Bu çalışma, deniz ürünlerinde patojen Vibrio türlerini tespit etmek için aktif karbon ve bentonit kullanarak Döngü aracılı izotermal amplifikasyon (LAMP) analizini optimize etmektedir. Bu ön işlem, reaksiyon inhibitörlerini etkili bir şekilde uzaklaştırarak geleneksel yöntemlere kıyasla önemli ölçüde daha hızlı, daha hassas ve maliyet etkin tanı sonuçları sağlamaktadır.
Araştırma makalesi
Balıkçılık Ürünlerinde Vibrio türlerinin Tespiti için Aktif Karbon ve Bentonit Kullanılarak Artırılmış Hassasiyetli Loop-Amplifikasyonu
Bu makalede
Özet
Özet
Vibrio cinsi, 12'si insanlar için patojen kabul edilen 100'den fazla türe sahiptir; gıdalarda en sık izole edilen türler V. cholerae, V. parahaemolyticus, V. vulnificus ve V. alginolyticus'tur. Bu türlerin konvansiyonel mikrobiyolojik yöntemlerle tanımlanmasındaki temel sorun, yüksek maliyetler ve uzun süreli teşhistir. V. cholerae, V. parahaemolyticus, V. vulnificus ve V. alginolyticus tanımlaması için Loop-mediated isothermal Amplification (LAMP) kullanılmıştır. İnhibitörleri uzaklaştırmak ve testin hassasiyetini artırmak için bentonitli aktif karbon (ACB) kullanılmıştır; pH 6, 7 ve 9 değerlerinin yanı sıra örnek ile ACB arasındaki farklı temas süreleri test edilmiştir. Karides, balık ve istiridye örneklerindeki reaksiyon inhibitörlerini uzaklaştırmak için aktif karbon ve bentonit kullanıldığında LAMP hassasiyet yöntemi iyileştirilmiştir. Test edilen tüm örnekler için LAMP hassasiyeti, negatif prediktif değer, pozitif prediktif değer ve LAMP özgüllüğü %90 veya daha yüksek bulunmuştur. LAMP yöntemi, standart yönteme göre daha hızlı uygulanması, daha yüksek hassasiyeti ve daha düşük maliyetleri nedeniyle su ürünlerinde V. cholerae, V. parahaemolyticus, V. vulnificus ve V. alginolyticus tanımlamak için bir alternatif olabilir.
Giriş
Vibrio cinsine ait türler deniz ortamlarında yaygın olarak bulunur ve balıklar, yumuşakçalar veya kabuklularla patojenik veya komensal şekilde ilişkili olabilirler. Vibrio cholerae, V. parahaemolyticus, V. vulnificus ve V. alginolyticus türlerinin balık ürünlerinde daha yüksek izolasyon sıklığına sahip olduğu ve toplamda 12 türün insanlar için patojenik olabileceği bildirilmiştir. Amerika Birleşik Devletleri'nde sağlık makamları, Vibrio spp.'nin yılda 80.000'den fazla enfeksiyona neden olduğunu tahmin etmektedir1,2,3,4,5. Vibrio spp. izolasyonu; ön zenginleştirme, seçici besiyerlerinde kültürleme ve biyokimyasal ile serolojik testlerle doğrulama içeren geleneksel yöntemlerle gerçekleştirilir6,7. Bu geleneksel yöntemler, patojenin izole edilmesi için gereken uzun süre (5 güne kadar) ve benzer fenotipik ile biyokimyasal profiller nedeniyle Vibrio cinsi içindeki yakından ilişkili türleri doğru şekilde ayırt etmede yetersiz kalan çözünürlük kapasiteleri ile sınırlıdır6,7,8.
Alternatif olarak, Döngü aracılı izotermal amplifikasyon (LAMP), patojenlerin tanımlanması için hızlı, doğru ve düşük maliyetli bir moleküler teknik olarak rapor edilmiştir9,10. Bu yöntem, termosikletörler gibi gelişmiş ekipmanlar gerektirmediği için oldukça maliyet etkin ve geleneksel PCR'dan daha hızlıdır9. LAMP yöntemi, magnezyum pirofosfatın çökelmesi sonucu reaksiyon tüpünde oluşan bulanıklığın gözlemlenmesi yoluyla hedef genin tek bir adımda tespit edilmesine olanak tanır; çünkü magnezyum pirofosfat, LAMP tekniğinde kullanılan sıcaklık olan 65 °C'de kararlı bir reaksiyon ürünüdür; böylece bulanıklık artışı, sentezlenen DNA miktarıyla ilişkilendirilir ve agaroz jeller ile transilüminatörlerin kullanımı önlenmiş olur11,12,13,14,15.
Bu patojenlerin saptama duyarlılığı; Bst polimerazı inhibe edebilen veya DNA hedefine bağlanarak amplifikasyonu engelleyebilen proteazlar, kalsiyum iyonları, glikojen ve lipidler gibi reaksiyon inhibitörlerinin giderilmesiyle artırılabilir13,16,17,18,19,20. Aktive edilmiş karbon ile bentonit kombinasyonunun (ACB), amplifikasyon inhibitörlerini gidermede yüksek verimliliğe sahip olduğu, böylece istiridye örneklerinde Escherichia coli saptamanın duyarlılığını artırdığı ve ACB'nin ticari kitlerin kullanımından daha ucuz olması nedeniyle maliyetleri düşürdüğü rapor edilmiştir21.
