Kronik Glomerulonefrit ile İlgili İnflamatuar ve Profibrotik Mezangiyal Hücre Modellerinde β-sitosterolün Ağ Rehberli Değerlendirmesi

Özet

Bu çalışma, Cordyceps sinensis bileşenleri ile kronik glomerulonefrite ilişkili süreçler arasındaki aday bileşik-hedef ilişkilerini değerlendirmek için ağ farmakolojisini, doğrulanmış moleküler kenetlenmeyi ve in vitro deneyleri entegre etmektedir. Bileşik düzeyinde doğrulama için β-Sitosterol seçilmiş ve mezanjiyal hücre modellerinde inflamatuar ve profibrotik aktivasyonu hafiflettiği belirlenmiştir.

Özet

Kronik glomerulonefrit (CGN), kalıcı inflamatuar hasar ve progresif fibrotik yeniden şekillenme ile karakterize edilir, ancak doğal ürün tabanlı müdahalelerin temelindeki bileşik-hedef ilişkileri henüz tam olarak tanımlanmamıştır. Bu çalışma, Cordyceps sinensis (C. sinensis) bileşen adaylarının CGN ile ilişkili patolojik süreçlerdeki etkilerini değerlendirmek için ağ farmakolojisi, doğrulanmış moleküler kenetleme ve in vitro deneyleri entegre etmiştir. C. sinensis bileşen adayları taranmış ve Geleneksel Çin Tıbbı Sistemler Farmakolojisi Veritabanı ve Analiz Platformu'ndan türetilen bileşik ilişkili hedefler, CGN ile ilişkili genlerle kesiştirilmiştir. Biyolojik süreçleri ve merkez hedefleri önceliklendirmek için fonksiyonel zenginleştirme ve protein-protein etkileşim analizleri kullanılmıştır. PTGS2 temel örtüşen hedef olarak belirlenmiştir. Moleküler kenetleme, celecoxib bağlı bir COX-2 yapısı kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Birlikte kristalize edilmiş celecoxib ligandının yeniden kenetlenmesi, 0.876 Å'lik bir RMSD ile kristalografik pozu yeniden üretmiş ve böylece kenetleme protokolünü desteklemiştir. β-Sitosterol ve linoleyl asetat, sırasıyla −7.2 ve −7.5 kcal/mol bağlanma afiniteleri ile COX-2 kenetleme bölgesiyle öngörülen bir uyumluluk göstermiştir. HBZY-1 sıçan glomerüler mezangiyal hücrelerinde bileşik düzeyinde doğrulama için β-Sitosterol seçilmiştir. 0.5–10 µM konsantrasyonlarda, β-sitosterol hücre canlılığını belirgin şekilde azaltmamıştır. Lipopolisakkarit (LPS) ile stimüle edilen hücrelerde β-sitosterol; Tnf, Il6 ve Ptgs2 ekspresyonunu azaltmış, prostaglandin E2 (PGE2) üretimini düşürmüş ve siklooksijenaz-2 (COX-2) protein bolluğunu azaltmıştır. Transforme edici büyüme faktörü β1 (TGF-β1) ile işlem görmüş hücrelerde β-sitosterol, Col1a1 ve Acta2 ekspresyonunu azaltmış ve alfa-düz kas aktini (α-SMA) protein bolluğunu düşürmüştür. Bu bulgular, β-sitosterolün mezangiyal hücre modellerinde inflamatuar ve profibrotik aktivasyonu modüle ettiğine dair hipotez oluşturucu kanıtlar sağlamaktadır; ancak doğrudan COX-2 enzimatik inhibisyonunu veya CGN'de terapötik etkinliği kanıtlamamaktadır.

Giriş

Kronik glomerulonefrit (CGN), kronik böbrek hastalığına ve son evre böbrek hastalığına ilerleyebilen heterojen bir glomerüler bozukluklar grubunu kapsar¹. Kalıcı glomerüler hasar, inflamatuar aktivasyon ve progresif fibrotik yeniden şekillenme ile karakterizedir^2,3. Seçilmiş hastalarda kortikosteroidler ve immünosüpresif ajanlar kullanılsa da, birçok vakada uzun süreli hastalık kontrolü zor olmaya devam etmekte ve tedaviyle ilişkili yan etkiler yaygın görülmektedir^1,4,5. CGN'nin ilerlemesi; imm....

