Üç boyutlu (3D) bir ortamda tümör-immün etkileşimlerini modellemek için bir mikroakışkan platformun kullanımına yönelik bir protokol sunuyoruz. Sonuçlarımız, Doğal Öldürücü (NK) hücrelerin mekanik sıkıştırma altında anti-tümör aktivitelerini koruduklarını ortaya koymuştur.
Yöntem makalesi
3B Hücre Dışı Matriste Tümör-Bağışıklık Hücresi Etkileşimlerinde Mekanik Kompresyonun Rollerini İncelemek İçin Bir Mikroakışkan Platform
Bu makalede
Özet
Özet
Hücre tabanlı immünoterapinin bağlamında, mekanik kuvvetler immün hücrelerin tümör hücrelerini öldürme yeteneğini önemli ölçüde etkiler. Tümör hücrelerini öldürmek için immün hücrelerin hedef hücreye kuvvet uygulaması ve granzyme B dahil olmak üzere sitotoksik moleküllerin iletildiği bir immün sinaps oluşturması gerekir. Önemlerine rağmen, mekanik uyaranların immün aracılı öldürmeyi artırmak için nasıl kullanılabileceği hala yeterince anlaşılamamıştır. Bu bilgi boşluğu, kısmen hücre kültürlerine fizyolojik olarak gerçekçi bir ortamda iyi kontrollü mekanik stres sağlayabilen araçların eksikliğinden kaynaklanmaktadır. Burada, ekstraselüler matrise (ECM) gömülü tümör sferoidlerine statik veya dinamik kompresyon uygulayabilen ve aynı zamanda optik mikroskopi aracılığıyla tümör-immün etkileşimlerinin gerçek zamanlı görüntülenmesine olanak tanıyan bir mikroakışkan kompresyon cihazını tanımlıyoruz.
Mikroakışkan platform 12 bölmeden (6 kontrol ve 6 fonksiyonel) oluşmaktadır. Her bölme, basınç kontrol ünitesinin hemen altına konumlandırılmış bir hücre odası içerir. ECM içine gömülmüş sferoidler hücre odasına yerleştirilir. Bu platformu kullanarak, tanımlanmış mekanik kompresyon altında Doğal Katil (NK) hücrelerinin meme tümör sferoidlerine (MCF-7) karşı öldürme etkinliğini inceledik. Sonuçlar, 1.5 mg/mL kolajende mekanik kompresyona bakılmaksızın NK hücrelerinin tümör sferoidi ölümünün temel itici gücü olmaya devam ettiğini göstermiştir. Bu durum, NK hücrelerinin kompresyon stresine rağmen antitümör aktivitelerini koruyabildiklerini göstermektedir. Bu bulgular, tümör-immün etkileşimlerinde mekanik kuvvetlerin rolünü araştırmak için bu platformun kullanışlılığını kanıtlamaktadır. Devam eden çalışmalar, immün hücrelerin kompresyon stresine uyum sağlamasına olanak tanıyan moleküler mekanizmaları belirlemektedir. Bu çalışmalardan elde edilen bilgiler, gelecek vaat eden bir terapötik yol ortaya çıkarabilir.
Giriş
Hücre tabanlı kanser immünoterapisi, kanser hücrelerini hedeflemek için bağışıklık hücrelerinin kullanıldığı terapötik bir yaklaşımdır1. Bu strateji, kan kanserlerinin tedavisinde dikkat çekici bir başarı göstermiştir2,3,4. Ancak, kan kanserlerinde gözlemlenen başarı düzeyi henüz solid tümörlerin tedavisine tam olarak yansıtılamamıştır5,6,7. Bu sınırlamanın temel nedenlerinden biri, solid tümörlere özgü olan immünosupresif tümör mikroçevresidir (TME).
TME, hücresel davranışı düzenleyebilen belirgin mekanik sinyallerle karakterizedir. İmmün hücreler tarafından tümör hücrelerinin etkili bir şekilde öldürülmesi, bu hücrelerin hedef hücreler üzerinde kuvvet uygulamalarını ve sitotoksik moleküllerin iletildiği bir immün sinaps kurmalarını gerektirir8. Bu nedenle, mekanik kuvvetlerin immün hücre fonksiyonunu nasıl etkilediğinin anlaşılması, katı tümörlere karşı hücre tabanlı immünoterapilerin etkinliğini artıracak yeni terapötik stratejiler ortaya çıkarabilir.
Katı TME'nin belirleyici bir mekanik özelliği, tümör mikroçevresinin büyüyen tümör üzerinde oluşturduğu kompresyon stresidir9,10. Bugüne kadar, çoğu kompresyon çalışması tümör hücresi davranışı üzerindeki etkilere odaklanmıştır10,11. Kompresyonun TME içindeki immün hücreleri nasıl etkilediğini anlamaya yönelik ilgi ancak yakın zamanda artmıştır12. Sonuç olarak, kompresyon stresinin Doğal Öldürücü (NK) hücre migrasyonu, immün sinaps oluşumu ve sitotoksik aktivite üzerindeki etkilerinin mekanizmaları hala yeterince anlaşılamamış ve yetersiz şekilde nicelleştirilmiştir. Bu boşluk, TME içindeki mekanik ipuçlarının katı tümörlerin immün hedeflemesini artırmak için nasıl kullanılabileceğine dair anlayışımızda kritik bir sınırlamayı temsil etmektedir.
Bu soruyu elelmenin önündeki temel engel, fizyolojik olarak ilgili 3D mikroortamlarda kontrollü ve ölçülebilir kompresyon uygulayabilen ve aynı zamanda tümör-immün etkileşimlerinin gerçek zamanlı görüntülenmesine olanak tanıyan deneysel platformların eksikliğidir. Kompresyon stresini incelemeye yönelik erken deneysel yaklaşımlar, sferoidlerin agaroz jellerine gömülmesini içeriyordu13. Bu yöntem fiziksel sınırlamayı etkili bir şekilde yakalamış olsa da, doğal hücre dışı matris (ECM)-hücre etkileşimlerini ortadan kaldırmıştır. Dolega ve arkadaşları, kompresyon stresini indüklemek için ozmotik basınç uygulamışlardır; ancak sferoidler kültür ortamında süspanse edilmişti ve bu nedenle ECM etkileşimlerinden yoksun kalmıştı9. Pandey ve arkadaşları, kolajen içine gömülmüş sferoidleri sıkıştırmak için bir transwell insert ve ağırlıklar kullanmışlardır; bu yöntem ECM-hücre etkileşimlerini korumuş ancak immün hücre motilitesini ve sitotoksik aktiviteyi nicelleştirmek için gereken yüksek çözünürlüklü görüntülemeyi sınırlamıştır14. Tüm bu sınırlamalar, TME içindeki hücrelerin kompresyona verdikleri morfolojik yanıtların gerçek zamanlı görüntülenmesini sağlayan deneysel platformlara duyulan ihtiyacı vurgulamaktadır.
