakire dişi toplayın. Çıkış yapmaya başladıkları anda yedek çoğaltma şişelerinden toplayın.
    3. Bir ısı şokuna maruz bırakılmış erkeği 4-5 adet [dişi] ile çaprazlayarak test tüplerini hazırlayın y w bakire dişiler (Çaprazlama 2; Şekil 3A). Gelişim evresi yanlılığını azaltmak için 1.3.1 adımındaki ortak havuzdan rastgele erkekler seçin. Test çaprazlamalarını 25 °C'de kültüre edin.
      NOT: DR- geçişini önlemek için-beyaz ve I-SceI, en yaygın olarak erkek germ hücreleri analiz edilir; ancak dişi döller de analiz edilebilir. Dişi döller analiz edilecekse, Cross 2 test tüpleri 2:5 dişi:y w erkek oranı ve üretkenliği sağlamak için 5–6 gün boyunca kültüre alınır (sonraki adım).
    4. Test tüplerinin ne zaman boşaltılması gerektiğini belirlemek için, kurulumdan 4 gün sonra üretkenliği kontrol edin.
      NOT: En az 20 değerlendirilebilir döl elde etmek için yeterli yumurtanın bırakıldığını onaylayın; ancak kültürlerin aşırı büyümesine izin vermeyin, aksi takdirde sineklerin besine yapışma olasılığı yüksektir.
    5. Test tüpleri hazır olduğunda (test çaprazlamaları oluşturulduktan sonra 4-5 güne kadar), sinekler atılmalı ve fazla nemi absorbe etmek için gıdaya katlanmış bir laboratuvar mendilinin 1/3'ü eklenmelidir.
      NOT: Daha ileri analizler (örneğin, moleküler genotipleme) gerekliyse, erkekler bu aşamada toplanabilir.
    6. Test tüplerini 25 °C'de ek olarak 5–6 gün daha kültüre edin.
  4. Puanlama
    NOT: Her bir genetik deney için her bir koşulda (örneğin, homozigot mutantlar ve heterozigot kontroller) yaklaşık 25 test tüpü hazırlanır. Her bir genetik deney 2–3 kez tekrarlanır ve bireysel tüp verileri birleştirilir.
    1. Çaprazlama 2'nin döllerini puanlayın (Şekil 3Ailk sinekler çıkmaya başladıktan sonra yaklaşık 9 gün boyunca.
    2. Sinekleri CO2 kullanarak anestezi altına alın2 veya sineklerin yemsiz boş bir tüpe aktarılıp -20 °C'de en az 30 dk dondurulmasıyla.
      NOT: Sinekler dondurulursa, değerlendirmeleri birkaç gün sonrasına kadar ertelenebilir.
    3. Sinekleri bir sinek pedi üzerine yerleştirin ve uygun fenotipler için skorlama yapın (Şekil 3A). Veri setine yalnızca en az 20 puanlanmış sinek içeren vialleri dahil edin.
      1. Puanlama yapmak için, önce DR- taşıyan sinekleri ayıklayın.beyaz kaset (marker olarak kırmızı floresan protein pozitif [RFP+] floresansı kullanılarak), ardından göz ve vücut rengi skorlanmalıdır.
      2. The y+ DR- ile bağlantılı transgenbeyaz kaset, tamamen vahşi tip olmayan, ara bir kahverengi gövde rengine yol açar. No DSB/NHEJ'i (kahverengi gövde; y+ vve SSA (sarı gövde; y- w-), sineklerle karşılaştırın y w DR- taşımayan döllerbeyaz kromozom (RFP-). SSA olayları, bu sineklerle aynı sarı renge sahip olacaktır. Bunlardan daha koyu (daha kahverengi) olan sinekleri DSB/NHEJ Yok olarak skorlayın.
        NOT: Şunlarda tanımlanan fenotiplerden sapmalar: Şekil 3A kontaminasyona işaret edebilir ve flakon skorlanmamalıdır. Ölü sineklerin tamamı skorlanabilse de, fenotipler belirlenemiyorsa hasarlı sinekler atılmalıdır.

