Yöntem makalesi

Tümleşik Mouse Embriyolarında Gelişimsel Protein ve Transkript Ekspresyonunun İncelenmesi için Optimize Edilmiş Yöntemler

34 görüntülenme

⸱

11 Eylül 2026

 ,  ,  ,  , 
1Department of Physiology, Anatomy and Genetics, University of Oxford, 2Cellular Imaging Core Facility, Centre for Human Genetics, Nuffield Department of Medicine, University of Oxford

Bu makalede

Özet

Fare modelleri, embriyonik gelişimle ilgili anlayışımızı geliştirmede temel bir rol oynamaktadır. Burada, tamamen fikse edilmiş fare embriyolarında proteinlerin ve transkriptlerin boyanması için bir protokol ve sonuçta ortaya çıkan boyamanın üç boyutlu olarak nasıl nicel analiz edileceği anlatılmaktadır. Bu teknikler, temel gelişimsel hücre tiplerinin ve süreçlerinin görselleştirilmesine ve analiz edilmesine olanak tanır.

Özet

Fare modelleri, embriyonik gelişime dair anlayışımızı ilerletmede çok önemli bir rol oynamıştır. Embriyolardaki proteinlerin ve transkriptlerin ekspresyonunun ve lokalizasyonunun analizi, gelişimin ve hastalıkların altında yatan hücresel ve moleküler mekanizmaların aydınlatılması açısından kritik öneme sahiptir. Ancak, fare embriyolarındaki transkript ve proteinleri analiz etmek için kullanılan geleneksel teknikler sınırlıdır. RNA in situ hibridizasyon, transkriptlerin bütün mount boyanmasına olanak tanır ancak multipleksleme yeteneğinden yoksundur. Buna karşılık, embriyoların kesitlenmesi multipleks hedef boyamaya imkan verir, fakat bu yalnızca iki boyutludur (2D). Daha yakın zamanda, RNAscope ve immünofloresan boyama gibi teknikler bütün mount embriyolara uygulanarak hedeflerin üç boyutlu (3D) olarak multiplekslenmesi sağlanmıştır. Bu yöntemler, geleneksel tekniklerin kısıtlamaları olmadan embriyonik gelişim için gerekli olan temel etkileşimlerin, yolakların ve hücre tiplerinin haritalanmasına imkan tanımaktadır.

Burada, RNAscope veya immünofloresan kullanılarak fikse edilmiş embriyonik gün (E) 8.5 ve E9.5 fare embriyolarının tüm vücut (whole-mount) boyanması için optimize edilmiş yöntemleri tanımlıyoruz. Her iki yöntem de tek bir embriyoda aynı anda 4 hedefe kadar çoklu saptamaya olanak tanır. Ayrıca, gelişim sırasındaki proteinler ve transkriptler arasındaki etkileşimi görselleştirmek için aynı embriyoda immünofloresan boyamanın RNAscope ile birleştirilmesi için bir yöntem sunuyoruz. Dahası, Zeiss Arivis Pro yazılımını kullanarak hedef ekspresyonunun tüm embriyo boyunca ve tanımlanmış gelişimsel hücre tipleri içinde konfokal görüntüleme ve 3D analizine yönelik bir işlem hattı tanımlıyoruz. Bu yöntemler birlikte, çoklu protein ve transkript hedeflerinin 3D ortamda kapsamlı analizini sağlayarak, erken ila orta embriyogenezdeki hücresel ve moleküler etkileşimlerin çözümlenmesi için güçlü bir sistem sunar.

Giriş

Fare modelleri, fare ve insan gelişimi arasındaki homoloji ve Cre-LoxP veya CRISPR/Cas91,2 gibi temel tekniklerin kullanımıyla gen ifadesini modüle edebilme yeteneği sayesinde, insanla ilişkili gelişimsel süreçlerin in vivo olarak anlaşılmasını sağlayarak gelişimsel biyolojideki ilerlemelerde etkili rol oynamıştır. Genomik bölgelerin yaklaşık %90'ı fareler ve insanlar arasında korunmuştur3 ve fareler ile insanlar birçok gelişimsel süreci paylaşır. Örneğin, hem fareler hem de insanlar; zigot oluşumuyla başlayıp blastokiste ilerleyen, ardından implantasyon ve gastrülasyonla devam eden benzer bir embriyogenez zaman çizelgesini izlerler4. Ayrıca, çoğu organın gelişimi fareler ve insanlar arasında benzerdir. Örneğin, hem insan hem de fare kalbi; dört odacıklı bir kalp oluşturmak için benzer bir kardiyak döngülenme, atriyumların ve ventriküllerin septasyonu, kapakçık oluşumu ve çıkış yolu oluşumu sırasını takip eder5. Bu nedenle, hem gelişmekte olan hem de tam gelişmiş fare ve insan kalpleri önemli yapısal benzerlikler gösterir6,7.

Normal ve patolojik gelişimde meydana gelen süreçleri incelemek amacıyla, temel proteinlerin ve transkriptlerin mekansal olarak görüntülenmesine olanak tanıyan çok sayıda teknik geliştirilmiştir. Bu teknikler arasında immünofloresan boyama ve RNA in situ hibridizasyon yer almaktadır.

RNA in situ hibridizasyon ilk kez Gall ve Pardue tarafından tanımlanmıştır8 ve 1969 yılında John, Brinstall ve Jones tarafından9ve Buongiorno-Nardelli ile Amaldi10 1970 yılında geliştirilmiştir. Dokulardaki transkript ekspresyonunu incelemek için kullanılır.8Kısaca, istenen hedefle tamamlayıcı RNA dizisine sahip problar seçilir ve saptama için işaretleyicilerle etiketlenir. Bu etiketler arasında radyoaktif etiketler, biyotin veya digoksinigen bulunur. Sabitlenmiş örnekler, probun nüfuz etmesini sağlamak için geçirgen hale getirilir ve ardından prob dokuya hibridize edilir. Daha sonra dokular, eğer radyoaktif olarak etiketlenmişse doğrudan görüntülenir veya alkalin fosfataz ya da floresan bir boyaya konjuge edilmiş antikorlar kullanılarak etiketler görselleştirilir. RNA in situ hibridizasyon, 3D lokalizasyon için bütün monte edilmiş (whole-mount) örneklerin boyanabilmesi avantajına sahiptir11Ancak, çok spesifik uygulamalara yönelik optimize edilmiş teknikler veya kromozomların floresan işaretlemesi için kullanılan M-FISH gibi DNA hibridizasyon yöntemleri kullanılmadığı sürece, genellikle 2 hedeften fazla hedefleme yapabilen çoklama kapasitesinin eksikliği nedeniyle sınırlıdır.12,13.

İlk olarak 1941 yılında Coons ve arkadaşları tarafından geliştirilen14,15 immunofloresan, fikse edilmiş veya dondurulmuş örneklerde hedef protein tespit yöntemidir. Kısaca, dokunun hedef dışı bölgelerine olan spesifik olmayan bağlanmayı azaltmak için örnekler bloklanır. Ardından, hedef bir antigene özgü bir primer antikor ile örnekler inkübe edilir. Primer antikorlar doğrudan bir floresan boyaya veya proteine konjuge edilebilir ya da primer antikoru üreten türe yönelik, floresan konjuge bir sekonder antikor kullanılarak hedeflenebilirler. Sekonder antikorların, doğrudan konjuge edilmiş primer antikorlara göre avantajı, sinyalin amplifiye edilmesiyle daha yüksek hassasiyet sağlanmasıdır. Farklı eksitasyon ve emisyon spektrumlu floroforlara konjuge edilmiş sekonder veya doğrudan konjuge antikorlar kullanılarak, farklı türlerde üretilmiş çoklu primer antikorlarla hedef tespitinde multipleksleme yapılabilir.

RNA gibi geleneksel teknikler in situ hibridizasyon ve immünofloresans sınırlıdır. Tipik olarak, RNA in situ hibritizasyon, bir örnekte yalnızca tek bir hedefin saptanmasına izin verir; bu nedenle farklı hücre tipleri ve yolaklar arasındaki etkileşimler son derece sınırlıdır. Ayrıca, immünofloresan geleneksel olarak bütün montaj yerine doku kesitlerinde uygulandığından, uzaysal çözünürlük 2D ile sınırlı kalmaktadır. Daha yakın tarihli teknikler, 3D sistemlerde hedef saptamanın çoklanmasına odaklanmıştır. İmmünofloresan protokollerinin optimizasyonu, tekniğin bütün montajda kullanılmasına olanak sağlamıştır.16Ayrıca, immunofloresansa benzer bir şekilde, floresan işaretli problar kullanılarak transkript tespitinin çoklanan şekilde (multiplex) gerçekleştirilmesini sağlayan teknikler geliştirilmiştir.

RNAscope ilk olarak 2012 yılında Wang ve ark. tarafından tanımlanmıştır. Bu yöntem, fikse edilmiş örneklerde transkriptlerin mekansal olarak tanımlanmasına olanak tanıyan RNA in situ hibridizasyon teknolojisine17 dayanmaktadır. Kısaca, fikse edilmiş örnekler permeabilize edilerek, tamamlayıcı transkript dizilerine bağlanan hedef probların içeri sızması sağlanır. RNAscope probları; hedef RNA'nın 18–25 baz çiftlik bir bölgesine özgü bir bölge, 14 baz çifti içeren bir kuyruk bölgesi ve iki "Z probunu" birbirine bağlayan bir ara bölgeden oluşan "çift Z tasarımına" sahiptir. İki kuyruk bölgesi birlikte, bir ön-amplifikatör tarafından bağlanan 28bp'lik bir bölge oluşturur. Bağlanan Z prob çiftleri daha sonra, ön-amplifikatör üzerindeki bölgelere bağlanan bir dizi amplifikatörün bağlanması yoluyla amplifiye edilir. Amplifikatörler, floresan işaretleyiciler veya yaban turbası peroksidaz (HRP) ile etiketlenmiş problar kullanılarak spesifik olarak hedeflenebilir. Probların çift Z tasarımının amacı, bağlanmamış probların amplifikasyonunu önleyerek spesifik olmayan amplifikasyonu azaltmaktır; çoklu amplifikatör kullanımı ise hassasiyeti artırmak içindir. RNAscope'un RNA in situ hibridizasyona göre avantajı, her hedef için farklı floresan işaretleyiciler kullanarak tek bir örnekte çoklu transkript tespitine (multiplexing) imkan tanımasıdır. RNAscope, örneklerin formalinde fikse edilmiş parafin gömülü kesitlerinde yaygın olarak kullanılmış ve 2D'de mekansal transkript tespitine olanak sağlamıştır18. Daha güncel çalışmalar, fare embriyolarında bütün montaj (whole-mount) RNAscope boyamasını tanımlayarak temel gelişimsel süreçlerin 3D analizine imkan tanımıştır19.

Burada, hem RNAscope in situ hibridizasyon hem de immunofloresan yöntemleri kullanılarak fikse edilmiş E8.5 ve E9.5 fare embriyolarının bütun boyama (whole-mount) yöntemiyle boyanmasına yönelik optimize edilmiş yöntemleri açıklıyoruz. Bu protokol, E8.5/E9.5 bütun boyama embriyoları için başarılı olan, immunofloresan ve RNAscope'u birleştiren revize edilmiş bir yöntemi tanımlamakta; Opal 780 floroforu ile kombine edilmiş dördüncü bir RNAscope probu kullanılarak bütun boyama RNAscope boyamasının bir kanal daha eklenmesine olanak sağlamakta ve boyanan embriyoların analizi için yaygın olarak uygulanabilir bir yöntemi detaylandırmaktadır. Bu yöntemler, immunofloresan boyama ve RNAscope aracılığıyla 4 proteine ve transkript hedefine kadar çoklu görselleştirmeye ve gelişim sırasındaki bütun boyama E8.5/E9.5 fare embriyolarında kantitatif 3D analize imkan tanıyarak, hücre göçü ve sinyal yolları gibi temel gelişimsel süreçlere dair bilgilerin daha fazla ilerletilmesi için kullanılabilir.

