Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Kronik Glomerulonefrit ile İlgili İnflamatuar ve Profibrotik Mezangiyal Hücre Modellerinde β-sitosterolün Ağ Rehberli Değerlendirmesi

107 görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/73000

⸱

28 Ağustos 2026

 ,  ,  ,  , 
1Hemodialysis Room, Hospital of Traditional Chinese Medicine of Qiqihar, 2Department of Nephrology, Ezhou Central Hospital, 3Department of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine, The First Hospital of Qiqihar, 4Department of Nephrology, Shanghai Minhang Hospital of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Bu çalışma, Cordyceps sinensis bileşenleri ile kronik glomerulonefrite ilişkili süreçler arasındaki aday bileşik-hedef ilişkilerini değerlendirmek için ağ farmakolojisini, doğrulanmış moleküler kenetlenmeyi ve in vitro deneyleri entegre etmektedir. Bileşik düzeyinde doğrulama için β-Sitosterol seçilmiş ve mezanjiyal hücre modellerinde inflamatuar ve profibrotik aktivasyonu hafiflettiği belirlenmiştir.

Özet

Kronik glomerulonefrit (CGN), kalıcı inflamatuar hasar ve progresif fibrotik yeniden şekillenme ile karakterize edilir, ancak doğal ürün tabanlı müdahalelerin temelindeki bileşik-hedef ilişkileri henüz tam olarak tanımlanmamıştır. Bu çalışma, Cordyceps sinensis (C. sinensis) bileşen adaylarının CGN ile ilişkili patolojik süreçlerdeki etkilerini değerlendirmek için ağ farmakolojisi, doğrulanmış moleküler kenetleme ve in vitro deneyleri entegre etmiştir. C. sinensis bileşen adayları taranmış ve Geleneksel Çin Tıbbı Sistemler Farmakolojisi Veritabanı ve Analiz Platformu'ndan türetilen bileşik ilişkili hedefler, CGN ile ilişkili genlerle kesiştirilmiştir. Biyolojik süreçleri ve merkez hedefleri önceliklendirmek için fonksiyonel zenginleştirme ve protein-protein etkileşim analizleri kullanılmıştır. PTGS2 temel örtüşen hedef olarak belirlenmiştir. Moleküler kenetleme, celecoxib bağlı bir COX-2 yapısı kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Birlikte kristalize edilmiş celecoxib ligandının yeniden kenetlenmesi, 0.876 Å'lik bir RMSD ile kristalografik pozu yeniden üretmiş ve böylece kenetleme protokolünü desteklemiştir. β-Sitosterol ve linoleyl asetat, sırasıyla −7.2 ve −7.5 kcal/mol bağlanma afiniteleri ile COX-2 kenetleme bölgesiyle öngörülen bir uyumluluk göstermiştir. HBZY-1 sıçan glomerüler mezangiyal hücrelerinde bileşik düzeyinde doğrulama için β-Sitosterol seçilmiştir. 0.5–10 µM konsantrasyonlarda, β-sitosterol hücre canlılığını belirgin şekilde azaltmamıştır. Lipopolisakkarit (LPS) ile stimüle edilen hücrelerde β-sitosterol; Tnf, Il6 ve Ptgs2 ekspresyonunu azaltmış, prostaglandin E2 (PGE2) üretimini düşürmüş ve siklooksijenaz-2 (COX-2) protein bolluğunu azaltmıştır. Transforme edici büyüme faktörü β1 (TGF-β1) ile işlem görmüş hücrelerde β-sitosterol, Col1a1 ve Acta2 ekspresyonunu azaltmış ve alfa-düz kas aktini (α-SMA) protein bolluğunu düşürmüştür. Bu bulgular, β-sitosterolün mezangiyal hücre modellerinde inflamatuar ve profibrotik aktivasyonu modüle ettiğine dair hipotez oluşturucu kanıtlar sağlamaktadır; ancak doğrudan COX-2 enzimatik inhibisyonunu veya CGN'de terapötik etkinliği kanıtlamamaktadır.

Giriş

Kronik glomerulonefrit (CGN), kronik böbrek hastalığına ve son evre böbrek hastalığına ilerleyebilen heterojen bir glomerüler bozukluklar grubunu kapsar1. Kalıcı glomerüler hasar, inflamatuar aktivasyon ve progresif fibrotik yeniden şekillenme ile karakterizedir2,3. Seçilmiş hastalarda kortikosteroidler ve immünosüpresif ajanlar kullanılsa da, birçok vakada uzun süreli hastalık kontrolü zor olmaya devam etmekte ve tedaviyle ilişkili yan etkiler yaygın görülmektedir1,4,5. CGN'nin ilerlemesi; immün aktivasyon, endotelyal disfonksiyon, oksidatif stres ve ekstraselüler matris birikimi dahil olmak üzere etkileşim halindeki patolojik süreçleri içerir3,6,7. Bu nedenle, inflamatuar ve profibrotik yanıtları birbirine bağlayan moleküler düğümlerin belirlenmesi, hastalıkla ilgili müdahale stratejileri için test edilebilir hipotezler üretilmesine yardımcı olabilir.