Bu çalışmada, su ürünlerinden doğrudan V. cholerae, V. parahaemolyticus, V. vulnificus ve V. alginolyticus tanımlamasında hassasiyeti artırmak için aktif karbon ve bentonit kullanarak LAMP yöntemini optimize etmeyi öneriyoruz. Optimize edilen bu yöntem, uzun ön zenginleştirme aşamalarını ortadan kaldırarak patojenlerin hızlı tanısı için oldukça uygulanabilir olup, gıda endüstrisindeki rutin izleme ve kalite kontrol süreçleri için pratik bir rehberlik sağlamaktadır. Beklenen performansı açısından yöntem, balık ve karides gibi matrislerde mükemmel hassasiyet (%98'den fazla) ve özgüllük (%100) sergilemektedir. Ancak, dikkate alınması gereken temel bir kısıtlama, istiridye gibi kaynağında yüksek düzeyde kontamine olmuş örneklerde, ACB sisteminin tüm girişimci organik maddeleri tamamen ortadan kaldıramamasıdır; bu durum analizin hassasiyetini hafifçe düşürebilmektedir (%94–%98).
Protokol
Bu çalışma insan veya omurgalı hayvan denekleri içermediğinden, kurumsal etik onay gerekmemiştir. Kullanılan reaktifler ve ekipmanlar Materyaller Tablosu'nda listelenmiştir.
1. Kullanılan bakteriyel suşlar ve DNA ekstraksiyonu
Vibrio cholerae no O1 CECT 55, V. parahaemolyticus ATCC 17802, V. vulnificus ATCC 29037 ve V. alginolyticus ATCC 17749 suşları, %2 NaCl içeren beyin kalp infüzyon (BHI) besiyerinde 37 °C'de 24 sa boyunca büyütüldü. Escherichia coli ATCC 25922, Cronobacter sakazakii ATCC 12868, Listeria monocytogenes ATCC 49594 ve Salmonella Typhimurium ATCC 14028 suşları, testlerde negatif kontrol olarak kullanılmak üzere sodyum klorür içermeyen BHI besiyerinde 37 °C'de 24 sa boyunca kültüre edildi. DNA ekstraksiyonu için, gece boyu kültüre edilen örnekler bir santrifüjde 25 °C'de 16,000 x g hızında 6 dk santrifüj edildi. Hücre peletinin bozulmaması için süpernatant dikkatlice boşaltıldı ve pelet, 500 μL TAE tampon çözeltisi (Tris-asetik asit-EDTA, pH 8) içerisinde pipetleme yoluyla tamamen yeniden süspanse edildi. Hücreleri liz etmek için süspansiyon 6 dk boyunca kaynatıldı ve ardından hemen 5 dk boyunca buz üzerinde soğutuldu. Hücresel kalıntıları çöktürmek için son bir santrifüj işlemi gerçekleştirildi ve böylece ekstraksiyonu yapılan DNA'yı içeren berrak bir süpernatant elde edildi; bu süpernatant daha sonra LAMP ile amplifikasyon için kalıp olarak kullanıldı22,23.
2. LAMP prosedürü
LAMP'ta kullanılan primerler (Tablo 1), V. cholerae, V. parahaemolyticus, V. vulnificus ve V. alginolyticus tanımlamasındaki özgüllüğü doğrulamak için test edilmiştir. Her bir Vibrio türünün LAMP kullanılarak tanımlanması, şu bileşenleri içeren 25 μL son hacimli bir karışım hazırlanarak reaksiyon tüplerinde gerçekleştirilmiştir: her bir primerden 1.6 μM, 1.4 mM dNTP karışımı, 6 mM MgSO4, 800 mM betain, 8 U Bst DNA polimeraz ve 5 μL kalıp DNA. Reaksiyon karışımı nazikçe karıştırılmış ve 65 °C'deki su banyosunda 60 dk inkübe edilmiştir. İnkübasyon süresinin ardından, amplifikasyon ürünleri %1,5'lik agaroz jel üzerinde ayrıştırılmıştır. Amplifikasyon ürünleri daha sonra 1:100 oranında seyreltilmiş 1 μL floresan DNA boyası ile boyanmış ve mavi ışık transilüminatör kullanılarak görüntülenmiştir. Patojen tanımlamasında testin pozitif olup olmadığını belirlemek için kullanılan bir diğer teknik ise, reaksiyon tüplerine 4 μL hidroksinaftol mavisi (HNB, 125 μM) eklemek ve renk değişimini çıplak gözle gözlemlemekten oluşmaktaydı. Pozitif test mavi renk oluşumuyla, negatif test ise menekşe rengiyle belirtilmiştir24. LAMP yöntemi için negatif kontrol olarak Escherichia coli ATCC 25922, Cronobacter sakazakii ATCC 12868, Listeria monocytogenes ATCC 49594 ve Salmonella Typhimurium ATCC 14028 kullanılmıştır. LAMP'ta elde edilen amplifikasyonlar agaroz jel üzerinde ayrıştırılmış ve transilüminatör kullanılarak gözlemlenmiştir. Ortaya çıkan görüntüler MS 1D Analysis Software kullanılarak alınmış ve dijitalleştirilmiştir.
