Bu çalışma, deniz ürünlerinde patojen Vibrio türlerini tespit etmek için aktif karbon ve bentonit kullanarak Döngü aracılı izotermal amplifikasyon (LAMP) analizini optimize etmektedir. Bu ön işlem, reaksiyon inhibitörlerini etkili bir şekilde uzaklaştırarak geleneksel yöntemlere kıyasla önemli ölçüde daha hızlı, daha hassas ve maliyet etkin tanı sonuçları sağlamaktadır.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Araştırma makalesi
Balıkçılık Ürünlerinde Vibrio türlerinin Tespiti için Aktif Karbon ve Bentonit Kullanılarak Artırılmış Hassasiyetli Loop-Amplifikasyonu
Bu makalede
Özet
Özet
Vibrio cinsi, 12'si insanlar için patojen kabul edilen 100'den fazla türe sahiptir; gıdalarda en sık izole edilen türler V. cholerae, V. parahaemolyticus, V. vulnificus ve V. alginolyticus'tur. Bu türlerin konvansiyonel mikrobiyolojik yöntemlerle tanımlanmasındaki temel sorun, yüksek maliyetler ve uzun süreli teşhistir. V. cholerae, V. parahaemolyticus, V. vulnificus ve V. alginolyticus tanımlaması için Loop-mediated isothermal Amplification (LAMP) kullanılmıştır. İnhibitörleri uzaklaştırmak ve testin hassasiyetini artırmak için bentonitli aktif karbon (ACB) kullanılmıştır; pH 6, 7 ve 9 değerlerinin yanı sıra örnek ile ACB arasındaki farklı temas süreleri test edilmiştir. Karides, balık ve istiridye örneklerindeki reaksiyon inhibitörlerini uzaklaştırmak için aktif karbon ve bentonit kullanıldığında LAMP hassasiyet yöntemi iyileştirilmiştir. Test edilen tüm örnekler için LAMP hassasiyeti, negatif prediktif değer, pozitif prediktif değer ve LAMP özgüllüğü %90 veya daha yüksek bulunmuştur. LAMP yöntemi, standart yönteme göre daha hızlı uygulanması, daha yüksek hassasiyeti ve daha düşük maliyetleri nedeniyle su ürünlerinde V. cholerae, V. parahaemolyticus, V. vulnificus ve V. alginolyticus tanımlamak için bir alternatif olabilir.
Giriş
Vibrio cinsine ait türler deniz ortamlarında yaygın olarak bulunur ve balıklar, yumuşakçalar veya kabuklularla patojenik veya komensal şekilde ilişkili olabilirler. Vibrio cholerae, V. parahaemolyticus, V. vulnificus ve V. alginolyticus türlerinin balık ürünlerinde daha yüksek izolasyon sıklığına sahip olduğu ve toplamda 12 türün insanlar için patojenik olabileceği bildirilmiştir. Amerika Birleşik Devletleri'nde sağlık makamları, Vibrio spp.'nin yılda 80.000'den fazla enfeksiyona neden olduğunu tahmin etmektedir1,2,3,4,5. Vibrio spp. izolasyonu; ön zenginleştirme, seçici besiyerlerinde kültürleme ve biyokimyasal ile serolojik testlerle doğrulama içeren geleneksel yöntemlerle gerçekleştirilir6,7. Bu geleneksel yöntemler, patojenin izole edilmesi için gereken uzun süre (5 güne kadar) ve benzer fenotipik ile biyokimyasal profiller nedeniyle Vibrio cinsi içindeki yakından ilişkili türleri doğru şekilde ayırt etmede yetersiz kalan çözünürlük kapasiteleri ile sınırlıdır6,7,8.
Alternatif olarak, Döngü aracılı izotermal amplifikasyon (LAMP), patojenlerin tanımlanması için hızlı, doğru ve düşük maliyetli bir moleküler teknik olarak rapor edilmiştir9,10. Bu yöntem, termosikletörler gibi gelişmiş ekipmanlar gerektirmediği için oldukça maliyet etkin ve geleneksel PCR'dan daha hızlıdır9. LAMP yöntemi, magnezyum pirofosfatın çökelmesi sonucu reaksiyon tüpünde oluşan bulanıklığın gözlemlenmesi yoluyla hedef genin tek bir adımda tespit edilmesine olanak tanır; çünkü magnezyum pirofosfat, LAMP tekniğinde kullanılan sıcaklık olan 65 °C'de kararlı bir reaksiyon ürünüdür; böylece bulanıklık artışı, sentezlenen DNA miktarıyla ilişkilendirilir ve agaroz jeller ile transilüminatörlerin kullanımı önlenmiş olur11,12,13,14,15.