2. TIDE analizi (Şekil 4)

  1. Genomik DNA (gDNA) ekstraksiyonu18
    1. Çaprazlama 1 progeny'lerinde olduğu gibi, hem DR-white hem de I-SceI transgenini taşıyan ısı şokuna uğratılmış sinekleri (veya larvaları) toplayın (Şekil 3A).
    2. Tekil sinekleri 1,5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne yerleştirin ve şok dondurma işlemi yapın (örneğin, kuru buz/etanol banyosu veya sıvı azot).
      UYARI: Kuru buz, sıvı azot, etanol, izopropanol ve diğer kimyasalları uygun kişisel koruyucu donanım ve kurumsal güvenlik prosedürlerini kullanarak kullanın.
      DURAKLAMA NOKTASI:  Numuneler -80 °C'de saklanabilir ve gerektiğinde daha sonra işlenebilir. Sinekler veya larvalar analiz ediliyorsa, numune başına tek bir (bir) sinek veya larva kullanın. Daha küçük dokular (örneğin, beyinler, imaginal diskler) analiz ediliyorsa, DNA verimini artırmak için numuneleri havuzlayın.
    3. Her numuneyi, bir elektrikli homojenizatör kullanarak 50 µL Tampon A (100 mM Tris-Cl, pH 7,5; 100 mM etilendiamintetraasetik asit [EDTA]; 100 mM sodyum klorür; %0,5 sodyum dodesil sülfat [SDS]) içinde homojenize edin.
    4. Numuneleri bir su banyosunda 65 °C'de 30 dk inkübe edin.
    5. Her numuneye 100 µL Tampon B (1,4 M potasyum asetat, 4,3 M lityum klorür) ekleyin ve tüpleri ters çevirerek kısa süreli karıştırın.
      NOT: Tam sinek kullanılıyorsa, numuneleri tam olarak homojenize etmek için daha yüksek hacimler gerekebilir. Bu durumda, 1:2 Tampon A:Tampon B hacimsel oranını koruyun.
    6. Numuneleri buz üzerinde en az 30 dk inkübe edin.
    7. Numuneleri 4 °C'de yaklaşık 16.000 x g hızında 15 dk santrifüjleyin.
    8. Berrak süpernatantın 125 µL'sini yeni 1,5 mL'lik mikrosantrifüj tüplerine aktarın. Herhangi bir çökelekten kaçının.
    9. Her 125 µL süpernatant için 100 µL %100 oda sıcaklığında izopropanol ekleyin ve tüpleri ters çevirerek kısa süreli karıştırın.
    10. Numuneleri oda sıcaklığında yaklaşık 16.000 x g hızında 10 dk santrifüjleyin.
    11. DNA peletini rahatsız etmemeye dikkat ederek süpernatantı aspire edin.
      NOT: DNA peleti bu aşamada görünür olmayabilir. Mikrosantrifüje yerleştirirken tüplerin yönünü not edin ve peletin olması beklenen yerin karşı yüzeyinden aspirasyon yapın.
    12. Peletleri 250 µL buz gibi soğuk %70 etanol ile yıkayın, ardından tüpleri nazikçe ters çevirerek kısa süreli karıştırın.
    13. Numuneleri 4 °C'de yaklaşık 16.000 x g hızında 5 dk santrifüjleyin.
    14. Peleti rahatsız etmemeye dikkat ederek süpernatantı aspire edin.
      NOT: Pelet, etanol yıkamasından sonra daha görünür olabilir. Değilse, Adım 2.1.11'deki Not kısmına bakın.
    15. Kalan etanolün buharlaşması için tüpleri oda sıcaklığında kapağı açık bırakın. Peletin aşırı kurumasına izin vermeyin, aksi takdirde tamamen yeniden çözünmeyebilir.
    16. 20 µL nükleazdan arındırılmış su ekleyin ve peletlerin 4 °C'de gece boyunca yeniden çözünmesine izin verin.
      DURAKLAMA NOKTASI: DNA peleti tamamen çözünmemişse, ek su eklenebilir.
    17. Ertesi gün tüpleri nazikçe ters çevirin ve DNA konsantrasyonunu ölçün. Hemen işlemeyecekseniz numuneleri -20 °C'de saklayın.
      NOT: Tek sinek ekstraksiyonu için verimler genellikle yaklaşık 100 ng/µL'dir. Yüksek kaliteli numuneler önemlidir. A260/A280 absorbansı 1,7 ile 2,0 arasında olmalıdır. Bu aralığın dışındaki değerler proteinler gibi kontaminantlara işaret eder. A260/A230 değeri 2,0 ile 2,2 arasında olmalıdır. Bu aralığın dışındaki değerler etanol ve tampon tuzları gibi kontaminantları gösterir. Düşük verimli ve kalitesiz numuneler, zayıf PCR amplifikasyonuna neden olabilir.
  2. Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR)
    1. Üretici talimatlarını izleyerek 100 ng gDNA ve DR-white_8f (5’-GTGGATCAGGTGATCCAGG) ve DR-white_8a (5’-CTTAAGCCATCGTCAGTTGC) primerlerini kullanarak PCR yoluyla Sce.white üzerinden amplifikasyon yapın. Bir DR-white kontrol sinek numunesi ekleyin (yani, I-SceI transgeni bulunmayan DR-white ebeveyn stok). Şu döngü koşullarını kullanın: 94 °C'de 3 dk; {94 °C'de 30 sn; 66 °C'de touchdown (-0,5 °C / döngü) 30 sn; 72 °C'de 30 sn} x 16 döngü; {94 °C'de 30 sn; 58 °C'de 30 sn; 72 °C'de 30 sn} x 20 döngü; 72 °C'de 5 dk; 12 °C'de bekletme.