Burada, fizyolojik olarak anlamlı ECM-hücre etkileşimlerini korurken kontrollü kompresyon stresinin uygulanmasına olanak tanıyan ve immün-tümör dinamiklerinin yüksek çözünürlüklü canlı hücre görüntülemesini destekleyen bir mikroakışkan kompresyon cihazı15 için bir protokol sunuyoruz. Protokol; cihaz bileşenlerinin hazırlanması (Bölüm 1), cihazın montajı (Bölüm 2) ve tümör-immün etkileşimlerinin görüntülenmesinden (Bölüm 3) oluşmaktadır. İş akışını, yeşil floresan protein (GFP) etiketli tümör sferoidlerine karşı bir NK öldürme testi kullanarak gösteriyoruz. Bu uygulamanın ötesinde platform, mekanik kuvvetlerin 3B mikroortamlardaki geniş bir hücre tipi ve hücresel etkileşim yelpazesi üzerindeki etkilerini araştırmak için kolayca uyarlanabilir.
Protokol
1. Cihaz bileşenlerinin hazırlanması
- Numune yükleme odasının yüzey aktivasyonu
- Yalnızca kuyucuklar açıkta kalacak şekilde, örnek yükleme odasının (Tabaka 1, L1) üzerine bir maske yerleştirin.
- Maskelenmiş 1. Tabakayı, yüksek güç ayarı (45 W) kullanılarak 15 saniye boyunca oksijen plazmasına maruz bırakın.
- Katman 1'i bir Petri kabına yerleştirin, ardından aşağıdaki adımlara biyogüvenlik kabininde devam edin.
- Her bir kuyucuğa şunları uygulayın: 10 µL 10 dakika boyunca %1 polietilenimin (PEI) ile.
- Cam yüzeyin çizilmesini önlemek için, her kuyucuğun dört köşesinden vakum aspirasyonu yaparak PEI'yi kuyucuklardan uzaklaştırın.
- Kuyucukları şunlarla yıkayın: 10 µL fosfat tamponlu salin (PBS) ile, ardından yıkama sıvısını yandan vakumlu aspirasyonla uzaklaştırın.
- Kuyucukları şunlarla işleyin: 10 µL 30 dakika boyunca %0,1'lik glutaraldehit ile inkübe edin, ardından glutaraldehidi köşelerden vakum aspirasyonu ile uzaklaştırın.
- Kuyucukları üç kez PBS ile yıkayın ve her yıkama işleminden sonra köşelerde kalan yıkama solüsyonunu uzaklaştırın.
- Katman 1'i içeren Petri kabını folyoyla sarın ve gece boyunca biyogüvenlik kabininde bırakın.
- Sterilizasyon metal çerçevenin
- 38 mm'lik parçayı daldırın × 88 mm'lik metal çerçeveyi ve on iki adet M2.5 mercimek başlı vidayı gece boyunca %70'lik etanol içerisinde bekletin.
- Priming basınç kontrol ünitesinin
- Basınç kontrol ünitesini, yüksek güç ayarını (45 W) kullanarak 30 saniye boyunca oksijen plazmasına maruz bırakın.
- Basınç kontrol ünitesinin kanallarını ve odacıklarını doldurmak için, özelliklerin aşağı bakacak şekilde ünitedi tüm gece boyunca deiyonize (DI) su içerisinde bekletin.
- Ertesi gün, basınç kontrol ünitesini içinde bulunduğu DI sudan çıkarın.
- Bir mikroakışkan rezervuarı 50 mL DI su ile doldurun.
NOT: Mikroakışkan rezervuar, iki adet tüp bağlantısı (bir pnömatik tüp hattı ve bir sıvı iletim tüp hattı) içeren özel bir kapakla donatılmış 50 mL'lik konik bir tüpten oluşur. - Hava ile doldurulmuş bir şırıngayı pnömatik boru hattına bağlayın.
- Siringa pistonunu yavaşça bastırarak rezervuarı basınçlandırın ve tüpler dolup uçtan su damlamaya başlayana kadar DI suyu sıvı iletim tüpleri üzerinden ilerletin.
- Önceden doldurulmuş, damlama yapan sıvı iletim tüpünü polikarbonat manifold üzerinden geçirerek basınç kontrol ünitesinin arkasında bulunan 1,5 mm'lik girişe bağlayın.
- Basınç kontrol ünitesinin ve manifold düzeneğinin 2 saat boyunca havada kurumasına izin verin. Tamamen kuruduğunda, basınç kontrol ünitesi ve manifold düzeneği bir sonraki adım için hazır olacaktır.
2. Cihazın kurulumu
- Hücre gömülü kolajen hazırlama
- Metal çerçeveyi ve vidaları %70 etanolden çıkarın ve kurulayın.
- Biyogüvenlik kabini içerisinde üç adet 600 µL buz üzerindeki mikrotüpler. Tüpleri şu şekilde etiketleyin: "N" (nötralizasyon), "sp" (MCF-7 sferoidleri) ve "sp+NK" (NK hücreleri ile MCF-7 sferoidleri).
- 10 ekleyerek nötralizasyon karışımını hazırlayın× gerekli hacimdeki Medium 199 (M199) ve sodyum hidroksit (NaOH) ile "N" tüp
- M199:NaOH karışımının uygun hacmini ...'ya aktarın "sp" ve "sp+NK" nihai 1 değerine ulaşmak için tüpler× konsantrasyon
- Tümör sferoitlerini toplayın ve 141 g'de santrifüjleyin × g sferoidlerin tüpün dibine çökmesi için 3 dakika bekleyin.
NOT: Tümör sferoitleri yaklaşık olarak 200 µm önceden tanımlanmış bir agaroz mikro kuyu platformu kullanılarak [belirtilen] çapta oluşturulmuştur16Kısaca, 3 × 106 MCF-7 hücreleri 36'lık bir plakaya ekildi × kuyucuklardan oluşan 36'lı agaroz mikro-kuyu dizisi 200 µm çapında ve 200 µm derinlemesine ekilmiş ve ardından deneylerde kullanılan tümör sferoidlerini üretmek için 7 gün boyunca kültüre edilmiştir. - Süpernatantı dikkatlice uzaklaştırın ve sferoidleri şunların içinde yeniden süspanse edin: 200 µL %50:50 MCF-7/NK komple ortamından (Tablo 1 ve Tablo 2).
- NK hücrelerini 50 mL'lik konik bir tüpe toplayın, 141'de santrifüjleyin × g 4 dakika boyunca bekleyin ve hücreleri sayın.
NOT: NK hücresi canlılığı şu düzeyde olmalıdır >deney gününde %85. - Elde edilen peleti şu içinde yeniden süspande edin: 200 µL tam NK besiyerinden.