Bu patojenlerin saptama duyarlılığı; Bst polimerazı inhibe edebilen veya DNA hedefine bağlanarak amplifikasyonu engelleyebilen proteazlar, kalsiyum iyonları, glikojen ve lipidler gibi reaksiyon inhibitörlerinin giderilmesiyle artırılabilir13,16,17,18,19,20. Aktive edilmiş karbon ile bentonit kombinasyonunun (ACB), amplifikasyon inhibitörlerini gidermede yüksek verimliliğe sahip olduğu, böylece istiridye örneklerinde Escherichia coli saptamanın duyarlılığını artırdığı ve ACB'nin ticari kitlerin kullanımından daha ucuz olması nedeniyle maliyetleri düşürdüğü rapor edilmiştir21.
Bu çalışmada, su ürünlerinden doğrudan V. cholerae, V. parahaemolyticus, V. vulnificus ve V. alginolyticus tanımlamasında hassasiyeti artırmak için aktif karbon ve bentonit kullanarak LAMP yöntemini optimize etmeyi öneriyoruz. Optimize edilen bu yöntem, uzun ön zenginleştirme aşamalarını ortadan kaldırarak patojenlerin hızlı tanısı için oldukça uygulanabilir olup, gıda endüstrisindeki rutin izleme ve kalite kontrol süreçleri için pratik bir rehberlik sağlamaktadır. Beklenen performansı açısından yöntem, balık ve karides gibi matrislerde mükemmel hassasiyet (%98'den fazla) ve özgüllük (%100) sergilemektedir. Ancak, dikkate alınması gereken temel bir kısıtlama, istiridye gibi kaynağında yüksek düzeyde kontamine olmuş örneklerde, ACB sisteminin tüm girişimci organik maddeleri tamamen ortadan kaldıramamasıdır; bu durum analizin hassasiyetini hafifçe düşürebilmektedir (%94–%98).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Bu çalışma insan veya omurgalı hayvan denekleri içermediğinden, kurumsal etik onay gerekmemiştir. Kullanılan reaktifler ve ekipmanlar Materyaller Tablosu'nda listelenmiştir.
1. Kullanılan bakteriyel suşlar ve DNA ekstraksiyonu
Vibrio cholerae no O1 CECT 55, V. parahaemolyticus ATCC 17802, V. vulnificus ATCC 29037 ve V. alginolyticus ATCC 17749 suşları, %2 NaCl içeren beyin kalp infüzyon (BHI) besiyerinde 37 °C'de 24 sa boyunca büyütüldü. Escherichia coli ATCC 25922, Cronobacter sakazakii ATCC 12868, Listeria monocytogenes ATCC 49594 ve Salmonella Typhimurium ATCC 14028 suşları, testlerde negatif kontrol olarak kullanılmak üzere sodyum klorür içermeyen BHI besiyerinde 37 °C'de 24 sa boyunca kültüre edildi. DNA ekstraksiyonu için, gece boyu kültüre edilen örnekler bir santrifüjde 25 °C'de 16,000 x g hızında 6 dk santrifüj edildi. Hücre peletinin bozulmaması için süpernatant dikkatlice boşaltıldı ve pelet, 500 μL TAE tampon çözeltisi (Tris-asetik asit-EDTA, pH 8) içerisinde pipetleme yoluyla tamamen yeniden süspanse edildi. Hücreleri liz etmek için süspansiyon 6 dk boyunca kaynatıldı ve ardından hemen 5 dk boyunca buz üzerinde soğutuldu. Hücresel kalıntıları çöktürmek için son bir santrifüj işlemi gerçekleştirildi ve böylece ekstraksiyonu yapılan DNA'yı içeren berrak bir süpernatant elde edildi; bu süpernatant daha sonra LAMP ile amplifikasyon için kalıp olarak kullanıldı22,23.