      NOT: Farklı bir reaktif kullanılıyorsa döngü koşullarının ayarlanması gerekebilir.
    2. Sce.white amplifikasyonunu doğrulamak için yaklaşık 2 µL PCR ürününü %1 tris-asetat-EDTA (TAE)-agaroz diagnostik jelde yürütün. Beklenen amplikon boyutu yaklaşık 1,7 kb'dir.
    3. Sce.white amplikonlarını PCR yöntemiyle saflaştırın ve DNA konsantrasyonunu ölçün.
    4. Saflaştırılmış PCR ürününü DR-white_9f (5’-GAGCCCACCTCCGGACTGGAC) primeri kullanarak sekanslayın.
      NOT: Genellikle 40 ng saflaştırılmış PCR ürününü sekanslarız, ancak bu durum sekanslama servisinin talimatlarına göre farklılık gösterebilir.
  3. TIDE analizi
    NOT: TIDE R script'inin kullanımından kaynaklanan çoğu hata, yanlış kod formatlamasına dayandırılabilir.
    1. Gerekli R paketlerini (yani, sangerseqR ve Biostrings) Bioconductor.org'dan indirin. Her paketin en son versiyonunu bulmak için arama çubuğunu kullanın.
    2. Sekans kromatogramlarının iyi kalitede olduğundan emin olmak için onları analiz edin. Sadece kırılma bölgesinden önce çok az arka plan gürültüsü olan veya hiç olmayan kromatogramları analiz edin.
    3. Sekans izleme dosyalarını (.ab1 dosya uzantısını kullanarak) indirin ve tüm sekans izleme dosyalarını tek bir bilgisayar klasörüne yerleştirin. Sonraki adımlarda script düzenlemelerini kolaylaştırmak için sekans dosya adlarını mümkün olduğunca basitleştirin (örneğin, F1, Het2, Hom3).
    4. TIDE R script'ini (Ek Dosya 1), RStudio entegre geliştirme ortamında (IDE; Malzeme Tablosuna bakın) açın. Kaynak (Source) panelinde, Control <- ile başlayan satırı bulun (Ek Dosya 2A) ve kontrol sekans dosya adını, .ab1 uzantısı dahil olmak üzere, tırnak işaretleri içinde kaydedildiği şekliyle tam olarak girin.
      NOT: “Kontrol sekansı”, I-SceI transgeni veya indüksiyonu olmayan ebeveyn DR-white stokundan alınan PCR'ın sekansıdır.
    5. samplename <- c( ile başlayan satırı bulun ve her bir numune sekans dosya adını parantez içine girin (Ek Dosya 2A). .ab1 uzantısını ekleyin, her dosya adını ayrı tırnak işaretleri içine yerleştirin ve dosya adlarını virgüllerle ayırın.
    6. Düzenlenen TIDE R script dosyasını, analiz edilecek sekanslarla aynı klasöre kaydedin. Sonraki adımlarda hata oluşmasını önlemek için dosya adını basit tutun.
    7. IDE'de, Çıktı (Output) panelindeki Dosyalar (Files) sekmesini kullanarak TIDE klasörüne gidin (Ek Dosya 2B).
    8. More açılır menüsüne tıklayın ve Open New Terminal Here seçeneğini belirleyin (Ek Dosya 2C). Konsol (Console) panelinde (sol alt) yeni bir terminal açılacaktır.
    9. Yeni açılan Terminal'e “R” yazın ve Enter tuşuna basın (Ek Dosya 2D).
    10. R terminalde çalışmaya başladığında, source("TIDE_analysis.R") yazarak ve Enter tuşuna basarak TIDE R script'ini çalıştırın (Ek Dosya 2E). Terminal script'i çalıştıracak ve grafiksel bir temsil (Ek Dosya 2F) ile her numune için ham verileri içeren bir .csv dosyası (Ek Dosya 2G ve Ek Dosya 3) üretecektir. Çıktı dosyaları, R script'i ve sekans dosyalarıyla aynı klasöre kaydedilir.
      NOT: Aynı R script'i yeniden çalıştırılırsa, oluşturulan her yeni .csv dosyası eskilerinin üzerine yazılır. Aynı dosyalar üzerinde birden fazla analiz yapılıyorsa, klasörün bir kopyasını alın.
    11. Her bir .csv dosyasını açarak verileri analiz edin.
      1. Ham verileri, numune sekansındaki indel oranları olarak yorumlayın. I-SceI tanıma sekansından wild-type SacI sekansına homolog rekombinasyon gen dönüşümü, kanonik 23-bp delesyonu üretir; script bu HR değerini çıktının alt kısmında ayrı bir satırda bildirir (Ek Dosya 2G). 0-indel değeri, DSB olmamasını veya indel içermeyen NHEJ'i temsil eder. İşlemli NHEJ'i elde etmek için diğer tüm indel değerlerini toplayın. İşlemli NHEJ ve HR'nin toplamı, tespit edilebilir toplam DSB onarım olayları sayısıdır.
      2. Tespit edilebilir DSB onarım olayları arasındaki onarım yolu oranlarını aşağıdaki denklemleri kullanarak hesaplayın:
        İşlemli NHEJ oranı = (İşlemli NHEJ) / (İşlemli NHEJ + HR)
        HR oranı = (HR) / (İşlemli NHEJ + HR)
        NOT: Her genetik deney için her koşulda yaklaşık 10–15 numune kullanılır (örneğin, homozigot mutantlar ve heterozigot kontroller). Her genetik deney 2–3 kez tekrarlanır ve bireysel veriler havuzlanır.