- Her bir mikrosantrifüj tüpüne uygun hacimde kolajen stok çözeltisi ekleyin.
- Her bir tüpe, nihai hacmi şuna ulaşacak şekilde uygun miktarda hücre süspansiyonu ekleyin: 200 µL 1,5 mg/mL kolajen içeren.
NOT: "sp" süspansiyon yalnızca tümör sferoidleri içerirken, buna karşılık "sp+NK" süspansiyon tümör sferoidleri ve 1,5 içerir × 106 NK hücreleri. - Kabarcık oluşumunu en aza indirirken hücrelerin ve kolajenin eşit dağılımını sağlamak için pipetleme yoluyla nazikçe karıştırın.
- Cihaz montajı ve hücre yüklemesi
- Katman 1'i kurutulmuş metal çerçevenin içine yerleştirin.
- Yükleme 9 µL kolajen karışımını her bir kuyucuğa.
- Basınç kontrol ünitesini ve manifold düzeneğini, bir mikroskop kullanarak Katman 1'deki hücre odalarıyla hizalayın.
- Kurutulmuş vidaları manifoldun içinden geçirerek metal çerçeveye yerleştirin; böylece basınç kontrol ünitesini ve Tabaka 1'i manifold ile metal çerçeve arasında sabitlemiş olursunuz.
- Montajı tamamlanmış cihazı bir ... içine yerleştirin 37 °C, %5 CO2₂ kolajen polimerizasyonuna izin vermek için 45 dakika boyunca inkübatöre yerleştirin.
- Dört medya portu aracılığıyla 50:50 MCF-7/NK tam hücre kültürü medyası ekleyin.
3. Tümör-immün etkileşimlerinin görüntülenmesi
- Canlı hücre görüntüleme için, monte edilmiş cihazı ters epifloresans mikroskoba takılı olan tabla inkübatörünün içine yerleştirin.
NOT: Tabla inkübatörü, görüntüleme süresi boyunca 37 °C sıcaklığı ve yaklaşık %50 nemi korumuştur. - Görüntüleme süresi boyunca dahili ortamı 37 °C, %100 nem ve %5 CO₂ değerlerinde tutmak için monte edilmiş cihazın üzerine ikincil bir muhafaza kutusu yerleştirin.
- Cihazı, pnömatik borulama kullanarak basınç kontrolörüne bağlayın.
- Sıkıştırma sonrası sferoid deformasyonunun değerlendirilebilmesi için, sıkıştırma uygulamadan önce tümör sferoidlerinin brightfield ve GFP görüntülerini alın.
- Görüntüleme süresi boyunca 120 mbar sabit basınç uygulayın.
NOT: Basınç kontrolörü yazılımı, kullanıcının deney sırasında uygulanan basınç profilini ve miktarını tanımlamasına olanak tanır. Ek Şekil 1, basınç kontrol sisteminin bir şemasını içermektedir. - 18 saat boyunca her 10 dakikada bir brightfield ve GFP görüntüleri alarak time-lapse görüntülemeye başlayın.
NOT: Görüntüler, ters epi-floresans mikroskobunda 20× objektif lens kullanılarak her tümör sferoidinin merkez Z-düzleminden alınmıştır. Brightfield ve GFP floresans görüntüleri sırasıyla 200.1 ms ve 298.9 ms pozlama süreleri ile yakalanmıştır.
Sonuçlar
Aşağıdaki deneyler için, fizyolojik olarak ilgili bir 3D mikroortamda tümör-immün etkileşimlerini modellemek ve aynı zamanda tümör sferoidlerine statik ve dinamik kompresyonlar uygulamak amacıyla bir mikroakışkan kompresyon cihazı15 kullanılmıştır (Şekil 1). Cihaz bileşenleri (Şekil 1A1) ve bunların montaj sırası (Şekil 1A2), Şekil 1A'da gösterilmiştir. Metal çerçeve cihazın tabanı görevi görür ve hücre odası katmanı (L1) çerçevenin içine yerleştirilir. Birbirine plazma ile bağlanmış L2 ve L3'ten oluşan basınç kontrol ünitesi L1'in üzerine yerleştirilir ve ardından manifold eklenir (Şekil 1A2). L1 ve basınç kontrol ünitesi birlikte fonksiyonel mikroakışkan cihazı oluşturur ve vidalarla metal çerçeve ile manifold arasına sıkıştırılır. Manifold, cihaza basınç sağlamak için akışkan borulama giriş portlarının yanı verilen, uzun süreli canlı hücre görüntüleme deneylerini kolaylaştıran medya rezervuarlarını içerir.
Şekil 1Mekanik kompresyon altındaki immün hücreler ve tümör sferoidleri arasındaki etkileşimlerin incelenmesi için mikroakışkan kompresyon cihazı. (A1) Cihaz montajı için gerekli bileşenlerin fotoğrafı; soldan sağa doğru: manifold, basınç kontrol ünitesi (L2 + L3), hücre odası katmanı (L1) ve metal çerçeve. (A2) Cihaz bileşenlerinin yukarıdan aşağıya doğru gösterilen 3 boyutlu şeması: manifold, basınç kontrol ünitesi (L2 + L3), hücre odası katmanı (L1) ve metal çerçeve. L2 ve L3 PDMS katmanları, hücre odasının üzerine konumlandırılan basınç kontrol ünitesini oluşturmak için plazma ile birbirine bağlanmıştır. Manifold ve metal çerçeve, monte edilmiş cihazı sabitlemektedir. (B1) Sıkıştırma öncesi ve sonrası bir sıkıştırma ünitesinin enine şematik görünümü. ECM gömülü tümör sferoidleri ve NK hücreleri hücre odasına yerleştirilir. Sıkıştırma öncesinde L1'in altı ile L2'nin altı arasındaki başlangıç mesafesi h ile gösterilmiştir. Basınç kontrol ünitesine basınç uygulandığında, L2 aşağı doğru esneyerek PDMS pistonun tümör sferoidini sıkıştırmasına neden olur. Sıkıştırma sonrası L2'nin aşağı yönlü yer değiştirmesi Δh ile gösterilmiştir. (B2) Sıkıştırma öncesi (sol) ve sonrası (sağ) NK hücreleri içeren MCF-7 tümör sferoidinin birleştirilmiş parlak alan ve GFP görüntüleri. MCF-7 hücreleri GFP ile işaretlenmiş, NK hücreleri ise işaretlenmemiştir. Temsili NK hücreleri mavi dairelerle, tümör sferoidlerinin çevreleri ise sarı dış hatlarla belirtilmiştir. Ölçek çubuğu = 50 µm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Montajı tamamlanan mikroakışkan sıkıştırma cihazı, Şekil 1B'de gösterildiği gibi tümör sferoidlerini sıkıştırmak için kullanılabilir. Burada, NK hücreleri içeren kollajen gömülü tümör sferoidleri hücre odasına (L1) yerleştirilir. Basınç odasına (L3) basınç uygulandığında, deforme olabilir membran tabakası (L2) aşağı doğru esneyerek Polidimetilsiloksan (PDMS) pistonun sferoide sıkıştırma kuvvetleri iletmesini sağlar. Basınç odası, harici bir basınç kaynağı tarafından kontrol edilir. Mikroakışkan sıkıştırma cihazının tasarımı, üretimi ve karakterizasyonuna ilişkin ek detaylar daha önce başka bir çalışmada yayımlanmıştır15.