2. LAMP prosedürü
LAMP'ta kullanılan primerler (Tablo 1), V. cholerae, V. parahaemolyticus, V. vulnificus ve V. alginolyticus tanımlamasındaki özgüllüğü doğrulamak için test edilmiştir. Her bir Vibrio türünün LAMP kullanılarak tanımlanması, şu bileşenleri içeren 25 μL son hacimli bir karışım hazırlanarak reaksiyon tüplerinde gerçekleştirilmiştir: her bir primerden 1.6 μM, 1.4 mM dNTP karışımı, 6 mM MgSO4, 800 mM betain, 8 U Bst DNA polimeraz ve 5 μL kalıp DNA. Reaksiyon karışımı nazikçe karıştırılmış ve 65 °C'deki su banyosunda 60 dk inkübe edilmiştir. İnkübasyon süresinin ardından, amplifikasyon ürünleri %1,5'lik agaroz jel üzerinde ayrıştırılmıştır. Amplifikasyon ürünleri daha sonra 1:100 oranında seyreltilmiş 1 μL floresan DNA boyası ile boyanmış ve mavi ışık transilüminatör kullanılarak görüntülenmiştir. Patojen tanımlamasında testin pozitif olup olmadığını belirlemek için kullanılan bir diğer teknik ise, reaksiyon tüplerine 4 μL hidroksinaftol mavisi (HNB, 125 μM) eklemek ve renk değişimini çıplak gözle gözlemlemekten oluşmaktaydı. Pozitif test mavi renk oluşumuyla, negatif test ise menekşe rengiyle belirtilmiştir24. LAMP yöntemi için negatif kontrol olarak Escherichia coli ATCC 25922, Cronobacter sakazakii ATCC 12868, Listeria monocytogenes ATCC 49594 ve Salmonella Typhimurium ATCC 14028 kullanılmıştır. LAMP'ta elde edilen amplifikasyonlar agaroz jel üzerinde ayrıştırılmış ve transilüminatör kullanılarak gözlemlenmiştir. Ortaya çıkan görüntüler MS 1D Analysis Software kullanılarak alınmış ve dijitalleştirilmiştir.
3. Numunelerde doğal olarak bulunan Vibrio türlerinin eliminasyonu için istiridye, karides ve balık numunelerinin işlenmesi
Her biri yaklaşık 200 g ağırlığında on istiridye örneği, 10 karides örneği ve 10 balık örneği temin edildi. Doğal olarak bulunan Vibrio hücrelerini uzaklaştırmak için daha önce yayınlanmış metodoloji21 takip edildi. Her bir örnekten elli gram (50 g) tartılarak bir paletli blenderda 260 rpm'de 1 dk boyunca mekanik olarak homogenize edildi ve homojen bir doku süspansiyonu elde edilerek -70 °C'de 72 sa boyunca saklandı. Ardından örnekler, 40 °C'lik bir su banyosunda tamamen çözdürüldü ve 300 mL salin fosfat tampon çözeltisi (0.85% NaCl, pH 9) ile yıkandı. Önceki işlemin örneklerdeki Vibrio hücrelerini başarıyla yok ettiğinden emin olmak için, Gıda ve İlaç İdaresi'nin Bakteriyolojik Analiz Kılavuzu'nun 9. bölümünde belirtilen ön zenginleştirme metodolojisi7 uygulandı. Örneği içeren salin çözelti, 450 mL alkalin peptonlu su (APW, pH 9) ile değiştirildi. Daha sonra APW içinde 10⁻3 dilüsyona kadar seri dilüsyonlar titizlikle hazırlandı ve 24 sa inkübe edildi. Son olarak, her tüpten bir alikot alınarak seçici bir ortam olan tiyosülfat-sitrat-safra tuzları-sakkaroz (TCBS) agarına ekildi ve karakteristik Vibrio kolonilerinin yokluğu görsel olarak onaylamak için 37 °C'de 24 sa inkübe edildi. Tüm testler üç tekrarlı olarak gerçekleştirildi.
4. Bentonit ile aktif karbonun (ACB) hazırlanması ve hücresel geri kazanımın değerlendirilmesi
Su ürünleri örneklerinde bulunan inhibitörlerin ACB tarafından en verimli şekilde absorbe edildiği ve aynı zamanda hedef hücrelerin minimum düzeyde absorbe edildiği koşulları belirlemek için, ACB ile gıda örnekleri arasındaki optimal pH ve temas süresini saptamak amacıyla yayınlanmış metodoloji21 takip edilmiştir. Aktif karbon, distile su ile iyice yıkanmış ve 55 °C'de kurutulmuştur. Ardından, 32,6 g aktif karbon, 3,04 g bentonit ile karıştırılmış, homojen dağılım sağlamak için 150 rpm'de 24 saat boyunca sürekli karıştırılmış, 55 °C'de kurutulmuş ve sterilize edilerek ince, homojen kuru bir ACB tozu elde edilmiştir. Vibrio hücrelerinin aktif karbon-bentonit (ACB) karışımıyla karıştırılmasının ardından hücresel geri kazanımı değerlendirmek için, suşlar %2 NaCl içeren BHI besiyerinde 1,5 x 104 CFU/mL hücre yoğunluğuna ulaşana kadar ayrı ayrı büyütülmüştür. Daha sonra, her bir Vibrio suşundan 1 mL, 100 mL fosfat tamponuna (PBS, %0,85 NaCl, pH 4, 6 ve 9'a ayarlanmış) ayrı ayrı inoküle edilmiştir. Bakteriyel süspansiyon daha sonra önceden hazırlanmış 4,6 g ACB ile birleştirilmiş ve teması kolaylaştırmak için 150 rpm'de 15, 30 ve 60 dakika boyunca karıştırılmaya bırakılmıştır. Belirlenen her temas süresinin ardından, 0,1 mL'lik bir alikvot dikkatlice ayrılmış, TCBS agarına ekilmiş ve koloni sayımı yapılmadan önce 24 saat boyunca 37 °C'de inkübe edilmiştir.