3. Numunelerde doğal olarak bulunan Vibrio türlerinin eliminasyonu için istiridye, karides ve balık numunelerinin işlenmesi
Her biri yaklaşık 200 g ağırlığında on istiridye örneği, 10 karides örneği ve 10 balık örneği temin edildi. Doğal olarak bulunan Vibrio hücrelerini uzaklaştırmak için daha önce yayınlanmış metodoloji21 takip edildi. Her bir örnekten elli gram (50 g) tartılarak bir paletli blenderda 260 rpm'de 1 dk boyunca mekanik olarak homogenize edildi ve homojen bir doku süspansiyonu elde edilerek -70 °C'de 72 sa boyunca saklandı. Ardından örnekler, 40 °C'lik bir su banyosunda tamamen çözdürüldü ve 300 mL salin fosfat tampon çözeltisi (0.85% NaCl, pH 9) ile yıkandı. Önceki işlemin örneklerdeki Vibrio hücrelerini başarıyla yok ettiğinden emin olmak için, Gıda ve İlaç İdaresi'nin Bakteriyolojik Analiz Kılavuzu'nun 9. bölümünde belirtilen ön zenginleştirme metodolojisi7 uygulandı. Örneği içeren salin çözelti, 450 mL alkalin peptonlu su (APW, pH 9) ile değiştirildi. Daha sonra APW içinde 10⁻3 dilüsyona kadar seri dilüsyonlar titizlikle hazırlandı ve 24 sa inkübe edildi. Son olarak, her tüpten bir alikot alınarak seçici bir ortam olan tiyosülfat-sitrat-safra tuzları-sakkaroz (TCBS) agarına ekildi ve karakteristik Vibrio kolonilerinin yokluğu görsel olarak onaylamak için 37 °C'de 24 sa inkübe edildi. Tüm testler üç tekrarlı olarak gerçekleştirildi.
4. Bentonit ile aktif karbonun (ACB) hazırlanması ve hücresel geri kazanımın değerlendirilmesi
Su ürünleri örneklerinde bulunan inhibitörlerin ACB tarafından en verimli şekilde absorbe edildiği ve aynı zamanda hedef hücrelerin minimum düzeyde absorbe edildiği koşulları belirlemek için, ACB ile gıda örnekleri arasındaki optimal pH ve temas süresini saptamak amacıyla yayınlanmış metodoloji21 takip edilmiştir. Aktif karbon, distile su ile iyice yıkanmış ve 55 °C'de kurutulmuştur. Ardından, 32,6 g aktif karbon, 3,04 g bentonit ile karıştırılmış, homojen dağılım sağlamak için 150 rpm'de 24 saat boyunca sürekli karıştırılmış, 55 °C'de kurutulmuş ve sterilize edilerek ince, homojen kuru bir ACB tozu elde edilmiştir. Vibrio hücrelerinin aktif karbon-bentonit (ACB) karışımıyla karıştırılmasının ardından hücresel geri kazanımı değerlendirmek için, suşlar %2 NaCl içeren BHI besiyerinde 1,5 x 104 CFU/mL hücre yoğunluğuna ulaşana kadar ayrı ayrı büyütülmüştür. Daha sonra, her bir Vibrio suşundan 1 mL, 100 mL fosfat tamponuna (PBS, %0,85 NaCl, pH 4, 6 ve 9'a ayarlanmış) ayrı ayrı inoküle edilmiştir. Bakteriyel süspansiyon daha sonra önceden hazırlanmış 4,6 g ACB ile birleştirilmiş ve teması kolaylaştırmak için 150 rpm'de 15, 30 ve 60 dakika boyunca karıştırılmaya bırakılmıştır. Belirlenen her temas süresinin ardından, 0,1 mL'lik bir alikvot dikkatlice ayrılmış, TCBS agarına ekilmiş ve koloni sayımı yapılmadan önce 24 saat boyunca 37 °C'de inkübe edilmiştir.
5. Aktif karbon ve bentonit ile işlem görmüş istiridye, karides ve balık örneklerinde V. cholerae, V. parahaemolyticus, V. vulnificus ve V. alginolyticus tespit sınırının değerlendirilmesi
Bu çalışmada kullanılan Vibrio türlerinin her biri BHI besiyerinde büyütülmüş ve hücre yoğunlukları, bir spektrofotometre kullanılarak ölçüldüğü üzere tam olarak 1.5 x 104, 7.5 x 103, 3.8 x 103, 1.5 x 103, 7.5 x 102, 3 x 102, 1.5 x 102 ve 76 CFU/mL (A600 nm ~0.25) değerlerine ayarlanmıştır. Ardından, herhangi bir Vibrio varlığını ortadan kaldırmak için önceden işlem görmüş her bir numunenin (istiridye, balık, karides) 50 g'ını inoküle etmek için her bir Vibrio kültüründen 1 mL kullanılmıştır. İnoküle edilen numuneler, bir paletli blenderda 360 rpm'de 30 s boyunca homojenize edilmiş ve 450 mL APW (pH 6) ile seyreltilmiştir. Karışım daha sonra, büyük kalıntıları ayırmak için 4 °C'de 5 dakika boyunca 260 x g hızında santrifüj edilmiştir. Elde edilen süpernatant, 23 g ACB içeren flasklara boşaltılmış, inhibitörleri absorbe etmek için 150 rpm'de 15 dakika boyunca karıştırılmış ve filtre kağıdı kullanılarak filtrelenmiş; böylece büyük partiküllerden arındırılmış berrak bir eluat elde edilmiştir. Bu eluat daha sonra 4 °C'de 10 dakika boyunca 16,000 x g hızında santrifüj edilmiş ve tüpün dibinde görünür bir hücre peleti oluşmuş, bu pelet daha sonra DNA ekstraksiyonu için kullanılmıştır. Her bir Vibrio türü LAMP yöntemi ile tanımlanmıştır. Negatif kontroller, Escherichia coli ATCC 25922, Cronobacter sakazakii ATCC 12868, Listeria monocytogenes ATCC 49594 ve Salmonella Typhimurium ATCC 14028 suşları ile inoküle edilen numunelerden oluşmuştur. Reaksiyon karışımı, 65 °C'deki bir su banyosunda 60 dakika boyunca inkübe edilmiştir. İnkübasyon süresinin ardından, amplifikasyon ürünleri %1.5'luk agaroz jel üzerinde ayrıştırılmış ve floresan bir DNA boyası ile boyanmıştır. Jeller, mavi ışık transilüminatöründe görüntülenmiştir. Son olarak, gözle tespit için her bir tüpe 4 μL hidroksinaftol mavisi (125 μM) eklenmiştir24.