Hücre bölmesinin altı (L1) ile deforme olabilir membranın altı (L2) arasındaki mesafeyi h olarak tanımlıyoruz (Şekil 1B1, sol panel). Sıkıştırma öncesinde bu mesafe 20 µm'dir. Basınç kontrol ünitesine sıvı basıncı uygulandığında, deforme olabilir membran aşağıya doğru çöker ve böylece h mesafesini Δh kadar azaltarak (Δh; Şekil 1B1, sağ panel) kolajene gömülü tümör sferoidini sıkıştırır. Bu sistemde, sıkıştırma gerinimi Δh/h olarak tanımlanır; burada h, sıkıştırma öncesindeki L1 ve L2 arasındaki başlangıç mesafesi, Δh ise sıkıştırma sonrası L2'nin aşağı yönlü yer değiştirmesidir. Membran yer değiştirmesi, daha önce L2'nin altına yapışmış floresan boncuklar görselleştirilerek kalibre edilmiştir. Kalibrasyon prosedürünün ve sıkıştırma gerinimi hesaplamalarının ayrıntılı açıklaması önceki bir çalışmada bulunabilir17. Örnek bir kalibrasyon eğrisi Ek Şekil 2'de görülebilir.
Şekil 1B2, 1.5 mg/mL kolajen içine gömülmüş NK hücreli bir MCF-7 sferoidinin sıkıştırma öncesi (sol panel) ve sonrası (sağ panel) temsilci birleştirilmiş brightfield ve GFP görüntülerini göstermektedir. Tümör sferoid sınırları sarı ile belirtilmiştir. Sıkıştırma sonrası sferoid, izdüşüm alanında bir artış göstermiş olup, bu durum mekanik yükün başarılı bir şekilde uygulanmasına yanıt olarak meydana gelen deformasyonu göstermektedir. Bu makalede sunulan tüm deneyler için Δh/h = 50% değerinde bir sıkıştırma gerinimi kullanılmıştır. Sferoid çapının 140 µm ile 20 µm arasında değiştiğini belirtmek isteriz. Bu, sferoid üzerindeki gerçek sıkıştırma geriniminin %50'den biraz daha düşük olduğu anlamına gelmektedir. Ek Video 1 ve Ek Video 2, sırasıyla %50 sıkıştırma gerinimi uygulanmadan önce ve uygulandıktan sonra, 1.5 mg/mL kolajen içine gömülmüş bir MCF-7 sferoidinin GFP floresan kanalında elde edilen temsilci X-Y z-stack görüntülerini göstermektedir.
Mikroakışkan sıkıştırma cihazı; NK hücrelerinin, sıkıştırmanın ve bunların kombinasyonunun tümör sferoid ölümü üzerindeki etkilerini incelemek için kullanılmıştır (Şekil 2). Bu, cihazın 12 kültür kuyucuğu içeren tasarımı sayesinde mümkün olmuştur. Bu kuyucukların altısı sıkıştırmaya tabi tutulabilirken, kalan altısı sıkıştırılmamış kontroller olarak hizmet eder. Bu yapılandırma dört deneysel koşula olanak tanır (Şekil 2A): sıkıştırma uygulanmamış tek başına sferoidler (sp), NK hücreleri içeren ancak sıkıştırma uygulanmamış sferoidler (+NK), sıkıştırmaya tabi tutulmuş sferoidler (+comp) ve hem sıkıştırmaya hem de NK hücrelerine maruz kalmış sferoidler (+comp+NK).
Şekil 2Mekanik kompresyon, NK hücreleri aracılığıyla gerçekleşen tümör sferoidlerinin öldürülmesini modüle eder. (A) 1,5 mg/mL kolajen içine gömülmüş MCF-7 sferoidlerinin dört farklı koşul altındaki zaman atlamalı floresan görüntüleri: sadece sferoid kontrol (sp), NK hücreli sferoidler (+NK), kompresyon uygulanan sferoidler (+comp) ve hem kompresyon hem de NK hücreli sferoidler (+comp+NK). GFP floresanası, canlı MCF-7 tümör hücrelerini etiketler. Sarı dış hat, 18. saatteki görüntü kullanılarak tanımlanan ve floresan miktarının belirlenmesi için tüm zaman noktalarına uygulanan ilgi alanını (ROI) belirtmektedir. ROI içindeki toplam GFP floresan yoğunluğu ölçülmüş ve sonraki analizlerde kullanılmıştır. Ölçek çubuğu = 50 µm. (B) 4 farklı koşul altında, bir sferoidin zamanla değişen toplam GFP floresan yoğunluğu. Her renkli çizgi, tek bir sferoidin t = 0 anındaki başlangıç yoğunluğuna normalize edilmiş toplam floresan yoğunluğunu temsil etmektedir. Siyah çizgi, kontrol koşulunda kültüre edilen 7 sferoidden toplanan floresan yoğunluğu verilerinin ikinci dereceden polinomyal uyumudur ve (C) bölümündeki tümör hücresi kaybının hesaplanmasında referans olarak kullanılmıştır.C) +comp, +NK ve +comp+NK koşulları için normalize edilmiş GFP kaybı, her bir sferoidin t = 18 saattteki GFP yoğunluğunun, yalnızca sferoid içeren referans hattından (sp) çıkarılmasıyla hesaplanmıştır. Bu nedenle, her bir veri noktası tek bir sferoidin normalize edilmiş GFP kaybını temsil etmektedir. Hata çubukları SEM'i temsil etmektedir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
NK hücrelerinin, kompresyonun ve bunların kombinasyonunun tümör sferoidleri üzerindeki etkileri, 1,5 mg/mL kollajen içindeki MCF-7 sferoidlerinin temsili görüntülerinde görselleştirilebilir (Şekil 2A). Tümör sferoidlerini oluşturmak için kullanılan MCF-7 hücreleri GFP ile etiketlendiğinden, tümör canlılığı GFP floresanındaki değişiklikler üzerinden izlenebilmiştir. GFP ve parlak alan görüntüleri, ters epifloresan mikroskobu kullanılarak 18 saat boyunca her 10 dakikada bir alınmıştır. Özellikle, kompresyona maruz kalan sferoidlerin, kompresyona maruz kalmayan sferoidlere göre daha geniş bir projeksiyon alanı sergilediği görülmüş; bu durum, mekanik yükün deforme olabilir membrandan tümör sferoidine başarılı bir şekilde iletildiğini doğrulamıştır. Zamanla, +NK ve +comp+NK koşullarında progresif bir GFP floresans kaybı gözlemlenmiş (Şekil 2A), bu durum NK hücreleri aracılı tümör hücresi öldürülmesini göstermiştir.