Sonuçlar

Drosophila homolog rekombinasyon yoluyla onarım için Rad51 gereksinimi

Başarılı germline deneyleri, Şekil 3A'da gösterilen beklenen fenotipik sınıfları ve şişe başına en az 20 değerlendirilebilir döl verir. Beklenmeyen fenotipler veya 20'den az değerlendirilebilir döl, kontaminasyonu veya yetersiz üretkenliği gösterir ve adım 1.4.3'te belirtildiği gibi hariç tutulmalıdır. TIDE analizi için başarılı örnekler, yaklaşık 1,7 kb boyutunda bir amplikon ve kırılma bölgesinden önce az arka plan gürültüsü içeren kromatogramlar üretir; düşük verimli veya kontamine DNA ile gürültülü kromatogramlar suboptimaldir ve analiz edilmemelidir.

Isı şokuyla indüklenebilir bir I-SceI kaynağı ile DR-white analizi kullanıldığında, vahşi tip sineklerde HR onarım sıklığı %38,5 ± 1,2 (ortalama ± SEM) iken, SSA yaklaşık %3,2 ± 0,35 oranında gerçekleşir (Şekil 3B ve Ek Dosya 4). Rad51 (Drosophila'da homolog spnA tarafından kodlanır), homolog rekombinasyonun zincir istilası aşaması için gereklidir14,19. Bu nedenle, Rad51 kaybı yetersiz HR ile sonuçlanmalıdır. Nitekim, DmRad51-/- arka planında HR onarımı %1,3 ± 0,4'e düşerken, SSA onarımında eş zamanlı bir artış (%34,5 ± 1,8; Şekil 3B ve Ek Dosya 4) görülür14. Bu durum büyük olasılıkla, homolog rekombinasyona yönelmiş onarım olaylarının, white tekrar dizilerinin tek zincir tavlaması yoluyla alternatif olarak onarılmasından kaynaklanmaktadır.

Drosophila CtIP'in somatik dokularda etkin HR onarımına katkısı

TIDE algoritması, somatik hücrelerde onarım yolu seçiminin ölçülmesine olanak tanır. Mutant olmayan bir arka planda, tespit edilebilir onarım olaylarının %59,0'ında işlemeli NHEJ ve %41,0'ında HR gerçekleşir (Şekil 4B ve Ek Dosya 4). CtIP, DNA uç rezeksiyonunu teşvik ederek HR onarımının başlatılmasında önemli bir rol oynar20. Buna bağlı olarak, DmCtIP-/- arka planında, somatik hücrelerde HR yolu seçimi belirgin şekilde azalır; heterozigot kontrollerdeki %41,0'luk oran, homozigot mutantlarda %10,9'a düşer (Şekil 4B ve Ek Dosya 4)16. Bu durum, Drosophila'da CtIP'nin HR onarımına katkıda bulunduğunu ancak bunun için temel bir gereklilik olmadığını göstermektedir.

Sce.white gen elemanları ile HR, NHEJ ve SSA yöntemlerini içeren DNA onarım yolaklarını gösteren DR-white analiz diyagramı.
Şekil 1DR-wbeyaz DSB raporcu testi ve onarım sonuçları. Doğrudan Tekrarı beyaz deney, şunun iki işlevsiz kopyasını içerir beyaz gen: Sce.white (I-SceI tanıma bölgesini içeren ve erken bir stop kodonu getiren 23-bp'lik bir insersiyon ile) ve iwhite (5′- ve 3′- uçları kırpılmış donör dizisi). DR- içeren sineklerin çaprazlanmasıbeyaz ve bir I-SceI transgen, fenotipik veya moleküler olarak analiz edilebilen bölgeye özgü bir DSB üretir. Ortaya çıkan fenotipler şunlardır (A) beyaz gözlü yavrular (y+ w−), DSB, kardeş kromatit arası HR veya NHEJ olmadığını belirterek; (B) kırmızı gözlü yavrular (y+ w+), yaban tipini geri kazandıran intrakromozomal HR'yi göstermektedir SacI ...den gelen sekans iwhite donör; ve (C) sarı gövdeli, beyaz gözlü döller (y− Lütfen çevirisini istediğiniz metni sağlayın.−), SSA veya mitotik CO'yu göstermektedir. Şekil Do ve ark. çalışmasından uyarlanmıştır.14Kısaltmalar: CO = crossover; DR-beyaz = white'ın doğrudan tekrarı; DSB = çift zincir kırılması; HR = homolog rekombinasyon; NHEJ = nonhomolog uç birleşmesi; SSA = tek zincir tavlaması. Lütfen bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayın.

Gen düzenleme diyagramı: homolog rekombinasyon, I-SceI kesimi, DR-white.mu, DNA, iwihiteΔ9, SacI bölgeleri.
Şekil 2: DR- türevleribeyaz analiz (A) DR-beyaz.mu analiz, şunları içeren 28 sessiz SNP barındırmaktadır: iwhite.mu doğrudan tekrarlar arasında %1,4 dizi farklılığına yol açan donör dizi. Münferit polimorfizmlerin gen dönüşümü, HR olayları arasında farklılık gösterir ve dizileme ile belirlenebilir. (B) DR-beyaz ile iwhiteΔ9 donörü, interhomolog rekombinasyonu intrakromozomal rekombinasyondan ayır. İntrakromozomal rekombinasyondan kaynaklanan HR iwhite donör, yabani tipi geri kazandırır SacI dizi ve kırmızı gözlü döller üretir. İnterhomologdan HR beyazΔ9 donörü, 9-bp'lik delesyonun azaltması nedeniyle turuncu gözlü döngüler üretir beyaz ekspresyon. Şekil Do et al.'den uyarlanmıştır.14 ve Fernandez ve ark.15Kısaltmalar: DSB = çift zincir kırığı; HR = homolog rekombinasyon; SNP = tek nükleotid polimorfizmi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Drosophila gen onarım yolakları, genetik çaprazlama şeması, progeniye dağılımı sütun grafiği analizi.
Şekil 3: Premeiyotik germ hattında DSB onarım sonuçlarının tespitine yönelik deneysel iş akışı. (A) Cross 1, DR-yi birleştirir-beyaz bir raporlayıcı (veya bir türevi) ile I-SceI transgen (bu örnekte, ikinci kromozom üzerinde). Hem DR- içeren progeny (soygüllemesi)beyaz analiz ve I-SceI transgenler, germ hattı ve somatik dokularında onarım olaylarını sürdürür. Premeiyotik germ hattındaki bireysel onarım olaylarını analiz etmek için, her iki transgeni de taşıyan döl, şunlarla çaprazlanır: y w test sinekleri (Kross 2) ve döller, şu şekilde tanımlanan yöntemle puanlanır: Şekil 1. (B) Vahşi tip sineklerde bireysel germ hattı DSB onarım olayları (n = 106 germ hattı) ve DmRad51 homozigot mutantlar (n = 46 germ hattı). **P < 0.01; ****P < İki yönlü ANOVA ve ardından Sidak çoklu karşılaştırma testi ile 0,001. Çubuklar ortalamaları; hata çubukları SEM'i temsil etmektedir. Veriler Do ve ark. çalışmasından yeniden analiz edilmiştir.14Kısaltmalar: ANOVA = varyans analizi; CO = geçiş (crossover); DSB = çift zincir kırığı; HR = homolog rekombinasyon; NHEJ = homolog olmayan uç birleşmesi; SEM = ortalamanın standart hatası; SSA = tek zincir tavlanması (annealing). Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

