Yöntem makalesi

Tek İnsan Oositlerinde Mitokondriyal DNA'nın Düpleks Sekanslama Protokolü

66 görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/73071

⸱

3 Eylül 2026

 ,  ,  , 
1Department of Gynaecology, Obstetrics and Gynaecological Endocrinology, Experimental Gynaecology and Obstetrics, Johannes Kepler University,, 2Department of Gynaecology, Obstetrics and Gynaecological Endocrinology, Johannes Kepler University Linz, Kepler University Hospital, 3Department of Biology, Penn State University

Bu makalede

Özet

Burada, Eksonükleaz V kullanarak tekli insan oositlerinden mitokondriyal DNA zenginleştirmek ve Illumina uyumlu sekanslama platformları ile mitokondriyal DNA varyantlarının yüksek doğrulukla tespiti için dubleks sekanslama kütüphaneleri hazırlamak için bir protokol sunuyoruz.

Özet

Oositler, kendi genomlarını, yani mitokondriyal DNA'yı (mtDNA) içeren enerji üreten organeller olan mitokondrilerle yoğun şekilde doludur. Her hücre, doku tipleri arasında farklılık gösteren kopya sayısında birden fazla mtDNA kopyası içerir. Oositler, hücre başına yüz binlerce mtDNA molekülü içererek en yüksek mtDNA kopya sayısına sahiptir. Mitokondriler yalnızca maternal hat üzerinden aktarıldığı için, mtDNA varyantlarının doğru tespiti kalıtım, yaşlanma ve hastalık çalışmalarında temel öneme sahiptir. Çok sayıda mtDNA kopyasının varlığı, vahşi tip ve mutant moleküllerin aynı hücre içinde bir arada bulunmasına olanak tanır; düşük frekanslı ve de novo varyantların %1'in altındaki frekanslarda görülebildiği bu duruma heteroplazmi denir. Geleneksel yeni nesil dizileme (NGS), bu nadir varyantları kütüphane hazırlama ve dizileme sırasında oluşan hatalardan güvenilir şekilde ayırt etmek için yeterli hassasiyete sahip değildir. Burada, doğrusal DNA'yı uzaklaştırmak için Ekzonükleaz V kullanarak tekil insan oositlerinden mtDNA zenginleştirme ve ardından yüksek doğrulukta mtDNA analizi için dupleks dizileme kütüphanesi hazırlama protokolünü sunuyoruz. Bu iş akışı, tekil oositlerin hata düzeltmeli dizilemesini sağlayarak düşük frekanslı mtDNA varyantlarının güvenilir tespitini, heteroplazmi ve de novo mutajenez analizlerini kolaylaştırır. Protokol, Illumina uyumlu dizileme platformlarını kullanarak tekil oositlerde mitokondriyal genom varyasyonlarını araştırmak için tekrarlanabilir bir yaklaşım sunmaktadır.

Giriş

Mitokondriler; enerji üretimi, apoptoz, sinyal iletimi ve kalsiyum homeostazı dahil olmak üzere temel hücresel süreçlerde temel roller oynarlar1. Memelilerde yaklaşık 16,6 kb uzunluğunda, dairesel ve çift sarmallı bir molekül olan kendi genomlarına, mitokondriyal DNA'ya (mtDNA) sahiptirler. Atasal mitokondriyal genlerin çoğu endosimbiyoz sırasında nükleer genoma aktarılmış olsa da, mtDNA; 13 oksidatif fosforilasyon (OXPHOS) polipeptidini, 22 transfer RNA'yı (tRNA) ve iki ribozomal RNA'yı (rRNA) kodlayan 37 geni muhafaza eder2. mtDNA'daki mutasyonlar, mitokondriyal gen ekspresyonunu ve fonksiyonunu bozabilir ve ciddi bozukluklara yol açabilir3. Mitokondriler yalnızca maternal hat üzerinden kalıtıldığı için, oosit mtDNA'sı döllenmede, embriyonik gelişimde ve yavruların sağlığında kritik bir rol oynar4. Sonuç olarak, mtDNA mutasyonlarının ve frekanslarının tespiti ile karakterizasyonu büyük önem taşımaktadır. Örneğin, yaşlanma ve hastalıklarla ilişkili germ hattı mutajenezinin anlaşılması, kadın kısırlığına yönelik terapötik stratejiler geliştirmenin önemli bir ön koşuludur.

Nükleer DNA'nın aksine, mtDNA hücre başına çok sayıda kopya şeklinde bulunur; bu sayı doku tipine bağlı olarak somatik hücrelerde yüzlerce ile binlerce kopya arasında değişirken, olgun oositlerde 100.000 kopyayı aşar4. mtDNA'nın bu yüksek kopya sayısı, oositleri tek hücre düzeyinde mitokondriyal mutajenezi araştırmak için oldukça uygun hale getirir. Ancak, özellikle çok düşük frekanslarda bulunan de novo mtDNA mutasyonlarını tespit etmek zor olmaya devam etmektedir; çünkü konvansiyonel yeni nesil dizileme (NGS) hata oranları, birçok gerçek varyantın frekansını aşmaktadır5. Bu nedenle, gerçek mutasyonları kütüphane hazırlama, amplifikasyon ve dizileme sırasında oluşan artefaktlardan ayırt etmek için hata düzeltmeli dizileme yöntemleri gereklidir. Bu yaklaşımlardan biri dupleks dizilemedir (DS)6,7. DS'de, DNA fragmanları amplifikasyon öncesinde çift sarmallı, randomize 12-nükleotidlik moleküler etiketler içeren adaptörlerle ligatlenir. Bu benzersiz moleküler tanımlayıcılar, her bir orijinal DNA molekülünü her iki ucundan etiketleyerek, aynı kalıp sarmaldan kaynaklanan dizileme okumalarının ortak etiket dizilerine göre aileler halinde gruplandırılmasını sağlar. Her okuma ailesinden tek sarmal konsensüs dizisi (SSCS) oluşturulur ve ardından orijinal DNA dupleksinden türetilen komplementer SSCS'ler, bir dupleks konsensüs dizisi (DCS) üretmek için birleştirilir. Yalnızca her iki komplementer SSCS içindeki okumaların çoğunluğunda tespit edilen ve sonuçtaki DCS ile onaylanan varyantlar gerçek mutasyonlar olarak kabul edilir; bu da konvansiyonel NGS yaklaşımlarından birkaç kat daha düşük hata oranları sağlar8. Bu strateji, özellikle tek hücrelerdeki düşük frekanslı mtDNA varyantlarının ve heteroplazminin tespit edilmesinde avantajlıdır.

Yayımlanmış çoğu dupleks sekanslama protokolünün temel bir kısıtlaması, kütüphane hazırlığı sırasında nispeten yüksek miktarlarda girdi DNA'sına ihtiyaç duyulmasıdır; bu durum, söz konusu yöntemleri tek hücreli uygulamalar için uygunsuz kılmaktadır6,7,9. Bu protokolün genel amacı; mtDNA zenginleştirme, kütüphane hazırlığı ve sekanslama için optimize edilmiş bir iş akışı aracılığıyla, tek bir insan oositinden yüksek doğrulukta mtDNA dupleks sekanslamasını mümkün kılmaktır. Nükleer mitokondriyal DNA segmentlerinin (NUMT'ler) sekanslanmasını en aza indirmek ve sekanslama verimliliğini artırmak için bu protokol, dairesel mtDNA'yı korurken doğrusal DNA'yı seçici olarak sindiren Ekzonükleaz V tabanlı bir zenginleştirme adımı içermektedir. Ortaya çıkan iş akışı, tek oositlerde doğru mtDNA varyant tespiti için pratik bir yaklaşım sunmakta olup heteroplazmi, de novo mutajenez, yaşlanma ve mitokondriyal hastalıkları inceleyen çalışmalar için uygundur.

Protokol

İnsan oosit toplama ve işleme işlemleri, Johannes Kepler Üniversitesi Linz Etik Komisyonu tarafından onaylanmıştır (Onay No. 1293/2020). Tüm prosedürleri; bilgilendirilmiş onam, örnek anonimleştirme ve insan dokusunun kullanımını düzenleyen tüm geçerli yönetmelikler dahil olmak üzere kurumsal kılavuzlara uygun olarak gerçekleştirin.

NOT: Bu protokol insan oositleri için tanımlanmış olsa da, iş akışını diğer türlere uygulamak için türe özgü primerleri uyarlayın. Numune kaybını minimize etmek için protokol boyunca DNA düşük bağlayıcılıklı sarf malzemeleri (örneğin tüpler ve pipet uçları) kullanın. İlk saflaştırmaya kadar olan tüm adımları orijinal düşük bağlayıcılıklı oosit toplama tüpünde gerçekleştirin. Vortexleme DNA zincarlarına zarar verebileceği için numuneleri vortexlemeyin. Bunun yerine, reaksiyon bileşenlerini nazikçe pipetleme veya tüpe hafifçe vurma yoluyla karıştırdıktan sonra kısa süreli santrifüj yapın. Kontaminasyonu minimize etmek için mümkün olduğunca DNA izolasyonunu, master mix hazırlığını ve reaksiyon kurulumunu özel polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) istasyonlarında veya fiziksel olarak ayrılmış laboratuvar alanlarında gerçekleştirin.

1. Tamponların ve Reaktiflerin Hazırlanması

  1. Stok çözeltilerin belirtilen hacimlerini birleştirerek ve her bir çözeltiyi moleküler biyoloji sınıfı su ile belirlenen son hacme getirerek Oosit Lizis Tamponu (OLB), 10 mM Tris-HCl, TE tamponu, TElow tamponu ve 10 mM Tris-NaCl'yi Tablo 1'e göre hazırlayın. Hazırlanan tamponlardan 1 mL'lik alikotlar ayırın, bu alikotları 4°C'de saklayın ve 1 yıl içinde kullanın.

Tablo 1: Protokol boyunca kullanılan tamponların bileşimi. 10 mM Tris-HCl, TE tamponu, TElow tamponu, 10 mM Tris-NaCl ve Oosit Liziz Tamponu (OLB) hazırlama için tampon bileşimleri ve final konsantrasyonlar. Tüm tamponları moleküler biyoloji sınıfı su kullanarak hazırlayın. Tris-HCl ve EDTA stok çözeltilerinin pH değerini, gerekirse tampon hazırlamadan önce üretici tavsiyelerine göre ayarlayın. OLB, protokolde açıklandığı üzere örnek lizizinden hemen önce termolabil proteinaz K ile desteklenir. Lütfen bu dosyayı indirmek için buraya tıklayın.

2. Tekli Oosit Toplama

NOT: Bu protokolde kullanılan insan oositleri, Avusturya, Linz'deki Kepler Üniversite Hastanesi'nin Kinderwunsch Zentrum (fertilite merkezi) biriminde intracytoplasmic sperm injection (ICSI) planlanan hastalardan toplanmıştır. Over stimülasyon protokolleri, hastanın öngörülen ovaryen yanıtına göre belirlenmiş ve dozlar; yaş, anti-Müllerian hormone (AMH) seviyeleri ve vücut ağırlığı gibi bireysel özelliklere göre, European Society of Human Reproduction and Embryology (ESHRE) tavsiyeleri uyarınca ayarlanmıştır10. Foliküler matürasyonu desteklemek amacıyla, gonadotropin stimülasyonu ile birlikte gonadotropin-releasing hormone (GnRH) agonisti veya GnRH antagonisti protokolleri kullanılarak pituitary süpresyon sağlanmıştır. Ovülasyon tetiklenmeden önce foliküler büyüme, transvajinal ultrasonografi ile düzenli olarak izlenmiştir. Ardından oositler transvajinal foliküler aspirasyonla geri kazanılmış ve cumulus–oocyte complexes (COCs) içeren foliküler sıvı toplanmıştır11. Bilgilendirilmiş onam alındıktan sonra, yalnızca hastanın ICSI tedavisi için kullanılamayan ve aksi takdirde atılacak olan immatür veya fertilize olmamış oositler araştırmalar için kullanıma sunulmuştur. Antral folikül sayıları (AFCs) daha yüksek olan hastalar, araştırma için uygun immatür veya fertilize olmamış oosit üretme olasılıkları daha yüksek olduğu için oosit bağışı konusunda öncelikli olarak değerlendirilmiştir. Araştırma için oositlerin seçilmesinden önce gerçekleştirilen tüm prosedürler, in vitro fertilizasyon ve insan dokusu kullanımını düzenleyen ulusal yönetmeliklere uygun olmalıdır. Tüm malzemeleri laminer akışlı kabin içinde steril koşullarda işleyin. Oositlerle doğrudan temas eden tüm CE sertifikalı malzemelerin ve kültür ortamlarının steril olduğundan, 37°C'ye ön ısıtma yapıldığından ve pH değerinin 7.20–7.40 aralığında tutulduğundan emin olun.