Cordyceps sinensis (C. sinensis), böbrekle ilgili klinik ve deneysel bağlamlarda kullanılmış olup çeşitli hastalık modellerinde anti-inflamatuar, anti-apoptotik ve sitoprotektif etkiler gösterdiği bildirilmiştir8,9,10. Ancak, aday bileşenlerinin glomerulonefrit ile ilgili hedeflerle etkileşime girme mekanizmasının moleküler temeli henüz yeterince tanımlanmamıştır11. C. sinensis'in çok bileşenli yapısı ve CGN'nin mekanistik heterojenliği göz önüne alındığında, ağ farmakolojisi, aday bileşik-hedef-yolak ilişkilerini önceliklendirmek için kullanışlı bir çerçeve sunmaktadır12,13.

Bu çalışmada, C. sinensis'in aday bileşenleri ile CGN ile ilişkili patolojik süreçler arasındaki potansiyel moleküler ilişkileri keşfetmek için bileşik tarama, hedef belirleme, hastalık-gen kesişim analizi, fonksiyonel zenginleştirme, protein-protein etkileşim ağı analizi, moleküler kenetleme ve in vitro doğrulama entegre edilmiştir. Bileşik-hastalık ağından merkez bir hedef olarak önceliklendirilen Prostaglandin-endoperoksit sentaz 2 (PTGS2), redocking doğrulamasıyla birlikte celecoxib bağlı siklooksijenaz-2 (COX-2) yapısı kullanılarak moleküler kenetleme ile değerlendirilmiştir. Ağ sonuçlarına, kenetleme analizine ve anti-inflamatuar ile anti-fibrotik aktiviteye dair önceki kanıtlara dayanarak, alt doğrulama için temsili bir aday bileşik olarak β-sitosterol seçilmiştir14,15,16. İnflamatuar aktivasyonu ve COX-2/prostaglandin E2 (PGE2) ile ilişkili yanıtı değerlendirmek için lipopolisakkarit (LPS) ile stimüle edilmiş mezanjiyal hücreler kullanılırken, profibrotik marker ekspresyonunu değerlendirmek için transforme edici büyüme faktörü β1 (TGF-β1) ile indüklenmiş bir model dahil edilmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Ağ farmakolojisi ve biyoinformatik analizleri, halka açık veri tabanlarına dayandırılmış olup insan katılımcıları veya hayvanları kapsamamıştır. in vitro deneyler, yerleşik bir hücre hattı kullanılarak gerçekleştirilmiş olup kurumsal gerekliliklere göre etik onay gerektirmemiştir.

Aday bileşen taraması ve hedef geri kazanımı

Aday bileşenler ve bunlara karşılık gelen hedefler, 13 Temmuz 2025 tarihinde “dongchongxiacao” arama terimi kullanılarak Geleneksel Çin Tıbbı Sistem Farmakolojisi Veri Tabanı ve Analiz Platformu'ndan (TCMSP) elde edilmiştir. Tahmin edilen oral biyoyararlanımı en az %30 ve ilaç benzerliği en az 0,18 olan bileşiklerle çalışılmıştır. Yedi aday bileşen her iki tarama kriterini de karşılamıştır. Tanımlayıcı karşılaştırma için molekül ağırlığı, oral biyoyararlanım, ilaç benzerliği ve mevcut diğer farmakokinetik tanımlayıcılar TCMSP'den kaydedilmiştir.

Elde tutulan bileşenlerle ilişkili bileşik-hedef bilgileri doğrudan TCMSP'den indirilmiştir. Tekrarlanmayan hedef seti oluşturulurken yinelenen hedef girişleri manuel olarak kaldırılmış, ancak orijinal bileşik-hedef ilişkileri sonraki ağ inşası için korunmuştur. TCMSP'nin hedef isimlerini standartlaştırılmış gen sembolleri yerine tam uzunluktaki formlarında sunması nedeniyle, her bir hedef UniProt veri tabanında (14 Temmuz 2025 tarihinde erişilen) aranmıştır. İlgili insan girişi seçilmiş ve hedef adı resmi gen sembolüne dönüştürülmüştür. Standartlaştırılmış bileşik-hedef veri seti, hastalık-hedef kesişimi ve bileşik-hedef ağ analizi için kullanılmıştır.

Glomerülonefrit ile ilişkili genlerin toplanması ve hedef kesişimi

Hastalıkla ilişkili genler; GeneCards, DisGeNET, PharmGKB ve Therapeutic Target Database veritabanlarından 14 Temmuz 2025 tarihinde “glomerulonephritis” arama terimi kullanılarak elde edilmiştir. GeneCards için, 10 olan medyan skorun üzerindeki ilgili kayıtlar tutulmuştur. Diğer veritabanlarından uygun kayıtlar, küratörlü hastalık-hedef açıklamalarına göre dahil edilmiştir. Gen isimleri resmi insan gen sembollerine göre standart hale getirilmiş ve mükerrer kayıtlar çıkarılmıştır. Bu prosedür sonucunda 1.134 benzersiz glomerulonefrit ilişkili gen elde edilmiştir. Arama işleminde daha geniş bir terim olan “glomerulonephritis” kullanıldığı için, ortaya çıkan veri setinin tek bir histopatolojik alt tiple sınırlı olmaktan ziyade, kronik glomerulonefrit ilişkili moleküler süreçlerle ilgili olduğu değerlendirilmiştir.

TCMSP kaynaklı bileşikle ilişkili hedefler, R kullanılarak hastalıkla ilişkili gen setiyle kesiştirildi. Yirmi üç örtüşen hedef belirlendi. Venn diyagramları R'nin venn paketi kullanılarak oluşturuldu ve bileşik-örtüşen hedef ağı Cytoscape kullanılarak kuruldu ve görselleştirildi. Aday bileşenler ve örtüşen hedefler arasındaki ilişkiler Tablo 1'de özetlenmiştir.