Protokol

Tüm hayvan deneyleri, Birleşik Krallık Hayvanlar (Bilimsel Prosedürler) Yasası 1986'ya uygun olarak gerçekleştirilmiş ve Oxford Üniversitesi hayvan refahı inceleme kurulu ile İçişleri Bakanlığı (Proje lisansı PP7967396) tarafından onaylanmıştır.

1. E8.5 ve E9.5 fare embriyolarının diseksiyonu, dehidrasyonu ve saklanması

  1. Gebelik döneminin E8.5 veya E9.5 günündeki gebe dişileri onaylanmış bir yöntemle itlaf edin.
    NOT: Bu çalışmadaki fareler, kan kaybı ile ölümün doğrulanmasını takiben servikal dislokasyon yöntemiyle itlaf edilmiştir. Kan kaybı, ventriküllere insizyon yapılarak kanamanın kolaylaştırılmasıyla gerçekleştirilir. CO2 inhalasyonu gibi diğer yöntemler de kullanılabilir, ancak bu protokolde test edilmemiştir.
  2. Önce deriye, ardından abdominal duvara kesi yaparak karnı açın.
    NOT: Kepek ve bakteriyel kontaminasyonu azaltmak için fareleri %70 etanol ile silin. Abdominal duvarı açarken, duvarı karnın üzerinden çekip ardından küçük bir insizyon yapmak önemlidir. Rahmi yanlışlıkla kesmemeye dikkat ederek abdominal duvarı V şeklinde kesin.
  3. Rahmin vajina ile birleştiği noktadan keserek rahmi çıkarın. Her iki uterin boynuz için, yumurtalıklara ulaşana kadar küçük eksizyonlar yaparak rahmi abdominal yağdan ayırın.
    NOT: Her bir embriyonun rahim içindeki konumunu not etmek faydalıdır. Yönlendirmeyi korumaya yardımcı olmak için yumurtalığı rahimle birlikte diseke edin.
  4. Tek bir embriyoyu, çevresindeki rahim dokusuyla birlikte uterin boynuzdan tek tek kesin ve 5mM EDTA içeren 1× Hanks’ Basic Salt Solution içeren bir kaba yerleştirin.
  5. İnce pensler kullanarak, rahmi embriyodan, plasentadan ve ikisini çevreleyen decidua'dan nazikçe soyun.
  6. Plasentanın, embriyoyu çevreleyen maternal decidua'nın birleştiği yeri belirleyin; bu iki bölüm arasında hafif bir renk farkı olmalıdır. Plasentayı ayırmak ve embriyoyu ortaya çıkarmak için maternal decidua'yı keserek embriyoyu dikkatlice ayırın.
  7. Vitellüs kesesi içindeki embriyoyu geri kalan dokulardan nazikçe ayırın. İnce pensler kullanarak embriyoyu çevreleyen vitellüs kesesini çıkarın. Amniyonu çıkarın. Tam embriyonik evreyi belirlemek için somitleri sayın.
    NOT: Vitellüs kesesi embriyoyu çevreler, daha kalın ve daha opaktır. Amniyon ise ince, şeffaf ve embriyoya sıkıca yapışmış durumdadır. Sonraki aşamalardaki prob/antikor penetrasyonunu sağlamak için bunun dikkatlice çıkarılması gerekir. Daha yaşlı embriyolar için, probun gelişmekte olan beyin ventriküllerinde hapsolmasını önlemek için ince penslerle baş kısmına bir delik açılabilir. Bu noktada vitellüs kesesinin mümkün olduğunca fazla çıkarılması önemlidir. Kalan vitellüs kesesi, anti-mouse sekonder antikorlar kullanıldığında güçlü şekilde floresan verir.
  8. Opsiyonel: Kontamine kanı temizlemek için, sonraki genotipleme yöntemine bağlı olarak 500 µL PBS veya %70 etanol ile yıkayarak vitellüs kesesini genotipleme için 1,5 mL Eppendorf tüpünde saklayın. Vitellüs kesesini ince penslerle PBS içinde tutun ve manuel olarak çalkalayın. Yıkanmış vitellüs kesesini temiz bir 1,5 mL Eppendorf tüpüne veya genotipleme plakasına yerleştirin. -20 °C'de 4 haftaya kadar saklayın veya tercih edilen DNA ekstraksiyon tekniğine geçin.
  9. 2 mL düşük yoğunluklu polietilen (LDPE) Pasteur pipeti kullanarak embriyoyu nazikçe pipetleyin ve PFA'ya minimum diseksiyon medyumu eklemeye dikkat ederek, 1 mL taze hazırlanmış veya dondurulmuş stok %4 paraformaldehit (PFA) içeren 2 mL yuvarlak tabanlı Eppendorf tüpüne taşıyın.
    NOT: E9.5 embriyoları diseke ederken, açıklığın boyutunu artırmak için Pasteur pipetinin ucunu açılı kesin. Bu, pipetleme sırasında embriyonun zarar görmesini önlemek için önemlidir. Embriyonun tüpün dibine sıkışmasını önlemek ve daha kolay geri kazanım sağlamak için yuvarlak tabanlı 2 mL Eppendorf tüplerinin kullanımı önemlidir. PFA'nın tekrarlanan dondurma-çözme döngülerinden kaçının.
    UYARI: PFA toksik ve kanserojendir. Uygun kişisel koruyucu donanım (KKD) kullanın; solumayın veya yutmayın. Toz PFA solunduğunda tehlikelidir; bu nedenle çeker ocak altında hazırlanmalıdır.
  10. Embriyoyu %4 PFA içinde, tüpler sallama yönüne dik olacak şekilde, hafif sallama ile 4 °C'de 16–24 sa boyunca inkübe edin.
  11. Metanol serisi yıkamalar kullanarak embriyoyu dehydre edin. LDPE Pasteur pipetleri kullanarak ve embriyoyu pipetle çekmemeye dikkat ederek PFA'yı alın ve 1 mL PBS ekleyin. Tüpler sallama düzlemine 90° olacak şekilde, hafif sallama ile oda sıcaklığında (RT) 10 dakika boyunca yıkayın. PBS içindeki %25, %50, %75 ve 2× %100 metanol yıkamaları için işlemi tekrarlayın.
  12. Son %100 metanol yıkamasını 1,5 mL taze %100 metanol ile değiştirin ve -20 °C'de saklayın.
    NOT: Numuneler -20 °C'de yıllarca saklanabilir. Buharlaşmayı önlemeye dikkat edin.
    UYARI: Metanol yanıcı ve toksiktir. Uygun KKD giyin ve yanıcılar dolabında saklayın. Solumayın veya yutmayın.

2. İmmünofloresan yöntemle E8.5 ve E9.5 embriyolarının bütün monte protein boyaması

NOT: Tüm yıkama adımları, 2 mL'lik yuvarlak tabanlı Eppendorf tüpünde 1 mL hacminde gerçekleştirilir. 1 mL'lik yıkama adımlarını, tüpler sallama düzlemine 90° açıda olacak şekilde nazikçe sallayarak uygulayın. Embriyoyu pipetle çekmemeye dikkat ederek, sıvıyı 2 mL'lik bir LDPE Pasteur pipetiyle çıkarın ve yenisini ekleyin. E9.5 embriyoları kullanılırken, istem dışı pipetleme durumunda embriyonun zarar görmesini önlemek için Pasteur pipetinin ucunu kesin. Metanolü PBS ile seyreltin. Embriyolar tek tek veya 12 adede kadar havuzlanmış embriyonun bulunduğu bir tüp içinde boyanabilir. E9.5 embriyoları için: tek bir tüpte 2 farklı koşula kadar boyama yapılabilir. Birden fazla koşul kullanılıyorsa, görüntüleme sırasında ayırt edilebilmeleri için gruplardan birinin kuyruğunu kesin.

  1. Embriyoları -20 °C'deki saklama alanından çıkarın ve 20–26 °C'de oda sıcaklığına (RT) gelmeleri için 10–20 dk bekletin. Benzer gelişim evrelerinin karşılaştırılabilmesini sağlamak için embriyoların somit sayılarının benzer olduğundan emin olun.
  2. Embriyoları 4:1:1 oranında %100 metanol: Dimetil sülfoksit (DMSO): %30 hidrojen peroksit çözeltisi içinde 2 saat boyunca ağartın ve permeabilize edin.
    UYARI: Hidrojen peroksit korozif ve irite edicidir. Ciddi göz hasarına yol açabilir ve yutulduğunda zararlı olabilir. Hidrojen peroksit göze kaçarsa, birkaç dakika boyunca suyla durulayın. Hidrojen peroksit sucul yaşam için tehlikelidir; onaylanmış bir atık bertaraf tesisinde imha edin. Göz koruması dahil uygun KKD kullanın. Yutmayın.
  3. Isıtma bloğunu 98 °C'ye önceden ısıtın, 100 µL sitrat maske açma tamponunu 10,7 mL distile su ile seyrelterek sitrat maske açma tamponunu hazırlayın.
  4. Örnekleri önce %70 metanol ile durulayarak, ardından %50 metanol, %25 metanol ve son olarak PBS ile oda sıcaklığında (RT) sallayarak her biri 10 dk boyunca yıkayarak rehidrate edin.
  5. Önceden ısıtılmış ısıtma bloğunu kullanarak sitrat maske açma tamponunu en az 20 dakika boyunca 98 °C'ye kadar ısıtın. Embriyoları sitrat maske açma tamponu ile oda sıcaklığında (RT) 3 x 10 dk yıkayın.
  6. Oda sıcaklığındaki yıkamalardan sonra, embriyolara önceden ısıtılmış sitrat maske açma tamponu ekleyin ve ısıtma bloğunda 98 °C'de 10 dk ısıtın. Isıdan uzaklaştırın ve en az 40 dk soğumaya bırakın.
    NOT: E8.5 embriyolarda antijen geri kazanımı için sitrat maske açma tamponu kullanmayın, çünkü bu durum embriyo disosyasyonuna yol açabilir. Embriyolar sitrat maske açma tamponu içindeyken yapışkan hale gelebilir, bu nedenle kümelenme nedeniyle embriyo hasarını önlemek için yıkama sırasında örnekleri hareketsiz tutun.
  7. Embriyoları PBS + %0,1 Triton-X içinde oda sıcaklığında (RT) sallayarak 3 × 10 dk yıkayın. Embriyoları minimum 150 µL/tüp PBS + %0,1 Triton-X + %10 normal eşek serumu içinde 4 °C'de sallayarak 16–24 saat bloke edin.
  8. Primer antikorları, embriyolara uygulamadan 1 saat önce önerilen konsantrasyonlarda PBS + %0,1 Triton-X + %10 normal eşek serumu içinde seyrelterek hazırlayın ve 4 °C'de saklayın.
  9. Bloklama çözeltisini embriyolardan uzaklaştırın ve minimum 150 µL/tüp seyreltilmiş antikor çözeltisi ekleyin. 4 °C'de sallayarak 1–3 gün inkübe edin.
    NOT: Her bir antikor farklı bir türde üretilmiş olduğu sürece primer antikorlar çoklanabilir (multiplexing). Farelerde üretilen antikorların ve ardından kullanılan anti-fare sekonder antikorların kullanımı, parlak spesifik olmayan boyanmalara yol açabilir. Alternatif olarak, bazı durumlarda, primer antikorların farklı izotiplere sahip olduğu ve izotip-spesifik sekonder antikorlarla kombine edildiği durumlarda, tek bir türe ait primer antikorlar çoklanabilir.
  10. Embriyoları PBS + %0,1 Triton-X ile durulayın, embriyoları oda sıcaklığında (RT) PBS + %0,1 Triton-X içinde 6 × 30 dk yıkayın.
  11. Uygun floresan konjuge sekonder antikorları ve DAPI'yi (veya alternatif çekirdek belirteci) önerilen konsantrasyonlarda %0,1 Triton-X + %10 normal eşek serumu içinde seyrelterek, embriyolara uygulamadan 1 saat önce 4 °C'de karanlıkta sekonder antikoru bloke edin.
  12. Yıkama çözeltisini uzaklaştırın, seyreltilmiş sekonder antikor çözeltisini embriyolara ekleyin ve karanlıkta 4 °C'de sallayarak 16–24 saat inkübe edin.
    NOT: Tüm antikorlar yerine floresan konjuge F(ab) fragman sekonder antikorların kullanılmasını öneririz. F(ab) fragmanları daha küçüktür, bu nedenle daha iyi doku penetrasyonuna sahiptirler ve Fc bölgesinin yokluğu spesifik olmayan arka plan boyanmasını azaltmaya yardımcı olur.
  13. Embriyoları PBS + %0,1 Triton-X ile durulayın, ardından embriyoları oda sıcaklığında (RT) karanlıkta sallayarak PBS + %0,1 Triton-X içinde 6 × 30 dk yıkayın. 4 °C'de karanlıkta PBS + %0,1 Triton-X içinde 4 haftaya kadar saklayın.