  1. Kontrollü overyal hiperstimülasyon ve transvajinal oosit toplama işleminin ardından, foliküler sıvıdan COC'leri toplayın ve steril mineral yağı altında 750 µL GM501 Kültür ortamına aktarın.
  2. Hiyaluronidaz ile enzimatik sindirim yaparak zona pellucida'yı (ZP) çevreleyen kumulus hücrelerini uzaklaştırın. Oositleri 37°C'de 30–60 s boyunca 500 µL GM501 Hiyaluronidaz (80 U/mL) içerisinde inkübe edin, ardından 750 µL GM501 Kültür ortamı ile üç kez yıkayın. Kalan kumulus hücrelerini denüdasyon pipetleri kullanarak mekanik olarak dikkatlice uzaklaştırın.
  3. Telofaz I (TI) veya metafaz II (MII) oositleri için, polar cismin yanına bir dizi lazer darbesi uygulayarak ZP'yi açın ve mikromanipülatörler kullanarak birinci polar cismi çıkarın. Lazer ayarlarını ZP kalınlığına göre düzenleyin (1–3 darbe; darbe süresi, 1,5–2,6 ms; nokta çapı, 16–20 µm). Oositin somatik hücre DNA'sı ile kontamine olmasını en aza indirmek için kalan kumulus hücrelerini temizlemek amacıyla lazeri kullanın.
  4. Her bir oositi tek tek 200 µL'lik düşük bağlanma kapasiteli bir tüp içindeki 2–3 µL 1× fosfat tamponlu salin (PBS) içine aktarın. Tüpü derhal −20°C'de dondurun. Uzun süreli saklama için dondurulmuş oositleri −80°C'ye aktarın.
    NOT: Çözme işleminden sonra, protokolün geri kalanını ilk amplifikasyon adımı tamamlanana kadar kesintisiz olarak gerçekleştirin.
  5. Protokol boyunca potansiyel çevresel DNA kontaminasyonunu izlemek için, kütüphane hazırlama sırasında (4. Adımdan itibaren) oosit içermeyen 2 µL 1× PBS'den oluşan bir negatif kontrol ekleyin. Negatif kontrolü tüm oosit örnekleriyle aynı şekilde işlemden geçirin. Protokolün hiçbir aşamasında negatif kontrolde saptanabilir DNA gözlemlenmemelidir.

3. Adaptör Sentezi

NOT: Kütüphane hazırlığına başlamadan önce adaptörleri hazırlayın. Sentezlenmiş adaptörleri −80°C'de 3 aya kadar saklayın. Tekrarlanan dondurma-çözme döngülerini önlemek için alikotlar hazırlayın ve çözülen adaptörleri tekrar dondurmayın. Bu protokolde kullanılan tüm oligonükleotid dizileri Tablo 2'de listelenmiştir.

Tablo 2: Protokol boyunca kullanılan oligonükleotidler ve primerler. Tablo; adaptör sentezi, kütüphane amplifikasyonu, kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu (qPCR), kütüphane kantifikasyonu ve mitokondriyal DNA (mtDNA) zenginleştirme tahmini için kullanılan tüm oligonükleotidleri, dizileriyle, saflaştırma yöntemleriyle, tedarik edilen miktarları veya önerilen stok konsantrasyonlarıyla ve üreticileriyle birlikte listelemektedir. Gösterilen taşıyıcı oligonükleotid dizisi, bu protokolde kullanılan örnek dizidir. Primer dizilerindeki yıldırım (*) işareti, fosforotiyoat bağını belirtir. mws55 adaptöründeki rastgele nükleotidler (N), benzersiz moleküler tanımlayıcıyı (UMI) temsil ederken; Y ise dejenere pirimidin bazını (C veya T) belirtir. Aksi belirtilmedikçe, oligonükleotidler standart tuzsuzlaştırma saflaştırması kullanılarak sentezlenmiştir. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

  1. %96 etanol (EtOH) alikotu hazırlayın ve sonraki saflaştırma adımları için −20°C'de saklayın. %80'lik EtOH'yi kullanımdan hemen önce taze olarak hazırlayın.
  2. Toplam 41 µL hacim (her bir oligonükleotidden 2.000 pmol) elde etmek için 200 µL'lik düşük bağlanma kapasiteli bir tüpe 100 µM mws51_short ve 100 µM mws55 oligonükleotidlerinden 20,5 µL'den ekleyin.
  3. Birleştirilen oligonükleotidleri, kapak sıcaklığı 110°C'ye ayarlanmış bir termosiklet cihazında 95°C'de 5 dk inkübe edin. Zamanlayıcıyı numune 95°C'ye ulaştıktan sonra başlatın, 5 dk sonra termosiklet cihazını kapatın ve tüpleri oda sıcaklığına (RT) yavaşça soğumaları ve tavlanmaları (“tavlanmış adaptör”) için 1 saat boyunca cihazın içinde bırakın.
  4. 1× NEB Buffer 2 (10× stoktan 5,6 µL), 3,5 mM deoksinükleotit trifosfatlar (dNTP'ler; 10 mM stoktan 5,6 µL), 11,5 U Klenow fragmanı (5 U/µL stoktan 2,3 µL) ve 16 µL nihai hacme ulaşacak şekilde 2,5 µL moleküler biyoloji saflığında su ekleyerek bir Uzatma Master Mix hazırlayın.
  5. Adım 3.3'te hazırlanan tavlanmış adaptörden 1 µL alın, TElow tamponunda 1:20 oranında seyreltin, alikotu “tavlanmış” olarak etiketleyin ve agaroz jel elektroforezi için 4°C'de saklayın.
  6. Kalan 40 µL tavlanmış oligonükleotidlere 16 µL Uzatma Master Mix ekleyin ve iyice karıştırın.
  7. Tepkimeyi, termosiklet kapağı 47°C'ye ayarlanmış şekilde 37°C'de 1 saat inkübe edin.
  8. Uzatılmış oligonükleotidleri EtOH çöktürme ile saflaştırın. 56 µL'lik tepkime karışımına 28 µL amonyum asetat (NH4OAc) ekleyin ve iyice karıştırın.
  9. Tüm tepkimeyi 1,5 mL'lik düşük bağlanma kapasiteli bir tüpe aktarın ve 168 µL buz gibi %96 EtOH ekleyin.
  10. Tüpü birkaç kez altüst edin ve DNA'yı çöktürmek için −20°C'de 30 dk inkübe edin.
  11. 1 mL taze %80 EtOH hazırlayın ve −20°C'ye soğutun. Santrifüjü 4°C'ye ön soğutma yapın.
  12. 14.000 × g hızda 30 dk santrifüjleyin.
  13. Pelete zarar vermeden süpernatantı dikkatlice uzaklaştırın. Tüpü karıştırmadan veya altüst etmeden 1 mL buz gibi %80 EtOH ekleyin.
  14. 14.000 × g hızda 5 dk santrifüjleyin.
  15. Tüm kalıntı EtOH'yi uzaklaştırın ve görünür sıvı kalmayana ve pelet şeffaf görünene kadar DNA peletini 10–15 dk boyunca havada kurutun. Oligonükleotidleri aşırı kurutmayın.
  16. Peleti 41 µL moleküler biyoloji saflığında su içinde yeniden süspande edin.
  17. 1 µL alın, TElow tamponunda 1:20 oranında seyreltin, alikotu “uzatılmış” olarak etiketleyin ve 4°C'de saklayın.
  18. 47 µL moleküler biyoloji saflığında su, 1× CutSmart Buffer (10× stoktan 10 µL) ve 15 U HpyCH4III (5 U/µL stoktan 3 µL) ekleyerek toplam 60 µL hacminde bir Restriksiyon Master Mix hazırlayın.
  19. 60 µL Restriksiyon Master Mix'i 40 µL saflaştırılmış oligonükleotidlere ekleyin ve iyice karıştırın.
  20. Tepkimeyi, termosiklet kapağı 47°C'ye ayarlanmış şekilde 37°C'de 16 saat inkübe edin.
  21. 6,5 mL taze %80 EtOH hazırlayın ve −20°C'ye soğutun. Santrifüjü 4°C'ye ön soğutma yapın.
  22. Sindirilmiş adaptörleri 1,5 mL'lik düşük bağlanma kapasiteli bir tüpe aktarın ve 900 µL moleküler biyoloji saflığında su ekleyin.
  23. 500 µL NH4OAc ekleyin ve iyice karıştırın.
  24. Çözeltiyi, 1,5 mL'lik düşük bağlanma kapasiteli tüplerde altı adet 250 µL'lik alikota bölün. Her tüpe 500 µL buz gibi %96 EtOH ekleyin.
  25. Tüpleri birkaç kez altüst edin ve DNA'yı çöktürmek için −20°C'de 30 dk inkübe edin.
  26. 14.000 × g hızda 30 dk santrifüjleyin. Pelete zarar vermeden süpernatantı dikkatlice uzaklaştırın. Her tüpe karıştırmadan veya altüst etmeden 1 mL buz gibi %80 EtOH ekleyin. 14.000 × g hızda 5 dk santrifüjleyin.
  27. Tüm kalıntı EtOH'yi uzaklaştırın ve adaptör peletlerini havada kurutun.
  28. Her peleti 6,7 µL Tris-NaCl tamponunda yeniden süspande edin ve toplam 41 µL hacim elde etmek için altı süspansiyonun tamamını birleştirin. 1 µL alın, TElow tamponunda 1:10 oranında seyreltin, alikotu “kesilmiş” olarak etiketleyin ve 4°C'de saklayın.
  29. Adaptör stok alikotları hazırlayın ve −80°C'de saklayın. Adaptör konsantrasyonunu ölçün ve bir spektrofotometre kullanarak “kesilmiş” alikotun A260/280 ve A260/230 absorbans oranlarını belirleyin. Beklenen adaptör konsantrasyonu 30–50 µM, A260/280 oranı >1,7 ve A260/230 oranı >1,9'dur.
  30. Adaptör oluşumunu ve tam restriksiyon sindirimini doğrulamak için “tavlanmış”, “uzatılmış” ve “kesilmiş” alikotları %2'lik agaroz jelde 125 V'da 45 dk boyunca çalıştırın (Şekil 1).
    NOT: “Tavlanmış” alikotu, tavlanmış ve tavlanmamış fraksiyonları temsil eden iki bant içermelidir. Tavlanmış adaptörün yaklaşık 90 bp'de göç etmesi beklenir ve 68-nt tek zincirli bir çıkıntıya sahip 13-bp çift zincirli bir bölgeden oluşur; buna karşılık tavlanmamış oligonükleotitler yaklaşık 60 bp'de göç eder. Uzatmanın ardından adaptör, 44-nt Y şeklinde bir çıkıntıya sahip 37-bp çift zincirli bir bölgeden oluşur ve yaklaşık 110 bp'de göç etmesi beklenir. Restriksiyon sindiriminden sonra, adaptörden 8-bp'lik bir fragman uzaklaştırılır. Üç bant görünür olmalıdır: yaklaşık 100 bp'de baskın bir bant (nihai adaptör) ve yaklaşık 60 bp'de (kalan tavlanmamış oligonükleotitler) ve 8 bp'de (restriksiyon fragmanı) iki sönük bant.

figure-protocol-1
Şekil 1Ara ürünlerin ve nihai dupleks sekanslama adaptörlerinin temsilci fragman boyutu analizi. Oligonükleotid tavlaması (“tavlanmış”, 1:20 seyreltilmiş), dolgu uzatması (“uzatılmış”, 1:20 seyreltilmiş) ve HpyCH4III restriksiyon sindirimi (“kesilmiş”, 1:10 seyreltilmiş) sonrası adaptör sentezi sırasında toplanan alikotlar, doğru dupleks sekanslama adaptörü oluşumunu doğrulamak amacıyla %2'lik agaroz jel elektroforezi ile analiz edildi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