6. LAMP yönteminin pozitif öngörü değeri, negatif öngörü değeri, özgünlüğü ve duyarlılığının belirlenmesi
LAMP yönteminin duyarlılığı, özgüllüğü ve öngörü değerleri 30 örnek (10 karides, 10 istiridye ve 10 balık) kullanılarak belirlenmiştir. Her bir örnek, her bir Vibrio türü için belirlenen minimum saptanabilir konsantrasyon ile inoküle edilmiştir. Duyarlılık ve özgüllük yüzdelerinin yanı sıra negatif öngörü değerini (NPV) ve pozitif öngörü değerini25 belirlemek için, deneyler sırasında elde edilen gerçek pozitifler (TP), gerçek negatifler (TN), yanlış pozitifler (FP) ve yanlış negatifleri (FN) özetlemek amacıyla bir kontingans tablosu kullanılmıştır. (Tablo 2). Bu verilerden hareketle aşağıdaki formüller uygulanmıştır:
Sonuçlar
Kullanılan bakteriyel suşlar ve DNA ekstraksiyonu
Sıralı LAMP analizlerinde şablon olarak kullanılmak üzere tüm patojenik ve negatif kontrol suşlarından DNA başarıyla ekstrakte edilmiştir.
LAMP prosedürü
Bu çalışmada kullanılan primerler, her bir Vibrio türündeki moleküler hedefin amplifikasyonu için spesifiktir. Vibrio suşları kullanıldığında LAMP ile elde edilen amplifikasyon ürünleri, her bir primerin her bir Vibrio türünün hedef gen amplifikasyonunda spesifik olduğunu göstermiştir (Şekil 1).
Numunelerde doğal olarak bulunan Vibrio türlerinin elenmesi için istiridye, karides ve balık numunelerinin işlenmesi
Numunelerde doğal olarak bulunan Vibrio türlerini elemeye yönelik işlem yeterli olmuş ve %100 Vibrio türü azalması sağlanmıştır. BAM yöntemi izlendiğinde Vibrio türü büyümesi gözlemlenmemiştir7.
Bentonit ile aktive edilmiş karbonun (ACB) hazırlanması ve hücresel geri kazanımın değerlendirilmesi
Aktif karbon-bentonit kullanılarak reaksiyon inhibitörlerinin giderilmesi, LAMP yöntemiyle patojen tespitinin hassasiyetinde artış sağlamıştır. Bu durum, aktif karbon-bentonitin, amplifikasyon prosedürü sırasında polimerazı etkileyebilecek inhibitör maddeleri absorbe etme yeteneğine ve bakteriyel hücrelerin sınırlı tutulmasına (Şekil 2) bağlıdır. Farklı pH ve temas süreleri kullanılarak gerçekleştirilen Vibrio geri kazanım yüzdesi, pH 6 ve 15 dakikalık temas süresinde daha yüksek bir hücresel geri kazanım (%93,4 ± 2,9) göstermiştir. pH 4 kullanıldığında herhangi bir Vibrio büyümesi gözlenmezken, pH 7 ve 9 değerleri sırasıyla %33,4 ± 7,6 ve %67,2 ± 5,8 olarak gerçekleşmiştir. Bu çalışma, yöntemin tespit hassasiyetini artırmak için pH 6 kullanımını önermektedir.
Aktif karbon ve bentonit ile işlem görmüş istiridye, karides ve balık örneklerinde V. cholerae, V. parahaemolyticus, V. vulnificus ve V. alginolyticus saptama limitlerinin değerlendirilmesi
İstiridye örneklerinde saptama limiti V. cholerae için 150 CFU/g; V. alginolyticus, V. vulnificus ve V. parahaemolyticus için 3 x 102 CFU/g olarak belirlenmiştir; karides ve balık örneklerinde ise V. cholerae minimum 150 CFU/g konsantrasyonda saptanırken, V. alginolyticus, V. vulnificus ve V. parahaemolyticus için bu değer 76 CFU/g olmuştur. LAMP yöntemi ile elde edilen sonuçlar, ACB ile işlem görmemiş örneklerdeki reaksiyon inhibitörlerini ortadan kaldırarak, hidroksinaftol mavisi kullanımının LAMP duyarlılığını artırdığını ortaya koymuştur (Şekil 3). Örnekler ACB ile işlem gördüğünde LAMP duyarlılığının daha yüksek olduğu gözlemlenmiştir.
LAMP yönteminin pozitif öngörü değeri, negatif öngörü değeri, özgüllüğü ve duyarlılığının belirlenmesi
Optimize edilmiş loop-mediated isothermal amplification (LAMP) yönteminin, aktive edilmiş karbon-bentonit (ACB) ön işlemi ile ve ön işlem olmadan tanısal performansı, sağlamlığını değerlendirmek amacıyla 150 deneme boyunca sistematik olarak değerlendirilmiştir (Tablo 3). ACB sistemi kullanılarak doğal gıda inhibitörlerinin giderilmesi, tedavi edilmemiş numunelerle karşılaştırıldığında tüm matrikslerde tüm tanısal parametreleri (duyarlılık, özgüllük, pozitif öngörü değeri (PPV) ve negatif öngörü değeri (NPV)) %90'a eşit veya daha büyük değerlere anlamlı şekilde yükseltmiştir.