TIDE analizi ile Sanger dizileme yoluyla gen düzenleme işlemi; onarım yöntemi karşılaştırma tablosunu içerir.
Şekil 4: DEcomposition ile indel takibi kullanarak DSB onarım sonuçlarının tespitine yönelik deneysel iş akışı. (A) DR- taşıyan sineklerbeyaz ve indüklenmiş bir I-SceI transgenler; gDNA ekstraksiyonu, DSB bölgesinde PCR amplifikasyonu, Sanger dizilemesi ve R betiği ile TIDE analizi kullanılarak analiz edilir.B) -den elde edilen temsili veriler DmCtIP-/- mutantlar (Sadece "n" karakteri sağlandığı için çevrilecek bir metin bulunmamaktadır. Lütfen çevrilmesini istediğiniz metni giriniz. = 23) ve DmCtIP+/- heterozigot kontroller (n = 31). Tespit edilebilir onarım olayları, indelsiz NHEJ/DSB yok durumu hariç tutularak, HR artı işlem görmüş NHEJ olarak hesaplanır.P < Sidak çoklu karşılaştırma testi ile takip edilen iki yönlü ANOVA ile 0,001. Çubuklar ortalamaları; hata çubukları SEM'i temsil etmektedir. Veriler Thomas ve ark. çalışmasından yeniden analiz edilmiştir.16Kısaltmalar: ANOVA = varyans analizi; DSB = çift zincir kırığı; gDNA = genomik DNA; HR = homolog rekombinasyon; NHEJ = homolog olmayan uç birleştirme; PCR = polimeraz zincir reaksiyonu; SEM = ortalamanın standart hatası; TIDE = DEkompozisyon yoluyla Indel'lerin İzlenmesi. Lütfen bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayın.

Ek Dosya 1: DSB-olmayan kontrolle karşılaştırmalı olarak sekans kromatogramlarındaki insersiyon ve delesyonların belirlenmesi için TIDE R betiği. Kullanıcı tarafından düzenlenebilir kontrol dosya adı, örnek dosya adları ve I-SceI hedef sekansı betiğin sonuna doğru işaretlenmiştir. Gerekli girdiler, çıktı dosyaları ve yorumlama bölüm 2.3'te açıklanmıştır. sangerseqR ve Biostrings paketleri gereklidir.Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Dosya 2: TIDE R betiği iş akışına yönelik adım ekran görüntüsü kılavuzu. Paneller, bölüm 2.3'te açıklanan yazılım işlemlerini göstermektedir.Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Dosya 3: Örnek TIDE çıktısı ve onarım olayı hesaplamaları. 0-indel değeri, DSB oluşmadığını veya indel içermeyen NHEJ'i temsil eder; ayrı HR satırı, kanonik 23-bp delesyon ürününü temsil eder ve geri kalan tüm indel yüzdeleri "işlemeli NHEJ" olarak toplanır. Toplam tespit edilebilir onarım, HR ile işlemeli NHEJ'in toplamı olarak hesaplanır.Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Dosya 4: Şekil 3B ve Şekil 4B'nin temelini oluşturan ham veriler, ayrı düzenlenebilir çalışma sayfalarında düzenlenmiştir. Bu veriler, ilgili şekil açıklamalarında atıfta bulunulan daha önce yayınlanmış çalışmalardan yeniden analiz edilmiştir.Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