Tümör hücresi ölümünün bir ölçütü olarak GFP floresan kaybını kullanıyoruz. Bu çalışmada kullanılan GFP etiketli MCF-7 hücreleri, lentiviral transdüksiyon yoluyla oluşturulmuştur. Kısaca, elongasyon faktörü-1α (EF1α) promotörü tarafından yönlendirilen gelişmiş yeşil floresan protein (eGFP) ekspresyon kaseti ile Rous sarkom virüsü (RSV) promotörü tarafından yönlendirilen bir puromisin direnç geni aktarmak için lentiviral bir vektör kullanılmıştır. Enfeksiyondan sonra, lentiviral ekspresyon kasetleri MCF-7 hücrelerinin genomik DNA'sına entegre edilerek stabil GFP ekspresyonu sağlanmıştır. Transdükte olmamış hücreleri ayıklamak için ardından puromisin seçilimi uygulanmıştır. MCF-7 hücrelerinin GFP ile etiketlenmesi, GFP floresan yoğunluğundaki zamanla meydana gelen değişikliklerin izlenerek tümör hücresi canlılığının nicelendirilmesine olanak sağlamıştır (Şekil 2B). GFP floresan kaybı ile canlı/ölü belirteci propidyum iyodür (PI) ve apoptotik belirteç annexin-V dahil olmak üzere hücre ölümünün yerleşik belirteçleri arasındaki güçlü korelasyon daha önce kanıtlanmış olup18, GFP floresan kaybının tümör hücresi ölümü için geçerli bir vekil ölçüm olduğu doğrulanmıştır.
Dört deneysel koşulun tümör canlılığı üzerindeki etkilerini nicelleştirmek için, her bir tümör sferoidinin toplam GFP floresan yoğunluğu her zaman noktasında ölçülmüş, arka plan gürültüsü çıkarılmış ve başlangıç değerine normalize edilmiştir (Şekil 2B). Toplam sferoid floresansı, önceden tanımlanmış bir ilgi alanı (ROI) içinde hesaplanmıştır. Bu ROI, kurum içi bir MATLAB betiği kullanılarak 18. saat görüntüsündeki tümör sferoidinin sınırlarının manuel olarak çizilmesiyle elde edilmiştir (18. saat panelindeki sarı çerçeve, Şekil 2A). Bu ROI içindeki toplam floresan yoğunluğu daha sonra her zaman noktası için hesaplanmış ve görüntünün başka bir yerinden seçilen ayrı bir ROI'den ölçülen ortalama arka plan floresansı çıkarılarak düzeltilmiştir. Elde edilen arka plan düzeltmeli floresan değerleri, ardından sferoidin başlangıç floresan yoğunluğuna normalize edilmiştir.
Şekil 2B'deki her renkli eğri, belirli bir deneysel koşul altındaki bireysel bir sferoidin normalize edilmiş GFP yoğunluğunu temsil etmektedir. Eğri, deneysel verilere ikinci derece polinom uydurma işlemi uygulanarak elde edilmiştir. Mor eğriler sadece kompresyona tabi tutulan sferoidleri (+comp, Şekil 2B), kırmızı eğriler NK hücreleri içeren sferoidleri (+NK, Şekil 2B) ve mavi eğriler hem kompresyona hem de NK hücrelerine maruz kalan sferoidleri (+comp+NK, Şekil 2B) temsil eder. Buna karşılık siyah eğri, kontrol olarak hizmet eden sadece sferoid koşulunda kültüre edilen yedi sferoidin verilerine uygulanan ikinci derece polinom uydurmadır (sp, Şekil 2B). Şekil 2B'de, netlik sağlamak adına deneysel veri noktaları değil, yalnızca polinom uydurulmuş veriler sunulmuştur. Özellikle, sadece sferoid (sp) ve sferoid + kompresyon (+comp) koşullarının GFP floresan yoğunluğu, zamanla genel bir artış eğilimi göstermiştir (Şekil 2B); bu durum, devam eden tümör büyümesi veya canlılığın korunması ile tutarlıdır. Buna karşılık, +NK ve +comp+NK koşulları, tümör hücresi ölümüne işaret eden progresif bir GFP floresan yoğunluğu azalması göstermiştir (Şekil 2B).
Kümülatif tümör hücresi kaybı, belirli bir koşul altındaki (+comp, +NK veya +comp+NK) her bir sferoidin uygun edilen normalize edilmiş GFP floresans yoğunluğunun, 18. saatteki kontrol koşulundan çıkarılmasıyla nicelleştirilmiştir (Şekil 2C). Sonuç olarak, her bir veri noktası, tek başına sferoid kontrolüne göre bireysel bir sferoidin normalize edilmiş GFP kaybını temsil etmektedir (Şekil 2C). Buna göre, +comp koşulu yalnızca sıkıştırmadan kaynaklanan GFP kaybını (mor, Şekil 2C), +NK koşulu yalnızca NK hücrelerinden kaynaklanan GFP kaybını (kırmızı, Şekil 2C) ve +comp+NK koşulu ise sıkıştırma ve NK hücrelerinin kombine etkilerinden kaynaklanan GFP kaybını (mavi, Şekil 2C) yansıtmaktadır. +comp koşulu en düşük GFP kaybı derecesini göstermiş olup (Şekil 2C), bu durum yalnızca sıkıştırmanın sferoid viabilitesi üzerinde minimal bir etkiye sahip olduğunu önermektedir. Buna karşılık, hem +NK hem de +comp+NK koşulları, +comp koşuluna göre anlamlı derecede daha yüksek GFP kaybı göstermiş (Şekil 2C), bu da NK hücrelerinin tümör hücresi ölümünün temel itici gücü olduğunu belirtmiştir. +comp+NK koşulu, +NK koşuluna göre daha yüksek ortalama GFP kaybı sergilese de, bu fark istatistiksel anlamlılığa ulaşmamıştır (Şekil 2C). Bu bulgular, sıkıştırmanın NK hücre aracılı tümör hücresi öldürülmesini engellemediğini göstermektedir. Topluca değerlendirildiğinde bu bulgular, mikroakışkan sıkıştırma cihazının, fizyolojik olarak ilgili bir 3D ortamda sıkıştırma ve NK hücrelerinin tümör sferoid viabilitesi üzerindeki bağımsız ve kombine etkilerini nicelleştirmek için başarıyla kullanılabileceğini kanıtlamaktadır.