3. RNAscope kullanarak E8.5 ve E9.5 embriyolarının tüm vücut transkript boyaması

NOT: Tüm yıkama basamakları, 2 mL'lik bir Eppendorf tüpünde 1 mL hacimde gerçekleştirilir. 1 mL'lik yıkama basamaklarını, tüpler sallama düzlemine 90° açıda olacak şekilde hafifçe sallayarak uygulayın. Sıvıyı, embriyoyu pipetle çekmemeye dikkat ederek 2 mL'lik bir LDPE Pasteur pipeti ile çıkarın ve yenisini ekleyin. E9.5 embriyoları kullanılırken, istem dışı pipetleme durumunda embriyonun zarar görmesini önlemek için Pasteur pipetinin ucunu kesin. Metanol, PBS ile seyreltilmelidir. Hibritleme fırınını, başlamadan önce tabanına nemli bir mendil yerleştirerek 40 °C'de çalıştırın. Embriyolar tek tek veya 12 adede kadar embriyonun bir arada bulunduğu bir tüpte boyanabilir. E9.5 embriyoları için: tek bir tüpte 2 koşula kadar boyama yapılabilir. Birden fazla koşul kullanılıyorsa, görüntüleme sırasında ayırt edilebilmeleri için gruplardan birinin kuyruğunu kesin.

  1. Tezgahı, pipetleri ve rafı %70'lik etanol ve ardından bir RNaz dekontaminasyon solüsyonu ile temizleyerek hazırlayın.
  2. Embriyoları; %75, %50, %25 metanol (PBS ile seyreltilmiş), PBS ve PBS + %0,1 Tween 20 içeren dereceli bir metanol serisi aracılığıyla, her adımda 5 dakika boyunca nazikçe sallayarak rehidrate edin.
  3. Embriyoları ~ içinde inkübe ederek permeabilize edin75 µL Dik konumda sallayarak, oda sıcaklığında 20 dakika boyunca (3 damla) proteaz III uygulayın.
    NOT: Permeabilizasyon süresi, embriyonik evreye veya boyuta göre optimize edilebilir. E8.5/E9.5 embriyoları için 20 dakikalık süre etkili sonuçlar verir; ancak E9.5 embriyolarındaki daha derin yapıları görebilmek için daha uzun inkübasyon süreleri gerekebilir. Permeabilizasyon adımlarının çok uzun tutulması, embriyo disosiasyonuna yol açabilir.
  4. Embriyoları %0,01 Tween 20 içeren PBS ile 3 dakika boyunca yıkayın × 5 dk.
  5. Yaklaşık olarak ... koyarak RNAscope problarını hazırlayın 150 µL (tüp başına yaklaşık 6 damla) C1 probunu bir Eppendorf tüpüne ekleyin. Varsa C2–C4 problarını, C1 probu içerisinde 1:50 konsantrasyonda seyreltin ve bir hibridizasyon fırınında dik konumda şu sıcaklıkta inkübe edin: 40 °C embriyoların üzerine yerleştirmeden önce 10 dakika boyunca.
    NOT: Bir deneydeki her bir RNAscope prob seti için ‘C’, kanal belirtecini ifade eder. Diğer tüm problar C1 probu ile seyreltildiği için bir C1 probu gereklidir. Her karışımda her kanal belirtecinden yalnızca bir prob kullanıldığından emin olun. Prob karışımları en az 1 kez yeniden kullanılabilir.× saklanırsa 4 °C 6 haftaya kadar.
  6. Son yıkama adımını kaldırın ve ekleyin 150 µL prob karışımını embriyoların bulunduğu her bir tüpe ekleyin. Bir hibridizasyon fırınında, dik konumda, 16–24 saat boyunca şu sıcaklıkta inkübe edin: 40 °C.
  7. Prob karışımını uzaklaştırın ve 0.2 içinde yıkayın× 3 oranında %0,1 Tween 20 içeren Salin-Sodyum Sitrat (SSC) tamponu × Oda sıcaklığında 8 dk.
  8. Embriyoları, tüpler oda sıcaklığında hafifçe sallanır haldeyken %4'lük PFA ile post-fikse edin; tüpler... 90° sallantı düzlemine.
  9. 0,2 ile yıkayın× 3 saat boyunca %0,1 Tween 20 içeren SSC tamponu × Oda sıcaklığında 8 dk.
  10. Örnekleri yaklaşık olarak inkübe edin 150 µL tüp başına (6 damla) Amp1 reaktifi ile 30 dk boyunca 40 °C tüpler dik tutularak bir hibridizasyon fırınında.
  11. 0,2 ile yıkayın× 3 saat boyunca %0,1 Tween 20 içeren SSC tamponu × Oda sıcaklığında 8 dakika.
  12. Numuneleri yaklaşık olarak inkübe edin 150 µL (6 damla)/tüp Amp2 reaktifi ile 30 dakika boyunca 40 °C tüpler dik tutulacak şekilde bir hibridizasyon fırınında.
  13. 0,2 ile yıkayın× 3 için SSC tamponu + %0,1 Tween 20 × Oda sıcaklığında 8 dk.
  14. Numuneleri yaklaşık olarak inkübe edin 150 µL tüp başına (6 damla) Amp3 reaktifi ile 15 dakika boyunca 40 °C tüpler dik tutularak bir hibridizasyon fırınında.
  15. 0,2 ile yıkayın× 3 adet için %0,1 Tween 20 içeren SSC tamponu × Oda sıcaklığında 8 dk.
  16. Şurada inkübe edin 150 µL (6 damla) HRP-C1, 15 dakika boyunca 40 °C bir hibridizasyon fırınında dik konumda. 0,2 içinde yıkayın× 3 saat boyunca %0,1 Tween 20 içeren SSC tamponu × Oda sıcaklığında 8 dk.
  17. Numuneleri, TSA tamponunda seyreltilmiş bir florofor ile 30 dakika boyunca şu sıcaklıkta inkübe edin: 40 °C tüpler dik tutularak bir hibritleşme fırınında.
    NOT: RNAscope floroforları farklı problarda kullanılabilir. En parlak olan TSA-vivid 570, ardından TSA-vivid 650 ve sonrasında TSA-vivid 520'dir. Florofor seçimini, beklenen prob bolluğuna göre yapın.
  18. 0,2 ile yıkayın× 3 saat boyunca %0,1 Tween 20 içeren SSC tamponu × Oda sıcaklığında 8 dk.
  19. Örnekleri karanlıkta, yaklaşık olarak şu süreyle inkübe edin: 150 µL tüp başına (6 damla) HRP-bloklayıcı reaktif, 15 dakika boyunca 40 °C tüpler dik tutularak bir hibridizasyon fırınında.
  20. 0,2 ile yıkayın× 3 için SSC tamponu + %0,1 Tween 20 × Oda sıcaklığında 8 dk.
    NOT: Embriyolar son yıkama çözeltisinde oda sıcaklığında bırakılarak protokol burada 16–24 saat boyunca duraklatılabilir.
  21. Kullanılıyorsa, C2–C4 problarının her biri için gerektirdiği şekilde HRP-C1 yerine HRP-C2/C3/C4 kullanarak 3.16–3.20 arasındaki adımları tekrarlayın. Her bir ayrı prob için farklı bir florofor kullanın.
    NOT: C4 probları kullanılıyorsa, RNAscope 4-plex yardımcı kiti ve Opal 780 floroforu gereklidir. Opal 780, yalnızca 4-prob çoklama (multiplexing) gerektiğinde kullanılmalı ve degradasyona karşı hassas olduğu için kullanılan son florofor olmalıdır. Florofor seçimi yapılırken, kullanılacak mikroskopi platformunun kapasitelerinin göz önünde bulundurulması önemlidir. Görüntüleme sisteminin, kullanılan tüm problar için uygun uyarılma dalga boylarına, emisyon filtrelemesine ve detektör hassasiyetine sahip olduğundan daima emin olun. Opal 780 ile boyama yaparken, 3.17–3.19 arasındaki adımları şunlarla değiştirin:
    1. Numuneleri şu ortamda inkübe edin: 150 µL/tube TSA-DIG (TSA-tamponunda 1:100 oranında seyreltilmiş), oda sıcaklığında 30 dakika boyunca hafifçe sallanarak inkübe edilir.
    2. 0,2 ile yıkayın× 3 adet için SSC tamponu + %0,1 Tween 20 × Oda sıcaklığında 8 dk.
    3. Karanlıkta, örnekleri yaklaşık olarak şu sürede inkübe edin: 150 µL 15 dakika boyunca her tüp için (6 damla) HRP-bloklayıcı reaktif 40° bir hibridizasyon fırınında, tüpler dik tutularak.
    4. 0,2 ile yıkayın× 3 saat boyunca %0,1 Tween 20 içeren SSC tamponu × Oda sıcaklığında 8 dk.
    5. Numuneleri şurada inkübe edin 150 µL/tube 45 dakika boyunca Antikor Seyreltici/Bloklayıcı ile seyreltilmiş Opal Polaris 780 kullanılarak 40 °C tüpler dik tutularak bir hibridizasyon fırınında
  22. Karanlıkta, örnekleri yaklaşık olarak inkübe edin 150 µL 0,2 x SSC tamponu + %0,1 Tween 20 ile seyreltilmiş DAPI'den (çalışma konsantrasyonu 1µg/mL) 16–24 saat boyunca şu sıcaklıkta/koşulda 4 °C tüpler dik tutularak, hafifçe sallanarak
  23. 0,2 ile yıkayın× 3 saat boyunca %0,1 Tween 20 içeren SSC tamponu × Oda sıcaklığında 8 dk. Numuneleri kısa süreli olarak PBS içinde saklayın 4 °C.

4. Tam boy E8.5 embriyolarda kombine RNAscope ve immünofloresan boyama

  1. RNAscope protokolünün 3.1–3.21 adımlarını izleyin.
    NOT: RNAscope permeabilizasyon adımının süresinin kısaltılması, immünofloresan üzerindeki antikor performansının iyileştirilmesine yardımcı olabilir.
  2. Numuneleri oda sıcaklığında (RT), sallama yöntemiyle (rocking) 1 mL 0.2× SSC tamponu + %0.1 Tween 20 içerisinde 16–24 saat boyunca yıkayın.
  3. İmmünofloresan protokolünün 2.7–2.12 adımlarını izleyin.