5. Aktif karbon ve bentonit ile işlem görmüş istiridye, karides ve balık örneklerinde V. cholerae, V. parahaemolyticus, V. vulnificus ve V. alginolyticus tespit sınırının değerlendirilmesi
Bu çalışmada kullanılan Vibrio türlerinin her biri BHI besiyerinde büyütülmüş ve hücre yoğunlukları, bir spektrofotometre kullanılarak ölçüldüğü üzere tam olarak 1.5 x 104, 7.5 x 103, 3.8 x 103, 1.5 x 103, 7.5 x 102, 3 x 102, 1.5 x 102 ve 76 CFU/mL (A600 nm ~0.25) değerlerine ayarlanmıştır. Ardından, herhangi bir Vibrio varlığını ortadan kaldırmak için önceden işlem görmüş her bir numunenin (istiridye, balık, karides) 50 g'ını inoküle etmek için her bir Vibrio kültüründen 1 mL kullanılmıştır. İnoküle edilen numuneler, bir paletli blenderda 360 rpm'de 30 s boyunca homojenize edilmiş ve 450 mL APW (pH 6) ile seyreltilmiştir. Karışım daha sonra, büyük kalıntıları ayırmak için 4 °C'de 5 dakika boyunca 260 x g hızında santrifüj edilmiştir. Elde edilen süpernatant, 23 g ACB içeren flasklara boşaltılmış, inhibitörleri absorbe etmek için 150 rpm'de 15 dakika boyunca karıştırılmış ve filtre kağıdı kullanılarak filtrelenmiş; böylece büyük partiküllerden arındırılmış berrak bir eluat elde edilmiştir. Bu eluat daha sonra 4 °C'de 10 dakika boyunca 16,000 x g hızında santrifüj edilmiş ve tüpün dibinde görünür bir hücre peleti oluşmuş, bu pelet daha sonra DNA ekstraksiyonu için kullanılmıştır. Her bir Vibrio türü LAMP yöntemi ile tanımlanmıştır. Negatif kontroller, Escherichia coli ATCC 25922, Cronobacter sakazakii ATCC 12868, Listeria monocytogenes ATCC 49594 ve Salmonella Typhimurium ATCC 14028 suşları ile inoküle edilen numunelerden oluşmuştur. Reaksiyon karışımı, 65 °C'deki bir su banyosunda 60 dakika boyunca inkübe edilmiştir. İnkübasyon süresinin ardından, amplifikasyon ürünleri %1.5'luk agaroz jel üzerinde ayrıştırılmış ve floresan bir DNA boyası ile boyanmıştır. Jeller, mavi ışık transilüminatöründe görüntülenmiştir. Son olarak, gözle tespit için her bir tüpe 4 μL hidroksinaftol mavisi (125 μM) eklenmiştir24.
6. LAMP yönteminin pozitif öngörü değeri, negatif öngörü değeri, özgünlüğü ve duyarlılığının belirlenmesi
LAMP yönteminin duyarlılığı, özgüllüğü ve öngörü değerleri 30 örnek (10 karides, 10 istiridye ve 10 balık) kullanılarak belirlenmiştir. Her bir örnek, her bir Vibrio türü için belirlenen minimum saptanabilir konsantrasyon ile inoküle edilmiştir. Duyarlılık ve özgüllük yüzdelerinin yanı sıra negatif öngörü değerini (NPV) ve pozitif öngörü değerini25 belirlemek için, deneyler sırasında elde edilen gerçek pozitifler (TP), gerçek negatifler (TN), yanlış pozitifler (FP) ve yanlış negatifleri (FN) özetlemek amacıyla bir kontingans tablosu kullanılmıştır. (Tablo 2). Bu verilerden hareketle aşağıdaki formüller uygulanmıştır:
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Kullanılan bakteriyel suşlar ve DNA ekstraksiyonu
Sıralı LAMP analizlerinde şablon olarak kullanılmak üzere tüm patojenik ve negatif kontrol suşlarından DNA başarıyla ekstrakte edilmiştir.