4. Tek Oosit Lizisi

  1. 0.0012 U/µL nihai proteinaz K konsantrasyonu elde etmek için, 99 µL OLB'ye 1 µL termolabil proteinaz K (0.120 U/µL) ekleyerek termolabil proteinaz K ile desteklenmiş OLB (OLB+) hazırlayın.
  2. Oositleri oda sıcaklığında çözdürün. Her bir oosite derhal 4 µL OLB+ ekleyin. Oositin tampona tamamen aktarıldığından emin olmak ve numunenin tüp duvarına yapışmasını önlemek için tüpün yanlarını lizis tamponu ile birkaç kez durulayın.
  3. Numuneyi iyice karıştırın, içeriği tüpün dibinde toplamak için kısa süreli santrifüj yapın ve kapak sıcaklığı 47°C'ye ayarlanmış bir termosiklet cihazında 37°C'de 16 sa boyunca inkübe edin.
    NOT: Fragmentasyondan önce oosit lizisine yönelik bağımsız bir değerlendirme yapılmaz. Belirtilen lizis koşulları altında 16 saatlik inkübasyon, tek bir oositin tam lizisi için genellikle yeterlidir. Buna rağmen, işlem sırasındaki numune kaybı ve oositler arasındaki mtDNA kopya sayısı farklılıkları nedeniyle geri kazanılan DNA miktarı değişkenlik gösterebilir.
  4. Numuneleri, kapak sıcaklığı 75°C'ye ayarlanmış bir termosiklet cihazında 55°C'de 15 dakika inkübe ederek termolabil proteinaz K'yi inaktive edin.
    NOT: Daha sonraki bir protokol adımı açıkça bir duraklama noktası belirtmedikçe, lizis ve proteinaz K inaktivasyonundan sonraki iş akışını kesintisiz olarak tamamlayın.

5. Ekzonükleaz V Sindirimi

  1. İşleme geçmeden önce örneklerin oda sıcaklığına (RT) gelmesini bekleyin.
  2. 4 µL 25 mM magnezyum klorür (MgCl₂), 1 µL 10 mM Tris-HCl, 1 µL 10 mM adenozin trifosfat (ATP) ve 1 µL Ekzonükleaz V (10 U/µL stok) birleştirerek, toplam 7 µL hacminde bir Ekzonükleaz V Master Mix hazırlayın.
  3. 1 µL 10 mg/mL RNaz A stoğunu 99 µL moleküler biyoloji sınıfı su ile seyrelterek 1 mg/mL ribonükleaz A (RNaz A) çalışma çözeltisi hazırlayın. Her bir liz edilmiş oosit örneğine yaklaşık 0,1 µL seyreltilmiş RNaz A çözeltisi ekleyin.
    NOT: Bu adım için uygun bir pipet kullanın. Birden fazla örnek aynı anda işlenirken, örnekler arasında çapraz kontaminasyonu önlemek için önlemler alındığı sürece uygun bir çok kanallı pipet kullanılabilir. Çok kanallı pipet ile bu kadar küçük hacimler dağıtılırken pipetleme doğruluğu azalabileceğinden, tüm kanalları dikkatle kontrol edin. Alternatif olarak, pipet ucunun seyreltilmiş RNaz A çözeltisine kısa süreli daldırılması yaklaşık 0,1 µL transfer etmek için yeterlidir. Bu hacimdeki küçük sapmalar protokolün performansını etkilemez. Transfer edilen yaklaşık hacmi önceden tek kanallı bir pipet kullanarak doğrulayın.
  4. Her bir liz edilmiş oosit örneğine 7 µL Ekzonükleaz V Master Mix ekleyin ve iyice karıştırın. Örnekleri, kapak sıcaklığı 47°C'ye ayarlanmış bir termosiklet cihazında 37°C'de 1 saat inkübe edin.
  5. Son reaksiyon hacmini yaklaşık 51 µL'ye tamamlamak için her bir örneğe 38 µL TE tamponu ekleyin. Örnekleri, kapak sıcaklığı 75°C'ye ayarlanmış bir termosiklet cihazında 70°C'de 30 dakika inkübe ederek enzimleri ısı ile inaktive edin.
  6. Hemen kütüphane hazırlama aşamasına geçin.

6. Fragmantasyon

  1. Sonikasyon kullanarak DNA'yı yaklaşık 550 baz çifti (bp) ortalama fragman boyutuna getirin.
    NOT: Bu protokol, bundan böyle sonikatör olarak adlandırılan bir Covaris M220 odaklanmış ultrasonikasyon cihazı kullanılarak yapılan DNA fragmantasyonunu tanımlamaktadır; ancak eşdeğer sistemler de kullanılabilir. Numuneler liz sonrası DNA'nın yanı sıra hücresel kalıntılar da içerdiğinden, hedeflenen fragman boyutu çevresinde nispeten dar bir fragman boyutu dağılımı elde etmek için fragmantasyon koşullarını ilgili cihaza ve numune tipine göre optimize edin.
  2. Numunenin tüm hacmini (yaklaşık 51 µL), 50 µL'lik bir odaklanmış ultrasonikasyon tüpüne aktarın.
  3. DNA'yı %10 Duty Factor, 75 W Peak Incident Power ve 20°C'de Burst başına 200 Cycle kullanarak 70 s boyunca shear işlemine tabi tutun.
  4. Shear tüpleri düşük bağlanma özelliğine sahip olmadığından, her bir shear edilmiş numuneyi (yaklaşık 50 µL) hemen shear tüpünden 200 µL'lik bir düşük bağlanma (low-binding) tüpüne aktarın. Bu amaçla orijinal oosit toplama tüpü yeniden kullanılabilir. Numune geri kazanımını maksimize etmek için shear tüpünün kapağını kalıntı sıvı açısından kontrol edin ve kalan tüm numuneyi geri kazanın.
  5. Vakit kaybetmeden uç onarımı (end repair) ve A-kuyruklama (A-tailing) işlemine geçin.

7. Uç Onarımı/A-Kuyruklama

  1. 7 µL End Prep Reaction Buffer ve 3 µL End Prep Enzyme Mix içeren bir Uç Onarımı/A-Kuyruklama (End Repair/A-Tailing) Master Mix hazırlayın.
  2. Final reaksiyon hacmi 60 µL olacak şekilde her örneğe 10 µL Uç Onarımı/A-Kuyruklama Master Mix ekleyin. Pipetle 10 kez aşağı yukarı çekerek iyice karıştırın.
  3. Örnekleri, termosaykler kapağı kapalıyken 20°C'de 30 dk, ardından kapak sıcaklığı 75°C'ye ayarlanmış şekilde 65°C'de 30 dk inkübe edin.
  4. Hemen adaptör ligasyonuna geçin.

8. Adaptör Ligasyonu

  1. 30 µL Ligasyon Karışımı ve 1 µL Ligasyon Artırıcı içeren bir Ligasyon Ana Karışımı hazırlayın.
  2. Sentezlenmiş adaptörün bir alikvotunu çözdürün ve Tris-NaCl tamponunda 1:4000 oranında seyreltin.
  3. Seyreltilmiş adaptörden 1,5 µL'yi, uçları onarılmış ve A-kuyruğu eklenmiş her bir DNA örneğine ekleyin. 31 µL Ligasyon Ana Karışımı ekleyin ve iyice karıştırın.
  4. Örnekleri 20°C'de 15 dk inkübe edin. Final reaksiyon hacmi 93,5 µL olacak şekilde her bir örneğe 1 µL seyreltilmiş adaptör ekleyin. İyice karıştırın ve 4°C'de 16 sa boyunca inkübe edin.
  5. Vakit kaybetmeden saflaştırma aşamasına geçin.

9. Adaptör Bağlı DNA'nın Saflaştırılması

  1. Manyetik boncukların ve TElow tamponunun oda sıcaklığına (RT) gelmesi için en az 30 dakika bekleyin. Bu süre zarfında taze %80 EtOH hazırlayın. 1 nM nihai konsantrasyon elde etmek için 99 µL TElow tamponuna 1 µL taşıyıcı oligonükleotid (insan genomunda temsil edilmeyen dizi; Tablo 2'ye bakınız) ekleyerek bir taşıyıcı oligonükleotid çözeltisi hazırlayın.
  2. 0,8× boncuk-örnek oranına karşılık gelen 74,8 µL manyetik boncuğu 1,5 mL'lik düşük bağlanma kapasiteli (low-binding) bir tüpe aktarın. Adaptör ligasyonlu DNA'nın tamamını (93,5 µL) ekleyin ve iyice karıştırın.
  3. Boncuk-örnek karışımını oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin. 7,5 dakika sonra süspansiyonu nazikçe karıştırın ve tüpü kısa süre santrifüjleyin.
  4. Tüpü kısa süre santrifüjleyin, manyetik rafa yerleştirin ve boncukların tamamen ayrışması için 5 dakika inkübe edin. Berrak süpernatantı dikkatlice uzaklaştırıp atın ve ardından tüpü hemen kapatın.
  5. 400 µL %80 EtOH ekleyin, 30 saniye inkübe edin ve EtOH'yi uzaklaştırın. 200 µL %80 EtOH ekleyin, 30 saniye inkübe edin ve EtOH'yi uzaklaştırın.
  6. Tüpü manyetik raftan çıkarın ve kısa süre santrifüjleyin. Tüpü tekrar manyetik rafa yerleştirin, kalan tüm EtOH'yi uzaklaştırın ve boncukları 5 dakikadan kısa süre havada kurutun.
  7. Taşıyıcı oligonükleotidler eklenmiş 50 µL TElow tamponu ekleyin. Tüpü manyetik raftan çıkarın ve pipetleyerek boncukları iyice yeniden süspanse edin.
  8. Süspansiyonu oda sıcaklığında, ara ara karıştırarak 5 dakika inkübe edin. Tüpü kısa süre santrifüjleyin, manyetik rafa geri yerleştirin ve ek 5 dakika daha inkübe edin.
  9. İlk manyetik ayırmanın son 5 dakikasında, 40 µL manyetik boncuk içeren yeni bir 1,5 mL'lik düşük bağlanma kapasiteli tüp hazırlayın. İkinci saflaştırmayı 0,8× boncuk-örnek oranında gerçekleştirmek için eluatın 50 µL'sini hazırlanan tüpe aktarın.
  10. İyice karıştırın ve oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin. 7,5 dakika sonra süspansiyonu nazikçe karıştırın ve tüpü kısa süre santrifüjleyin.
  11. Tüpü manyetik rafa yerleştirin ve boncukların tamamen ayrışması için 5 dakika inkübe edin. Berrak süpernatantı dikkatlice uzaklaştırıp atın ve ardından tüpü hemen kapatın.
  12. 400 µL %80 EtOH ekleyin, 30 saniye inkübe edin ve EtOH'yi uzaklaştırın. 200 µL %80 EtOH ekleyin, 30 saniye inkübe edin ve EtOH'yi uzaklaştırın.
  13. Tüpü manyetik raftan çıkarın ve kısa süre santrifüjleyin. Tüpü tekrar manyetik rafa yerleştirin, kalan tüm EtOH'yi uzaklaştırın ve boncukları 5 dakikadan kısa süre havada kurutun.
  14. Her örneğe 15,5 µL Tris-HCl ekleyin. Tüpü manyetik raftan çıkarın ve pipetleyerek boncukları iyice yeniden süspanse edin.
  15. Süspansiyonu oda sıcaklığında, ara ara karıştırarak 5 dakika inkübe edin. Tüpü kısa süre santrifüjleyin, manyetik rafa geri yerleştirin ve ek 5 dakika daha inkübe edin.
  16. Eluatın 15 µL'sini yeni bir 200 µL'lik düşük bağlanma kapasiteli tüpe aktarın. Attomol düzeyinde kantitatif PCR (qPCR) ve mitokondriyal DNA (mtDNA) zenginleştirme qPCR analizleri için eluatın 1 µL'sini alın ve Tris-HCl ile 1:10 oranında seyreltin.