Protokol

Ağ farmakolojisi ve biyoinformatik analizleri, halka açık veri tabanlarına dayandırılmış olup insan katılımcıları veya hayvanları kapsamamıştır. in vitro deneyler, yerleşik bir hücre hattı kullanılarak gerçekleştirilmiş olup kurumsal gerekliliklere göre etik onay gerektirmemiştir.

Aday bileşen taraması ve hedef geri kazanımı

Aday bileşenler ve bunlara karşılık gelen hedefler, 13 Temmuz 2025 tarihinde “dongchongxiacao” arama terimi kullanılarak Geleneksel Çin Tıbbı Sistem Farmakolojisi Veri Tabanı ve Analiz Platformu'ndan (TCMSP) elde edilmiştir. Tahmin edilen oral biyoyararlanımı en az %30....

Sonuçlar

Aday Bileşen Taraması, Hedef Geri Çağırma ve Hedef Kesişimi

Aday bileşik-hastalık örtüşen hedeflerinin belirlenmesine yönelik iş akışı Şekil 1A'da özetlenmiştir. C. sinensis'in araşidonik asit, linoleil asetat, β-sitosterol, peroksiergosterol, serevisterol, kolesteril palmitat ve CLR dahil olmak üzere yedi aday bileşiği, OB ≥%30 ve DL ≥0,18 şeklinde önceden tanımlanmış tarama kriterlerini karşılamıştır (Tablo 2). Paralel .......

Tartışma

Bu çalışma, C. sinensis'in aday bileşenlerinden türetilen PTGS2 ilişkili bir hipotezi incelemek için ağ farmakolojisini, referans ligand doğrulamalı moleküler kenetlenmeyi ve bileşik düzeyinde deneyleri entegre etmiştir. Yedi bileşen önceden tanımlanmış TCMSP tarama kriterlerini karşılamış ve 23 hedef glomerülonefrit ilişkili gen setiyle örtüşmüştür. Protein etkileşim analizi dokuz merkezi hedefi önceliklendirmiş ve bunlar arasından PTGS2, kenetlenme ve deneysel değerlendirme için seçilmiştir. .......