DR-white sisteminin çok yönlülüğü, DNA onarımı alanındaki geçmiş ve gelecekteki etkisi için kritik bir faktördür. İlk olarak, DR-white raporlayıcı konstrüktündeki attB entegrasyon dizisi, araştırmacıların raporlayıcıyı Drosophila genomundaki çok sayıda konuma hedeflemesine olanak tanır21 ve halihazırda birçok hedefli hat mevcuttur22. İkinci olarak, hsp70 promotörü aracılığıyla ısı şoku ekspresyonu (bu çalışma), ubiquitin promotörü aracılığıyla konstitütif ekspresyon23 ve Bam promotörü aracılığıyla premeiyotik germ hattı ekspresyonu24 gibi farklı I-SceI transgenlerinin mevcudiyeti, DSB onarımını keşfetmek için çok sayıda gelişimsel ve doku spesifik bağlam sunar. Kullanılan  I-SceI transgenine bakılmaksızın, uygun DSB indüksiyonunu sağlamak için I-SceI transgeninin yalnızca son çaprazlamada tanıtıldığından emin olmak adına genetik çaprazlamalar dikkatle planlanmalıdır. Onarım frekanslarının, DR-white genomik konumuna ve/veya kullanılan I-SceI transgenine bağlı olarak önemli ölçüde değişebileceğini belirtmek önemlidir. Gelecekteki deneyler, genomik bağlamın mı yoksa doku spesifikliğinin mi DSB onarımını yönlendirdiğini belirlemek için genomik konumları ve I-SceI transgenlerini daha ayrıntılı olarak karşılaştırabilir.

DR-white testi ve türevlerinin özel bir avantajı, DSB'lerin homolog rekombinasyon, işlemeli NHEJ ve çoğu durumda SSA aracılığıyla onarımını tanımlayabilmeleridir. Sistem, fenotipik olarak germ hattı onarım olaylarını tespit etmek için tasarlanmış olsa da, TIDE algoritmik analizi yoluyla somatik dokuların analizine de olanak tanır. Bu avantajlara rağmen, bu testin dikkate alınması gereken bazı sınırlamaları vardır. Özellikle, DR-white testi HR frekanslarını olduğundan düşük tahmin edebilir. Nükleaz kaynaklı DSB'ler kullanan diğer genetik raporlayıcı testlerde olduğu gibi, kardeş kromatid aracılığıyla gerçekleşen HR onarımı (intersister HR), DSB olmayan bir olaydan veya işlemesiz NHEJ'den ayırt edilemez. Bu nedenle, "No DSB/NHEJ" sınıfının en az bir kısmı HR olayları olabilir. Bu sınırlama göz önüne alındığında, genetik faktörleri (mutant hatlar gibi) karşılaştıran sonuçlar ihtiyatla değerlendirilmelidir. Testin diğer sınırlamaları arasında, canlı döller üretmeyen premeiyotik olayların skorlanamaması yer alır. Örneğin, onarılmamış olabilecek ve hücre ölümüyle sonuçlanan DSB olayları döllerde skorlanmayacaktır. Genel fertilite, germ hattı hücre ölümü için kalitatif bir ölçüt olsa da, hücre tabanlı testler (TUNEL gibi) gerekebilir. Ek olarak, TIDE R script analizi yalnızca bir hücre popülasyonundaki tespit edilebilir olayların oranını sağlar. Spesifik indel sekans sonuçlarını belirlemek için, multipleks DNA sekanslama kullanılarak bireysel onarım olaylarının sekanslanması gereklidir.

DR-white analizi, DSB onarımı çalışmalarında şimdiden derin bir etki yaratmıştır. Bu analizin uygulaması; yaş25, cinsiyet26, DSB konumu22,26, donör dizilim konumu15, hücre döngüsü ve doku tipi26 dahil olmak üzere çok hücreli organizmalarda DSB onarımına katkıda bulunan faktörleri tanımlamıştır. Ayrıca, bu analizi Drosophila türünde onarım yolu seçimini ve/veya diverjan dizilerin onarımını yönlendiren Msh627, Blm28, Rif116 ve CtIP16,29 gibi çeşitli proteinleri tanımlamak için kullandık. Nitekim, korunmuş DNA onarım proteinlerine sahip genetik bir model organizma olarak Drosophila'nın yerleşik kullanımı, karmaşık biyolojik bağlamlarda DSB onarımına katkıda bulunan genetik, hücresel ve organizmal faktörlerin araştırılması için basit ve çok hücreli bir sistem sunmaktadır.

Açıklamalar

Yazarların beyan edecekleri herhangi bir finansal veya finansal olmayan çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