10. Attomol Tahmini

NOT: DNA girdisini ve sonraki amplifikasyon ile indeksleme PCR'larında kullanılan döngü sayısını ayarlamak için adaptörle ligasyon yapılmış DNA'nın yaklaşık miktarını belirleyin. Örnek miktarı sınırlı olduğundan, doğrudan konsantrasyon ölçümleri güvenilir olmayabilir; bu nedenle, DNA miktarı qPCR ile tahmin edilmelidir. Fragman boyutu dağılımını değerlendirmek ve kalıntı adaptör dimerlerini saptamak için amplifikasyon ürünlerini agaroz jel elektroforezi ile analiz edin. Cq değerleri, kullanılan reaktiflere ve gerçek zamanlı PCR cihazına bağlı olarak değişebilir. Adaptör dimer saptamasına dayalı Cq değeri ayarlamaları ile sonraki DNA girdi miktarları ve PCR döngü sayıları temel olarak ampirik gözlemlere dayanmaktadır ve bireysel kütüphane hazırlıkları için optimizasyon gerektirebilir.

  1. Reaksiyon başına 5 µL 2× KAPA HiFi HotStart Reaction Mix (bundan sonra 2× yüksek sadakatli PCR karışımı olarak anılacaktır), 1 µL Illumina için Dual-NEBNext Universal PCR Primer (10 µM; bundan sonra evrensel kütüphane primeri olarak anılacaktır), 1 µL mws20 primeri (10 µM), 0.5 µL 20× EvaGreen ve 0.5 µL moleküler biyoloji düzeyinde su içeren bir attomole qPCR Master Mix hazırlayın.
  2. qPCR uyumlu 96 kuyucuklu bir plakanın belirlenen her kuyucuğuna 8 µL Master Mix ekleyin. Toplam reaksiyon hacmini 10 µL'ye tamamlamak için 2 µL 1:10 oranında seyreltilmiş örnek ekleyin.
  3. Plakayı kapatın ve real-time PCR cihazına yerleştirmeden önce kısa süreliğine santrifüjleyin.
  4. Şu termal döngü koşullarını kullanarak qPCR gerçekleştirin: 98°C'de 45 s, ardından 98°C'de 15 s, 65°C'de 30 s ve 72°C'de 45 s şeklinde 45 döngü.
  5. Floresan eşiğini 1.000 bağıl floresan birimi (RFU) olarak ayarlayarak kantifikasyon döngüsünü (Cq) belirleyin.
    NOT: Real-time PCR cihazı ile uyumlu bir floresan eşiği seçin ve Cq değerlerinin karşılaştırılmasına olanak sağlamak için tüm deneylerde aynı eşiği kullanın.
  6. qPCR amplifikasyon ürünlerini %1,5'luk agaroz jelde 125 V'da 40 dk boyunca ayırın.
  7. Jelde kalıntı adaptör dimerleri olup olmadığını kontrol edin. Adaptör dimerleri yaklaşık 130 bp'de göç eder (Şekil 2).
  8. Adaptör dimerleri görünürse, Şekil 2'de gösterilen uygun attomole Cq düzeltme faktörünü (ACF) kullanarak Cq değerini ayarlayın. Şekil 2'deki temsilci örnekleri referans alarak, agaroz jelde gözlemlenen adaptör-dimer bandının yoğunluğuna göre ACF'yi seçin. ACF ile düzeltilmiş 22–26 arası bir attomole Cq değeri optimaldir; ancak <29 değerleri genellikle kabul edilebilirdir.
    NOT: Cq değerini düzeltmek yerine, gerektiğinde ek bir saflaştırma işlemi yapılabilir; ancak bu durum önemli miktarda kütüphane kaybına yol açabilir. Güçlü adaptör-dimer bantlarına sahip örnekler tipik olarak yüksek attomole qPCR Cq değerleri ile ilişkilidir ve bu da düşük DNA girdisini gösterir. Cq değerleri ≥29 olan örnekler genellikle geniş aile boyutları ve düşük mitokondriyal DNA sekanslama derinlikleri (<100×) üretir ve bu nedenle sekanslamadan hariç tutulabilir. Cq değerleri real-time PCR cihazına ve analiz koşullarına bağlı olduğu için, bu protokolü uygularken laboratuvara özgü kesme değerleri belirleyin.

figure-protocol-2
Şekil 2Kütüphane girdisini tahmin etmek ve adaptör/primer dimerlerini tanımlamak için kullanılan temsili attomol düzeyindeki kantitatif PCR (qPCR) ürünleri. Amplifiye edilmiş attomol qPCR ürünleri, fragman boyut dağılımını değerlendirmek ve kalıntı adaptör/primer dimerlerini tespit etmek amacıyla %1,5'lik agaroz jel elektroforezi ile analiz edilmiştir. (A–D) Farklı miktarlarda adaptör ligasyonlu DNA ve değişken seviyelerde adaptör/primer dimerleri içeren kütüphaneleri gösteren temsili örnekler. Her örnek için attomol Cq düzeltme faktörü (ACF) ve buna karşılık gelen düzeltilmemiş kantifikasyon döngüsü (Cq) gösterilmiştir. M, DNA boyut belirteci; NTC, kalıp içermeyen kontrol. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

11. Mitokondriyal DNA Zenginleştirme Tahmini (Opsiyonel)

NOT: Mitokondriyal ND6 geni ve nükleer Alu elementlerini hedefleyen primerler kullanarak qPCR ile mitokondriyal DNA (mtDNA) zenginleştirmesini tahmin edin. mtDNA zenginleştirmesini tahmin etmek için nükleer ve mitokondriyal hedefler arasındaki Cq değerleri farkını hesaplayın. Örnekteki mtDNA miktarını tahmin etmek için mitokondriyal hedefin mutlak Cq değerini kullanın. Cq değerleri kullanılan reaktiflere, sarf malzemelerine ve gerçek zamanlı PCR cihazına bağlı olarak değişebilir. Diğer türler için primer dizilerini ayarlayın. Fareye ve makaka'ya özgü primerler için önceki yayınlara başvurun12,13. Bu adım isteğe bağlıdır ve sekanslama öncesinde mtDNA zenginleştirmesi hakkında kaba bir tahmin sağlar.

  1. Mitokondriyal ve nükleer hedefler için ayrı Master Mix'ler hazırlayın. Her bir reaksiyon için şunları birleştirin: 5 µL 2'den× PowerUp SYBR Green Mix, 0.4 µL ilgili primer çiftindeki her bir primerin10 µM her biri), ve 2.1 µL moleküler biyoloji saflığındaki sudan.
  2. Ekle 8 µL qPCR uyumlu 96 kuyucuklu bir plakanın belirlenmiş her bir kuyucuğuna uygun miktarda Master Mix ekleyin. Şunları ekleyin: 2 µL son reaksiyon hacmini elde etmek için 1:10 oranında seyreltilmiş örnekten 10 µL.
  3. Plakayı kapatın ve gerçek zamanlı PCR cihazına yerleştirmeden önce kısa süreliğine santrifüjleyin.
  4. Aşağıdaki termal döngü koşullarını kullanarak qPCR gerçekleştirin: 2 dk, şurada 95°CArdından 15 saniyelik 45 döngü şeklinde; 95°C, 20 sn'de bekletin 56°Cve 30 saniye boyunca 72°C.
  5. Floresans eşiğini 100 RFU olarak ayarlayarak Cq değerini belirleyin.
    NOT: Cq değerlerinin karşılaştırılabilmesine olanak sağlamak için real-time PCR cihazı ile uyumlu bir floresans eşiği seçin ve tüm deneylerde aynı eşiği kullanın. Sekanslama sonrası, Cq değerlerini sekanslama kaynaklı zenginleştirme verimlilikleri ile ilişkilendirin ve bu değerleri sonraki kütüphane hazırlıkları için referans olarak kullanın.
  6. zenginleştirme ile ilişkili değeri hesaplayın Δmitokondriyal hedef Cq değerinden nükleer hedef Cq değerini çıkararak Cq (CqmtDNA − CqnDNA). İlk sekanslama verileri elde edildiğinde, mtDNA'dan türetilen sekanslama okumalarının oranını tahmin etmek için laboratuvara özgü bir standart eğri oluşturun.
    NOT: Eğer sekanslama verileri henüz mevcut değilse, Denklem 1 yedi oosit kütüphanesinden oluşturulan örnek bir standart eğri kullanılarak, mtDNA kaynaklı dizileme okumalarının beklenen yüzdesine dair kaba bir tahmin elde etmek için kullanılabilir (ΔCq = −0,8, %16,83; ΔCq = −2,1, %33,62; ΔCq = −3.0, %45,57; ΔCq = −3.9, %60,34; ΔCq = −5,0, %77,98; ΔCq = −6,2, %89,25; ΔCq = −8,4, %95,09). A ΔCq değeri <nükleer DNA'nın etkili bir şekilde uzaklaştırılmasını sağlamak için −1 değerine ulaşılmalıdır. Daha düşük zenginleştirme verimlilikleri, yeterli mtDNA sekanslama derinliği elde etmek için ek sekanslama okumaları ayrılarak telafi edilebilir; ancak bu durum, nükleer mitokondriyal DNA segmenti (NUMT) kontaminasyonunu artırabilir. ... arasındaki ilişki nedeniyle ΔCq ve mtDNA içeriği; reaktiflere, sarf malzemelerine, kullanılan cihazlara ve deneysel koşullara bağlıdır, Denklem 1 örnek bir kalibrasyon olarak değerlendirilmeli ve mümkün olduğunca laboratuvara özgü standart eğriler oluşturulmalıdır.
    Tahmini mtDNA (%) = −11,006 × ΔCq + 13,776 (1)

12. Kütüphane Amplifikasyonu

NOT: İlk amplifikasyonu birbirini izleyen iki PCR aşamasında gerçekleştirin. Lineer amplifikasyon sağlamak için ilk PCR'yi tek bir primer kullanarak gerçekleştirin. Ardından, ikinci PCR sırasında eksponansiyel amplifikasyonu mümkün kılmak için ikinci primeri ekleyin.

  1. Attomole qPCR sonuçlarını kullanarak ilk amplifikasyon PCR'ı için DNA girdi miktarını belirleyin.
  2. Tek oosit kütüphaneleri için, tipik olarak attomol qPCR Cq değeri 22'den büyük olan örnekler kullanın. Bir örneğin Cq değeri daha düşükse, örneği şuna göre yaklaşık 22 Cq değerine gelecek şekilde dilüe edin: Tablo 3Cq değerleri ≥29 olan kütüphaneler tipik olarak büyük aile boyutları ve sığ mtDNA sekanslama derinlikleri oluşturur; bu nedenle, bu kütüphanelerin hazırlama işlemine veya sekanslamaya devam edilmesi önerilmez.
  3. İçeriğinde şunlar bulunan bir amplifikasyon Master Mix hazırlayın: 20 µL 2'den× yüksek sadakatli PCR karışımı ve 4 µL mws20 primerinin (10 µM) reaksiyon başına.
  4. Ekle 24 µL Amplifikasyon Master Mix'inden ...'a/ye 14 µL seyreltilmiş numunenin.
  5. Aşağıdaki termal döngü koşullarını kullanarak lineer amplifikasyon PCR'ını gerçekleştirin: 45 saniye boyunca 98°Cardından 15 saniye süren 12 döngü ile devam edilir 98°C, 30 sn'de tutun 60°Cve 45 saniye boyunca 72°C, ardından 2 dakika boyunca şurada tutuldu 72°C.
  6. Ekle 4 µL evrensel kütüphane primerinin (10 µM) ve iyice karıştırın.
  7. Aşağıdaki termal döngü koşullarını kullanarak eksponansiyel amplifikasyon PCR'ı gerçekleştirin: 45 saniye boyunca 98°C, ardından 15 saniye süren 9 döngü ile 98°C, 30 sn'de 65°Cve 45 saniye boyunca 72°Cardından, ... sıcaklığında 2 dakikalık bir uzatma aşaması ile 72°C.
    NOT: İlk amplifikasyon tamamlandıktan sonra, numuneler şuralarda saklanabilir: 4°C ve gerekirse protokol daha sonra devam ettirilir. Oosit lizisinden ilk amplifikasyona kadar olan tüm önceki adımları kesintisiz olarak gerçekleştirin.
  8. Ekleyin 10 µL her bir örneğe moleküler biyoloji saflığında su.
  9. Amplifike edilen DNA'yı şu yöntemle saflaştırın: 40 µL manyetik boncukların (0,8× (numune hacmi), Adım 9.9–9.15'te açıklanan ikinci manyetik boncuk saflaştırma prosedürünün ardından. Boncukları iki kez şunlarla yıkayın: 200 µL %80'lik EtOH ile, DNA'yı şunların içinde elüe edin 15.5 µL Tris-HCl'in ve transferin 15 µL elüatın yeni bir 200 µL düşük bağlanma özellikli tüp.
    NOT: Burası uygun bir durma noktasıdır. Saflaştırılmış DNA'yı şuraya saklayın: 4°C veya doğrudan indekslemeye geçin.