Buna karşılık, (1) sferoidlerin piston sınırının dışında olması, (2) sferoidlerin piston sınırına çok yakın konumlanması ve (3) birden fazla sferoidin birbirine bir sferoid çapı kadar yakın olması durumlarında suboptimal sonuçlar ortaya çıkabilir (Şekil 3). Bu durumlarda, ilgili alanlar analiz dışı bırakılmalıdır.
Şekil 3Analiz dışı bırakılan sferoidlerin görüntü dizisine ait temsili örnek. 1,5 mg/mL kolajen içeren NK hücreli MCF-7 sferoidlerinin sıkıştırma öncesi (sol sütun) ve sıkıştırma sonrası (sağ iki sütun) zaman ayarlı parlak alan (BF), GFP floresan ve birleştirilmiş görüntüleri gösterilmektedir. Sıkıştırma öncesi görüntüler, basınç uygulamasından 20 dakika önce ve zaman ayarlı görüntülemenin başlangıcından 10 dakika önce alınmıştır. Görüntüler daha sonra 18 saat boyunca her 10 dakikada bir toplanmış olup, 0 saat sıkıştırma sonrası hemen alınan ilk görüntüye ve 18 saat deneyin sonuna karşılık gelmektedir. Mavi ok, PDMS pistonun (L2) kenarını göstermektedir. Sıkıştırma bölgesinde iki sferoid bulunması ve bunların piston sınırına çok yakın konumlanması nedeniyle bu görüntüleme alanı analiz dışı bırakılmıştır. Sonuç olarak, sıkıştırma sırasında sferoid deformasyonu ve GFP floresan yoğunluğu güvenilir şekilde nicelendirilememiştir. Ölçek çubuğu = 50 µm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
(1) Piston sınırının dışında yer alan sferoitler, basınç sadece piston bölgesi içinde uygulandığı için kompresyona maruz kalmazlar. Bu nedenle, söz konusu sferoitler hem komprese edilmiş hem de kontrol koşullarından hariç tutulmalıdır. (2) Piston sınırının üzerinde veya yakınında konumlanan sferoitler (Şekil 3, üstteki sferoit), sferoit düzensiz mekanik yüklemeye maruz kaldığından hariç tutulmalıdır. (3) Komşu sferoitlere bir sferoit çapı kadar yakın olan sferoitler hariç tutulmalıdır (Şekil 3). Sferoitlerin birbirine çok yakın olması, ilgi alanı (ROI) son zaman noktası kullanılarak tanımlandığı için GFP floresan yoğunluğunun nicelleştirilmesini zorlaştırır. Zamanla sferoit sınırları ayırt edilemez hale gelebilir ve bu da yalnızca tek bir sferoidi doğru şekilde kapsayan bir ROI belirlemeyi güçleştirir. Bu sorunlar, cihaz yüklemesi sırasında sferoitlerin kompresyon bölgesinin merkezinde olduğundan emin olunarak minimize edilebilir. Tekdüze kompresyon sağlamak ve güvenilir, tekrarlanabilir deneysel sonuçlar üretmek için sferoit dağılımına, konumlandırmaya ve cihaz kurulumuna dikkatle özen gösterilmesi esastır.
| Bileşenler | Konsantrasyon |
| α-MEM besiyeri | |
| Fetal bovine serum (FBS) (Fetal sığır serumu) | 10% |
| Penisilin/streptomisin | 1% |
Tablo 1: Tam MCF-7 besiyeri.
| Bileşenler | Konsantrasyon |
| $\alpha$-MEM besiyeri | |
| Miyo-inositol | 0,2 mM |
| 2-merkaptoetanol | 0,1 mM |
| Fetal bovin serum (FBS) | 12.50% |
| Folik asit | 0,02 mM |
| At serumu (HS) | 12.50% |
| Penisilin/streptomisin | 1% |
Tablo 2: NK tam besiyeri.
Ek Şekil 1: Basınç kontrol sisteminin şeması. Bir hava kompresörü, basınç kontrolöre sıkıştırılmış hava (20 psi'ye kadar) sağlar. Basınç kontrolör, kullanıcı tarafından tanımlanan ayarlara göre basınç rezervuarına iletilen hava basıncını düzenler. Kontrolör; 200 mbar maksimum çalışma basıncına, tam ölçeğin (FS) %0,05'i oranında basınç stabilitesine, %0,03 FS basınç çözünürlüğüne ve 9 ms tepki süresine sahiptir; bu özellikler doğru ve tekrarlanabilir basınç kontrolü sağlar. Kontrolör, evrensel seri veri yolu (USB) aracılığıyla bir bilgisayara bağlanarak kullanıcının beraberindeki yazılımı kullanarak uygulanan basıncın büyüklüğünü ve profilini programlamasına olanak tanır. Yazılım; sabit, sinüzoidal, üçgensel ve periyodik sıkıştırma dahil olmak üzere birden fazla sıkıştırma dalga formunu destekler. Bu şemada basınç 120 mbar'a ayarlanmıştır ve bu basınçtaki sıkıştırılmış hava, pnömatik tüp aracılığıyla basınçlandırılmış rezervuara iletilir. Basınçlandırılmış rezervuar 50 mL deiyonize (DI) su içerir ve pnömatik basıncı akışkan basıncına dönüştürme görevini görür. Basınçlandırıldıktan sonra rezervuar, akışkanı sıvı iletim borusu aracılığıyla mikroakışkan sıkıştırma cihazının basınç kontrol ünitesine (cihazla ilgili detaylar için Şekil 1'e bakınız) sürer; burada akışkan basıncı, tümör sferoidine sıkıştırma uygulamak için kullanılır. PDMS cihazında hava kabarcıklarının oluşmasını önlemek için sıvı basıncı kullanıldığını not edin. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Şekil 2: Mikroakışkan sıkıştırma cihazı için piston yer değiştirmesi (, µm) ile basınç kontrol odasına uygulanan basınç (KPa) arasındaki ilişkiyi gösteren kalibrasyon eğrisi. Deneysel ölçümler noktalarla, düz çizgi ise COMSOL simülasyonu ile temsil edilmektedir. Hata çubukları, sekiz bağımsız deneysel ölçümden elde edilen standart hata ortalamasını (SEM) göstermektedir ancak görünemeyecek kadar küçüktür. Bu şekil, Royal Society of Chemistry'den izin alınarak Suh ve ark.15 çalışmasından yeniden üretilmiştir. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Video 1: Sıkıştırma öncesi GFP etiketli bir MCF-7 sferoidinin X-Y z-yığını. Sferoid, mikroakışkan sıkıştırma cihazı içerisinde 1.5 mg/mL kolajene gömülmüş ve 1 µm z-adım boyutuyla GFP floresan kanalı kullanılarak görüntülenmiştir. Ardından, kontrastı artırmak için ImageJ kullanılmıştır. Ölçek çubuğu = 50 µm. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Video 2: Ardından, 1,5 mg/mL kolajen içine gömülmüş GFP etiketli MCF-7 sferoidine %50'lik bir basma gerinimi (Δh/h = 50%) uygulandı. Basma işlemini takiben, GFP floresans kanalında 1 µm adım boyutuyla bir X–Y z-yığını (z-stack) elde edildi ve kontrastı artırmak için ImageJ'de işlendi. Ölçek çubuğu = 50 µm. Lütfen bu dosyayı indirmek için buraya tıklayın.