ACB ile işlem görmüş balık ve karides örneklerinde analiz, %100 sensitivite, spesifite, PPV ve NPV değerlerine ulaşarak maksimumle diagnostik performans göstermiştir (Şekil 4). Buna karşılık, işlem görmemiş balık ve karides örneklerinde, matris kaynaklı inhibitörlerin varlığı analizi ciddi şekilde etkilemiş ve tespit sensitivitesini sırasıyla %62,5 ve %52,5'e düşürmüştür. Oldukça karmaşık olan istiridye matrisinde ise ACB işlemi temel girişimi başarıyla hafifleterek %95,0'lık yüksek bir genel sensitivite ve %71,4'lük bir NPV sağlamıştır (Şekil 5). Buna karşın, işlem görmemiş istiridye örneklerinde, polimerazı inhibe eden glikojen ve lipidler gibi organik bileşiklerin yoğun varlığı nedeniyle tespit sensitivitesinde %32,5'e ve NPV'de %15,6'ya kritik bir düşüş gözlemlenmiştir.
LAMP yönteminin tanısal özgüllüğü, matris türü veya ön işlemden bağımsız olarak 150 denemenin tamamında %100 olarak kalmış ve hiç yanlış pozitif sonuç kaydedilmemiştir. Bu mutlak özgüllük, türe özgü genleri hedefleyen primer setlerinin yüksek seçiciliğe sahip tasarımına (V. alginolyticus için gyrB, V. cholerae için ompW, V. parahaemolyticus için tlh ve V. vulnificus için vvhA) dayandırılmaktadır. Bu istatistiksel bulgular, optimize edilmiş ACB-LAMP yönteminin, çeşitli balıkçılık ürünlerindeki patojenik Vibrio türlerinin kültürsüz ve hızlı tespiti için oldukça güvenilir ve sağlam bir araç olduğunu kanıtlamaktadır.
Son olarak, reaksiyon inhibitörlerini gidermek için bir ön işlem ile birlikte LAMP yönteminin kullanılmasının, gıdalarda patojenlerin LAMP yöntemiyle tespit edilmesinin hassasiyetini artırabileceği değerlendirilmektedir. Bu nedenle, V. cholerae, V. parahaemolyticus, V. alginolyticus ve V. vulnificus arayışına uygulanan bu tekniğin, bu mikroorganizmaların neden olduğu enfeksiyonları önlemek için yapılan izlemede faydalı olacağı düşünülmektedir.
VERİ KULLANILABİLİRLİĞİ:
Farklı pH değerleri ve temas süreleri altındaki sayısal bakteriyel geri kazanım koloni sayımları (CFU/g) ile 150 doğrulama denemesinin tamamı için tanısal performans sonuçlarını içeren, bu çalışmanın bulgularını destekleyen tüm ham veriler, https://doi.org/10.5281/zenodo.21799272 adresindeki Zenodo deposunda kamuya açıktır. İlişkili veri seti, tam hesap çizelgesi dosyasını (Ek Dosya 1) içermektedir.
Şekil 1: %1,5 agaroza jelde LAMP ile amplifiye edilmiş ürünlerin özgüllük analizi. Şerit M, 100 bp moleküler boyut belirteci; Şerit 1, negatif kontrol (Escherichia coli ATCC 25922); Şerit 2, negatif kontrol (Listeria monocytogenes ATCC 49594); Şerit 3, V. alginolyticus ATCC 17749; Şerit 4, V. cholerae no O1 CECT 557; Şerit 5, V. parahaemolyticus ATCC 7802; Şerit 6, V. vulnificus ATCC 29037. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 2: Aktive edilmiş karbon-bentonit (ACB) karışımı ile farklı pH koşulları ve temas süreleri kullanılarak Vibrio suşlarının geri kazanım yüzdesi. Hücresel geri kazanım (%), Vibrio suşlarının pH 4.0, 6.0, 7.0 ve 9.0'ye ayarlanmış PBS içinde 1.5 × 104 CFU/mL konsantrasyonunda inoküle edilmesi ve 15 dk, 30 dk ve 60 dk boyunca 4.6 g ACB ile muamele edilmesiyle belirlenmiştir. pH 6.0 ve 15 dk temas süresindeki veri noktası, optimal hücresel geri kazanımı (%93.4 ± 2.9) göstermekte olup, yüksek inhibitör uzaklaştırma verimliliğini korurken hedef hücreleri geri kazanmak için kısa bir temas süresinin yeterli olduğunu belirtmektedir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 3: Yapay olarak spiking uygulanmış deniz ürünü örneklerinde LAMP ile amplifiye edilmiş ürünlerin saptama sınırı. Vibrio türlerinin seri dilüsyonları ile spiking uygulanmış ve ACB ile ön işlemden geçirilmiş (A) istiridye, (B) karides ve (C) balık örneklerindeki amplifikasyon sonuçları. Tüpler: (1) Negatif kontrol; (2) V. alginolyticus; (3) V. parahaemolyticus; (4) V. vulnificus; (5) V. cholerae no O1; ve (6) V. mimicus (hedef kontrol olarak kullanılmıştır). Üst panel: Pozitif reaksiyonların mavi, negatif reaksiyonların ise menekşe rengi kaldığı, 4 μL Hidroksinaftol Mavi (HNB, 125 μM) kullanılarak yapılan çıplak gözle görsel kolorimetrik saptama. Alt panel: Mavi ışık transillüminatörü altında görüntülenen Midori Green Advanced (MGA) boyası kullanılarak yapılan floresan tabanlı saptama. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: LAMP yönteminin inhibitör giderme işlemiyle ve işlemsiz karşılaştırmalı diyagnostik performans parametreleri. Minimum saptanabilir limitlerde spike edilmiş balık, karides ve istiridye örneklerinde genel duyarlılığın, özgüllüğün, pozitif öngörücü değerin (PPV) ve negatif öngörücü değerin (NPV) karşılaştırılması (tür/matris kombinasyonu başına n = 10 deneme, toplamda 150 deneme). Sütunlar, optimize edilmiş aktif karbon-bentonit (ACB) karışımı ile ön işlem görmüş örnekleri, işlem görmemiş kontrollerle (inhibitör giderme yapılmamış) karşılaştırmaktadır. Spike seviyeleri tüm matrislerde V. cholerae için 150 CFU/g; istiridyede V. parahaemolyticus, V. alginolyticus ve V. vulnificus için 300 CFU/g; balık ve karideste ise 76 CFU/g olarak belirlenmiştir. ACB ile ön işlem, tüm matrislerde tüm diyagnostik parametreleri başarıyla ≥%90 seviyesine geri getirmiştir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5Optimize edilmiş ACB-LAMP yönteminin farklı deniz ürünü matrisleri genelindeki hedefe özgü duyarlılığı ve özgüllüğü. ... için bireysel tanısal performans V. alginolyticus, V. cholerae, V. parahaemolyticusve V. vulnificus ACB ile ön işlem uygulanmış balık, karides ve istiridye örneklerinde (hedef/gıda kombinasyonu başına n = 10 test); türe özgü primer tasarımının ... hedeflemesi sayesinde tüm hedefler için %100 özgünlük sağlanmıştır. gyrB, ompW, Tüm Laparoskopik Histerektomive vvhA genler. Balık ve karides matrislerinde duyarlılık %100'e ulaşırken, organik matrisin yüksek bazal karmaşıklığının reaksiyonu etkilemesi nedeniyle istiridyelerde %90'a hafif bir düşüş gözlemlenmiştir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayınız.
Tablo 1: Loop-aracılı İzotermal Amplifikasyon (LAMP) analizlerinde kullanılan primerler. V. alginolyticus (gyrB), V. parahaemolyticus (tlh), V. vulnificus (vvhA) ve V. cholerae (ompW) türlerine özgü hedefleme için tasarlanan ileri ve geri iç primerlerin (FIP, BIP), dış primerlerin (F3, B3) ve loop primerlerin (LF, LB) açıklaması. Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Tablo 2: LAMP yönteminin tanısal performans parametrelerini değerlendirmek için kullanılan kontenjans tablosu. Spiked ve spiked olmayan deniz ürünleri örneklerinde sensitivite, spesifite, pozitif öngörü değeri (PPV) ve negatif öngörü değerini (NPV) hesaplamak amacıyla Gerçek Pozitifleri (TP), Gerçek Negatifleri (TN), Yanlış Pozitifleri (FP) ve Yanlış Negatifleri (FN) sınıflandırmak ve özetlemek için kullanılan standart 2x2 matris düzeneği. Bu tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Dosya 1: Bu çalışmanın bulgularını destekleyen ham veri setleri. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Tartışma
Bu çalışma, kontamine deniz ürünleri örneklerinde V. cholerae, V. parahaemolyticus, V. alginolyticus ve V. vulnificus tespiti için loop-aracılı izotermal amplifikasyonun (LAMP) duyarlılığını artırmak amacıyla optimize edilmiş koşulları belirlemektedir. Geleneksel ön zenginleştirme aşamasının atlanmasıyla tanı süresi önemli ölçüde azaltılarak, su ürünlerinden patojenlerin doğrudan tanımlanması için oldukça verimli ve hızlı bir yaklaşım sunulmaktadır.
Bu çalışmadaki temel metodolojik iyileştirme, inhibitör uzaklaştırma adımının optimizasyonudur. Önceki metodolojiler amplifikasyon öncesinde 4 pH değeri kullanmıştır21; ancak bu durum, öncelikle Vibrio türlerinin asidik ortamlara karşı oldukça hassas olmaları nedeniyle26 Vibrio suşlarının sıfır geri kazanımıyla sonuçlanmıştır. Bunu gidermek için, hücresel geri kazanımı aynı anda artırmak ve doğal olarak oluşan reaksiyon inhibitörlerini ortadan kaldırmak amacıyla koşullar sistematik olarak değiştirilmiştir. Aktif karbonun bentonit (ACB) ile pH 6'daki bir tampon çözeltide yeniden süspande edilmesi ve ardından numune ile 15 dakikalık ajitasyon uygulanması optimal koşul olarak belirlenmiştir. Bu modifikasyon, bakteriyel membranın izoelektrik noktasına yaklaşarak bakteriler ile ACB arasındaki elektrostatik itmeyi maksimize eder21,27,28, böylece hedef hücre kaybını minimize eder. Sonuç olarak, bu metodolojik geliştirme, ACB işlemi olmadan işlenen numunelere göre 2–50 kat daha fazla deteksiyon hassasiyeti sağlamıştır.