5. Nokta taramalı veya dönen disk konfokal mikroskopi ile görüntüleme için bütün monte embriyoların hazırlanması

  1. Boyama işleminden sonra, bir LDPE Pasteur pipeti kullanarak embriyoyu nazikçe çekin ve embriyonun kurumamasına dikkat ederek ya çok kuyucuklu bir görüntüleme lamına ya da bir çukur lama aktarın. Gerekirse, örneğe zarar vermemeye dikkat ederek embriyoyu istediğiniz şekilde yönlendirin.
    NOT: Çukur lamlar, embriyoların yönlendirilmesini sağlamak için faydalıdır ancak embriyo sıkışmasına ve doku hasarına yol açabilir. Çok kuyucuklu görüntüleme lamları embriyolar için daha naziktir ancak görüntüleme yönünde farklılıklara yol açabilir ve kuyu kenarı artefaktları oluşturabilir.
  2. Opsiyonel – Doku şeffaflaştırma: Embriyodan son yıkama sıvısını nazikçe uzaklaştırıp görüntüleme kabına oda sıcaklığında (RT) 200 µL'ye kadar CUBIC-R çözeltisi ekleyerek dokuları şeffaflaştırın. Görüntüleme öncesinde embriyoyu tek bir inkübasyon için minimum 40 dk boyunca CUBIC-R içinde tutun. Şeffaflaştırılmış örnekler, inkübasyon için kullanılan CUBIC-R çözeltisinin aynında görüntülenmelidir.
    UYARI: CUBIC-R solunduğunda toksiktir ve göz ile cilt tahrişine yol açabilir. Solumaktan kaçının ve kullanım sırasında uygun kişisel koruyucu ekipman (PPE) kullanın.
    NOT: Embriyolar, CUBIC-R'ye maruz kaldıktan kısa bir süre sonra tamamen şeffaf hale gelir. CUBIC-R'yi yalnızca yönlendirme yaptıktan sonra doğrudan görüntüleme kabına ekleyin ve embriyoyu kaybetmemeye dikkat edin. CUBIC-R embriyodan uzaklaştırılıp yerine PBS konulursa, şeffaflaştırma işleminin kısmen geri dönmesi gerçekleşir.
  3. Doku şeffaflaştırma yapılmayacaksa, embriyoların çok fazla kurumamasını sağlamak için kuyucukları PBS ile tamamlayın. Çukur lam kullanılıyorsa, lamı #1.5 lamellen ile kapatın. Çok odacıklı görüntüleme lamına kapak ekleyin.
    NOT: Embriyolar geniş bir ışık mikroskobu yelpazesi ile görüntülenebilir. Örnek kalınlığı nedeniyle, uygun derinlikte görüntüleme yapabilen bir mikroskop seçmek yerindedir. İstenen yapıya uygun bir objektif seçin. 10x, düşük sayısal açıklıklı bir objektif, tüm embriyo boyamasının iyi bir genel görünümünü sağlar; ancak daha küçük veya daha derin yapıları yüksek çözünürlükte ayırt etmek için daha yüksek büyütmeli ve sayısal açıklıklı bir objektif gerekebilir. Embriyolar bazen görüntüleme kabı içinde hareket ederek hatalara yol açabilir, bu nedenle mümkün olduğunca görüntüleme süresini kısaltmak önemlidir.

6. Sayım ve sinyal yoğunluğu için çekirdeklerin analiz edilmesi

NOT: Bu protokol, Zeiss Arivis Pro kullanılarak çekirdeklerin analizini kapsamaktadır; benzer analizler alternatif görüntü analiz programları kullanılarak da gerçekleştirilebilir. Bu yöntem, transkriptler veya nükleer proteinler gibi nükleer örneklerle en iyi şekilde çalışır. Nükleer olmayan proteinlerin analizi yapılıyorsa, hücre yapısını görselleştirmek için örneğin hücre membranlarını boyayan CellMask gibi bir boya kullanmak ve belirteçlerin tüm hücre içindeki ekspresyonunu incelemek faydalı olabilir.

  1. Zeiss Arivis SIS dönüştürücü kullanarak görüntüleme dosyalarını SIS formatına dönüştürün. Dönüştürücüyü açın ve önce ‘Add files’ (Dosya ekle), ardından ‘Browse folder’ (Klasöre göz at) seçeneğini belirleyin. Kaynak görüntü klasörünü seçin. 1-to-1 (bir bire bir) dönüştürmeyi seçin. Çıktı dizininizi belirleyin ve ‘start conversion’ (dönüştürmeyi başlat) seçeneğini seçin.
  2. 'Dosya' (file), ardından 'aç' (open) seçeneğini belirleyip istenen SIS dosyasını seçerek SIS dosyalarını Zeiss Arivis Pro'ya aktarın.
  3. Görüntüleri döndürerek veri setini pipeline analizi için hazırlayın. Bunun için önce 'Data', ardından 'Transformation gallery' seçeneğini belirleyin. 'Rotation' (döndürme) fonksiyonunu seçerek, ilgi alanı sabit dikdörtgen bir kutu ile hizalanacak şekilde embriyoyu döndürün.
  4. ‘Data’, ardından ‘Transformation gallery’ ve sonrasında ‘Crop’ seçeneğini belirleyerek ilgi bölgelerini kırpın. İlgi bölgesini belirlemek için kenarları sürükleyin ve ‘Ok’ seçeneğine tıklayın.
    NOT: E8.5 embriyolarındaki baş bölgesi için, görüntüyü otik veziküle yakın olan çentikten keserek bölgeyi baş ile sınırlandırın. E8.5 embriyolarındaki kalp bölgesi için, otik veziküle yakın olan çentiğin altından kalp tüpünün altına kadar olan kısmı kırpın. Döndürülmüş görüntüleri kırparken, döndürme işlemi sonucunda oluşan siyah bölgeleri çıkarın.
  5. ‘Analysis’ ardından ‘Analysis Panel’ seçeneğini belirleyerek yeni bir işlem hattı başlatın. ‘new pipeline’ seçeneğini seçin.
  6. ROI Girişi: ROI'yi 'güncel görüntü seti' olarak, kanalları 'Tüm kanallar' ve ölçeklendirmeyi '%100' olarak ayarlayın. 'Z'yi dahil et' seçeneğinin seçili olduğundan emin olun.
    NOT: Görüntüler çok büyükse veya işleme hızı çok düşükse, görüntülerin çözünürlüğü düşürülerek boyutları küçültülebilir (örneğin %50'ye).
  7. Blob bulucu (blob finder) aracını kullanarak çekirdekleri (marker #1) bulun: ‘İşlem Ekle’ (Add Operation) seçeneğine tıklayın, ardından ‘Blob bulucu’ (Blob finder) seçeneğini bulun. Kanal kısmından, çekirdek markörünü içeren kanalı seçin. Çapı şu şekilde ayarlayın: 6 µm ve boyama yoğunluğuna göre olasılık eşiğini optimize edin. Düzlemdeki çekirdekler, çekirdekler arasında uygun bir ayrım olacak şekilde tespit edilmelidir. Bölme hassasiyetini (split sensitivity) ayarlayın; çoğu örnek için %55 makul bir değerdir. 'Normalizasyon' (Normalization) seçeneğini ilk zaman noktasına ayarlayın. Çıktı adını belirleyin, örneğin Blob finder (nuclei). Tespit edilen nesneler, işlemin üst çubuğundaki 'göz' simgesi seçilerek görselleştirilebilir.
  8. Blob bulucu aracını kullanarak 2 numaralı belirtecin ifadesini bulun: ‘İşlem Ekle’yi (Add Operation) seçin, ardından ‘Blob bulucu’yu (Blob finder) bulun. Kanal kısmında, çekirdek belirtecinin bulunduğu kanalı seçin. Çapı şu şekilde ayarlayın: 6 µm ve olasılık eşiğini boyama yoğunluğuna göre optimize edin. Düzlemdeki marker #2 için pozitif olan 'blobs' (lekeler), uygun bir ayrıştırma ile tespit edilmelidir. Bölme hassasiyetini (split sensitivity) ayarlayın; çoğu örnek için %55 makul bir değerdir. 'Normalizasyon'u (Normalization) ilk zaman noktasına ayarlayın. Çıktı adını belirleyin, örneğin: Blob finder (channel 2). Tespit edilen nesneler, işlemin üst çubuğundaki 'göz' simgesi seçilerek görselleştirilebilir.
  9. Blob bulucu aracını kullanarak marker #3'ün ekspresyonunu bulun: ‘Add Operation’ (İşlem Ekle) seçeneğini belirleyin, ardından ‘Blob finder’ı (Blob bulucu) bulun. Kanal kısmında, çekirdek marker'ını içeren kanalı seçin. Çapı şu şekilde ayarlayın: 6 µm ve boyama yoğunluğuna göre olasılık eşiğini optimize edin. Düzlemdeki markör #3 pozitif 'bloblar' uygun bir ayrımla tespit edilmelidir. Bölme hassasiyetini (split sensitivity) ayarlayın. Çoğu örnek için %55 makul bir değerdir. 'Normalizasyon'u şu şekilde ayarlayın: µ first zaman noktası. Çıktı adını belirleyin, örneğin, Blob finder (kanal 3). Saptanan nesneler, işlemin üst çubuğundaki 'göz' simgesi seçilerek görselleştirilebilir.
  10. İsteğe bağlı: hacim filtresi – Görüntülemede çok fazla kalıntı varsa, artefaktları gidermek için bir hacim filtresi kullanılabilir. ‘Add Operation’ seçeneğini seçin, ardından ‘Object Feature Filter’ı bulun. Girişi (input), Blob finder (nuclei) (veya adım 6.7'deki diğer set adı) olarak ayarlayın. ‘is type’ kısmını ‘any’ olarak ayarlayın. Açılır menüden Volume (volume) seçeneğini seçin ve değeri şuna ayarlayın: > 6 µm3'Filtre ekle' seçeneğini belirleyin. Açılır menüden Hacim (volume) seçeneğini seçin ve değeri şu şekilde ayarlayın: <3000 µm3Çıktıyı adlandırın, örneğin, ‘nuclei’. Modüldeki 3 çizgi butonunu seçip ‘run pipeline to here’e tıklayarak hattı buraya kadar çalıştırın.
    NOT: Gerektiğinde diğer kanallar için de hacim filtreleri kullanılabilir. Tüm pozitif nesnelerin seçildiğinden emin olmak ancak kalıntıların (debris) hariç tutulmasını sağlamak için "büyüktür" ve "küçüktür" değerlerini optimize edin.
  11. Bir diğer belirteç için pozitif olan çekirdekleri tanımlamak için intersect (kesişim) aracını kullanın. ‘Add operation’ (işlem ekle) seçeneğini belirleyin ve ‘compartments’ (kompartmanlar) aracını bulun. İlk açılır kutuya çekirdek çıktısını (örneğin, blob finder (nuclei) veya hacim filtresinden geçirilmiş ‘nuclei’) ekleyin ve kutunun solundaki düğmenin seçili olduğundan emin olun. İkinci açılır kutudan istenen kanalı (örneğin, blob finder (channel 2)) seçin. Çıktıya ‘nuclei with channel 2’ gibi bir isim verin. İstenilen tüm belirteçler için işlemi tekrarlayın.
  12. 2 veya daha fazla diğer markör için pozitif olan çekirdekleri bulmak için ‘Add operation’ seçeneğini seçin ve ‘Object Feature Filter’ aracını bulun. Giriş (input) kısmını çekirdek markörü (örneğin, ‘nuclei’, type= any) olarak ayarlayın ve önceki adımdaki filtreleri ‘Has tag,’ kısmından sonra ekleyin; örneğin ‘Nuclei with channel 2’ ve ‘Nuclei with channel 3’. Çıktıya bir isim verin, örneğin ‘Nuclei with channel 2 and channel 3’. İş akışını (pipeline) buraya kadar çalıştırın.
  13. Üst çubuktaki veri tablosu simgesine, ardından 'create' (oluştur) ve 'object count' (nesne sayımı) seçeneklerine tıklayarak çekirdekleri saymak için özel özellikler oluşturun. Özelliğe uygun bir etiket (örneğin, nuclei count) verin ve etiket menüsünden nicelleştirilmek istenen çıktıyı (örneğin, nuclei) seçin. Bu adımı, nicelleştirilecek her grup için tekrarlayın.
  14. ‘İşlem ekle’ (Add operation) ve ardından ‘Nesne grupları oluştur’ (Create object groups) seçeneklerini belirleyerek nesne grupları oluşturun. Girdiler kısmından analizlerde kullanılacak grupların her birini seçin. Çıktıları ‘Nesne grupları oluştur’ (Create object groups) şeklinde etiketleyin. İş akışını buraya kadar çalıştırın.
  15. ‘Add operation’ (İşlem ekle), ardından ‘Export object features’ (Nesne özelliklerini dışa aktar) seçeneğini belirleyerek özet sayımları dışa aktarın. Girdiler kısmından ‘create object groups’ (nesne grupları oluştur) seçeneğini seçin. Verileri kaydetmek için bir dizin seçin. Mod ‘single table’ (tek tablo) olarak ayarlanmalıdır. Features (Özellikler) sekmesine tıklayın ve adım 6.13'te oluşturulan özel özellikleri seçin.
  16. ‘İşlem ekle’ (Add operation), ardından ‘Nesne özelliklerini dışa aktar’ (Export object features) seçeneğini seçerek çekirdek detaylarını dışa aktarın. Girdiler kısmında, adım 6.7'de (veya hacim filtresi kullanılıyorsa 6.10'da) oluşturulan çekirdek tespitini seçin. Verileri kaydetmek için bir dizin seçin. Mod, ‘tek tablo’ (single table) olarak ayarlanmalıdır. Özellikler (features) kısmına tıklayın ve her kanal için (#1, #2, #3 vb.) ‘yoğunluklar’ (intensities) seçeneğini ve dışa aktarılmak istenen diğer özellikleri, örneğin hacmi (volume) seçin.
  17. Nesneleri depola kutusundan görselleştirme/analiz için gereken nesneleri seçerek nesneleri depolayın.
  18. Tüm adımları geri alarak, sağ üstteki 3 satırı seçip 'Export' (Dışa Aktar) düğmesine tıklayarak iş akışını kaydedin. 'pipeline'ı kaydetmek için bir 'klasör' seçin ve kaydedin.
  19. Bir hattı (pipeline) toplu olarak çalıştırmak için Arivis'i yeniden yükleyin. Üst çubuktan önce ‘Analysis’, ardından ‘Batch analysis’ seçeneğini belirleyin. Açılan pencerede, adım 6.18'de kaydedilen hattı seçin. ‘Files’ kısmında analiz edilecek dosyaları seçin ve ‘ok’ butonuna tıklayın. Yükleme tamamlandığında, istenmeyen görünümler silinebilir. ‘Ok’ seçeneğini belirleyin. Bir sonraki ekranda verilerin kaydedileceği dizini seçin. ‘Run’ butonuna tıklayın. Veriler, seçilen çıktı klasörüne otomatik olarak kaydedilecektir.