Tablo 3: İlk kütüphane amplifikasyon polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) için DNA girdisini standardize etmek amacıyla kullanılan dilüsyon faktörleri ve karşılık gelen kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu (qPCR) kuantifikasyon döngüsü (Cq) düzeltme faktörleri. Attomol qPCR Cq değerleri hedef değerin altında olan örnekler, ilk amplifikasyon PCR'sından önce moleküler biyoloji sınıfı su ile dilüe edilmiştir. Düzeltilmiş Cq değeri, deneysel olarak ölçülen Cq değerine uygun dilüsyon düzeltme faktörünün eklenmesiyle elde edilmiş ve ardından indeksleme PCR döngü sayısını ve hedef sekanslama derinliğini belirlemek için kullanılmıştır (Tablo 4). Örnek ve su hacimleri, ilk amplifikasyon PCR'sı için 14 µL'lik bir nihai girdi hacmi oluşturur. Yıldız (*) işareti, düzeltilmiş Cq değerini elde etmek için listelenen dilüsyon düzeltme faktörünün deneysel olarak ölçülen attomol qPCR Cq değerine eklenmesi gerektiğini belirtir. Düzeltme faktörleri, bu iş akışı için ampirik olarak belirlenmiştir. Lütfen bu dosyayı indirmek için buraya tıklayın.

13. İndeksleme

  1. Tablo 4'e göre, dimer ve dilüsyon düzeltmeli attomol qPCR Cq değerini kullanarak indeksleme PCR döngü sayısını belirleyin.
  2. Her örnek için 25 µL 2× high-fidelity PCR karışımı ve 10 µL 10 µM Unique Dual Index Primer Pair içeren bir indeksleme master mix hazırlayın.
  3. Her bir amplifiye edilmiş örneğin 15 µL'sine 35 µL indeksleme master mix ekleyin.
  4. İndeksleme PCR'sını şu termal döngü koşullarını kullanarak gerçekleştirin: 98°C'de 45 s, ardından 98°C'de 15 s, 65°C'de 30 s ve 72°C'de 45 s'den oluşan uygun sayıda döngü ve son olarak 72°C'de 2 dk final uzatma.
  5. İndekslenmiş kütüphaneleri 40 µL manyetik boncuk (0,8× örnek hacmi) kullanarak saflaştırın. Boncukları iki kez %80 EtOH ile yıkayın ve DNA'yı 21 µL TElow tamponunda elüe edin.
  6. Elüatı DNA low-binding tüpüne aktarın.
  7. DNA konsantrasyonunu Qubit High Sensitivity DNA Assay veya eşdeğer bir florometrik analiz kullanarak ölçün.
  8. Kütüphaneleri sekanslama öncesinde 4°C'de veya uzun süreli saklama için −80°C'de saklayın.
    NOT: Burası güvenli bir duraklama noktasıdır.

Tablo 4: Düzeltilmiş attomol kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu (qPCR) kantifikasyon döngüsünden (Cq) belirlenen indeksleme polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) döngü sayıları ve hedef sekanslama derinliği.Düzeltilmiş Cq değeri, deneysel olarak ölçülen attomol qPCR Cq değerini, varsa uygun adaptör-dimer düzeltme faktörünü (Şekil 2) ve dilüsyon düzeltme faktörünü (Tablo 3) içerir. Düzeltilmiş Cq değeri, hem indeksleme PCR döngü sayısını hem de havuzlama için her kütüphaneye ayrılan önerilen çift uçlu sekanslama okuma sayısını belirlemek için kullanılmıştır. Hedef sekanslama okuma tahsisleri başlangıç kılavuzu olarak hizmet eder ve gerçek zamanlı PCR cihazına, sekanslama platformuna, multipleksleme stratejisine ve deneysel gereksinimlere bağlı olarak laboratuvara özgü optimizasyon gerektirebilir. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

14. Kalite Kontrol

  1. Bir Bioanalyzer, TapeStation veya eşdeğer bir nükleik asit fragman analiz cihazı kullanarak kütüphane kalitesini, fragman boyutu dağılımını ve kalıntı adaptör veya primer dimerlerin varlığını değerlendirin. Fragman boyutları yaklaşık 300 ile 1.000 bp arasında olmalıdır. Küçük kalıntı pikleri (<örnek floresan yoğunluğunun %5'i [Bioanalyzer izindeki RFU], genellikle kabul edilebilir düzeydeydi (Şekil 3A–D). Artık adaptör veya primer dimerleri, yaklaşık 70–150 bp'de belirgin pikler olarak görüldü (Şekil 3E–H). Nihai kütüphane konsantrasyonu en az 5 ng/µL...'ya bakınız/başvurunuz Ek Dosya 1 (Sorun Giderme Kılavuzu) bu kalite kriterlerinden herhangi biri karşılanmazsa.
  2. (Opsiyonel) Adaptör veya primer dimerleri tespit edilirse (Şekil 3E–H), kütüphane hacmini şuna ayarlayın 50 µL moleküler biyoloji saflığındaki su ile ekleyin 40 µL manyetik boncukların (0,8× örnek hacmi), ve ek bir saflaştırma gerçekleştirin. Boncukları iki kez %80 EtOH ile yıkayın ve saflaştırılmış kütüphaneyi şunlarda elüe edin: 21.5 µL TE'nindüşük tampon çözelti
  3. (Opsiyonel) Adaptör ve primer dimerlerinin tamamen uzaklaştırıldığını doğrulamak için kalite kontrol analizini (Adım 14.1) tekrarlayın.

figure-protocol-3
Şekil 3. İndekslenmiş sekanslama kütüphanelerinin temsili fragman analizi. İndeksleme PCR'ı sonrası kütüphane kalitesini gösteren, Bioanalyzer fragman analizi ile oluşturulmuş temsili elektroferogramlar. (A–D) Beklenen fragman boyutu dağılımına (yaklaşık 300-1000 bp) sahip ve saptanabilir adaptör/primer dimeri içermeyen, ek saflaştırma gerektirmeden sekanslama için uygun kütüphaneler. (E–H) Sekanslama öncesinde ek bir manyetik boncuk saflaştırması gerektiren, kalıntı adaptör ve/veya primer dimerleri içeren kütüphaneler. Yaklaşık 35 bp ve 10.380 bp'deki pikler sırasıyla alt ve üst iç belirteçlere karşılık gelmektedir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

15. Havuzlama ve Sekanslama

  1. Her bir indekslenmiş kütüphanenin konsantrasyonunu, Collibri Library Quantification Kit gibi Illumina tarafından hazırlanan kütüphanelerle uyumlu qPCR tabanlı bir kütüphane kantifikasyon testi kullanarak, üretici protokolüne göre ölçün. Her bir kütüphaneyi, sağlanan kütüphane dilüsyon tamponunda 1:100.000 oranında seyreltin ve her örneği en az iki kez analiz edin; üç paralel ölçüm yapılması önerilir. Standartları üç paralel şeklinde analiz edin.
  2. Her örnek ve standart için ortalama kantifikasyon döngüsü (Cq) değerini hesaplayın. Standartların ortalama Cq değerlerinden bir standart eğrisi oluşturun ve her bir kütüphanenin konsantrasyonunu üretici talimatlarına göre hesaplayın.
  3. Kütüphaneleri, Adım 10'da elde edilen ve adaptör dimerleri ile dilüsyon düzeltmesi yapılmış attomol qPCR Cq değerinden belirlenen planlanan paired-end okuma sayısına ve Tablo 4'te verilen tahsisatlara göre havuzlayın.
    NOT: Havuzlama oranı, her bir oosit kütüphanesinin düzeltilmiş Cq değerine ve karşılık gelen hedef paired-end okuma sayısına bağlıdır. Tablo 4'teki değerler yaklaşık değerlerdir ve real-time PCR cihazları arasında farklılık gösterebilir. Optimal performans için laboratuvara özgü değerler belirleyin.
  4. Her kütüphanenin hedef paired-end okuma sayısını, tüm kütüphanelere atanan hedef okumaların toplamına bölerek bağıl havuzlama fraksiyonunu hesaplayın. Bu fraksiyonu final havuzun toplam molar miktarıyla çarparak her bir kütüphaneden gereken miktarı belirleyin, ardından ölçülen molar konsantrasyondan karşılık gelen kütüphane hacmini hesaplayın. Final havuzu oluşturmak için hesaplanan hacimleri birleştirin.
  5. Havuzlanmış kütüphaneleri bir Illumina sekanslama platformu veya Illumina adaptör dizileriyle uyumlu başka bir platform kullanarak sekanslayın. Minimum 2 × 150 bp okuma uzunluğuna sahip bir paired-end konfigürasyonu kullanın. Daha kısa nükleer mitokondriyal DNA segmentlerinden (NUMT'ler) türeyen okumaların tanımlanma ve filtrelenme kapasitesini artırdıkları için 2 × 250 veya 2 × 300 bp gibi daha uzun okumalar önerilir.
  6. Havuzlanmış kütüphaneleri, örneğin, bir Illumina NovaSeq 6000 platformunda, SP Reagent Kit v1.5 (500 döngü) ile iki kanallı sekanslama-sentez kimyası kullanarak ve %5 PhiX spike-in içeren 2 × 250 bp paired-end konfigürasyonunda sekanslayın. Kütüphaneyi yükleyin ve sekanslamayı üretici talimatlarına göre gerçekleştirin. Temsili sekanslama performansı, bazların ≥%75'inin ≥Q30 kalite skoruna sahip olmasını ve kümelerin ≥%60'ının filtreyi geçmesini sağlamalıdır.

16. Biyoenformatik Analiz

NOT: Aşağıdaki iş akışı, Galaxy'de Du Novo analiz araçları8,14,15 kullanılarak yapılan veri analizini tanımlamaktadır. Analizler, Du Novo'nun yerel bir kurulumu veya dupleks dizileme verileri için geliştirilmiş diğer yazılımlar kullanılarak da gerçekleştirilebilir.