Bu metodolojik iyileştirmelerden farklı olarak, bu protokolün başarılı bir şekilde uygulanması, yaygın sorunlar ortaya çıktığında açık bir sorun giderme sürecini gerektirebilir. Uygulama sırasında karşılaşılan yaygın bir sorun, özellikle yüksek derecede kontamine matrislerde polimerazla etkileşime girebilen ve LAMP hassasiyetini azaltabilen organik maddelerin eksik uzaklaştırılmasıdır. Amplifikasyon başarısız olursa veya hassasiyet düşerse, sorun giderme işlemi öncelikle ACB-örnek karışımının pH değerinin doğrulanmasını içermelidir; pH 6'dan sapmalar hücre ölümüne (çok asidikse) veya yetersiz inhibitör absorbsiyonuna yol açabilir. Ayrıca, uygun ACB işlemine rağmen yanlış negatif sonuçlar oluşursa, araştırmacılar temas süresinin 15 min değerini aşmadığından emin olmalıdır; çünkü uzun süreli maruziyet, hedef hücrenin matris tarafından istenmeyen şekilde tutulmasına neden olabilir. Çıplak gözle tespit için, belirsiz renk değişimleri, aksi takdirde LAMP analizindeki magnezyum pirofosfat çökelmesine müdahale edebilecek matris kalsiyum iyonlarının tamamen uzaklaştırılması sağlanarak giderilebilir.
Bu çalışma, ilk kez, ACB ön işlemle birleştirilmiş LAMP yöntemi kullanılarak balık örneklerinde Vibrio türlerinin tanımlanmasını bildirmektedir. Bu araştırma, su ürünleri için hızlı, güvenilir ve maliyet etkin bir tanımlama yöntemi oluşturarak bilimsel alanı ileriye taşımaktadır13,19,23,29. Geleneksel PCR, bu hipotezi test etmek için alternatif bir yaklaşım sunsa da, burada elde edilen güçlü özgüllük ve öngörü değerleri, ACB-LAMP analizinin daha üstün bir seçenek olduğunu kanıtlamaktadır. Bu tekniğin kritik bir metodolojik avantajı; termosikletler, elektroforez tankları ve transilüminatörler gibi gelişmiş ve pahalı ekipmanlara bağımlı olmamasıdır9,30. Ayrıca, sonuçların hidroksinaftol mavisi aracılığıyla görsel olarak saptanması, veri yorumlamayı önemli ölçüde kolaylaştırmaktadır.
Elde edilen yüksek hassasiyet ve özgüllüğe rağmen, çalışmanın belirgin bir kısıtlaması, istiridye örnekleri gibi bazal kontaminasyonu yüksek olan matrislerde gözlemlenmiştir. Bu durumlarda, ACB sistemi tüm girişim yapan organik maddeleri tamamen ortadan kaldıramamakta ve bu durum, balık veya karides örneklerine kıyasla analiz hassasiyetini hafifçe düşürmektedir. Son olarak, bu yöntemin potansiyel uygulamaları, Vibrio kaynaklı enfeksiyonları önlemek amacıyla gıda endüstrisindeki rutin, yüksek kapasiteli izleme süreçleri için faydasını ortaya koymaktadır. Gelecekteki çalışmalar, DNA ekstraksiyonu ve ACB inhibitör giderme basamaklarının otomatize edilmesine öncelik vermelidir. Bu temel metodolojik özelliklerin otomatize edilmesi, uygulama süresini önemli ölçüde azaltacak, insan hatasını minimize edecek ve sorun giderme değişkenlerini standardize edecek kritik bir avantaj sağlayarak, bu tekniğin endüstriyel kalite kontrol laboratuvarlarında geniş ölçekli uygulamasını kolaylaştıracaktır.
Açıklamalar
Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması beyan etmemektedir.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Aktif karbon | Sigma-Aldrich | C2764 | |
| Bentonit | Sigma-Aldrich | 682659 | |
| Betain | Sigma-Aldrich | B0300 | |
| Bio-Image systems transilüminatör | Bio-Image systems | MBE-CP-01 | |
| Bst DNA polimeraz | New England Biolabs | M0374 | |
| Santrifüj (model J2-HS) | Beckman Coulter | https://www.americaninstrument.com/products/beckman-j2-hs-high-speed-1273g-centri | |
| Cronobacter sakazakii | ATCC | 12868 | |
| dNTP karışımı | Thermo Fisher Scientific | R0241 | |
| Escherichia coli | ATCC | 25922 | |
| Hidroksinaftol mavisi | Sigma-Aldrich | 219916 | |
| Listeria monocytogenes | ATCC | 49594 | |
| Midori Green Advanced | Nippon Genetics | MG01 | |
| MS 1D Analiz Yazılımı | Major Science | MBE-IMG-SW | |
| Salmonella Typhimurium | ATCC | 14028 | |
| Spektrofotometre (model 6300) | Jenway | 630531 | |
| Stomacher Sirkülatör (model 400) | Seward | 0400/000/AJ | |
| Vibrio alginolyticus | ATCC | 17749 | |
| Vibrio cholerae no O1 | CECT | 55 | |
| Vibrio parahaemolyticus | ATCC | 17802 | |
| Vibrio vulnificus | ATCC | 29037 | |
| Whatman kağıdı | Whatman | 1001-055 |
Kaynaklar
- Baker GL. Food safety impacts from post-harvest processing procedures of molluscan shellfish. Foods. 2016;5(2):29.
- Kim HJ et al. Multiplex PCR for detection of the Vibrio genus and five pathogenic Vibrio species with primer sets designed using comparative genomics. BMC Microbiol. 2015;15(1):239.