Bu yöntem, J.R.L.'nin American Federation for Aging Research'dan AFAR Araştırma Hibesi aldığı dönemde geliştirilmiştir. Bu çalışma ayrıca, J.R.L.'ye sağlanan National Institute of General Medical Sciences (1R15GM110454 ve 1R15GM129628) desteği ile gerçekleştirilmiştir. Şekiller, BioRender'ın (https://BioRender.com/b8sbcjp) yardımıyla 2026 yılında hazırlanmıştır.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
0,5 mL RNAse/DNAse içermeyen havanlarFisher Scientific12141363gDNA ekstraksiyonu için örneklerin homojenizasyonu için
Pamuk toplarıGenesee Scientific51-101standart Drosophila kültürü için
Drosophila Peltier Soğutmalı İnkübatörShel LaboratuvarıSRI6PFstandart Drosophila kültürü için
Drosophila stoğu: y[1] w[1]Bloomington Drosophila  Stok MerkeziRRID:BDSC 1495
Drosophila stoku: y[2] w[Δ] cho[2] v[1] ; P{70I-SceI}2B Sco / CyO, P{GFP, w+} LaRocque LaboratuvarıMetin sağlanmamıştır. Lütfen çevrilmesini istediğiniz kaynak metni giriniz.Bloomington Drosophila Stok Merkezi'nden alınan stok RRID:BDSC_6934 (y[1] w[*]; P{ry[+t7.2]=70FLP}11 P{v[+t1.8]=70I-SceI}2B sna[Sco]/CyO, S[2])'in standart rekombinasyonu yoluyla LaRocque laboratuvarı tarafından oluşturulmuştur; sorumlu yazardan talep üzerine temin edilebilir
Drosophila stoku: y[2] w[Δ] cho[2] v[1] ; DR-white (y+).3 51C,RFP+ / [CyO-GFP]LaRocque LaboratuvarıÇevrilecek metin sağlanmamıştır. Lütfen çevrilmesini istediğiniz İngilizce metni iletiniz.Stok RRID:BDSC_24482'ye entegre edilmiş DR-white analizi (y[1] M{RFP[3xP3.PB] GFP[E.3xP3]=vas-int.Dm}ZH-2A w[*]; M{3xP3-RFP.attP’}ZH-51C); sorumlu yazardan talep edilebilir
Drosophila stoku: y[2] w[Δ] cho[2] v[1] ; DR-white.mu (y+).3 51C,RFP+ / [CyO-GFP]LaRocque LaboratuvarıLütfen çevirmek istediğiniz metni sağlayın.stok RRID:BDSC_24482 (y[1] M{RFP[3xP3.PB] GFP[E.3xP3]=vas-int.Dm}ZH-2A w[*]; M{3xP3-RFP.attP})'e entegre edilmiş DR-white.mu analizi’}ZH-51C); sorumlu yazardan talep edilebilir
Drosophila stoku: y[1] w[*]; iwhite2 (y+).1 51C,RFP+ / [CyO]LaRocque LaboratuvarıGirdi sağlanmadı. Lütfen çevrilmesini istediğiniz metni giriniz.iwhiteΔstok RRID:BDSC_24482 (y[1] M{RFP[3xP3.PB] GFP[E.3xP3]=vas-int.Dm}ZH-2A w[*]; M{3xP3-RFP.attP içine entegre edilmiş 9 donör’}ZH-51C); sorumlu yazardan talep üzerine temin edilebilir
Flugs Drosophila şişe kapaklarıGenesee Scientific49-100standart Drosophila kültürü için
Floresan stereomikroskop (RFP)TriTech ResearchSMT1-FLstandart Drosophila için "sinek itme" ve floresan tabanlı ayıklama
FlyStuff Drosophila Sinek pediGenesee Scientific59-172standart Drosophila için "sinek itme"
KimwipesKimberly-Clarke06-666A
MyBath 4L Benmari CihazıMidwest ScientificMB-2000-4için  ısı şoku
NanoDrop OneThermo Fisher Scientific13-400-518LYDNA kantitasyonu için
Nutri-fly Bloomington Formülasyon BesiyeriGenesee Scientific66-121standart Drosophila kültürü için
Pellet Pestle Kablosuz Motorlu HomojenizatörDWK Life SciencesK749540-0000gDNA ekstraksiyonu için örneklerin homojenizasyonu için
Polipropilen ŞişelerGenesee Scientific32-130standart Drosophila kültürü için
Polistiren FlakonlarGenesee Scientific32-116ısı şoku dahil olmak üzere standart Drosophila kültürü için
Primer/oligonükleotid DR-white_8fY/A; herhangi bir oligonükleotid sentez hizmeti yeterlidirGirdi sağlanmadı. Lütfen çevrilmesini istediğiniz metni paylaşın.5'GTGGATCAGGTGATCCAGG
Primer/oligonükleotid DR-white_8aYok; herhangi bir oligonükleotit sentez hizmeti yeterlidirLütfen çevrilmesini istediğiniz kaynak metni sağlayın. Metni gönderdiğinizde, belirttiğiniz profesyonel standartlar ve akademik kriterler çerçevesinde İngilizce'den Türkçe'ye çevirisini gerçekleştireceğim.5’-CTTAAGCCATCGTCAGTTGC
Primer/oligonükleotid DR-white_9fU/A; herhangi bir oligonükleotid sentez servisi yeterlidirMetin sağlanmamıştır. Lütfen çevirmemi istediğiniz kaynağı iletiniz.5’-GAGCCCACCTCCGGACTGGAC
R StudioVarsaymakSürüm 2023.06.1+524Ücretsiz indirilebilir versiyon; sunulan veriler şu sürüm kullanılarak analiz edilmiş olsa da R Studio'nun herhangi bir versiyonu kabul edilebilir:  versiyon 2023.06.1+524
R Studio paketleri: BiostringsBioconductor.org (Versiyon 3.24)Sürüm 2.76.0R betiği, kullanıcıdan bu paketi yüklemesini isteyecektir
R Studio paketleri: sangerseqRBioconductor.org (Sürüm 3.24)Sürüm 1.44.0R betiği, kullanıcının bu paketi yüklemesini isteyecektir
SapphireAMP Hızlı PCRTakaraRR350B
Stereo mikroskopLeicaM60standart Drosophila için "Sinek itme"
Wizard SV Jel ve PCR Temizleme PromegaA9281