Fonksiyonel zenginleştirme ve protein-protein etkileşim analizleri

Gen Ontolojisi (GO) ve Kyoto Gen ve Genom Ansiklopedisi (KEGG) zenginleştirme analizleri, R programında clusterProfiler ve org.Hs.eg.db kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Gen Ontolojisi terimleri; biyolojik süreç, hücresel bileşen ve moleküler fonksiyon kategorilerinde analiz edilmiştir. P değerleri, Benjamini-Hochberg yöntemi kullanılarak çoklu testler için düzeltilmiş ve düzeltilmiş P değerleri 0,05'in altında olan terimler veya yolaklar tutulmuştur. Zenginleşmiş terimler ve yolaklar, bağımsız olarak oluşturulan sütun grafikleri ve nokta grafikleri kullanılarak görüntülenmiştir.

Çakışan 23 hedef, organizma olarak Homo sapiens seçilerek ve 0,4'ten büyük bir minimum etkileşim skoru belirlenerek STRING'e yüklendi. Elde edilen protein-protein etkileşim ağı Cytoscape'e aktarıldı. Ağ topolojisi; derece, arasındalık, yakınlık, özvektör merkeziliği, yerel ortalama bağlanabilirlik ve ağ merkeziliğine dayalı olarak CytoNCA kullanılarak değerlendirildi. Hub hedefler; derece, arasındalık merkeziliği, yakınlık merkeziliği, özvektör merkeziliği, yerel ortalama bağlanabilirlik ve ağ merkeziliği değerlerinin tamamı, ağın ilgili medyan değerlerinden daha yüksek olan düğümler olarak tanımlandı. Bu analiz, sonraki yorumlamalar için dokuz hub hedefi önceliklendirdi.

Moleküler kenetlenme ve yeniden kenetlenme doğrulaması

Moleküler kenetleme, celecoxib bağlı siklooksijenaz-2 yapısı olan PDB ID 3LN1 kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Reseptör hazırlığı sırasında A zinciri ve ilişkili hem grubu reseptör olarak tutulurken, kristalografik su molekülleri ve birlikte kristalleşmiş celecoxib ligandı uzaklaştırılmıştır. Yeniden kenetleme doğrulaması için doğal celecoxib konformasyonu A zincirinden ayrı olarak çıkarılmıştır. AutoDockTools kullanılarak polar hidrojen atomları ve Gasteiger yükleri eklenmiş ve reseptör PDBQT formatında kaydedilmiştir. PDB ID 3LN1, celecoxib'e bağlı fare COX-2'nin 2.40 Å çözünürlükteki yapısıdır. β-sitosterol ve linoleil asetat yapıları PubChem'den alınmış ve Open Babel kullanılarak hazırlanmıştır. Hidrojen atomları ve Gasteiger kısmi yükleri eklenmiş, dönebilir bağlar atanmış ve her bir ligand PDBQT formatına dönüştürülmüştür. Celecoxib, β-sitosterol ve linoleil asetat, aynı reseptör ve arama parametreleri kullanılarak AutoDock Vina ile kenetlenmiştir.

Kenetleme kutusu, şu koordinatlar kullanılarak doğal selekoksib-bağlanma bölgesine merkezlendi: center_x = 30.9886 center_y = -22.2836 center_z = -16.5072 size_x = 26 Å size_y = 26 Å size_z = 26 Å. Kapsamlılık (exhaustiveness) değeri 16, çıktı modlarının sayısı 10 ve enerji aralığı 3 kcal/mol olarak belirlendi. En düşük tahmin edilen bağlanma enerjisine göre en üst sırada yer alan poz, görselleştirme için saklandı. Protokol doğrulaması için doğal selekoksib aynı koşullar altında yeniden kenetlendi ve kristalografik poz ile yeniden kenetlenen poz arasındaki ağır atom kök ortalama kare sapması (RMSD) PyMOL kullanılarak hesaplandı. 2 Å altındaki bir kök ortalama kare sapma, referans pozun kabul edilebilir bir reprodüksiyonu olarak değerlendirildi. Kenetlenen her ligandan 4 Å mesafede bulunan kalıntılar PyMOL'de tanımlandı. Kenetleme skorları ve pozlar, yapısal uyumluluğun tahminleri olarak yorumlandı; hedef bağlanmasının veya enzimatik inhibisyonun doğrudan kanıtı olarak değerlendirilmedi.

Hücre kültürü ve bileşik hazırlama

HBZY-1 sıçan glomerüler mezanjiyal hücreleri, %10 fetal bovine serum ve %1 penicillin-streptomycin ile desteklenmiş yüksek glikozlu Dulbecco’s modified Eagle ortamında, 37 °C'de, nemli koşullar altında ve %5 CO₂ ile kültüre edildi. Tüm deneyler için 2–7 pasajlarındaki hücreler kullanıldı ve kullanım öncesinde mikoplazma içermediği doğrulandı. β-Sitosterol ve celecoxib, kimyasal olarak tanımlanmış bileşikler olarak kullanıldı. β-Sitosterol, 10 mM'lık bir stok çözelti (yaklaşık 4,15 mg/mL) oluşturmak için mutlak etanolden çözüldü. Gerektiğinde, görsel olarak berrak bir çözelti elde etmek için kısa süreli sonikasyon ve 50–60 °C'ye ısıtma işlemleri uygulandı. Celecoxib, 10 mM'lık bir stok çözelti (yaklaşık 3,81 mg/mL) hazırlamak için dimetil sülfokside çözüldü. Stok çözeltiler alikotlara ayrıldı ve −20 °C'de saklandı. İşlemden önce, stoklar önceden ısıtılmış kültür ortamına doğrudan seyreltildi ve hemen karıştırıldı.