- CDC. Cholera and Other Vibrio Illness Surveillance (COVIS). Cdc.gov; 2022. Available from: http://www.cdc.gov/vibrio/surveillance.html
- Robert-Pillot A et al. Occurrence of the three major Vibrio species pathogenic for human in seafood products consumed in France using real-time PCR. Int J Food Microbiol. 2014;189:75-81.
- Brands DA et al. Prevalence of Salmonella spp. in oysters in the United States. Appl Environ Microbiol. 2005;71(2):893-897.
- Gxalo O et al. Virulence and antibiotic resistance characteristics of Vibrio isolates from rustic environmental freshwaters. Front Cell Infect Microbiol. 2021;11:732001.
- De Paola A, Kaysner CA. Bacteriological Analytical Manual, Vibrio. Food and Drug ENTER
- Chahorm K, Prakitchaiwattana C. Application of Reverse Transcriptase-PCR-DGGE as a rapid method for routine determination of Vibrio spp. in foods. Int J Food Microbiol. 2018;264:46-52.
- Anupama KP et al. Evaluation of loop-mediated isothermal amplification assay along with conventional and real-time PCR assay for sensitive detection of pathogenic Vibrio parahaemolyticus from seafood sample without enrichment. Mol Biol Rep. 2021;48(1):1009-1016.
- Notomi T et al. Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucleic Acids Res. 2000;28(12):E63.
- Sridapan T et al. Rapid detection of Clostridium perfringens in food by loop-mediated isothermal amplification combined with a lateral flow biosensor. PLoS One. 2021;16(1):e0245144.
- Notomi T, Mori Y, Tomita N, Kanda H. Loop-mediated isothermal amplification (LAMP): principle, features, and future prospects. J Microbiol. 2015;53(1):1-5.
- Yamazaki W, Ishibashi M, Kawahara R, Inoue K. Development of a loop-mediated isothermal amplification assay for sensitive and rapid detection of Vibrio parahaemolyticus. BMC Microbiol. 2008;8:163.
- Nagamine K, Hase T, Notomi T. Accelerated reaction by loop-mediated isothermal amplification using loop primers. Mol Cell Probes. 2002;16(3):223-229.
- Mori Y, Nagamine K, Tomita N, Notomi T. Detection of loop-mediated isothermal amplification reaction by turbidity derived from magnesium pyrophosphate formation. Biochem Biophys Res Commun. 2001;289(1):150-154.
- Yamazaki W et al. Development of a loop-mediated isothermal amplification assay for sensitive and rapid detection of the tdh and trh genes of Vibrio parahaemolyticus and related Vibrio species. Appl Environ Microbiol. 2010;76(3):820-828.
- Di H et al. Development and evaluation of a loop-mediated isothermal amplification assay combined with enrichment culture for rapid detection of very low numbers of Vibrio parahaemolyticus in seafood samples. Biol Pharm Bull. 2015;38(1):82-87.
- Cai SH et al. Loop-mediated isothermal amplification method for rapid detection of Vibrio alginolyticus, the causative agent of vibriosis in mariculture fish. Lett Appl Microbiol. 2010;50(5):480-485.
- Han F, Ge B. Evaluation of a loop-mediated isothermal amplification assay for detecting Vibrio vulnificus in raw oysters. Foodborne Pathog Dis. 2008;5(3):311-320.
- Zhang L et al. Rapid, specific and sensitive detection of Vibrio vulnificus by loop-mediated isothermal amplification targeted to vvhA gene. Hai Yang Xue Bao. 2018;37(4):83-88.
- Luan C, Levin RE. Use of activated carbon coated with bentonite for increasing the sensitivity of PCR detection of Escherichia coli O157:H7 in Canadian oyster (Crassostrea gigas) tissue. J Microbiol Methods. 2008;72(1):67-72.
- Ren C-H, Hu C-Q, Luo P, Wang Q-B. Sensitive and rapid identification of Vibrio vulnificus by loop-mediated isothermal amplification. Microbiol Res. 2009;164(5):514–21.
- Srisuk C et al. Rapid and sensitive detection of Vibrio cholerae by loop-mediated isothermal amplification targeted to the gene of outer membrane protein ompW: Detection of Vibrio cholerae by LAMP. Lett Appl Microbiol. 2010;50(1):36-42.
- Goto M et al. Colorimetric detection of loop-mediated isothermal amplification reaction by using hydroxy naphthol blue. Biotechniques. 2009;46(3):167-172.
- Parikh R et al. Understanding and using sensitivity, specificity and predictive values. Indian J Ophthalmol. 2008;56(1):45-50.
- Yung CM et al. Insensitivity of diverse and temporally variable particle-associated microbial communities to bulk seawater environmental parameters. Appl Environ Microbiol. 2016;82(11):3431-3437.
- Abolmaaty A, Gu W, Witkowsky R, Levin RE. The use of activated charcoal for the removal of PCR inhibitors from oyster samples. J Microbiol Methods. 2007;68(2):349-352.
- Lee JL, Levin RE. Detection of 5 CFU/g of Escherichia coli O157:H7 on lettuce using activated charcoal and real-time PCR without enrichment. Food Microbiol. 2011;28(3):562-567.
- Tian CD et al. Study on detection of Vibrio parahaemolyticus in shellfish by use of loop-mediated isothermal amplification method: V. Parahaemolyticus in shellfish. J Food Saf. 2011;31(3):371-378.
- Niessen L, Luo J, Denschlag C, Vogel RF. The application of loop-mediated isothermal amplification (LAMP) in food testing for bacterial pathogens and fungal contaminants. Food Microbiol. 2013;36(2):191-206.