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Mutlak etanol	Sigma-Aldrich/Merck	E7023	200 proof, denatüre edilmemiş moleküler biyoloji sınıfı etanol; β-sitosterol stok çözeltisi için çözücü.
AutoDock Vina	Scripps Research	Version 1.1.2	Moleküler kenetlenme (docking) simülasyonu
Biyogüvenlik kabini	Thermo Fisher Scientific	1300 Series A2	Steril hücre kültürü işlemleri
Celecoxib	MedChemExpress	HY-14398	Pozitif kontrol olarak kullanılan selektif COX-2 inhibitörü; DMSO içinde 10 mM stok.
Cell Counting Kit-8	Dojindo Molecular Technologies, Inc.	CK04	Hücre canlılığı için WST-8 kolorimetrik testi; absorbans 450 nm'de ölçülmüştür.
Kemilüminesans görüntüleme sistemi	Bio-Rad Laboratories	ChemiDoc MP	Western blot görüntüleme
clusterProfiler R paketi	Bioconductor	Version 4.10.0	GO ve KEGG zenginleştirme analizi
CO2 hücre kültürü inkübatörü	Thermo Fisher Scientific	Forma Series II 3111	37 °C ve %5 CO2'de hücre kültürü inkübasyonu
COX-2 (D5H5) Tavşan Monoklonal Antikoru	Cell Signaling Technology	12282	İnsan, fare ve sıçan COX-2 için doğrulanmış Western blot; 1:1.000 oranında kullanılmıştır.
CytoNCA eklentisi	Cytoscape App Store	Version 2.1.6	Hub hedef topolojik analizi
Cytoscape yazılımı	Cytoscape Consortium	Version 3.8.0	Ağ görselleştirme ve analizi
Dimetil sülfoksit	Sigma-Aldrich/Merck	D2650	Steril filtrelenmiş BioReagent, ≥99,7%; celecoxib stok çözeltisi için çözücü.
DisGeNET veri tabanı	Integrative Biomedical Informatics Group	Uygulanamaz	Glomerülonefrit için hastalık-gen sorgulama
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Gibco/Thermo Fisher Scientific	C11995500BT	HBZY-1 hücre kültürü için bazal besiyeri
Geliştirilmiş kemilüminesans substratı	Beyotime Biotechnology	P0018S	Western blot bant görselleştirmesi
Fetal bovin serumu	Gibco/Thermo Fisher Scientific	10099-141C	Hücre kültürü serum takviyesi
GAPDH (D16H11) Tavşan Monoklonal Antikoru	Cell Signaling Technology	5174	Western blot yükleme kontrolü; insan, fare ve sıçan GAPDH ile reaktif; kurum içi optimizasyon sonrası 1:5.000 oranında kullanılmıştır.
GeneCards veri tabanı	Weizmann Institute of Science	NA	Glomerülonefrit ile ilişkili genlerin sorgulanması
GraphPad Prism	GraphPad Software	Version 9.0.0.121	In vitro deneysel verilerin istatistiksel analizi
HRP-konjuge keçi anti-tavşan IgG	Proteintech Group	SA00001-2	Tavşan primer antikorları için sekonder antikor
ImageJ yazılımı	National Institutes of Health	Version 1.54	Western blot densitometrik analizi
Ters faz-kontrast mikroskobu	Olympus	CKX53	Hücre morfolojisi gözlemi
org.Hs.eg.db R paketi	Bioconductor	Version 3.18.0	Zenginleştirme analizi için insan gen anotasyonu
Penisilin-Streptomisin çözeltisi	Gibco/Thermo Fisher Scientific	15140122	Hücre kültürü için antibiyotik takviyesi
PGE2 Parametre Test Kiti	R&D Systems, a Bio-Techne brand	KGE004B	Hücre kültürü süpernatantları için çok türlü kompetitif ELISA; test aralığı 39–2.500 pg/mL; 450 nm'de kolorimetrik deteksiyon.
PharmGKB veri tabanı	Pharmacogenomics Knowledgebase	NA	Hastalıkla ilişkili hedef sorgulama
PubChem veri tabanı	National Center for Biotechnology Information	NA	Ligand yapılarının sorgulanması
PVDF membran	Millipore/Merck	IPVH00010	Western blotting için protein transfer membranı
PyMOL moleküler grafik sistemi	Schrödinger, LLC	Version 2.6.2	Kenetlenme pozisyonu görselleştirmesi
R yazılımı	R Foundation for Statistical Computing	Version 4.3.2	Hedef kesişim ve zenginleştirme analizi
Sıçan glomerüler mezangiyal hücre hattı (HBZY-1)	Procell Life Science & Technology Co., Ltd.	CL-0117	In vitro mezangiyal hücre doğrulama modeli
RCSB Protein Veri Bankası	Research Collaboratory for Structural Bioinformatics	PDB ID: 3LN1	PTGS2/COX2 kristal yapısının sorgulanması
Rekombinan insan TGF-β1 proteini	PeproTech, a Thermo Fisher Scientific brand	100-21-10UG	HEK293 kaynaklı rekombinan insan TGF-β1; 10 ng/mL'de profibrotik stimülasyon.
SDS-PAGE elektroforez sistemi	Bio-Rad Laboratories	Mini-PROTEAN Tetra	SDS-PAGE ile protein ayrımı
STRING veri tabanı	ELIXIR/STRING Consortium	Version 12.0	Protein-protein etkileşim ağı oluşturma
TCMSP veri tabanı	Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database	NA	Cordyceps sinensis aday bileşiklerinin taranması
Therapeutic Target Database	Innovative Drug Research and Bioinformatics Group	NA	Terapötik hedef sorgulama
α-SMA primer antikoru	Proteintech Group	14395-1-AP	α-SMA protein ekspresyonu deteksiyonu
β-Sitosterol (saflık >%98)	MedChemExpress	HY-N0171A	CAS 83-46-5; hücre tedavisi için tanımlanmış bileşik; mutlak etanol içinde 10 mM stok.