Taşıyıcı konsantrasyonları her bir deney içinde eşleştirilmiştir. Hücre canlılığı analizinde, test edilen en yüksek β-sitosterol konsantrasyonu 20 µM olduğu için tüm gruplarda nihai etanol konsantrasyonu %0.2 v/v olarak ayarlanmıştır. LPS kaynaklı inflamasyon deneyinde, tüm gruplarda nihai etanol ve dimetil sülfoksit konsantrasyonları sırasıyla %0.1 ve %0.01 v/v olarak ayarlanmıştır. TGF-β1 kaynaklı profibrotik deneyinde, tüm gruplarda nihai etanol konsantrasyonu %0.1 v/v olarak ayarlanmıştır. Kontrol, LPS ve TGF-β1 gruplarına ilgili taşıyıcıların eşdeğer hacimleri eklenmiştir.

Hücre canlılık analizi

Hücreler, 96 kuyucuklu plakalara kuyucuk başına 100 µL tam besiyeri içinde 5 × 103 hücre yoğunluğunda ekilmiş ve 24 sa boyunca tutunmaya bırakılmıştır. β-sitosterol konsantrasyon aralığını değerlendirmek için hücreler 0,5, 1, 5, 10 veya 20 µM β-sitosterol ile 24 sa boyunca inkübe edilmiştir. LPS ile ilişkili hücre canlılığı analizi için hücreler önce 1, 5 veya 10 µM β-sitosterol ile 2 sa boyunca ön işlemden geçirilmiş, ardından ek 24 sa boyunca 1 µg/mL lipopolisakkaride maruz bırakılmıştır.

Tedavi grupları Kontrol, 0,5 µM β-sitosterol, 1 µM β-sitosterol, 5 µM β-sitosterol, 10 µM β-sitosterol, 20 µM β-sitosterol, LPS, LPS artı 1 µM β-sitosterol, LPS artı 5 µM β-sitosterol ve LPS artı 10 µM β-sitosterol olarak belirlendi. Kuyu başına 10 µL Cell Counting Kit-8 reaktifi eklendi ve plaklar 2 s boyunca inkübe edildi. Ardından 450 nm'de absorbans kaydedildi. Hücre canlılığı, hücre içermeyen boş kontrol çıkarıldıktan sonra belirlendi ve Kontrol grubuna göre ifade edildi. Her koşul, altı bağımsız biyolojik deneyin her birinde altı teknik kuyu içeriyordu. İstatistiki analiz için tek bir biyolojik replika değeri oluşturmak amacıyla, her deneyden elde edilen teknik kuyu değerlerinin ortalaması alındı.

LPS ile indüklenen inflamatuar aktivasyon

İnflamatuar aktivasyon deneyleri için, HBZY-1 hücreleri 6 kuyucuklu plaklara kuyucuk başına 2 × 105 hücre yoğunluğunda ekildi ve yaklaşık %70%–80% konfluense ulaştıktan sonra işlem gördü. Hücreler, işlemden önce 12 sa boyunca %1 fetal bovine serum ile desteklenmiş ortamda tutuldu. β-Sitosterol veya celecoxib, LPS stimülasyonundan 2 sa önce uygulandı. Ardından hücreler 24 sa boyunca 1 µg/mL LPS'ye maruz bırakıldı.

Deneysel gruplar Kontrol, β$\beta$-sitosterol ekleyin 10 µM, LPS, LPS artı β-sitosterol ekleyin 1 µM, LPS artısı β-sitosterol ekleyin 5 µM, LPS artı β-sitosterol at 10 µMve LPS artı celecoxib şeklinde 1 µMCOX-2 bağımlı prostaglandin üretiminin inhibisyonu için fonksiyonel bir pozitif kontrol olarak Celecoxib dahil edilmiştir. Tedavinin sonunda, PGE2 ölçümü için kültür süpernatantları toplanmıştır. Hücreler, şunların kantitatif gerçek zamanlı PCR analizi için ayrı olarak toplanmıştır: Tnf, Il6ve Ptgs2 ve COX-2'nin western blot analizi için.

TGF-β1 kaynaklı profibrotik aktivasyon

Profibrotik aktivasyonu değerlendirmek için ayrı bir TGF-β1-indüklenen model kullanılmıştır. HBZY-1 hücreleri, kuyuk başına 2 × 105 hücre yoğunluğunda 6 kuyucuklu plakalara ekilmiş ve işlemden önce 12 sa boyunca %1 fetal bovine serum ile desteklenmiş ortamda tutulmuştur. Hücreler 2 sa boyunca β-sitosterol ile ön işlemden geçirilmiş, ardından 48 sa boyunca 10 ng/mL rekombinant TGF-β1 ile stimüle edilmiştir.

Tedavi grupları Kontrol, β-sitosterol (10 µM), TGF-β1, TGF-β1 + β-sitosterol (5 µM) ve TGF-β1 + β-sitosterol (10 µM) şeklinde düzenlenmiştir. Tedavi süresinin sonunda hücreler, Col1a1 ve Acta2 genlerinin kantitatif gerçek zamanlı PCR analizi ile alfa-düz kas aktinin (α-SMA) western blot analizi için toplanmıştır.