Kaynaklar

  1. Khanna KK, Jackson SP. DNA double-strand breaks: signaling, repair and the cancer connection. Nat Genet. 2001;27(3):247-54.
  2. Cejka P, Symington LS. DNA end resection: mechanism and control. Annu Rev Genet. 2021;55:285-307.
  3. Oh J, Myung K. Crosstalk between different DNA repair pathways for DNA double strand break repairs. Mutat Res Genet Toxicol Environ Mutagen. 2022;873:503438.
  4. Figueroa-González G, Pérez-Plasencia C. Strategies for the evaluation of DNA damage and repair mechanisms in cancer. Oncol Lett. 2017;13(6):3982-8.
  5. Picksley SM, Attfield PV, Lloyd RG. Repair of DNA double-strand breaks in Escherichia coli K12 requires a functional recN product. Mol Gen Genet. 1984;195(1-2):267-74.
  6. Motamedi MR, Szigety SK, Rosenberg SM. Double-strand-break repair recombination in Escherichia coli: physical evidence for a DNA replication mechanism in vivo. Genes Dev. 1999;13(21):2889-903.
  7. Malkova A, Ivanov EL, Haber JE. Double-strand break repair in the absence of RAD51 in yeast: a possible role for break-induced DNA replication. Proc Natl Acad Sci U S A. 1996;93(14):7131-6.
  8. Frankenberg-Schwager M, Frankenberg D. DNA double-strand breaks: their repair and relationship to cell killing in yeast. Int J Radiat Biol. 1990;58(4):569-75.
  9. Allalunis-Turner MJ et al. Radiation-induced DNA damage and repair in cells of a radiosensitive human malignant glioma cell line. Radiat Res. 1995;144(3):288-93.
  10. Pierce AJ, Johnson RD, Thompson LH, Jasin M. XRCC3 promotes homology-directed repair of DNA damage in mammalian cells. Genes Dev. 1999;13(20):2633-8.
  11. Rong YS, Golic KG. Gene targeting by homologous recombination in Drosophila. Science. 2000;288(5473):2013-8.
  12. Adams MD, McVey M, Sekelsky J. Drosophila Blm in double-strand break repair by synthesis-dependent strand annealing. Science. 2003;299(5604):265-7.
  13. Rong YS, Golic KG. The homologous chromosome is an effective template for the repair of mitotic DNA double-strand breaks in Drosophila. Genetics. 2003;165(4):1831-42.
  14. Do AT, Brooks JT, Le Neveu MK, LaRocque JR. Double-strand break repair assays determine pathway choice and structure of gene conversion events in Drosophila melanogaster. G3 (Bethesda). 2014;4(3):425-32.
  15. Fernandez J, Bloomer H, Kellam N, LaRocque JR. Chromosome preference during homologous recombination repair of DNA double-strand breaks in Drosophila melanogaster. G3 (Bethesda). 2019;9(11):3773-80.
  16. Thomas MS et al. The epistatic relationship of Drosophila melanogaster CtIP and Rif1 in homology-directed repair of DNA double-strand breaks. G3 (Bethesda). 2024;14(11):jkae210.
  17. Greenspan RJ. Fly pushing: the theory and practice of Drosophila genetics. 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press; Cold Spring Harbor, NY; 2004. 191 p.
  18. Sullivan W, Ashburner M, Hawley RS, editors. Drosophila protocols. Cold Spring Harbor Laboratory Press; Cold Spring Harbor, NY; 2000. 697 p.
  19. McIlwraith MJ et al. Human DNA polymerase eta promotes DNA synthesis from strand invasion intermediates of homologous recombination. Mol Cell. 2005;20(5):783-92.
  20. Sartori AA et al. Human CtIP promotes DNA end resection. Nature. 2007;450(7169):509-14.
  21. Bischof J et al. An optimized transgenesis system for Drosophila using germ-line-specific phiC31 integrases. Proc Natl Acad Sci U S A. 2007;104(9):3312-7.
  22. Janssen A et al. A single double-strand break system reveals repair dynamics and mechanisms in heterochromatin and euchromatin. Genes Dev. 2016;30(14):1645-57.
  23. Preston CR, Flores CC, Engels WR. Differential usage of alternative pathways of double-strand break repair in Drosophila. Genetics. 2006;172(2):1055-68.
  24. Chen H et al. An enhanced gene targeting toolkit for Drosophila: Golic+. Genetics. 2015;199(3):683-94.
  25. Delabaere L et al. Aging impairs double-strand break repair by homologous recombination in Drosophila germ cells. Aging Cell. 2017;16(2):320-8.
  26. Graham EL et al. The impact of developmental stage, tissue type, and sex on DNA double-strand break repair in Drosophila melanogaster. PLoS Genet. 2024;20(4):e1011250.
  27. Do AT, LaRocque JR. The role of Drosophila mismatch repair in suppressing recombination between diverged sequences. Sci Rep. 2015;5:17601.
  28. Ertl HA et al. The role of Blm helicase in homologous recombination, gene conversion tract length, and recombination between diverged sequences in Drosophila melanogaster. Genetics. 2017;207(3):923-33.
  29. Yannuzzi I, Butler MA, Fernandez J, LaRocque JR. The role of Drosophila CtIP in homology-directed repair of DNA double-strand breaks. Genes (Basel). 2021;12(9):1430.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

DNA ift Zincir K r klarDSB Onar mHomolog RekombinasyonHomolog Olmayan U Birle mesiTek Zincir TavlamasI SceI Megan kleazPCR AnaliziTIDE Analizi
Video yakında
Bize ulaşın
Kütüphaneye tavsiye et

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Telif hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.