İş akışına genel bir bakış Şekil 1'de gösterilmiştir.

figure-protocol-1
Şekil 1: İmmünofloresan ve RNAscope boyama protokolü. Embriyo toplama, immünofloresan, RNAscope, kombine immünofloresan ve RNAscope, örnek görüntüleme ve analiz aşamalarının temel basamaklarını gösteren şematik. Renkli kutular farklı protokol aşamalarına karşılık gelmektedir. BioRender ile oluşturulmuştur. Sparrow, D. (2026) https://BioRender.com/q6rmax8 Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Sonuçlar

Hücre döngüsünün G2/M evresinde olan göç eden nöral krist hücrelerinin sayısını analiz etmek için E8.5 embriyoları bu protokol izlenerek immunofloresan ile boyanmıştır. Örnekler, hücre döngüsünün G2/M evresini görselleştirmek için PHH3'ü ve göç eden nöral krist hücrelerini görselleştirmek için SOX10'u hedefleyen antikorlar kullanılarak boyanmıştır. Embriyolar daha sonra uygun sekonder antikorlarla boyanmıştır. Çekirdekler DAPI ile boyanmıştır. Örnekler, 10x objektifli (NA = 0.4) Olympus SpinSR döner disk konfokal mikroskobu kullanılarak görüntülenmiştir. Görüntüler, Hamamatsu Orca Fusion BT kamera ve 50 µm pinhole döner disk kullanılarak elde edilmiştir. Görüntüler, 1.99 µm Z-aralığı ile Z yığınları şeklinde, karo ve birleştirme (tile and stitch) fonksiyonu kullanılarak yakalanmıştır. Nöral krist hücresi delaminasyonu ve ardından epitelden mezenşime geçiş (EMT) yoluyla gerçekleşen göç, göç öncesi nöral krist hücrelerinin hücre döngüsünün S veya G2/M evresinde olmasını gerektirir20. Burada, SOX10 (macenta) ile belirtilen göç eden nöral krist hücreleri popülasyonu içerisinde, PHH3 boyaması (yeşil) ile belirtilen hücre döngüsünün G2/M evresindeki hücreleri görselleştirebiliyoruz (Şekil 2A). Kontrol ve tedaviye maruz kalan embriyolardaki G2/M evresindeki göç eden nöral krist hücrelerinin sayısı, tedavimizin G2/M'deki göç eden nöral krist hücrelerinin sayısını etkileyip etkilemediğini ve dolayısıyla tedavimizin EMT yoluyla nöral krist delaminasyonunu bozup bozmadığını belirlemek için nicelleştirilebilir. Bazı embriyolarda diseksiyondan kalma artık bir vitellus kesesi bulunmaktaydı (Şekil 2A’, kırmızı ok ucu). anti-PHH3 antikoru farede üretildiği için, bu örnekte yaygın olan anti-fare sekonder antikorların boyamasına karşı artık vitellus kesesi hassastır. Bu nedenle, tüm vitellus kesesi, anti-fare antikora konjuge olan florofor ile parlak bir şekilde floresan yayar. Bu uç örnekte, spesifik olmayan boyama PHH3 nicelleştirmesini etkileyebilir ve bu nedenle bu örnek analizden hariç tutulmalıdır. Ayrıca, anti-fare antikorların kullanımı, E8.5 embriyolarında kalp tüpünün bitişiğinde spesifik olmayan bir 'çizgi' bırakır (Şekil 2A’, kırmızı ok ucu). Farede üretilmiş bir primer antikordan gelen sinyal nicelleştirilirken bu bölge dikkate alınmalıdır.

Kan damarı yapısını ve kardiyak progenitör hücre dağılımını incelemek için E9.5 embriyoları, bu protokol kullanılarak immünofloresan ile boyanmıştır. İkinci kalp alanını görselleştirmek için ISLET1 (ISL1), göç eden nöral krist hücrelerini görselleştirmek için SOX10, venöz ve kapiller endotel hücrelerini görselleştirmek için ENDOMUCIN (EMCN) hedefleyen antikorlar ve uygun sekonder antikorlar kullanılarak örnekler boyanmıştır. Çekirdekler DAPI ile boyanmıştır. Daha iyi bir görüntüleme derinliği elde etmek için doku şeffaflaştırma yöntemi uygulanmıştır. Örnekler, 10x objektifli (NA = 0,4) bir Olympus SpinSR spinning disk mikroskobu kullanılarak görüntülenmiştir. E9.5 aşamasında, aort arkının bir kısmını oluşturan kardiyak nöral krist hücrelerinin (SOX10, sarı) ve atriyumların, çıkış kanalının ve sol ventrikülün bölümlerini oluşturan ikinci kalp alanı progenitör hücrelerinin (ISL1, yeşil) göçünü görmekteyiz21 (Şekil 2B). Kardiyak progenitör hücrelerin bozulması, konjenital kalp hastalıklarının temel itici gücüdür22,23. Bu yöntemi kullanarak, kardiyak progenitör hücre düzenlenmesini ve sayısını görselleştirebiliyoruz. Bir sonraki aşama, müdahalemizin göçü bozup bozmadığını veya temel hücre tiplerinin kaybına yol açıp açmadığını belirlemek için kontrol ve tedavi grupları arasındaki kardiyak progenitör hücre düzenlenmesini karşılaştırmak olacaktır.

Nöral krist hücresi evresi ile Wnt sinyalizasyonu arasındaki ilişkiyi belirlemek amacıyla, farklı göç ve farklılaşma evrelerindeki nöral krist hücrelerini ve bir Wnt sinyalizasyon belirtecini incelemek için E8.5 embriyoları bu protokol kullanılarak RNAscope ile boyanmıştır. Nöral krist hücrelerinin ortaya çıktığı nöral plaka sınırını belirten problar (Msx1), göç eden nöral krist hücreleri (Sox10) ve nöral krist hücresi farklılaşmasını belirten problar (Dlx2) kullanılmış ve Wnt sinyalizasyonunu belirten bir prob (Sp5) ile karşılaştırılmıştır. Probları görselleştirmek için TSA-vivid 520, 570 ve 650 ile Opal 780 floroforları kullanılmıştır. Örnekler, 10x objektif (NA=0,4), 144 µm pinhole ve 621 nm piksel boyutuyla bir Evident FV4000 mikroskobu kullanılarak görüntülenmiştir. Görüntüler, 4,32 µm Z-aralığı ile Z stack'leri olarak tile and stitch fonksiyonu kullanılarak yakalanmıştır. Nöral plaka sınırı (Msx1, yeşil) ve göç eden nöral krist hücreleri (Sox10, magenta), hücreler nöral tüpten göç etmeye başladıkça bazı örtüşmelerle birlikte baş bölgesinde ayrı bölgeleri kaplamaktadır (Şekil 3A). Göç eden nöral krist hücrelerinin bazı bölgeleri Dlx2 (siyan) ile ko-localize olmuş olup, bu durum bazı hücrelerin kraniofasiyal farklılaşmaya doğru ilerlediğini göstermektedir (Şekil 3A). Wnt sinyalizasyonu (Sp5, sarı), nöral krist hücresi delaminasyonu ve farklılaşması için Wnt sinyalizasyonunun modülasyonu gerekli olduğundan24,25 nöral plaka sınırının bölgelerini kaplamakta, ancak aynı zamanda göç eden nöral krist hücrelerine komşu ayrı bir bölgeyi de kaplamaktadır (Şekil 3A).

Ek boyamalar, nöral crest durumuna ve Wnt sinyaline özgü markerların boyanması yoluyla E9.5 aşamasında nöral crest hücresi migrasyonu ile Wnt sinyali arasındaki ilişkiyi incelemek amacıyla yapılmıştır. Nöral plak sınırını (Msx1) ve migratif nöral crest hücrelerini (Sox10) belirten problar kullanılmış ve bunlar Wnt sinyalini (Sp5) belirten bir prob ile karşılaştırılmıştır. Probları görselleştirmek için TSA-vivid 520, 570 ve 650 floroforları kullanılmıştır. Örnekler, 10x objektife (NA = 0.4) sahip bir Olympus SpinSR spinning disk mikroskobu kullanılarak görüntülenmiştir. Burada nöral plak sınırının (Msx1, yeşil), göç eden nöral crest hücrelerinden (Sox10 macenta) farklı olduğu görülebilir (Şekil 3B). Wnt sinyali (Sp5, sarı), gövde nöral crest hücrelerinin delaminasyon yaşadığı embriyonun dorsal bölgesinin yanı sıra başın farklı bölgelerinde, 1inci ve 2nci brankiyal ark çevresinde, çıkış kanalının altında ve otik vezikül içerisinde güçlü bir şekilde görülebilir (Şekil 3B). Bu yöntem kullanılarak kontrol ve tedavi grupları arasında nöral crest hücrelerinin ve Wnt sinyalinin uzaysal paternlemesi karşılaştırıldığında, müdahalemizin nöral crest hücresi delaminasyonunu ve migrasyonunu bozup bozmadığı ve herhangi bir bozulmanın Wnt sinyalindeki değişikliklerden kaynaklanıp kaynaklanmadığı belirlenebilecektir.