LAMP prosedürü
Bu çalışmada kullanılan primerler, her bir Vibrio türündeki moleküler hedefin amplifikasyonu için spesifiktir. Vibrio suşları kullanıldığında LAMP ile elde edilen amplifikasyon ürünleri, her bir primerin her bir Vibrio türünü...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Bu çalışma, kontamine deniz ürünleri örneklerinde V. cholerae, V. parahaemolyticus, V. alginolyticus ve V. vulnificus tespiti için loop-aracılı izotermal amplifikasyonun (LAMP) duyarlılığını artırmak amacıyla optimize edilmiş koşulları belirlemektedir. Geleneksel ön zenginleştirme aşamasının atlanmasıyla tanı süresi önemli ölçüde azaltılarak, su ürünlerinden patojenlerin doğrudan tanımlanması için oldukça verimli ve hızlı bir yaklaşım sunulmaktadır.
Bu çalış...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması beyan etmemektedir.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Aktif karbon | Sigma-Aldrich | C2764 | |
| Bentonit | Sigma-Aldrich | 682659 | |
| Betain | Sigma-Aldrich | B0300 | |
| Bio-Image systems transilüminatör | Bio-Image systems | MBE-CP-01 | |
| Bst DNA polimeraz | New England Biolabs | M0374 | |
| Santrifüj (model J2-HS) | Beckman Coulter | https://www.americaninstrument.com/products/beckman-j2-hs-high-speed-1273g-centri | |
| Cronobacter sakazakii | ATCC | 12868 | |
| dNTP karışımı | Thermo Fisher Scientific | R0241 | |
| Escherichia coli | ATCC | 25922 | |
| Hidroksinaftol mavisi | Sigma-Aldrich | 219916 | |
| Listeria monocytogenes | ATCC | 49594 | |
| Midori Green Advanced | Nippon Genetics | MG01 | |
| MS 1D Analiz Yazılımı | Major Science | MBE-IMG-SW | |
| Salmonella Typhimurium | ATCC | 14028 | |
| Spektrofotometre (model 6300) | Jenway | 630531 | |
| Stomacher Sirkülatör (model 400) | Seward | 0400/000/AJ | |
| Vibrio alginolyticus | ATCC | 17749 | |
| Vibrio cholerae no O1 | CECT | 55 | |
| Vibrio parahaemolyticus | ATCC | 17802 | |
| Vibrio vulnificus | ATCC | 29037 | |
| Whatman kağıdı | Whatman | 1001-055 |
Kaynaklar
- Baker GL. Food safety impacts from post-harvest processing procedures of molluscan shellfish. Foods. 2016;5(2):29.
- Kim HJ et al. Multiplex PCR for detection of the Vibrio genus and five pathogenic Vibrio species with primer sets designed using comparative genomics. BMC Microbiol. 2015;15(1):239.
- CDC. Cholera and Other Vibrio Illness Surveillance (COVIS). Cdc.gov; 2022. Available from: http://www.cdc.gov/vibrio/surveillance.html
- Robert-Pillot A et al. Occurrence of the three major Vibrio species pathogenic for human in seafood products consumed in France using real-time PCR. Int J Food Microbiol. 2014;189:75-81.
- Brands DA et al. Prevalence of Salmonella spp. in oysters in the United States. Appl Environ Microbiol. 2005;71(2):893-897.
- Gxalo O et al. Virulence and antibiotic resistance characteristics of Vibrio isolates from rustic environmental freshwaters. Front Cell Infect Microbiol. 2021;11:732001.
- De Paola A, Kaysner CA. Bacteriological Analytical Manual, Vibrio. Food and Drug ENTER
- Chahorm K, Prakitchaiwattana C. Application of Reverse Transcriptase-PCR-DGGE as a rapid method for routine determination of Vibrio spp. in foods. Int J Food Microbiol. 2018;264:46-52.