Kantitatif gerçek zamanlı PCR

Toplam RNA, üretici protokolüne uygun olarak fenol-guanidinyum bazlı bir RNA ekstraksiyon reaktifi kullanılarak işlem görmüş hücrelerden izole edildi. RNA konsantrasyonu ve saflığı bir spektrofotometre kullanılarak belirlendi. Ters transkripsiyon için yalnızca A260/A280 oranı 1,8–2,0 olan örnekler kullanıldı. Her örnek için 1 µg toplam RNA, 20 µL son reaksiyon hacminde tamamlayıcı DNA'ya ters transkribe edildi. Elde edilen tamamlayıcı DNA, kantitatif PCR öncesinde nükleaz içermeyen su ile beş kat seyreltildi. Kantitatif PCR; 10 µL 2× SYBR Green master mix, her birinden 0,4 µL 10 µM ileri ve geri primer, 2 µL seyreltilmiş tamamlayıcı DNA ve 7,2 µL nükleaz içermeyen su içeren toplam 20 µL hacimde gerçekleştirildi. Amplifikasyon koşulları, 95 °C'de 30 s boyunca başlangıç denatürasyon adımından sonra, 95 °C'de 5 s denatürasyon ve 60 °C'de 30 s bağlanma-uzama şeklinde 40 döngüden oluştu. Amplifikasyon özgüllüğünü doğrulamak için ardından 65 °C'den 95 °C'ye kadar bir erime eğrisi analizi yapıldı.

Ölçülen genler Tnf, Il6, Ptgs2, Col1a1, Acta2 ve Gapdh idi. Gapdh internal referans gen olarak kullanıldı. Bağıl gen ekspresyonu, Kontrol grubu kalibratör olarak kullanılarak 2−ΔΔCt yöntemiyle belirlendi. Primer dizileri Ek Tablo 1'de sunulmuştur. Her örnek teknik olarak üç tekrarlı analiz edildi ve altı bağımsız biyolojik deney gerçekleştirildi. Teknik tekrarlardan elde edilen değerler, istatistiksel analizden önce ortalaması alındı.

Enzim bağlı immünosorbent assay ile PGE2 ölçümü

Kültür süpernatantları 24 saatlik LPS stimülasyonunun ardından toplandı ve hücre kalıntılarını uzaklaştırmak için 4 °C'de 10 dakika boyunca 1,000 × g hızda santrifüj edildi. PGE2 konsantrasyonları, ticari olarak temin edilebilen bir enzim bağlı immünosorbent assay kiti kullanılarak üreticinin talimatlarına göre belirlendi.

Standartlar ve örnekler, analiz plağına ikişer kez (duplicate) yüklendi. Antikor bağlanma ve renk geliştirme aşamaları tamamlandıktan sonra, bir mikroplaka okuyucu kullanılarak 450 nm'de absorbans kaydedildi. PGE2 konsantrasyonları, dört parametreli lojistik standart eğrisinden belirlendi ve pg/mL olarak ifade edildi. Altı bağımsız hücre deneyinden elde edilen süpernatanlar analiz edildi. Her biyolojik örnek için yapılan çift ölçümler, istatistiksel analizden önce ortalandı.

Western blotting

İşlem görmüş hücreler, bir proteaz inhibitör karışımı ile desteklenmiş radyoimmünopresipitasyon analiz tamponunda lizlendi. Lizatlar buz üzerinde 30 dk boyunca inkübe edildi ve 4 °C'de 12,000 × g'de 15 dk boyunca santrifüj edildi. Süpernatantlardaki protein konsantrasyonları, bisinkoninik asit protein analizi kullanılarak belirlendi. Eşit miktarlarda protein (şerit başına 30 µg), yükleme tamponu ile karıştırıldı ve 95 °C'de 5 dk boyunca denatüre edildi. LPS deneylerinden elde edilen proteinler %10 sodyum dodesil sülfat-poliakrilamid jellerinde, TGF-β1 deneylerinden elde edilenler ise %12'lik jellerde ayrıştırıldı. Ayrıştırılan proteinler daha sonra poliviniliden florür membranlara aktarıldı.

Membranlar, %0,1 Tween 20 içeren Tris tamponlu salinde %5 yağsız süt ile oda sıcaklığında 1 saat boyunca bloke edildi ve ardından COX-2 (1:1000), α-SMA (1:1000) ve GAPDH (1:5000) primer antikorları ile 4 °C'de gece boyunca inkübe edildi. COX-2, LPS deneyinden alınan örneklerde; α-SMA ise TGF-β1 deneyinden alınan örneklerde analiz edildi. Yıkama işleminin ardından membranlar, horseradish peroksidaz konjugeli sekonder antikorlar (1:5000) ile oda sıcaklığında 1 saat boyunca inkübe edildi. Protein bantları, geliştirilmiş kemilüminesans substratı kullanılarak görselleştirildi ve bir kemilüminesans görüntüleme sistemi ile kaydedildi. Pozlama süreleri COX-2 için yaklaşık 10 s, α-SMA için 10 s ve GAPDH için 2 s olarak belirlendi.

Bant yoğunlukları ImageJ kullanılarak nicelendirilmiştir. COX-2 ve α-SMA sinyalleri, karşılık gelen GAPDH sinyaline göre normalize edilmiştir. Western blotting, altı bağımsız hücre kültürü ve tedavi deneyinden elde edilen protein örnekleri kullanılarak gerçekleştirilmiştir.