Nöral plak sınırındaki hücrelerin hücre döngüsü durumunu belirlemek için, immünofloresan ve RNAscope boyamasını birleştiren bu protokolü kullandık. Nöral plak sınırını belirten bir RNAscope probu (Msx1) kullanıldı. Hücre döngüsünün sırasıyla G2/M ve S evrelerini görselleştirmek için PHH3 ve PCNA'yı hedefleyen antikorlar kullanılarak örnekler boyandı. Embriyolar daha sonra uygun sekonder antikorlarla boyandı. Çekirdekler DAPI ile boyandı. Örnekler, 10x objektifli (NA = 0.4) bir Olympus SpinSR spinning disk mikroskobu (Şekil 4A,B) veya 10x objektifli (NA = 0.4), 127 µm pinhole ve 311 nm piksel boyutuna sahip bir Evident FV4000 konfokal mikroskobu ile görüntülendi (Şekil 4B’). Burada, hem G2/M (PHH3, sarı) hem de S-evresindeki (PCNA, magenta) hücrelerin nöral plak sınırı ile örtüştüğünü görebiliriz (Şekil 4A). Bu yöntemle, nöral plak sınırı içindeki hücrelerin hücre döngüsünün her bir aşamasındaki oranını nicelleştirebilir ve bu oranların tedavi gruplarımız tarafından değiştirilip değiştirilmediğini belirleyebiliriz. Bu embriyoda dikkat çeken delikler, embriyonun ince forsepslerle aşırı manipülasyonu sonucu oluşan disseksiyon hasarlarından kaynaklanmaktadır. Bu durum, özellikle embriyoların çok hassas olduğu E8.5 evresinde, hasarı önlemek için disseksiyon sırasında dikkatli olunması gerektiğini vurgulamaktadır.

RNAscope ve immunofloresansın birlikte uygulanması, RNAscope probunun tek başına uygulandığı durumlara göre daha sönük boyanmasına yol açabilir. Yakın bir florofor ile çok parlak floresans veren bir primer antikorla (örneğin, Fluorescein ve Cy3) birleştirildiğinde, bu durum daha parlak kanaldan daha sönük kanala sinyal sızıntısına (bleed-through) neden olabilir (Şekil 4B). Bunu önlemenin yolu, çok parlak olan antikoru daha seyreltik bir konsantrasyonda kullanmak, spektral olarak daha farklı floroforlar seçmek veya örneklerdeki görüntüleme parametrelerini değiştirmektir. Spinning disk mikroskoplar embriyoları görüntülemede çok hızlıdır, ancak sabit emisyon pencerelerine sahip bant geçiren emisyon filtreleri kullandıkları için, tespit pencerelerini belirli floroforlara uyacak şekilde dinamik olarak daraltmanın bir yolu yoktur. Örneğin, Evident FV4000 gibi bir nokta taramalı (point-scanning) mikroskop kullanıldığında, tespit penceresi operatör tarafından nanometre hassasiyetinde daraltılabilir; böylece emisyon spektrumları hafifçe örtüşen floroforlar kullanıldığında sızıntı azaltılabilir (Şekil 4B’).

E8.5 embriyolarındaki hücrelerin hangi oranlarda hücre döngüsünün farklı aşamalarında olduğunu belirlemek için, hem S evresindeki hem de G2/M evresindeki çekirdek oranlarını ve sinyal yoğunluğunu analiz etmek amacıyla bu protokolü kullandık. Hücre döngüsünün G2/M ve S evrelerinile sırasıyla görselleştirmek için PHH3 ve PCNA'yı hedefleyen antikorlar kullanılarak örnekler boyandı. Embriyolar daha sonra uygun sekonder antikorlarla boyandı. Çekirdekler DAPI ile boyandı. Örnekler, 10x objektifli (NA = 0.4) Olympus SpinSR spinning disk mikroskobu kullanılarak görüntülendi. Tüm çekirdekleri, PHH3 pozitif çekirdekleri, PCNA pozitif çekirdekleri ve çift pozitif çekirdekleri tanımlamak için Zeiss Arivis Pro kullanıldı (Şekil 5A). Bu yöntemle, hücre döngüsünün G2/M (PHH3+) ve S (PCNA+) evrelerindeki hücre oranlarını (Şekil 5B) ve her bir çekirdekteki PHH3 veya PCNA boyama yoğunluğunu (Şekil 5C) karşılaştırabildik. Kalp bölgesinde, baş ve tüm embriyoya kıyasla PCNA+ çekirdek oranının biraz daha yüksek olduğu görülmektedir (Şekil 5B). Ayrıca baş bölgesi, kalp ve tüm embriyoya kıyasla daha yüksek oranda PHH3+ ve çift boyanmış çekirdeğe sahipti (Şekil 5B). Bölgeler arasında PHH3 veya PCNA yoğunluğu açısından belirgin bir fark yoktu (Şekil 5C). Bu veriler tek bir temsilci embriyodan (n = 1) elde edilmiştir ve analiz iş akışını göstermek amacıyla sunulmuştur; herhangi bir çıkarımsal istatistiksel analiz yapılmamıştır. Birlikte değerlendirildiğinde bu yöntem, kardiyak ve kraniofasiyal gelişim için kritik olan bir gelişim aşamasında hücre döngüsü yayılım modellerini belirlememize olanak tanır. Bu yöntem, uyguladığımız tedavinin embriyonun farklı bölgelerindeki hücre döngüsü yayılımını etkileyip etkilemediğini belirlememizi sağlayacaktır.

figure-results-1
Şekil 2E8.5 ve E9.5 embriyolardaki proteinlerin immünofloresan boyaması. (A, A’) E8.5 fare embriyoları; hücre döngüsünün G2/M evresindeki hücreleri görüntülemek için PHH3, göç eden nöral krist hücrelerini görüntülemek için SOX10 ve çekirdekleri görüntülemek için DAPI ile immünofloresan yöntemle boyanmıştır. N = 1 deneyden 11 embriyo. (B) E9.5 embriyoları; ikinci kalp alanı progenitörlerini görüntülemek için ISL1, göç eden nöral krist hücrelerini görüntülemek için SOX10, kapiler ve venöz kan damarlarını görüntülemek için EMCN ve çekirdekleri görüntülemek için DAPI ile boyanmıştır. Kırmızı ok uçları, vitellus kesesinin spesifik olmayan boyanmasını ve anti-fare sekonder antikorlardan kaynaklanan embriyo içi spesifik olmayan boyama (n = 1 deneyden 15 embriyo). Ölçek çubuğu = 200 µmDAPI: 4′,6-diamidino-2-fenilindol; PHH3: Fosfohiston H3; EMCN: Endomusin. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-2
Şekil 3: E8.5 ve E9.5 embriyolardaki transkriptlerin RNAscope ile boyanması. (A) E8.5 embriyoları; nöral plaka sınırını görüntülemek için Msx1, göç eden nöral kristayı görüntülemek için Sox10, farklılaşan nöral kristayı görüntülemek için Dlx2 ve Wnt sinyalini görüntülemek için Sp5 hedefleyen problarla RNAscope ile boyanmıştır. n = 1 deneyden 13 embriyo. (B) E9.5 embriyoları; nöral plaka sınırını görüntülemek için Msx1, göç eden nöral kristayı görüntülemek için Sox10 ve Wnt sinyalini görüntülemek için Sp5 hedefleyen problarla RNAscope ile boyanmıştır. n = 1 deneyden 4 embriyo. Ölçek çubuğu = 200 µm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-3
Şekil 4: E8.5 embriyolarda kombine immünofloresan boyama ve RNAscope. (A, B, B’) E8.5 embriyoları, nöral plaka sınırını görselleştirmek için Msx1 hedefli problarla RNAscope ile ve S-fazındaki hücreleri görselleştirmek için PCNA'ya karşı immünofloresan ile, hücre döngüsünün G2/M fazındaki hücreleri görselleştirmek için ise PHH3 antikorları ile boyanmıştır. Turuncu ok uçları spesifik Msx1 boyamasını, kırmızı ok uçları sızıntı floresansı (B) veya Msx1 kanalına sızıntı olmaksızın spesifik PHH3 boyamasını (B') göstermektedir. N = 1 deneyden 2 embriyo. Ölçek çubuğu = 200 µm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-4
Şekil 5: Arivis Pro kullanılarak E8.5 embriyolarında hücre döngüsü aşamalarının analizi. (A) E8.5 fare embriyolarında, hücre döngüsünün S-fazındaki hücreleri görüntülemek için PCNA (yeşil), G2/M fazındaki hücreleri görüntülemek için PHH3 (macenta) ve çekirdekleri görüntülemek için DAPI (mavi) ile immünofloresan boyama yapılmıştır. Tespit edilen 3D nesneler (çok renkli küreler) üst üste bindirilmiş ve Zeiss Arivis Pro'daki 4D görüntüleyici kullanılarak görselleştirilmiştir. (B) Grafik, tek bir embriyonun tüm vücudunda, başında ve kalbindeki PCNA+, PHH3+ ve çift pozitif çekirdeklerin oranını göstermektedir. (C) Grafik, tek bir embriyonun tüm vücudunda, başında ve kalbindeki çekirdek başına düşen ortalama PCNA ve PHH3 boyama yoğunluğunu göstermektedir. Daireler ortalamayı; hata çubukları ise tek bir örnekteki tüm çekirdeklerin standart sapmasını temsil etmektedir. Grafikler GraphPad Prism kullanılarak oluşturulmuştur. Ölçek çubuğu = 200 µm. Kantitatif analiz n = 1 embriyo üzerinde gerçekleştirilmiştir. Çıkarımsal istatistik uygulanmamıştır. Hata çubukları, bireysel çekirdekler arasındaki standart sapmayı belirtmektedir. 3D: Üç boyutlu; DAPI: 4′,6-diamidino-2-phenylindole. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

Burada, bütün mount E8.5 ve E9.5 embriyoları içerisinde gen ve protein ekspresyonunun mekansal olarak analiz edilmesine yönelik optimize edilmiş bir yöntemi açıklıyoruz. Bu yöntemler, geleneksel RNA in situ hibridizasyon ve kesitlerin immünofloresan yöntemlerine kıyasla geliştirilmiş mekansal çözünürlüğe ve multipleksleme kapasitesine sahiptir. Bu protokol, fare embriyolarındaki gelişimsel yolakları incelemek için mevcut güncel protokoller üzerine inşa edilmiştir. Yakın tarihli bir protokolde, embriyolardaki Wnt sinyalleşmesine bakmak için RNAscope ve immünofloresan boyama kullanılmış ancak bütün mount embriyolar yerine boyanmış kesitler kullanılmıştır26. Bir diğer güncel çalışma, E8.5–E10.5 bütün mount fare embriyolarında bütün mount RNAscope ve immünofloresan boyama gerçekleştirmiştir27; ancak yazarlar bu iki boyama tekniğini birleştirmemiş ve C4 probları ile Opal 780 floroforları kullanılarak dördüncü bir RNAscope kanalı boyanmamıştır. Kombine immünofloresan ve RNAscope daha önce, RNAscope'un immünofloresan protokolü tamamlandıktan sonra gerçekleştirildiği bütün mount E3.5 embriyolarda açıklanmıştır28. Bu protokolü daha geç evre embriyolarda birebir denememiş olsak da, E8.5 embriyolarında immünofloresan protokolümüzün primer ve sekonder antikor inkübasyonları arasına RNAscope boyamasını yerleştirdiğimizde zayıf antikor boyaması elde ettik. Bu durum muhtemelen, daha büyük embriyolarda RNAscope uygulanırken gerek duyulan ancak E3.5 fare embriyolarının kullanıldığı çalışmada gerek duyulmayan proteaz inkübasyonu ihtiyacından kaynaklanmaktadır. Proteaz inkübasyonu, bağlı antikorların bütünlüğünü etkileyebilir; bu nedenle RNAscope ve immünofloresan sırasını değiştirmenin bu sistemde başarılı olması pek olası değildir. Miyofiberler üzerine yapılan bir başka güncel çalışma, RNAscope'u immünofloresan boyamadan önce gerçekleştirerek iki protokolü birleştirmiştir29. Bu protokole benzer şekilde, söz konusu çalışma immünofloresandan önce RNAscope uygulamıştır; ancak bu yöntem bütün mount fare embriyolarında valide edilmemiş ve C4 probları ile bir Opal 780 floroforu ile boyama yapılarak ek bir RNAscope kanalını içeren bir RNAscope uygulaması gerçekleştirilmemiştir.