- Anupama KP et al. Evaluation of loop-mediated isothermal amplification assay along with conventional and real-time PCR assay for sensitive detection of pathogenic Vibrio parahaemolyticus from seafood sample without enrichment. Mol Biol Rep. 2021;48(1):1009-1016.
- Notomi T et al. Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucleic Acids Res. 2000;28(12):E63.
- Sridapan T et al. Rapid detection of Clostridium perfringens in food by loop-mediated isothermal amplification combined with a lateral flow biosensor. PLoS One. 2021;16(1):e0245144.
- Notomi T, Mori Y, Tomita N, Kanda H. Loop-mediated isothermal amplification (LAMP): principle, features, and future prospects. J Microbiol. 2015;53(1):1-5.
- Yamazaki W, Ishibashi M, Kawahara R, Inoue K. Development of a loop-mediated isothermal amplification assay for sensitive and rapid detection of Vibrio parahaemolyticus. BMC Microbiol. 2008;8:163.
- Nagamine K, Hase T, Notomi T. Accelerated reaction by loop-mediated isothermal amplification using loop primers. Mol Cell Probes. 2002;16(3):223-229.
- Mori Y, Nagamine K, Tomita N, Notomi T. Detection of loop-mediated isothermal amplification reaction by turbidity derived from magnesium pyrophosphate formation. Biochem Biophys Res Commun. 2001;289(1):150-154.
- Yamazaki W et al. Development of a loop-mediated isothermal amplification assay for sensitive and rapid detection of the tdh and trh genes of Vibrio parahaemolyticus and related Vibrio species. Appl Environ Microbiol. 2010;76(3):820-828.
- Di H et al. Development and evaluation of a loop-mediated isothermal amplification assay combined with enrichment culture for rapid detection of very low numbers of Vibrio parahaemolyticus in seafood samples. Biol Pharm Bull. 2015;38(1):82-87.
- Cai SH et al. Loop-mediated isothermal amplification method for rapid detection of Vibrio alginolyticus, the causative agent of vibriosis in mariculture fish. Lett Appl Microbiol. 2010;50(5):480-485.
- Han F, Ge B. Evaluation of a loop-mediated isothermal amplification assay for detecting Vibrio vulnificus in raw oysters. Foodborne Pathog Dis. 2008;5(3):311-320.
- Zhang L et al. Rapid, specific and sensitive detection of Vibrio vulnificus by loop-mediated isothermal amplification targeted to vvhA gene. Hai Yang Xue Bao. 2018;37(4):83-88.
- Luan C, Levin RE. Use of activated carbon coated with bentonite for increasing the sensitivity of PCR detection of Escherichia coli O157:H7 in Canadian oyster (Crassostrea gigas) tissue. J Microbiol Methods. 2008;72(1):67-72.
- Ren C-H, Hu C-Q, Luo P, Wang Q-B. Sensitive and rapid identification of Vibrio vulnificus by loop-mediated isothermal amplification. Microbiol Res. 2009;164(5):514–21.
- Srisuk C et al. Rapid and sensitive detection of Vibrio cholerae by loop-mediated isothermal amplification targeted to the gene of outer membrane protein ompW: Detection of Vibrio cholerae by LAMP. Lett Appl Microbiol. 2010;50(1):36-42.
- Goto M et al. Colorimetric detection of loop-mediated isothermal amplification reaction by using hydroxy naphthol blue. Biotechniques. 2009;46(3):167-172.
- Parikh R et al. Understanding and using sensitivity, specificity and predictive values. Indian J Ophthalmol. 2008;56(1):45-50.
- Yung CM et al. Insensitivity of diverse and temporally variable particle-associated microbial communities to bulk seawater environmental parameters. Appl Environ Microbiol. 2016;82(11):3431-3437.
- Abolmaaty A, Gu W, Witkowsky R, Levin RE. The use of activated charcoal for the removal of PCR inhibitors from oyster samples. J Microbiol Methods. 2007;68(2):349-352.
- Lee JL, Levin RE. Detection of 5 CFU/g of Escherichia coli O157:H7 on lettuce using activated charcoal and real-time PCR without enrichment. Food Microbiol. 2011;28(3):562-567.
- Tian CD et al. Study on detection of Vibrio parahaemolyticus in shellfish by use of loop-mediated isothermal amplification method: V. Parahaemolyticus in shellfish. J Food Saf. 2011;31(3):371-378.
- Niessen L, Luo J, Denschlag C, Vogel RF. The application of loop-mediated isothermal amplification (LAMP) in food testing for bacterial pathogens and fungal contaminants. Food Microbiol. 2013;36(2):191-206.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.