İstatistiki analiz

İstatistiksel analizler GraphPad Prism kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Veriler ortalama ± standart sapma olarak sunulmuştur. Her bir nicel analiz için altı bağımsız hücre kültürü ve uygulama deneyi yapılmış olup, her bağımsız deney bir biyolojik tekrarlığı temsil etmektedir. Aynı biyolojik deneyden elde edilen teknik tekrarlı ölçümler, istatistiksel analizden önce ortalaması alınmış ve bağımsız gözlemler olarak değerlendirilmemiştir.

Hücre canlılığı analizi için, her biyolojik deney koşul başına altı teknik kuyucuk içermiştir. Kantitatif PCR reaksiyonları her biyolojik örnek için teknik olarak üç tekrarlı, PGE2 ölçümleri ise çift tekrarlı olarak gerçekleştirilmiştir. Western blot kantifikasyonu, bağımsız olarak hazırlanan altı protein örneğine dayandırılmıştır. Bu nedenle, her kantitatif sütun altı bireysel biyolojik replikat değeri içermektedir.

Birden fazla grup arasındaki farklar, tek yönlü varyans analizi ve ardından Tukey çoklu karşılaştırma testi kullanılarak analiz edildi. İki yönlü P değer < 0,05 istatistiksel olarak anlamlı kabul edildi. Bireysel biyolojik tekrarlamanın değerleri, ortalama ve standart sapma ile birlikte gösterildi.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Aday Bileşen Taraması, Hedef Geri Çağırma ve Hedef Kesişimi

Aday bileşik-hastalık örtüşen hedeflerinin belirlenmesine yönelik iş akışı Şekil 1A'da özetlenmiştir. C. sinensis'in araşidonik asit, linoleil asetat, β-sitosterol, peroksiergosterol, serevisterol, kolesteril palmitat ve CLR dahil olmak üzere yedi aday bileşiği, OB ≥%30 ve DL ≥0,18 şeklinde önceden tanımlanmış tarama kriterlerini karşılamıştır (Tablo 2). Paralel ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Bu çalışma, C. sinensis'in aday bileşenlerinden türetilen PTGS2 ilişkili bir hipotezi incelemek için ağ farmakolojisini, referans ligand doğrulamalı moleküler kenetlenmeyi ve bileşik düzeyinde deneyleri entegre etmiştir. Yedi bileşen önceden tanımlanmış TCMSP tarama kriterlerini karşılamış ve 23 hedef glomerülonefrit ilişkili gen setiyle örtüşmüştür. Protein etkileşim analizi dokuz merkezi hedefi önceliklendirmiş ve bunlar arasından PTGS2, kenetlenme ve deneysel değerlendirme için seçilmiştir. ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar, herhangi bir çıkar çatışması olmadığını beyan ederler. Dil düzenlemesine ve şematik figürlerin ön tasarımına yardımcı olmak için yapay zeka tabanlı araçlar (ChatGPT, OpenAI) kullanılmıştır. Şekil 1A ve 7'nin ön grafik taslaklarının hazırlanmasına yardımcı olmak için Üretken Yapay Zeka kullanılmış, ardından bu taslaklar bildirilen yöntemler ve sonuçlarla tutarlılığı sağlamak amacıyla yazarlar tarafından incelenmiş ve revize edilmiştir. Yapay zeka destekli tüm çıktılar yazarlar tarafından kritik bir şekilde değerlendirilmiş ve onaylanmıştır. Yazarlar, nihai figür içeriğini doğrulamış ve makalenin bütünlüğü ile doğruluğu konusunda tüm sorumluluğu üstlenmişlerdir.