  1. BCL Convert veya eşdeğer bir demultiplexing aracı kullanılarak oluşturulan demultiplex edilmiş paired-end FASTQ dosyalarını yerel bir Galaxy kurulumuna veya halka açık bir Galaxy örneğine yükleyin14.
  2. FastQC (Galaxy versiyon 0.72+galaxy1) kullanarak sekans okuma kalitesini değerlendirin. En azından Per Base Sequence Quality, Per Sequence GC Content ve Adapter Content modüllerini inceleyin.
  3. Du Novo hattını (Galaxy versiyon 3.0.2) kullanarak demultiplex edilmiş paired-end FASTQ dosyalarından tek zincirli konsensüs diziler (SSCS'ler) ve DCS'ler oluşturun. SSCS oluşumu için minimum üç okumadan oluşan bir aile boyutu kullanın ve bir konsensüs nükleotidini, okumaların en az %70'inde mevcut olduğunda belirleyin15. Üç uygunsuz eşleşmeye (mismatch) kadar barkod hata düzeltmesini etkinleştirin. Hattın kullanımına ilişkin ayrıntılı talimatlar için Galaxy Training Network Du Novo eğitimine başvurun16.
  4. “NRYSWKMBDHV” ile temsil edilen bazları kaldırmak ve 10 bp'den kısa olan okumaları atmak için Sequence Content Trimmer (Galaxy versiyon 0.2.3) kullanın.
  5. Uç onarım (end-repair) ile ilişkili yanlılığı azaltmak için FASTQ Trimmer (Galaxy versiyon 1.1.5) kullanarak her bir DCS'nin 5′ ucundan ilk 10 nükleotidi kesin. Kırpılmış DCS okumalarını, revize edilmiş Cambridge Referans Dizisini (rCRS; NC_012920.1) içeren GRCh38.p14 gibi insan referans genomuna BWA-MEM (Galaxy versiyon 0.7.17.1) kullanarak hizalayın.
    NOT: T2T-CHM13v2.0 veya daha yeni düzenlemeler dahil olmak üzere diğer insan genom düzenlemeleri kullanılabilir.
  6. BAM dosyalarını çeşitli niteliklere göre BAMTools Filter BAM veri setlerini kullanarak filtreleyin (Galaxy versiyon 2.5.2+galaxy1). chrM'ye hizalanan, birincil hizalamaları temsil eden, eşli olan, düzgün eşleşmiş olan ve eşleşmiş bir eşe sahip olan ve eşleme kalitesi >20 olan okumaları saklayın. Bu kriterler, potansiyel NUMT kaynaklı hizalamaları azaltır17.
  7. Bam Left Align (Galaxy versiyon 1.3.1) kullanarak okumaları sola hizalayın. BAMUtil clipOverlap (Galaxy versiyon 1.0.15+galaxy1) kullanarak eşli DCS okumalarının örtüşen bölgelerini kırpın.
  8. Varsayılan ayarları kullanarak Call variants with LoFreq (Galaxy versiyon 2.1.5+galaxy2) ile tek nükleotid varyantlarını (SNV'ler) ve insersiyon/delesyonları (indeller) belirleyin.
  9. Potansiyel NUMT kontaminasyonunu azaltmak için, mevcut olduğunda, ikiden fazla varyant içeren paired-end DCS okumalarını hariç tutun. Verimli mtDNA zenginleştirmesine sahip örnekler tipik olarak tespit edilebilir NUMT kaynaklı okumalardan arınmıştır; ancak nükleer DNA'nın yetersiz tüketimi NUMT kaynaklı dizilerle sonuçlanabilir.
  10. Sabit varyantlar ve yüksek frekanslı heteroplazmiler dahil olmak üzere donöre özgü mtDNA dizi farklarını kullanarak her bir kütüphaneyi potansiyel çapraz örnek kontaminasyonu açısından inceleyin. Çapraz örnek kontaminasyonu tespit edilirse, Ek Dosya 1 (Sorun Giderme Kılavuzu) içinde açıklanan önlemleri uygulayın. Fragment boyut dağılımı önerilen aralığı aşarsa veya ortalama fragment boyutu >900 bp ise, daha önce açıklandığı gibi çift boyut seçici saflaştırma gerçekleştirin18.
  11. Tespit edilen varyantların alt analizlerini çalışmanın amaçlarına göre gerçekleştirin.
  12. Alt analizler için yalnızca ortalama mitokondriyal DCS sekans derinliği ≥100× olan örnekleri dahil edin. Paired-end okuma sayısı veya SSCS veya DCS verimi için sabit minimum eşik değerleri uygulanmamıştır.

Sonuçlar

Duplex dizileme kütüphaneleri; germinal vezikül (GV), metafaz I (MI), MII, pronükleus evresi (0PN) ve TI oositleri dahil olmak üzere farklı olgunlaşma evrelerini temsil eden insan oositlerinden hazırlanmıştır. Başarıyla hazırlanan kütüphaneler, 2 × 250 bp paired-end okumalar içeren bir SP akış hücresi kullanılarak Illumina NovaSeq 6000 platformunda dizilenmiştir. Veri analizi, okuma ailesi gruplandırması ve konsensüs okuma üretimi için Du Novo hattı kullanılarak Galaxy'de gerçekleştirilmiştir8,14,15. Başarıyla işlenen kütüphaneler için temsili dizileme metrikleri Ek Tablo 1'de özetlenmiş, kütüphane hazırlama sırasında suboptimal sonuçlar veren ve dizileme dışında tutulan örnekler ise Ek Tablo 2'de özetlenmiştir.

Adaptörle bağlanmış DNA miktarını, mtDNA zenginleştirmesini, kütüphane konsantrasyonunu ve fragman boyutu dağılımını değerlendirmek için kütüphane hazırlığı boyunca çeşitli kalite kontrol adımları gerçekleştirilmiştir. İlk kalite kontrol adımı, adaptörle bağlanmış DNA miktarını tahmin etmek için kullanılan attomol qPCR analizidir (Şekil 4A,B). qPCR amplifikasyon ürünlerinin agaroz jel elektroforezi ile adaptör veya primer dimerleri tespit edildiğinde, hesaplanan kantifikasyon döngüsü (Cq) değeri ayarlanmıştır (Şekil 2A–D). Adaptör veya primer dimerleri genellikle daha yüksek Cq değerlerine sahip, dolayısıyla daha düşük miktarda adaptörle bağlanmış DNA içeren örneklerde gözlemlenmiştir. Bu protokolde açıklanan koşullar kullanılarak, ortalama 25,8'lik bir ayarlanmış attomol qPCR Cq değeri elde edilmiştir (Ek Tablo 1). Düzeltilmiş Cq değerine dayanarak, ilk amplifikasyon PCR'ı için DNA girişi, Tablo 3'te gösterilen dilüsyon şemasına göre ayarlanmıştır. Düzeltilmiş Cq değerleri ≥22 olan örnekler dilüsyon yapılmadan kullanılırken, düzeltilmiş Cq değerleri <22 olan örnekler amplifikasyondan önce dilüye edilmiştir. Bu ayarlama, okuma ailesi boyutunu optimize etmek ve gereken sekanslama okumalarının sayısını azaltmak için yapılmıştır. Düzeltilmiş Cq değerleri >28 olan örnekler genellikle daha büyük okuma aileleri (ortalama aile boyutu, 21,8) oluşturmuş, bu da daha az DCS'ye ve <200× ortalama mtDNA sekanslama derinliğine yol açmıştır (Ek Tablo 1). Düzeltilmiş Cq değerinin 22–28 olarak ayarlanması, daha önce duplex sekanslama için optimal olarak rapor edilen yaklaşık altı değerine yakın, 7,91'lik bir ortalama aile boyutuyla sonuçlanmıştır6,7. Yine de daha büyük aile boyutları, sekanslama derinliğini artırabildikleri için tek oositler gibi çok düşük girişli örnekler için avantajlı olabilir.

figure-results-1
Şekil 4. Kütüphane miktar tayini ve mitokondriyal DNA (mtDNA) zenginleştirme kestirimi için kullanılan kantitatif PCR (qPCR) analizleri. Saflaştırılmış adaptör-ligasyonlu DNA, qPCR analizi öncesinde 1:10 oranında seyreltilmiştir. (A) Adaptör-ligasyonlu DNA miktarını kestirmek için kullanılan attomol qPCR analizine ait amplifikasyon eğrileri. Floresans eşiği 1.000 göreceli floresans birimi (RFU) olarak belirlenmiştir. (B) Attomol qPCR analizinin erime eğrisi analizi. (C) mtDNA zenginleştirme qPCR analizine ait amplifikasyon eğrileri. Floresans eşiği 100 RFU olarak belirlenmiştir. Mitokondriyal NADH dehydrogenaz altbirim 6 (ND6) hedefinin amplifikasyonu kırmızıyla, nükleer Alu tekrarlı element hedefinin amplifikasyonu ise maviyle gösterilmiştir. (D) Mitokondriyal ve nükleer qPCR ürünlerinin erime eğrisi analizi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Kütüphane havuzlama işleminden önce, fragman boyutu dağılımını değerlendirmek ve kalıntı adaptör veya primer dimerlerini tespit etmek için tüm kütüphaneler bir Bioanalyzer veya TapeStation kullanılarak analiz edildi. Optimal kütüphanelerin ve kalıntı adaptör veya primer dimerleri içeren kütüphanelerin temsilci örnekleri Şekil 3A–H'de gösterilmiştir. Adaptör veya primer dimerleri yaklaşık 70–150 bp civarında pikler olarak görülmüştür (Şekil 3E–H); tespit edildiklerinde, kütüphaneler sekanslama öncesinde ek bir manyetik boncuk saflaştırmasına tabi tutulmuştur. Örnek kaybını minimize etmek için boyut seçimi kasıtlı olarak atlandığından, sekanslanan kütüphanelerin medyan insert boyutu 275 bp idi (Ek Tablo 1).

mtDNA zenginleştirme, mitokondriyal ve nükleer hedef lokuslar kullanılarak qPCR ile tahmin edilmiş ve böylece dizileme okumalarının mitokondriyal genoma eşleşmesi beklenen oranı öngörülmüştür (Şekil 4C,D). Ortalama Cq değerleri mitokondriyal hedef için 25,2 ve nükleer hedef için 29,7 olarak belirlenmiş (Ek Tablo 1), bu da −4,5'lik bir ortalama ΔCq (CqmtDNA − CqnDNA) değerine karşılık gelmiştir. Ortalama olarak, eşli uçlu (paired-end) dizileme okumalarının %67,5'i mitokondriyal referans genoma eşleşmiştir. Kütüphane havuzlama işlemi sırasında hem mtDNA zenginleştirme tahmini hem de düzeltilmiş attomol qPCR Cq değeri dikkate alınmıştır. Örnekler arasında dengeli bir dizileme çıktısı sağlamak amacıyla, daha yüksek düzeltilmiş Cq değerlerine ve daha etkili mtDNA zenginleştirmesine sahip kütüphanelere, Tablo 4'te gösterilen dizileme tahsis şemasına göre orantılı olarak daha az dizileme okuması ayrılmıştır.

Düzeltilmiş attomol qPCR Cq değerlerine dayanarak, kütüphane başına ortalama 4 milyon paired-end okuma şeklinde bir hedef tahsisi yapılmıştır (Tablo 4). Verimsiz küme oluşumu nedeniyle, sekanslama sonrası kütüphane başına ortalama 1,3 milyon paired-end okuma elde edilmiştir; ancak bu sekanslama verimi, sonraki duplex sekanslama analizi için yeterli olmuştur (Ek Tablo 1). DCS'lerin mitokondriyal referans genoma haritalanması, mitokondriyal genom genelinde 567× medyan sekanslama derinliği sağlamıştır (Şekil 5A,B,D; Ek Tablo 1). Kütüphane başına ortalama 344.554 SSCS ve 96.322 DCS üretilmiştir (Ek Tablo 1). Ortaya çıkan kütüphaneler 8,32 ortalama okuma ailesi boyutuna sahip olup, daha büyük aile boyutları genellikle daha yüksek düzeltilmiş attomol qPCR Cq değerlerine sahip kütüphanelerde gözlemlenmiştir (Şekil 5C,E; Ek Tablo 1). Bu sonuçlar, 1.440× medyan mtDNA sekanslama derinliğinin elde edildiği, optimal küme yoğunluğunda gerçekleştirilen önceki bir çalışmada elde edilen sonuçlarla tutarlıdır19.