Multiplexleme kullanarak bütün halindeki embriyoları boyama yeteneği, anahtar transkriptlerin ve proteinlerin haritalanması, farklı aşamalardaki embriyolarda öncül hücre tiplerinin veya gelişimsel sinyal yollarının etiketlenmesi gibi gelişimsel biyolojide geniş kapsamlı uygulama alanlarına sahiptir. Bu teknikleri kalp öncül hücre dağılımını (Şekil 2B), göç ve farklılaşmanın farklı aşamalarındaki nöral krista hücrelerini (Şekil 3), Wnt sinyal yolunu (Şekil 3) ve hücre döngüsü aşamasını (Şekil 2, Şekil 4, Şekil 5) haritalamak için kullanabildik. Kullanılan problar ve antikorlar modifiye edilerek, bu aşamadaki embriyolarda bulundukları sürece ilgi duyulan herhangi bir hücre tipinin veya sinyal molekülünün incelenmesi için bu tekniklerin kullanılması mümkündür. Bu protokolde E8.5 ve E9.5 aşamalarına odaklanmış olsak da, doku permeabilizasyonu, inkübasyon süreleri ve doku berraklaştırma işlemleri modifiye edilerek daha genç veya daha yaşlı embriyoların da boyanması mümkündür.

Bununla birlikte, bütün mount embriyolarda protein ve transkript ekspresyonunun çok kanallı şekilde analiz edilebilme yeteneğinin artması, beraberinde yeni zorluklar getirmiştir. İlk olarak, bütün mount örnekler üzerinde analiz yapmak; tipik olarak birden fazla gün yerine 1-2 gün içinde gerçekleştirilebilen kesitlerdeki immünofloresan ve RNAscope analizlerine kıyasla daha fazla zaman almaktadır. Ayrıca, bütün mount örneklerin kullanımı, yeterli örnek derinliği ve çözünürlüğü sağlamak için mikroskopi parametrelerinin dikkatli bir şekilde değerlendirilmesini gerektirir. Şunlar kadar derinlikten görüntüleme yapabilen bir mikroskoba ihtiyaç duyulur: 700 µm kalın doku, ve daha büyük embriyolarda doku berraklaştırma kullanılması gerekir; aksi takdirde numunenin derinliklerindeki yapılar gözden kaçabilir. Ayrıca, numunelerin kalınlığı nedeniyle geniş alanlı (widefield) bir mikroskopla görüntüleme yapmak, odak düzlemi dışından gelen çok miktarda ışığın görüntülenmesine yol açacaktır; konfokal mikroskop, odak düzlemi dışındaki sinyalleri yok etme yeteneği sayesinde tercih edilir, böylece odak dışı herhangi bir sinyali hariç tutarak numunenin derinlemesine görüntülemesini yapabilir. Ek olarak, döner diskli (spinning disk) konfokal mikroskop genellikle daha hızlı görüntü alım sürelerine olanak tanır, ancak nokta taramalı (point-scanning) konfokal mikroskoba kıyasla floresan tespitinin hassas kontrolünden ödün verir. Embriyoların boyutu da zorlayıcı olabilir, çünkü birçok mikroskop, embriyoyu karo tarama (tile-scanning) yapmadan görüntüleyecek kadar geniş bir görüş alanına sahip değildir. Bu durum, görüntüde birleştirme artefaktlarına (örneğin, Şekil 2B). Örneklerin çoğullanması (multiplexing), kanallar arasında sızıntıya (örneğin, Şekil 4B), Floroforların emisyon spektrumlarının hafifçe örtüştüğü durumlarda, tespit pencerelerinin daraltılabildiği nokta taramalı bir konfokal mikroskop seçilerek bu durum hafifletilebilir. Opal 780 floroforunun kullanımı, tek bir örnekte daha fazla hedefi çoklamayı (multiplexing) kolaylaştırır; bu sistemin tespit edilebilmesi için yakın kızılötesi görüntüleme yeteneğine sahip bir mikroskop gereklidir. Bu özellik, ışık mikroskoplarının çoğunda bulunmamaktadır.

Örneklerin görüntüleme için yerleştirilmesi de dikkatli bir değerlendirme gerektirir. Çok kuyucuklu oda slaytlarında görüntülemede olduğu gibi, örneklerin serbestçe yüzmesine izin verildiğinde, örnekler görüntüleme için her zaman tam olarak aynı açıda olmayabilir. Bu durum, embriyonun hangi kısımlarının kameraya/detektöre daha yakın olduğuna bağlı olarak boyama yoğunluğunda farklılıklara yol açabilir ve sonraki aşamalardaki yoğunluk analizi sırasında zorluklar çıkarabilir. Çok kuyucuklu oda slaytlarının kullanımına ilişkin bir diğer sorun ise, kuyucuk kenarının görüntülenen alanın içinde kalabilmesi ve bunun da görüntüde artefaktlara yol açabilmesidir. Embriyonun, kaviteli bir slaytta olduğu gibi sabitlenmesi yönelimin korunmasına yardımcı olabilir; ancak embriyonun kolayca hasar görmesine ve/veya sıkışmasına neden olarak yapıların hacim analizini zorlaştırabilir.

Bu protokol takip edilirken birkaç hususun göz önünde bulundurulması gerekir. İmmünofloresans için, özellikle daha genç embriyolar analiz edilirken, antijen geri kazanımı sırasında embriyonun ayrışmamasına dikkat edilmelidir. Bunu önlemek için Tris/EDTA gibi alternatif bir tampon kullanmak veya proteolitik bir geri kazanım yöntemi uygulamak gibi diğer antijen geri kazanım yöntemlerini kullanmak mümkün olabilir. Daha küçük veya daha büyük embriyolar için antikor inkübasyon sürelerinin optimizasyonundan fayda sağlanabilir. Birçok antikor farelerde üretildiği için primer antiktorların seçimi konusunda dikkatli olunmalıdır; zira anti-fare antiktorlarının kullanımı, kalıntı vitellus kesesine bağlanarak parlak floresans oluşturabilir. Bu durum, AlexaFluor 488 (Şekil 2) ve AlexaFluor 647 (Şekil 4) ile işaretlenmiş anti-fare sekonder antiktorları kullanılarak gözlemlenebilir. Diğer floroforlar laboratuvarımızda test edilmemiştir ancak bunlar farklı floresans yoğunluklarına sahip olabilir ve daha fazla optimizasyon gerektirebilir. Bu etki, anti-tavşan (Şekil 2, Şekil 4, Şekil 5) veya anti-sıçan antiktorlarının (Şekil 2B) kullanıldığı kanallarda görülmemiştir; bu nedenle, mümkün olduğunca diğer türlerde üretilmiş primer antiktorların kullanılması önerilir.

RNAscope için proteaz inkübasyon adımlarının optimize edilmesi kritik öneme sahiptir; çünkü çok kısa süre probların yetersiz penetrasyonuna, çok uzun süre ise örneğin tamamen disosiasyonuna yol açabilir. Proteaz inkübasyon sürelerini optimize ederken, süreyi her seferinde bir dakika değiştirerek düzenlemeyi öneririz. Bir probun veya antikorun çalışıp çalışmadığını belirlemek için uygun kontrollerin kullanılması da en iyi uygulamadır. Gözlemlenen boyamanın gerçek olduğunu belirlemek için negatif kontrol olarak, eşdeğer evrede olan ve birlikte boyanan ancak prob/birincil antikor uygulanmamış bir embriyo kullanılabilir veya immünofloresan için bir IgG izotip kontrolü ya da RNAscope için bir negatif kontrol probu kullanılabilir. İlgilenilen gen veya transkripti eksprese ettiği bilinen, eşdeğer büyüklükteki bir dokunun pozitif kontrolleri de boyamanın başarılı olup olmadığını belirlemek için faydalı olabilir.

Genel olarak bu protokol, E8.5 ve E9.5 aşamasındaki bütün mount fare embriyolarında protein ve transkript ekspresyonunu görselleştirmek için güçlü ve optimize edilmiş bir yöntemdir; normal embriyonik gelişim ve hastalıklardaki hücresel ve moleküler mekanizmaların araştırılması için büyük bir potansiyele sahiptir.

Açıklamalar

Yazarlar, herhangi bir çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.

Teşekkürler

Yazarlar, bu makalede yer alan mikroskopi ve görüntü analizi ile ilgili teknik destek sağladıkları için Oxford Üniversitesi, İnsan Genetiği Merkezi, Hücresel Görüntüleme Çekirdek tesisi ekibine teşekkür ederler. Yazarlar ayrıca, embriyo üretimi için hayvan bakımı ve zamanlanmış çiftleşmeler konusundaki destekleri nedeniyle Oxford Üniversitesi, Biyomedikal Hizmetler personelini teşekkürle anarlar.