Tartışma
Bu yöntem, kompresyon stresinin tümör-bağışıklık etkileşimleri üzerindeki etkilerini incelemek için bir mikroakışkan kompresyon cihazının kullanımını açıklamaktadır. Bu sistem, 3D kolajen matrise gömülmüş tümör sferoidlerine kontrollü mekanik kompresyon uygulayabilmektedir. Hücre odasının (L1) tabanını oluşturan cam substrat, yüksek çözünürlüklü canlı hücre görüntülemeye olanak tanıyarak platformu bağışıklık hücresi hareketliliğini, infiltrasyonunu ve sitotoksik aktivitesini nicelleştirmeyi amaçlayan çalışmalar için oldukça uygun hale getirir. Önemli bir nokta olarak sistem, mekanik ortamın hassas kontrolüne izin verirken hücre-hücre ve hücre-matriks etkileşimlerini korur. Buna karşılık, kompresyon stresini incelemek için mevcut birçok deneysel yaklaşım, ECM aracılı hücresel etkileşimler9,13 ile yüksek çözünürlüklü görüntüleme14 arasında bir ödünleşim gerektirmektedir.
Bu çalışmada, model sistem olarak NK hücreleri ve MCF-7 meme tümörü sferoidleri kullanılmıştır. Ancak, mikroakışkan sıkıştırma cihazı bu hücre tipleriyle sınırlı değildir. Bugüne kadar platform; MDA-MB-231 meme tümörü sferoidleri ve MCF-10A meme sferoidleri15,17 dahil olmak üzere birden fazla meme hücresi modeline başarıyla uygulanmıştır. Platform, beyin ve akciğer tümörü sferoidleri dahil olmak üzere çeşitli diğer tümör modellerindeki tümör-immün etkileşimlerini incelemek için kolayca uyarlanabilir. Benzer şekilde, platform NK hücrelerinin ötesinde geniş bir immün hücre popülasyonu yelpazesiyle uyumludur ve mekanik sıkıştırma altında çeşitli tümör-immün etkileşimlerinin araştırılmasına olanak tanır. Ayrıca, cihaz sferoid tabanlı çalışmalarla sınırlı değildir ve tek hücreli deneyler için uyarlanabilir. Tüm bu özellikler, platformu mekanik kuvvetlerin geniş bir biyolojik ve hastalık bağlamında hücresel davranışı nasıl düzenlediğini incelemek için çok yönlü bir araç haline getirmektedir.
Bu sistemin bir diğer avantajı, numunelere uygulanan kompresyonun büyüklüğü ve paterni üzerindeki hassas kontroldür. Mevcut çalışmada, deney süresi boyunca %50 oranında statik bir kompresyon gerinimi uygulanmıştır. Ancak, gerinim seviyesi deneysel amaca bağlı olarak kolayca değiştirilebilir. Ek olarak, harici basınç kontrol sistemi kullanılarak sferoidlere kare dalga ve sinüzoidal dalga formları dahil olmak üzere çeşitli dalga formlarında dinamik kompresyon uygulanabilir. Kare dalga kompresyonu, dönüşümlü kompresyon ve serbest bırakma aralıklarını içerirken17, sinüzoidal kompresyon zaman içinde kompresyondaki kademeli artış ve azalışları içerir15. Bu yetenekler, kantitatif görüntüleme ve öngörücü modelleme ile birleştirildiğinde, dinamik kompresyonun immün öldürme etkinliği üzerindeki etkisini incelemek için kullanılabilir.
Bu sıkıştırma cihazının başlangıçta tümör mekanik özelliklerini karakterize etmek için geliştirildiğini belirtmek isteriz17. Bir in situ kuvvet sensörü ve tümör sferoidinin altına yerleştirilen bir poliakrilamid (PAA) jel tabakası eklenerek, sferoidin sertlik ve viskoelastisite gibi mekanik özellikleri nicel olarak karakterize edilebilir15,17. Bu modifikasyon, platformun kullanım alanını basınç stresini modellemenin ötesine taşıyarak tümör mekanik davranışının doğrudan ölçümünü de kapsayacak şekilde genişletmektedir.
Genel olarak, mikroakışkan sıkıştırma cihazı, sferoidlerin mekanik özelliklerinin ölçümünden, mekanik olarak modüle edilen bir ortamda tümör-immün etkileşimlerinin incelenmesine kadar geniş bir uygulama alanına sahiptir. Bununla birlikte, cihazın başarılı bir şekilde çalıştırılması için birkaç kritik adım gereklidir. Uniform sıkıştırma sağlamak için tümör sferoidleri her kuyucuğun merkezine yakın konumlandırılmalıdır. Basıncın doğru iletilmesini sağlamak için basınç kontrol ünitesi, hücre odası katmanı (L1) ile düzgün bir şekilde hizalanmalıdır. Basınç kontrol ünitesi L1'in üzerine yerleştirildiğinde hava kabarcıkları oluşabilir ve bu durum görüntüleme kalitesini ve deneysel sonuçları olumsuz etkileyebilir. Bu sorunu önlemek için, kolajen karışımı yüklenirken kabarcık oluşmamasına dikkat edilmeli ve basınç kontrol ünitesi yerleştirilmeden önce odayı hafifçe doldurmak için her kuyucuğa 8 µL kolajen karışımı eklenmelidir. Bu işlem, katmanlar arasında tam temas sağlanmasına yardımcı olur ve hapsolmuş hava olasılığını azaltır.
Sonuç olarak bu cihaz, tümör-immün etkileşimlerini destekleyen, fizyolojik olarak ilgili 3 boyutlu bir kolajen matris içinde bası stresinin kontrollü modellenmesini sağlamaktadır. Bu platform, statik ve dinamik mekanik kuvvetlerin, tümör mikroçevresindeki immün aracılı öldürmeyi ve tümör davranışını nasıl düzenlediğini araştırmak için bir araç sunmaktadır. Mevcut durumda, tümör hücrelerinin immün öldürmesinin mekanik modülasyonunun altında yatan moleküler mekanizmayı belirlemekteyiz. Bu çalışmalar, potansiyel yeni terapötik ilaç hedeflerine yol açabilir.
Açıklamalar
Yazarların beyan edecek bir çıkar çatışması yoktur.