figure-results-2
Şekil 5. Tek oositli duplex sekanslama kütüphanelerinin sekanslama performansı. (A) Mitokondriyal genom boyunca duplex konsensüs sekans (DCS) derinliği. İnce çizgiler bireysel kütüphaneleri, kalın çizgi ise tüm kütüphanelerdeki ortalama derinliği temsil etmektedir. (B) Bireysel kütüphaneler için medyan DCS derinliğinin dağılımı. (C) Bireysel kütüphaneler için ortalama DCS aile boyutunun dağılımı. (B) ve (C)'de her bir nokta bir kütüphaneyi temsil eder ve nokta rengi attomole qPCR kantifikasyon döngüsünü (Cq) belirtir. (D) mtDNA zenginleştirme tahmini (ΔCq) ile mitokondriyal referans genoma hizalanan sekanslama okumalarının oranı arasındaki Pearson korelasyonu. (E) Attomole qPCR Cq değeri ile ortalama DCS aile boyutu arasındaki Pearson korelasyonu. (D) ve (E)'de her bir nokta bir kütüphaneyi temsil eder; nokta rengi attomole qPCR Cq değerini, nokta boyutu ise o kütüphane için elde edilen toplam paired-end okuma sayısını temsil eder. n = 39 kütüphane. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Tablo 1. Optimal insan oosit duplex dizileme kütüphaneleri için dizileme ve kütüphane kalite metrikleri. Bu tablo; kalite kontrolünden geçen ve sonraki analizlere dahil edilen kütüphanelerin dizileme öncesi kütüphane kalite metriklerini, kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu (qPCR) ölçümlerini, dizileme performansını ve duplex dizileme analiz sonuçlarını özetlemektedir. Raporlanan parametreler arasında oosit gelişim evresi, mitokondriyal DNA (mtDNA) zenginleştirme qPCR sonuçları, attomol qPCR ölçümleri, adaptör-dimer düzeltme faktörü (ACF), indeksleme PCR döngü sayısı, hedeflenen çift uçlu (paired-end) dizileme derinliği, kütüphane konsantrasyonu, dizileme verimi, mtDNA zenginleşmesi, tek zincir konsensüs dizisi (SSCS) ve duplex konsensüs dizisi (DCS) okuma sayıları, aile boyutu istatistikleri, dizileme derinliği ve insert-boyutu dağılımları yer almaktadır. Örnek tanımlayıcıları analizden önce anonimleştirilmiştir. Hedeflenen çift uçlu okuma sayıları, düzeltilmiş attomol qPCR kantifikasyon döngü (Cq) değerine göre atanmıştır (Tablo 4). Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Tablo 2. Sonraki duplex dizileme analizlerinden hariç tutulan suboptimal insan oosit kütüphaneleri için dizileme öncesi kalite metrikleri. Bu tablo, sonraki dizileme analizlerine dahil edilme kriterlerini karşılamayan kütüphanelerin dizileme öncesi kalite kontrol sonuçlarını özetlemektedir. Bildirilen parametreler arasında örnek tanımlayıcısı, oosit gelişim evresi, mitokondriyal DNA (mtDNA) zenginleştirme kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu (qPCR) sonuçları, adaptör-dimer düzeltme faktörü (ACF), düzeltilmiş attomol qPCR kantifikasyon döngüsü (Cq), indeksleme polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) döngü sayısı ve Qubit High Sensitivity DNA Assay kullanılarak ölçülen kütüphane konsantrasyonu yer almaktadır. Kütüphaneler, protokolde açıklanan kalite kontrol kriterlerine göre hariç tutulmuştur. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Dosya 1. Tek oosit mitokondriyal DNA dubleks sekanslama kütüphanesi hazırlama için sorun giderme kılavuzu. Bu ek dosya; numune kaybının önlenmesi, adaptör hazırlama ve kalite değerlendirmesi, manyetik boncuk saflaştırması, kütüphane kalite kontrolü, sekanslama performansı, numuneler arası kontaminasyon ve nükleer mitokondriyal DNA segmenti (NUMT) kontaminasyonu dahil olmak üzere iş akışının kritik adımları için sorun giderme önerileri sunar. Kılavuz, ana protokolü tamamlayıcı niteliktedir ve kütüphane kalite metrikleri veya sekanslama performansı önerilen aralıkların dışına çıktığında başvurulmalıdır. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

Oositlerde tanımlanan mtDNA varyantları; de novo mutajenez, nesiller arası heteroplazmi değişimleri ile yaşlanma ve hastalıkların dişi germ hattı üzerindeki etkilerinin bir kombinasyonunu yansıtır. Bu protokol, tekil oositlerden mtDNA zenginleştirme yönteminin ardından, mtDNA mutasyonlarının yüksek doğrulukla tespitini ve analizini sağlayan dupleks sekanslama kütüphane hazırlığı ve sekanslama sürecini tanımlamaktadır. Oositlerdeki yüksek mtDNA kopya sayısına rağmen, bu iş akışı tek bir hücreden eksiksiz bir sekanslama kütüphanesi hazırlanmasını gerektirir. Bu nedenle, Ek Dosya 1 (Sorun Giderme Kılavuzu) içerisinde de detaylandırıldığı üzere, prosedür boyunca numunelerin dikkatli bir şekilde işlenmesi esastır. Dikkatli numune işlemine rağmen, başlangıçtaki işlem basamaklarında oosit kaybı veya kütüphane hazırlığı sırasında numune kaybı nedeniyle kütüphane hazırlıklarının yaklaşık %5'i başarısız olabilir.

Kütüphane hazırlama süreci boyunca ve sonrasında yapılan kalite kontrolü; başarılı adaptör ligasyonunu doğrulamak, mtDNA zenginleştirmesini değerlendirmek, amplifikasyon için DNA girdisini optimize etmek, kalıntı adaptör veya primer dimerlerini tespit etmek ve ek saflaştırma veya amplifikasyon adımlarının gerekip gerekmediğini belirlemek için gereklidir. Tüm kütüphane hazırlıkları boyunca aynı gerçek zamanlı qPCR cihazının kullanılması, tutarlı reaksiyon koşulları sağlar ve aşağı yönlü kalite kontrolü ile protokol optimizasyonu için kullanılan ölçümlerin karşılaştırılabilirliğini, tekrarlanabilirliğini ve güvenilirliğini artırır. Bu protokolde açıklanan kütüphane amplifikasyonu ve indeksleme için kullanılan PCR döngü sayıları, farklı cihazlar, enzimler veya reaktifler kullanıldığında ayarlama gerektirebilir. Başlangıç amplifikasyon adımı, tek bir primer kullanılarak gerçekleştirilen doğrusal bir amplifikasyon evresine ve ardından ikinci primerin eklenmesiyle gerçekleşen eksponansiyel amplifikasyona ayrılmıştır. Bu strateji, ilk amplifikasyon döngüsü sırasında oluşan hataların, gerçek DNA mutasyonlarından ayırt edilmesinin zor olduğu seviyelere ulaşacak şekilde yayılma olasılığını minimize eder. Önerilen döngü sayıları, duplex sekanslama analizi için optimal bir okuma-aile boyutu elde etmek amacıyla seçilmiştir; ancak, giriş DNA'sının miktarına ve kalitesine bağlı olarak optimizasyon gerektirebilirler. Daha düşük DNA girdisine sahip örnekler ek amplifikasyon döngülerine ihtiyaç duyabilirken, daha yüksek DNA girdisine sahip örnekler, aşırı amplifikasyonu önlemek ve kütüphane kompleksitesini korumak için daha az döngü gerektirebilir.

Bu protokol tekil insan oositleri kullanılarak gösterilmiş olsa da, iş akışı insan örnekleri ile sınırlı değildir. Daha önce aynı yaklaşımı farelerde ve makaklarda germ hattı mutajenezini araştırmak için uyguladık12,13; bu durum, türe özgü primer dizilerinin ve gerektiğinde diğer deneysel parametrelerin optimizasyonunun ardından duplex sequencing kütüphane hazırlığının birçok türe ait oositlere uygulanabilir olduğunu göstermektedir. Duplex sequencing yönteminin geniş uygulanabilirliğine rağmen, burada açıklanan mtDNA zenginleştirme ve kütüphane hazırlama iş akışı tekil somatik hücrelere kolayca aktarılamaz; çünkü bu hücrelerin mtDNA kopya sayıları tipik olarak oositlerinkinden birkaç kat daha düşüktür ve bu durum kütüphane hazırlığı için mevcut olan girdi DNA miktarını sınırlar. Yine de, kütüphane hazırlığı öncesinde optimize edilmiş mtDNA zenginleştirmesi ile birleştirildiğinde, toplu somatik hücre örneklerinden duplex sequencing kütüphaneleri oluşturulabilir. Duplex sequencing'in bir diğer sınırlaması, özellikle fragman uçlarında yapay hatalara yol açabilen DNA fragmantasyonu gereksinimidir. Sonuç olarak, fragman uçlarında bulunan bazlar genellikle sonraki analizlerden hariç tutulur ve insersiyonlar ile delesyonların saptanması ve karakterizasyonu da fragmantasyon sürecinden etkilenebilir. Özellikle Oxford Nanopore Technologies tarafından geliştirilen uzun okuma sequencing teknolojilerindeki son gelişmeler, zamanla tüm mitokondriyal DNA moleküllerinin fragmantasyon olmadan yüksek doğrulukla sequencinglenmesine olanak sağlayabilir. Ancak, güvenilir mutasyon saptaması için gereken doğruluğa ulaşmak, şu an için doğal, amplifiye edilmemiş DNA moleküllerinin analizine dayanmaktadır. Tek bir oositle mevcut olan DNA miktarı bu yaklaşımlar için yetersiz olduğundan, bu yöntemlerin söz konusu örnek tipine uygulanması şu an için pratik değildir.

Uzun menzilli PCR ve geleneksel yüksek verimli paralel dizileme20,21,22 dahil olmak üzere önceki çalışmalarda kullanılan yaklaşımlarla karşılaştırıldığında, bu protokol birkaç avantaj sunmaktadır. Her amplifikasyon adımı, düşük frekanslı varyantların tespitini zorlaştırabilen artefakt mutasyonların oluşma riskini taşır ve bu durum genellikle en az %1'lik minör alel frekans eşiklerini gerektirir. Buna karşılık, dubleks dizileme ile elde edilen önemli ölçüde daha düşük hata oranı, mutasyon belirleme doğruluğunu artırır ve geleneksel dizileme yaklaşımlarının performansını aşar5. Sonuç olarak bu yöntem, nadir mtDNA mutasyonlarının tespit edilmesi ve miktarının belirlenmesi için daha güvenilir bir çerçeve sağlar. Bu iş akışını kullanarak, çoğu somatik dokunun aksine, oositlerin yaşa bağlı mtDNA mutasyon birikiminden büyük ölçüde kaçındığını daha önce göstermiştik19. Bu belirgin koruyucu etkinin, endometriozis gibi ovaryen mikroçevreyi değiştiren ve oosit kalitesini bozan hastalık durumlarında korunup korunmadığı henüz bilinmemektedir ve daha fazla araştırılması gerekmektedir.

Açıklamalar

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması beyan etmemektedir.