Bu araştırma için finansman; British Heart Foundation Senior Fellowship FS/SBSRF/22/31022 (DBS), Additional Ventures Single Ventricle Fund (DBS), John Fell Fund, University of Oxford 0016065 (VSR) ve Medical Sciences Internal Fund, University of Oxford 0016707 (VSR) tarafından sağlanmıştır.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Plastik malzemeler/cam malzemeler
3 ml'lik düşük yoğunluklu polietilen (LDPE) dereceli Pasteur pipetleriWheaton711116
Eppendorf Safe-lock tüpler 1,5 ml mikrotüpEppendorf0030 120.086
Ibidi µ-18 kuyucuklu lam Ibidi81817#1.5H cam lamelli, işlem görmemiş
Menzel X1000 Lamel 22x50 mm #1.5 (0.16-0.19mm)Thermo Scientific17284904
Çukurlu mikroskop lamlarıMarienfeld Superior1320000
2 ml güvenli kapaklı mikro tüpSarstedt72.695.5002 ml 'Eppendorf' tüpü, yuvarlak tabanlı
Çözeltiler/tamponlar
1x Antikor dilüent/bloklayıcıAkoya BiosciencesARD1001EA
Ambion™ RnaseZap™ RNaz Dekontaminasyon SolüsyonuAmbion9780.9782
Sitrattan maske çözücü tamponVector labs H-3300Antijen maskesi çözücü solüsyon olarak etiketlenmiş,
sitrik asit bazlı
Dimetil sülfoksit (DMSO)Merck (Sigma-Aldrich)D8418
Hanks' Dengeli Tuz Çözeltisi 10xMerck (Sigma-Aldrich)H4641
Hidrojen peroksit çözeltisiMerck (Sigma-Aldrich)H1009H2O içinde %30 (a/a)
MetanolMerck (Sigma-Aldrich)32213-2.5L-M
Normal eşek serumu AbcamAb7475%100 stok konsantrasyonu,
%10 nihai konsantrasyon
Paraformaldehit (PFA) tozuMerck (Sigma-Aldrich)158127-500gSu ile %4'e seyreltin. Çeker ocak içerisinde hazırlayın. Isıtıcı blok üzerinde karıştırın ve çözünmeyi kolaylaştırmak için az miktarda NaOH ekleyin. pH 7,2-7,6
Fosfat tamponlu salin (PBS)Merck (Sigma-Aldrich)P4417200 ml distile su başına 1 tablet
Multiplex Floresan Reaktif Kiti v2 için RNAscope 4-Plex Yardımcı KitACD (Bio-Techne)323120HRP-C4 ve HRP bloklayıcı içerir
RNAscope™ Multiplex Floresan Tespit Kiti v2 ACD (Bio-Techne)323110Protease Plus ve Protease III içerir,
Proteaz IV, hidrojen peroksit, TSA tamponu,
Amp1/2/3, Hrp-C1/2/3, HRP-bloklayıcı ve DAPI
20X Salin-Sodyum-Sitrata (SSC) tampon çözeltisiFisher BioreagentsBP-1325-1Distile su ile 0,2x konsantrasyona seyreltin
Doku Şeffaflaştırma Reaktifi Cubic-R+(M) [hayvanlar için]Tokyo Chemical IndustryT3741
Triton™ X 100Merck (Sigma-Aldrich)X100
Tween® 20Merck (Sigma-Aldrich)P7949
Ultra saf™ 0,5M EDTA, pH8Invitrogen15575020
Primer antikorlar
Endomüsin antikoru (V.7C7) Santa CruzSC-654951:50 dilüsyon kullanın. 
Islet 1 ve Islet 2 antikoruGelişimsel Çalışmalar Hibridoma Bankası34.4DS-5%50'lik gliserol ile seyreltin. 1:50 dilüsyon kullanın.
PCNA (PC10) Mouse Monoklonal antikoruHücre Sinyalizasyon Teknolojisi2586S1:500 dilüsyon kullanın
P-histon H3 (Ser10) (6G3) Fare Monoklonal antikoruHücre Sinyalizasyon Teknolojisi9706S1:500 dilüsyon kullanın
P-histone H3 (Ser10) (D7N8E) XP® Tavşan Monoklonal antikoruHücre Sinyalizasyon Teknolojisi53348S1:500 dilüsyon kullanın
Sox10 (E6B6I) XP® Tavşan Monoklonal Antikoru Hücre Sinyalizasyon Teknolojisi69661S1:500 seyreltme kullanın
Sekonder antikorlar/nükleer boyalar
AlexaFluor® 488-konjuge Affinipure® Eşek anti-fare IgG (H+L)Jackson Immunoresearch715-545-1511:500 dilüsyon kullanın
AlexaFluor® 647 konjuge Affinipure®  Eşek anti-sıçan IgG (H+L)Jackson Immunoresearch712-605-1531:500 dilüsyon kullanın
AlexaFluor® 647-konjuge Affinipure® F(ab')2 Fragmanı Eşek anti-fare IgG (H+L)Jackson Immunoresearch715-606-1501:500 dilüsyon kullanın
Cy™3 Affinipure® Eşek anti-Tavşan IgG (H+L)Jackson Immunoresearch711-165-1521:500 dilüsyon kullanın
DAPIMerck (Sigma-Aldrich)D9542Kullanım yeri 1 µg/ml
RNAscope probları
RNAscope® Prob - Mm Sp5-C4ACD (Bio-Techne)405681-C4C4 probu
RNAscope® Prob - Mm-Dlx2-C3ACD (Bio-Techne)555951-C3C3 probu
RNAscope® Prob - Mm-Msx1ACD (Bio-Techne)421841C1 probu
RNAscope® Prob - Mm-Sox10-C2ACD (Bio-Techne)435931-C2C2 probu
RNAscope floroforlar
Opal 780 Reaktif PaketiAkoya BiosciencesFP1501001KT Opal 780 reaktifi, Opal TSA-DIG içerir,
DMSO
TSA-vivid™ fluorofor 520ACD (Bio-Techne)323271şimdi ClariTSA™ fluorofor 520
TSA-canlı™ fluorofor 570ACD (Bio-Techne)323272şimdi ClariTSA™ fluorofor 570
TSA-vivid™ florofor 650ACD (Bio-Techne)323273şimdi ClariTSA™ fluorofor 650
Ekipman/yazılım
Fluoview FV4000 lazer tarama  mikroskopBelirginfv4000Uyarım lazerleri: 405/488/561/640/730 nm.
Saptanan dalga boyu (Şekil 3): 430-470, 500-540, 570-620,
650-710, 750-850 nm. Tespit edilen dalga boyu (Şekil 4) 430-470,
500-531, 570-620 nm.
Graphpad Prism 10Graphpadv10.6.1
Isıtma bloğuHibeQBT1
Hybrigene hibridizasyon fırınıTechne (Bibby Scientific)FHB4DD
Ixplore IX83 SpinSR Süper Çözünürlüklü Mikroskop SistemiOlympusixplore-ix83-spinsrUyarılma lazerleri: 405/488/561/640 nm.
Emisyon filtreleri: 447/60, 525/50, 617/73, 685/40. 
Zeiss Arivis Pro Carl Zeiss Microscopy GmbHsürüm 4.5 (önceki adı Arivis Vision 4D)
Zeiss Arivis SIS dönüştürücüCarl Zeiss Microscopy GmbHv. 4.3.0

Kaynaklar

  1. Bruter AV, Varlamova EA, Okulova YD, Tatarskiy VV, Silaeva YY, Filatov MA. Genetically modified mice as a tool for the study of human diseases. Mol Biol Rep. 2024;51(1):135.
  2. Rashbrook VS, Brash JT, Ruhrberg C. Cre toxicity in mouse models of cardiovascular physiology and disease. Nat Cardiovasc Res. 2022;1:806–16.
  3. Breschi A, Gingeras TR, Guigo R. Comparative transcriptomics in human and mouse. Nat Rev Genet. 2017;18(7):425–40.
  4. Mole MA, Weberling A, Zernicka-Goetz M. Comparative analysis of human and mouse development: From zygote to pre-gastrulation. Curr Top Dev Biol. 2020;136:113–38.
  5. Krishnan A, Samtani R, Dhanantwari P, Lee E, Yamada S, Shiota K, et al. A detailed comparison of mouse and human cardiac development. Pediatr Res. 2014;76(6):500–7.
  6. Anderson RH, Bamforth SD. Morphogenesis of the Mammalian Aortic Arch Arteries. Front Cell Dev Biol. 2022;10:892900.
  7. Wessels A, Sedmera D. Developmental anatomy of the heart: a tale of mice and man. Physiol Genomics. 2003;15(3):165–76.
  8. Gall JG, Pardue ML. Formation and detection of RNA-DNA hybrid molecules in cytological preparations. Proc Natl Acad Sci U S A. 1969;63(2):378–83.
  9. John HA, Birnstiel ML, Jones KW. RNA-DNA hybrids at the cytological level. Nature. 1969;223(5206):582–7.
  10. Buongiorno-Nardelli M, Amaldi F. Autoradiographic detection of molecular hybrids between RNA and DNA in tissue sections. Nature. 1970;225(5236):946–8.
  11. Dakou E, Vanbekbergen N, Corradi S, Kemp CR, Willems E, Leyns L. Whole-mount in situ hybridization (WISH) optimized for gene expression analysis in mouse embryos and embryoid bodies. Methods Mol Biol. 2014;1211:27–40.
  12. Anderson R. Multiplex fluorescence in situ hybridization (M-FISH). Methods Mol Biol. 2010;659:83–97.
  13. Kearney L. Multiplex-FISH (M-FISH): technique, developments and applications. Cytogenet Genome Res. 2006;114(3-4):189–98.
  14. Burnett R, Guichard Y, Barale E. Immunohistochemistry for light microscopy in safety evaluation of therapeutic agents: an overview. Toxicology. 1997;119(1):83–93.
  15. Coons AH, Creech HJ, Jones RN. Immunological properties of an antibody containing a fluorescent group. P Soc Exp Biol Med. 1941;47(2):200–2.
  16. Bardot E, Tzavaras N, Benson DL, Dubois NC. Quantitative Whole-mount Immunofluorescence Analysis of Cardiac Progenitor Populations in Mouse Embryos. J Vis Exp. 2017(128).
  17. Wang F, Flanagan J, Su N, Wang LC, Bui S, Nielson A, et al. RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. J Mol Diagn. 2012;14(1):22–9.
  18. Erben L, Buonanno A. Detection and Quantification of Multiple RNA Sequences Using Emerging Ultrasensitive Fluorescent In Situ Hybridization Techniques. Curr Protoc Neurosci. 2019;87(1):e63.
  19. De Bono C, Lescroart F, Zaffran S. How to Study Gene Expression and Gain of Function of Hoxb1 in Mouse Heart Development. Methods Mol Biol. 2025;2889:121–37.
  20. Zhao R, Moore EL, Gogol MM, Unruh JR, Yu Z, Scott AR, et al. Identification and characterization of intermediate states in mammalian neural crest cell epithelial to mesenchymal transition and delamination. Elife. 2024;13.
  21. Guijarro C, Kelly RG. On the involvement of the second heart field in congenital heart defects. C R Biol. 2024;347:9–18.
  22. Bradshaw L, Chaudhry B, Hildreth V, Webb S, Henderson DJ. Dual role for neural crest cells during outflow tract septation in the neural crest-deficient mutant Splotch(2H). J Anat. 2009;214(2):245–57.
  23. Zawada D, Kornherr J, Meier AB, Santamaria G, Dorn T, Nowak-Imialek M, et al. Retinoic acid signaling modulation guides in vitro specification of human heart field-specific progenitor pools. Nat Commun. 2023;14(1):1722.
  24. Rabadan MA, Herrera A, Fanlo L, Usieto S, Carmona-Fontaine C, Barriga EH, et al. Delamination of neural crest cells requires transient and reversible Wnt inhibition mediated by Dact1/2. Development. 2016;143(12):2194–205.
  25. Bhattacharya D, Rothstein M, Azambuja AP, Simoes-Costa M. Control of neural crest multipotency by Wnt signaling and the Lin28/let-7 axis. Elife. 2018;7.
  26. Kishimoto K, Furukawa KT, Luz-Madrigal A, Yamaoka A, Matsuoka C, Habu M, et al. Bidirectional Wnt signaling between endoderm and mesoderm confers tracheal identity in mouse and human cells. Nat Commun. 2020;11(1):4159.
  27. De Bono C, Liu Y, Ferrena A, Valentine A, Zheng D, Morrow BE. Single-cell transcriptomics uncovers a non-autonomous Tbx1-dependent genetic program controlling cardiac neural crest cell development. Nat Commun. 2023;14(1):1551.
  28. Hazra R, Spector DL. Simultaneous visualization of RNA transcripts and proteins in whole-mount mouse preimplantation embryos using single-molecule fluorescence in situ hybridization and immunofluorescence microscopy. Front Cell Dev Biol. 2022;10:986261.
  29. Kann AP, Krauss RS. Multiplexed RNAscope and immunofluorescence on whole-mount skeletal myofibers and their associated stem cells. Development. 2019;146(20).

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

B t n BoyamaProtein EkspresyonuRNAscope Boyamamm nofloresan BoyamaMultipleks TespitKonfokal G r nt leme3B AnalizEmbriyonik Geli im

Bu makale yayımlandı

Video yakında

Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.