Teşekkürler
Bu çalışma, Ulusal Kanser Enstitüsü'nden (Hibe R01CA221346), Cornell Üniversitesi Mühendislik Fakültesi'nin FM'ye sağladığı Lance R. Collins Bursu'ndan ve Cornell Rektörlüğü Araştırma Dayanıklılığı Fonu'nun FM'ye sağladığı destekten yararlanmıştır. Bu çalışma kısmen, Ulusal Bilim Vakfı (Hibe NNCI-2025233) tarafından desteklenen Ulusal Nanoteknoloji Koordineli Altyapı'nın (NNCI) bir üyesi olan Cornell NanoScale Tesislerinde gerçekleştirilmiştir.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| 1 N NaOH | Sigma-Aldrich | 79724 | 7 µL |
| 10× M199 besiyeri | Sigma-Aldrich | M0650 | 200 µL |
| 2-merkaptoetanol | ThermoFisher | 313500100 | |
| Hava kompresörü | Elveflow | Jun-Air Model 3 Compressor | |
| Otomatik X-Y mikroskop tablası | Applied Scientific Instrumentation | MS-2000 | |
| CCD kamera | Hamamtsu Photonics | ORCA-R2 | |
| Fetal sığır serumu (FBS) | GeminiBio | S11150 | |
| Sıvı iletim hortumu | Eleveflow | PTFE tubing spare roll | 1/16 in dış çap |
| Floresan ışık kaynağı | Excelitas Technologies | X-Cite series 120 PC unit | |
| Folik Asit | Sigma | F7876 | |
| Glutaraldehit | EM Sciences | 16019 | 0.10% |
| Harrick Plazma Temizleyici | Harrick Plasma | PDC-001-HP | Yüksek güç ayarı (45W) |
| At Serumu (HS) | ThermoFisher | 16050-122 | |
| Ters epi-floresan mikroskop | Olympus | IX81 | 20x objektif lens (NA = 0.25), Olympus CellSens yazılımı kullanılarak çalıştırılmıştır |
| Maske | Artus | 10 Sheet Aluminum Shim Stock | Kalınlık 0.0125" (0.75 mm) |
| MCF-7/GFP (Puromisin) stabil hücre hattı | GenTarget Inc | SC050-G | |
| Metal Çerçeve | Özel yapım | Özel yapım | |
| Mikroakışkan rezervuar | Eleveflow | 50 mL microfluidic reservoir | |
| Mikroskop | Olympus | CKX41 | 4x objektif lens (NA = 0.1) |
| Miyo-inositol | Sigma | I7508 | |
| NK-92 MI | ATCC | CRL-2407 | |
| Penisilin/streptomisin | Gibco | 15140122 | |
| Fosfat tamponlu salin (PBS) | ThermoFisher | 10010072 | |
| Pnömatik hortum | Eleveflow | PUR polyether clear pipe input | 4" mm dış çap |
| Polietilenimin (PEI) | Sigma-Aldrich | P3143 | 1% |
| Basınç kontrolörü | Elveflow | OB1 NK4 | Elveflow Smart Interface yazılımı kullanılarak çalıştırılmıştır |
| Sıçan kuyruğu tip I kolajen | Corning | 35429 | 9.6 mg/mL stok kolajenden 31.3 µL |
| Vidalar | Phillips | M2.5 Pan-head | 12 vida |
| Tabla inkübatörü | Precision Plastic | Özel yapım | |
| Şırınga | Becton Dickinson | 303134 | Eleveflow'dan 3/32" OD Barb içeren Erkek Luer İntegral kilit ile eşleştirilmiştir |
| α-MEM besiyeri | ThermoFisher | 12561056 |
Kaynaklar
- Cao J-Z, Zhao W, Xia X-J. Cell-based cancer immunotherapy: milestones, mechanistic insights, and emerging therapeutic directions. Acta Pharmacol Sin. 2026:https://doi.org/10.1038/s41401-026-01811-y.
- Yang R, Yang Y, Liu R, et al. Advances in CAR-NK cell therapy for hematological malignancies. Front Immunol. 2024;15:1414264.
- Neelapu SS, et al. Axicabtagene ciloleucel CAR T-cell therapy in refractory large B-cell lymphoma. N Engl J Med. 2017;377(26):2531-44.
- Sheykhhasan M, Manoochehri H, Dama P. Use of CAR T-cell for acute lymphoblastic leukemia (ALL) treatment: a review study. Cancer Gene Ther. 2022;29(8-9):1080-96.
- Tan S, Li D, Zhu X. Cancer immunotherapy: Pros, cons and beyond. Biomed Pharmacother. 2020;124:109821.
- Chen T, Wang M, Chen Y, Liu Y. Current challenges and therapeutic advances of CAR-T cell therapy for solid tumors. Cancer Cell Int. 2024;24(1):133.
- Peng L, et al. CAR-T and CAR-NK as cellular cancer immunotherapy for solid tumors. Cell Mol Immunol. 2024;21(10):1089-108.
- Basu R, et al. Cytotoxic T cells use mechanical force to potentiate target cell killing. Cell. 2016;165(1):100-10.
- Dolega ME, et al. Cell-like pressure sensors reveal increase of mechanical stress towards the core of multicellular spheroids under compression. Nat Commun. 2017;8(1):14056.
- Linke JA, Munn LL, Jain RK. Compressive stresses in cancer: characterization and implications for tumour progression and treatment. Nat Rev Cancer. 2024;24(11):768-91.
- Luo M, Cai G, Ho KKY, et al. Compression enhances invasive phenotype and matrix degradation of breast cancer cells via Piezo1 activation. BMC Mol Cell Biol. 2022;23(1):1.
- Ren T, Sun L, Zheng Y, et al. Mechanical forces and immune cells in the tumor microenvironment: from regulation mechanisms to therapeutic strategies. Int J Surg. 2025;111(8):5420-34.
- Helmlinger G, Netti PA, Lichtenbeld HC, Melder RJ, Jain RK. Solid stress inhibits the growth of multicellular tumor spheroids. Nat Biotechnol. 1997;15(8):778-83.
- Pandey M, et al. Mechanical compression regulates tumor spheroid invasion into a 3D collagen matrix. Phys Biol. 2024;21(3):036003.
- Suh YJ, et al. A microfluidic rheometer for tumor mechanics and invasion studies. Lab Chip. 2025;25(22):6018-32.
- Song W, et al. Dynamic self-organization of microwell-aggregated cellular mixtures. Soft Matter. 2016;12(26):5739-46.
- Pandey M, et al. Viscoelastic properties of tumor spheroids revealed by a microfluidic compression device and a modified power law model. Soft Matter. 2026;22(7):1618-29.
- Steff A-M, Fortin M, Arguin C, Hugo P. Detection of a decrease in green fluorescent protein fluorescence for the monitoring of cell death: An assay amenable to high-throughput screening technologies. Cytometry. 2001;45(4):237-43.
Yeniden basım ve izinler