Teşekkürler

Oosit toplama konusundaki destekleri için Kepler Üniversitesi Hastanesi Linz In Vitro Fertilizasyon Merkezi ekibine içtenlikle teşekkür ederiz. Ayrıca, Galaxy üzerinde duplex sekanslama analiz örneğini geliştirdikleri ve veri analizi konusunda rehberlik ettikleri için N. Stoler ve A. Nekrutenko'ya teşekkür ederiz. Bu çalışma, Avusturya Bilim Fonu (FWF) Schrödinger Bursu (DOI: 10.55776/J4096; BA) ve FWF Bağımsız Projesi (DOI: 10.55776/P36928; BA) tarafından desteklenmiştir. KDM, kısmen Ulusal Sağlık Enstitüleri hibe programı R01GM116044 ve Pennsylvania State Üniversitesi Eberly Bilim Koleji'nin Willaman Kürsüsü Bağış Fonu tarafından desteklenmiştir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
96 Benzersiz Çift İndeksli Primer ÇiftleriNew England BiolabsE6440S/Lİndeksleme PCR'ı için benzersiz çift indeksli primer çiftleri
Absolut etanol, moleküler biyoloji sınıfı, %96Fisher BioReagents15518181Moleküler biyoloji sınıfı su ile taze %80'lik etanol hazırlayın
Agaroz, düşük elektroendozmozBiozym840000%1,5 ve %2'lik agaroz jellerin hazırlanması için
Amonyum asetat çözeltisi, 5 MThermo Fisher ScientificJ60688.ADEtanol çöktürmesi için kullanılır
ATP, 10 mMNew England BiolabsP0756S/LEksonükleaz V sindirimi için kullanılır
Otomatik elektroforez cihazıAgilent TechnologiesG2992AAArtık üretilmeyen Agilent 2100 Bioanalyzer kullanılmıştır; 4150 TapeStation veya eşdeğer bir nükleik asit fragman analiz cihazı kullanılabilir.
Bioanalyzer Yüksek Hassasiyetli DNA KitiAgilent Technologies5067-4626Kütüphane boyut dağılımı ve adaptör-/primer-dimer değerlendirmesi için
Taşıyıcı oligonükleotidIntegrated DNA Technologies (IDT)Custom synthesisİnsan genomu ile komplementer olmayan sekans. Örnek bir sekans Tablo 2'de verilmiştir. 100 nM'lik bir stok çözelti hazırlayın ve nihai konsantrasyon 1 nM olacak şekilde seyreltin.
CFX96 Touch Real-Time PCR Tespit SistemiBio-Rad12011319Bu çalışmada kullanılan cihaz artık üretilmemektedir; Cq değerleri değişebilse de CFX Opus 96 veya eşdeğer bir real-time PCR cihazı kullanılabilir.
Collibri Kütüphane Kantifikasyon KitiInvitrogenA38524100Havuzlama öncesi indekslenmiş kütüphanelerin kantifikasyonu için
Hiyalüronidaz (80 U/mL) içeren Cumulus-hücre uzaklaştırma medyumuGynemed4 HY 0010GM501 Hiyalüronidaz
DNA düşük bağlanma özellikli PCR tüpü, 200 µLCorningPCR-02-L-CAxygen Maximum Recovery tüpü
DNA düşük bağlanma özellikli tüp, 0,5 mLBiozym710136
DNA düşük bağlanma özellikli tüp, 1,5 mLBiozym710176
DNA Polimeraz I, Büyük (Klenow) Fragman (5 U/µL)New England BiolabsM0210S/LAdaptör uzatması sırasında kullanılır
dNTP Karışımı (ekimolar dATP, dCTP, dGTP ve dTTP), 10 mMNew England BiolabsN0447S/LAdaptör uzatması sırasında kullanılır
EDTA, 0,5 M (pH 8,0)Fisher BioReagents10628203TE ve TElow tamponlarının bileşeni
EvaGreen boyası, 20×Biotium31077-TAttomole qPCR'da kullanılır
Eksonükleaz V (RecBCD), 10 U/µLNew England BiolabsM0345S/LLineer DNA sindirimi için kullanılır
Sabit yüksekliğe sahip tarakBio-Rad1704446EDUAgaroz jel elektroforezi için
Odaklanmış ultrasonikasyon cihazıCovaris500295M220 odaklanmış ultrasonikatör
Odaklanmış ultrasonikasyon tüpü, 50 µLCovaris520166microTUBE-50 AFA Fiber Vidalı Kapak
Gel yükleme boyası, 6×Thermo Fisher ScientificR1161TriTrack DNA Yükleme Boyası
GM501 Mineral YağıGynemed4 MO 0100Oosit işlemleri sırasında buharlaşmayı önlemek ve sıcaklık, ozmolalite ve pH dahil olmak üzere stabil steril kültür koşullarını korumak için oosit toplama medyumunun üzerine kaplamak amacıyla kullanılır
Yüksek sadakatli PCR Karışımı, 2×KAPA BiosystemsKK2602KAPA HiFi HotStart ReadyMix
Yüksek hassasiyetli florometrik DNA analiz kitiInvitrogenQ32854Qubit dsDNA Yüksek Hassasiyetli Analiz Kiti
HpyCH4III restriksiyon enzimi (5 U/µL)New England BiolabsR0618S/LAdaptör restriksiyon sindirimi için kullanılır
Laboratuvar santrifüjü, soğutmalıEppendorf54060003134 °C'de 14.000 × g'yi desteklemelidir
Zona pellucida açma lazer sistemiVitrolife19310/0146Polar gövdenin uzaklaştırılması için kullanılır
Kütüphane hazırlama kitiNew England BiolabsE7645S/LNEBNext Ultra II DNA Kütüphane Hazırlama Kiti; uç onarımı/A-kuyruk ekleme ve ligasyon reaktiflerini içerir
Magnezyum klorür çözeltisi, 25 mMNew England BiolabsB9021S/LEksonükleaz V sindirimi için kullanılır
Manyetik boncuk saflaştırma reaktifiBeckman CoulterA63881AMPure XP Boncuklar
Manyetik rafInvitrogen12-321-DManyetik boncuk ayırımı için
MikromanipülatörLuigs & Neumann GmbHSM II/2Polar gövdenin uzaklaştırılması için kullanılır
MikroskopOlympusIX51Polar gövdenin uzaklaştırılması için kullanılır
Moleküler biyoloji sınıfı suThermo Fisher Scientific327290010Reaktif hazırlama ve seyreltmeler için kullanılır
Oosit kültür medyumuGynemed4 GM 501H-20GM501 Kültür medyumu
PCR plakası, 96 kuyucukluBiozymAF4TI-0960-CŞeffaf kuyucuklar, şeffaf çerçeve, düşük profilli, etekli
PCR plaka sızdırmazlık örtüsüBio-RadMSB1001BReal-time PCR cihazı ile uyumlu
Fosfat tamponlu salin (PBS), 20×Cell Signaling Technology9808SMoleküler biyoloji sınıfı su ile 1× olacak şekilde seyreltin
Cumulus–oosit komplekslerinin (COC'ler) ve oositlerin manipülasyonu ve transferi için pipetlerCooperSurgicalMXL3-150 (150 µm)Cumulus hücrelerinin mekanik olarak uzaklaştırılması ve COC'lerin ve oositlerin transferi için kullanılır. Ek pipet boyutları için üretici web sitesine bakınız.
Gel elektroforezi için güç kaynağıBio-Rad1645050PowerPac Temel Güç Kaynağı
PowerUp SYBR Green Master Mix, 2×Applied Biosystems15350929Mitokondriyal ve nükleer qPCR analizlerinde kullanılır
Qubit FlorometreInvitrogenQ33238Artık üretilmeyen Qubit 1 Florometre kullanılmıştır; daha yeni bir versiyon veya eşdeğer bir florometrik nükleik asit kantifikasyon cihazı kullanılabilir.
RNase A, 10 mg/mLThermo Fisher Scientific10753721Kullanmadan önce 1 mg/mL'ye seyreltin
SpektrofotometreThermo Fisher ScientificNDULTRAGLArtık üretilmeyen NanoDrop OneC cihazı kullanılmıştır; daha yeni bir versiyon veya eşdeğer bir mikrohacimli spektrofotometre kullanılabilir.
SYBR Safe DNA Jel BoyasıInvitrogenS33102Agaroz jel elektroforezi için
Termal döngüleyiciBio-Rad1861096T100 Termal Döngüleyici
Termolabil Proteinaz K (0,120 U/µL)New England BiolabsP8111S/LTek oosit lizisi için kullanılır
Tris-asetat-EDTA (TAE) tamponu, 50×Fisher ScientificBP1332-1Agaroz jel elektroforezi için 1× olacak şekilde seyreltin
Tris-HCl (pH 8,0), 1 MFisher BioReagents10336763Reaktif hazırlama ve seyreltmeler için kullanılır
Tween 20Fisher BioReagents11417160Oosit Lizis Tamponu'nun bileşeni
Evrensel DNA merdiveniThermo Fisher ScientificSM0333GeneRuler Kullanıma Hazır DNA Merdiveni (100–1.000 bp)
Wide Mini-Sub Cell GT HücresiBio-Rad1704468EDUAgaroz jel elektroforezi için
Wide Mini-Sub Cell GT UV-Şeffaf Jel Tepsisi (15 × 7 cm)Bio-Rad1704426Agaroz jel elektroforezi için

Kaynaklar

  1. Dyall SD, Brown MT, Johnson PJ. Ancient invasions: from endosymbionts to organelles. Science. 2004;304:253-257. doi:10.1126/science.1094884.
  2. Pakendorf B, Stoneking M. Mitochondrial DNA and human evolution. Annu Rev Genomics Hum Genet. 2005;6:165-183. doi:10.1146/annurev.genom.6.080604.162249.
  3. Ng YS, Turnbull DM. Mitochondrial disease: genetics and management. J Neurol. 2016;263:179-191. doi:10.1007/s00415-015-7884-3.
  4. Shoubridge EA, Wai T. Mitochondrial DNA and the mammalian oocyte. In: St John JC, editor. Current Topics in Developmental Biology. Vol. 77: The Mitochondrion in the Germline and Early Development. San Diego (CA): Academic Press; 2007. p. 87-111. doi:10.1016/S0070-2153(06)77004-1.
  5. Fox EJ, Reid-Bayliss KS, Emond MJ, Loeb LA. Accuracy of next generation sequencing platforms. Next Gener Seq Appl. 2014;1:1000106. doi:10.4172/jngsa.1000106.
  6. Kennedy SR, et al. Detecting ultralow-frequency mutations by Duplex Sequencing. Nat Protoc. 2014;9:2586-2606. doi:10.1038/nprot.2014.170.
  7. Schmitt MW, et al. Detection of ultra-rare mutations by next-generation sequencing. Proc Natl Acad Sci U S A. 2012;109:14508-14513. doi:10.1073/pnas.1208715109.
  8. Stoler N, et al. Family reunion via error correction: an efficient analysis of duplex sequencing data. BMC Bioinformatics. 2020;21:96. doi:10.1186/s12859-020-3419-8.
  9. Abascal F, et al. Somatic mutation landscapes at single-molecule resolution. Nature. 2021;593:405-410. doi:10.1038/s41586-021-03477-4.
  10. The ESHRE Guideline Group on Ovarian Stimulation, Ata B, Bosch E, Broer S, Griesinger G, Grynberg M, et al. ESHRE guideline: ovarian stimulation for IVF/ICSI: an update in 2025. Hum Reprod. 2026;41:498-514. doi:10.1093/humrep/deag018.
  11. The ESHRE Working Group on Ultrasound in ART, et al. Recommendations for good practice in ultrasound: oocyte pick up. Hum Reprod Open. 2019;2019:hoz025. doi:10.1093/hropen/hoz025.
  12. Arbeithuber B, et al. Age-related accumulation of de novo mitochondrial mutations in mammalian oocytes and somatic tissues. PLoS Biol. 2020;18:e3000745. doi:10.1371/journal.pbio.3000745.
  13. Arbeithuber B, et al. Advanced age increases frequencies of de novo mitochondrial mutations in macaque oocytes and somatic tissues. Proc Natl Acad Sci U S A. 2022;119:e2118740119. doi:10.1073/pnas.2118740119.
  14. The Galaxy Community. The Galaxy platform for accessible, reproducible, and collaborative data analyses: 2024 update. Nucleic Acids Res. 2024;52:W83-W94. doi:10.1093/nar/gkae410.
  15. Stoler N, Arbeithuber B, Guiblet W, Makova KD, Nekrutenko A. Streamlined analysis of duplex sequencing data with Du Novo. Genome Biol. 2016;17:180. doi:10.1186/s13059-016-1039-4.
  16. Nekrutenko A, Stoler N. Calling very rare variants. Galaxy Training Network. Available from: https://training.galaxyproject.org/training-material/topics/variant-analysis/tutorials/dunovo/tutorial.html. Accessed July 25, 2026.
  17. Barnett DW, et al. BamTools: a C++ API and toolkit for analyzing and managing BAM files. Bioinformatics. 2011;27:1691-1692. doi:10.1093/bioinformatics/btr174.
  18. Illumina. Double sided size selection and bead clean up. Illumina Knowledge Base. Available from: https://knowledge.illumina.com/library-preparation/general-library-prep/library-preparation-general-library-prep-reference_material-list/000006157. Accessed July 25, 2026.
  19. Arbeithuber B, et al. Allele frequency selection and no age-related increase in human oocyte mitochondrial mutations. Sci Adv. 2025;11:eadw4954. doi:10.1126/sciadv.adw4954.
  20. Mertens J, et al. Mitochondrial DNA variants segregate during human preimplantation development into genetically different cell lineages that are maintained postnatally. Hum Mol Genet. 2022;31:3629-3642. doi:10.1093/hmg/ddac059.
  21. Mertens J, et al. Children born after assisted reproduction more commonly carry a mitochondrial genotype associating with low birthweight. Nat Commun. 2024;15:1232. doi:10.1038/s41467-024-45446-1.
  22. Van Der Kelen A, et al. The interplay between mitochondrial DNA genotypes, female infertility, ovarian response, and mutagenesis in oocytes. Hum Reprod Open. 2025;2025:hoae074. doi:10.1093/hropen/hoae074.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Tekil OositlermtDNA VaryantlarHeteroplazmi AnaliziEkzon kleaz VK t phane Haz rlamaD k Frekansl VaryantlarDe Novo MutajenezIllumina Sekanslama

Bu makale yayımlandı

Video yakında

Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.