Teşekkürler

Bu çalışma, Entegre Geleneksel Çin ve Batı Tıbbı Nefropati Karakteristik Uzmanlık Alanı (ZYTSZK2-3) ve Kronik Hastalık Yönetimi Perspektifinden Kronik Böbrek Hastalığının Geleneksel Çin Tıbbı Müdahale Stratejisi Üzerine Çalışma (202240169) tarafından desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Mutlak etanolSigma-Aldrich/MerckE7023200 proof, denatüre edilmemiş moleküler biyoloji sınıfı etanol; β-sitosterol stok çözeltisi için çözücü.
AutoDock VinaScripps ResearchVersion 1.1.2Moleküler kenetlenme (docking) simülasyonu
Biyogüvenlik kabiniThermo Fisher Scientific1300 Series A2Steril hücre kültürü işlemleri
CelecoxibMedChemExpressHY-14398Pozitif kontrol olarak kullanılan selektif COX-2 inhibitörü; DMSO içinde 10 mM stok.  
Cell Counting Kit-8Dojindo Molecular Technologies, Inc.CK04Hücre canlılığı için WST-8 kolorimetrik testi; absorbans 450 nm'de ölçülmüştür.
Kemilüminesans görüntüleme sistemiBio-Rad LaboratoriesChemiDoc MPWestern blot görüntüleme
clusterProfiler R paketiBioconductorVersion 4.10.0GO ve KEGG zenginleştirme analizi
CO2 hücre kültürü inkübatörüThermo Fisher ScientificForma Series II 311137 °C ve %5 CO2'de hücre kültürü inkübasyonu
COX-2 (D5H5) Tavşan Monoklonal AntikoruCell Signaling Technology12282İnsan, fare ve sıçan COX-2 için doğrulanmış Western blot; 1:1.000 oranında kullanılmıştır.
CytoNCA eklentisiCytoscape App StoreVersion 2.1.6Hub hedef topolojik analizi
Cytoscape yazılımıCytoscape ConsortiumVersion 3.8.0Ağ görselleştirme ve analizi
Dimetil sülfoksitSigma-Aldrich/MerckD2650Steril filtrelenmiş BioReagent, ≥99,7%; celecoxib stok çözeltisi için çözücü.
DisGeNET veri tabanıIntegrative Biomedical Informatics GroupUygulanamazGlomerülonefrit için hastalık-gen sorgulama
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)Gibco/Thermo Fisher ScientificC11995500BTHBZY-1 hücre kültürü için bazal besiyeri
Geliştirilmiş kemilüminesans substratıBeyotime BiotechnologyP0018SWestern blot bant görselleştirmesi
Fetal bovin serumuGibco/Thermo Fisher Scientific10099-141CHücre kültürü serum takviyesi
GAPDH (D16H11) Tavşan Monoklonal AntikoruCell Signaling Technology5174Western blot yükleme kontrolü; insan, fare ve sıçan GAPDH ile reaktif; kurum içi optimizasyon sonrası 1:5.000 oranında kullanılmıştır.
GeneCards veri tabanıWeizmann Institute of ScienceNAGlomerülonefrit ile ilişkili genlerin sorgulanması
GraphPad PrismGraphPad SoftwareVersion 9.0.0.121In vitro deneysel verilerin istatistiksel analizi
HRP-konjuge keçi anti-tavşan IgGProteintech GroupSA00001-2Tavşan primer antikorları için sekonder antikor
ImageJ yazılımıNational Institutes of HealthVersion 1.54Western blot densitometrik analizi
Ters faz-kontrast mikroskobuOlympusCKX53Hücre morfolojisi gözlemi
org.Hs.eg.db R paketiBioconductorVersion 3.18.0Zenginleştirme analizi için insan gen anotasyonu
Penisilin-Streptomisin çözeltisiGibco/Thermo Fisher Scientific15140122Hücre kültürü için antibiyotik takviyesi
PGE2 Parametre Test KitiR&D Systems, a Bio-Techne brandKGE004BHücre kültürü süpernatantları için çok türlü kompetitif ELISA; test aralığı 39–2.500 pg/mL; 450 nm'de kolorimetrik deteksiyon.
PharmGKB veri tabanıPharmacogenomics KnowledgebaseNAHastalıkla ilişkili hedef sorgulama
PubChem veri tabanıNational Center for Biotechnology InformationNALigand yapılarının sorgulanması
PVDF membranMillipore/MerckIPVH00010Western blotting için protein transfer membranı
PyMOL moleküler grafik sistemiSchrödinger, LLCVersion 2.6.2Kenetlenme pozisyonu görselleştirmesi
R yazılımıR Foundation for Statistical ComputingVersion 4.3.2Hedef kesişim ve zenginleştirme analizi
Sıçan glomerüler mezangiyal hücre hattı (HBZY-1)Procell Life Science & Technology Co., Ltd.CL-0117In vitro mezangiyal hücre doğrulama modeli
RCSB Protein Veri BankasıResearch Collaboratory for Structural BioinformaticsPDB ID: 3LN1PTGS2/COX2 kristal yapısının sorgulanması
Rekombinan insan TGF-β1 proteiniPeproTech, a Thermo Fisher Scientific brand100-21-10UGHEK293 kaynaklı rekombinan insan TGF-β1; 10 ng/mL'de profibrotik stimülasyon. 
SDS-PAGE elektroforez sistemiBio-Rad LaboratoriesMini-PROTEAN TetraSDS-PAGE ile protein ayrımı
STRING veri tabanıELIXIR/STRING ConsortiumVersion 12.0Protein-protein etkileşim ağı oluşturma
TCMSP veri tabanıTraditional Chinese Medicine Systems Pharmacology DatabaseNACordyceps sinensis aday bileşiklerinin taranması
Therapeutic Target DatabaseInnovative Drug Research and Bioinformatics GroupNATerapötik hedef sorgulama
α-SMA primer antikoruProteintech Group14395-1-APα-SMA protein ekspresyonu deteksiyonu
β-Sitosterol (saflık >%98)MedChemExpressHY-N0171ACAS 83-46-5; hücre tedavisi için tanımlanmış bileşik; mutlak etanol içinde 10 mM stok. 

Kaynaklar

  1. Kidney Disease: Improving Global Outcomes Glomerular Diseases Work G. KDIGO 2021 Clinical Practice Guideline for the Management of Glomerular Diseases. Kidney Int. 2021;100(4S):S1–S276.
  2. Roccatello D. et al. From inflammation to renal fibrosis: A one-way road in autoimmunity? Autoimmun Rev. 2024;23(4):103466.
  3. Reiss AB. et al. Fibrosis in Chronic Kidney Disease: Pathophysiology and Therapeutic Targets. J Clin Med. 2024;13(7).
  4. Kant S, Kronbichler A, Geetha D. Principles of Immunosuppression in the Management of Kidney Disease: Core Curriculum 2022. Am J Kidney Dis. 2022;80(3):393–405.
  5. El Karoui K, Fervenza FC, De Vriese AS. Treatment of IgA Nephropathy: A Rapidly Evolving Field. J Am Soc Nephrol. 2024;35(1):103–16.
  6. Stenvinkel P. et al. Chronic Inflammation in Chronic Kidney Disease Progression: Role of Nrf2. Kidney Int Rep. 2021;6(7):1775–87.
  7. Tanaka S, Portilla D, Okusa MD. Role of perivascular cells in kidney homeostasis, inflammation, repair and fibrosis. Nat Rev Nephrol. 2023;19(11):721–32.
  8. Liu W. et al. Mechanism of Cordyceps sinensis and its Extracts in the Treatment of Diabetic Kidney Disease: A Review. Front Pharmacol. 2022;13:881835.
  9. Yan G. et al. The effects of Ophiocordyceps sinensis combined with ACEI/ARB on diabetic kidney disease: A systematic review and meta-analysis. Phytomedicine. 2023;108:154531.
  10. Li S, Pang W, Wang Y, Zhang Y. Cordyceps sinensis extract protects against acute kidney injury by inhibiting perforin expression in NK cells via the STING/IRF3 pathway. Aging (Albany NY). 2024;16(7):5887–904.
  11. Zhang Y, Li K, Zhang C, Liao H, Li R. Research Progress of Cordyceps sinensis and Its Fermented Mycelium Products on Ameliorating Renal Fibrosis by Reducing Epithelial-to-Mesenchymal Transition. J Inflamm Res. 2023;16:2817–30.
  12. Zhao L. et al. Network pharmacology, a promising approach to reveal the pharmacology mechanism of Chinese medicine formula. J Ethnopharmacol. 2023;309:116306.
  13. Ru J. et al. TCMSP: a database of systems pharmacology for drug discovery from herbal medicines. J Cheminform. 2014;6:13.
  14. Bi Y. et al. beta-Sitosterol Suppresses LPS-Induced Cytokine Production in Human Umbilical Vein Endothelial Cells via MAPKs and NF-kappaB Signaling Pathway. Evid Based Complement Alternat Med. 2023;2023:9241090.
  15. Sun Y, Gao L, Hou W, Wu J. beta-Sitosterol Alleviates Inflammatory Response via Inhibiting the Activation of ERK/p38 and NF-kappaB Pathways in LPS-Exposed BV2 Cells. Biomed Res Int. 2020;2020:7532306.
  16. Park YJ. et al. Effects of beta-Sitosterol from Corn Silk on TGF-beta1-Induced Epithelial-Mesenchymal Transition in Lung Alveolar Epithelial Cells. J Agric Food Chem. 2019;67(35):9789–95.
  17. Li DD. et al. RTEC-intrinsic IL-17-driven inflammatory circuit amplifies antibody-induced glomerulonephritis and is constrained by Regnase-1. JCI Insight. 2021;6(13).
  18. Martin-Carro B. et al. Role of Klotho and AGE/RAGE-Wnt/beta-Catenin Signalling Pathway on the Development of Cardiac and Renal Fibrosis in Diabetes. Int J Mol Sci. 2023;24(6).
  19. Naas S, Schiffer M, Schodel J. Hypoxia and renal fibrosis. Am J Physiol Cell Physiol. 2023;325(4):C999–C1016.
  20. Harris RC, Breyer MD. Physiological regulation of cyclooxygenase-2 in the kidney. Am J Physiol Renal Physiol. 2001;281(1):F1–11.
  21. Calder PC. Eicosanoids. Essays Biochem. 2020;64(3):423–41.
  22. Waldner C, Heise G, Schror K, Heering P. COX-2 inhibition and prostaglandin receptors in experimental nephritis. Eur J Clin Invest. 2003;33(11):969–75.
  23. Pan Y. et al. Myeloid cyclooxygenase-2/prostaglandin E2/E-type prostanoid receptor 4 promotes transcription factor MafB-dependent inflammatory resolution in acute kidney injury. Kidney Int. 2022;101(1):79–91.
  24. Volzke A, Koch A, Meyer Zu Heringdorf D, Huwiler A, Pfeilschifter J. Sphingosine 1-phosphate (S1P) induces COX-2 expression and PGE2 formation via S1P receptor 2 in renal mesangial cells. Biochim Biophys Acta. 2014;1841(1):11–21.
  25. Sawano H. et al. 15-Deoxy-Delta12,14-prostaglandin J2 inhibits IL-1beta-induced cyclooxygenase-2 expression in mesangial cells. Kidney Int. 2002;61(6):1957–67.
  26. Guo B. et al. Peroxisome proliferator-activated receptor-gamma ligands inhibit TGF-beta 1-induced fibronectin expression in glomerular mesangial cells. Diabetes. 2004;53(1):200–8.
  27. Zou R. et al. PPARgamma agonists inhibit TGF-beta-PKA signaling in glomerulosclerosis. Acta Pharmacol Sin. 2010;31(1):43–50.
  28. Wei J. et al. PP2 Ameliorates Renal Fibrosis by Regulating the NF-kappaB/COX-2 and PPARgamma/UCP2 Pathway in Diabetic Mice. Oxid Med Cell Longev. 2021;2021:7394344.
  29. Yang C, Chen EA, Zhang Y. Protein-Ligand Docking in the Machine-Learning Era. Molecules. 2022;27(14).
  30. Quiroga R, Villarreal MA. Developing Generalizable Scoring Functions for Molecular Docking: Challenges and Perspectives. Curr Med Chem. 2025;32(28):5960–72.
  31. Li J. et al. TGF-beta/Smad signaling in chronic kidney disease: Exploring post-translational regulatory perspectives (Review). Mol Med Rep. 2024;30(2).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Daha fazla makale keşfet

Beta-sitosterolAğ FarmakolojisiMoleküler KenetlemeCOX-2 İnhibisyonuİnflamatuar YolaklarProfibrotik AktivasyonCordyceps sinensisProtein Etkileşim Analizi
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.