Kontrast Maddeye Bağlı Akut Böbrek Hasarı Oluşturulmuş Sıçan Modelinde Kontrast Sonrası N-Asetilsistein ve Montelukast Tedavisinin Nefroprotektif Etkileri

Özet

Bu protokol, kontraste bağlı akut böbrek hasarının bir sıçan modelini sunmakta ve kontrast sonrası N-asetilsistein ile montelukastin ayrı ayrı ve kombinasyon halinde uygulanmasını değerlendirmektedir. Kombine tedavi monoterapiye göre tutarlı bir şekilde daha üstün sonuçlar vermese de, tedavi rejimlerinin daha az şiddetli renal disfonksiyon, oksidatif stres, inflamasyon ve histopatolojik hasar ile ilişkili olduğu görülmüştür.

Özet

Kontrast maddeye bağlı akut böbrek hasarı (CI-AKI), oksidatif stres ve inflamatuar süreçlerin renal hasara katkıda bulunduğu, iyotlu kontrast maruziyetinin önemli bir komplikasyonudur. Bu çalışma, CI-AKI'nın deneysel bir sıçan modelini oluşturmuş ve kontrast uygulaması sonrası N-asetilsistein (NAC), montelukast veya her ikisinin kombinasyonu ile başlatılan tedavilerin etkilerini incelemiştir. Yetişkin erkek Wistar sıçanlara su kısıtlaması uygulanmış, ardından sırayla intravenöz olarak Nω-nitro-L-arginin metil ester (L-NAME), indometasin ve iohexol uygulanmıştır. Tedaviye, iohexol uygulamasının tamamlanmasından 1 saat sonra, L-NAME uygulamasından yaklaşık 1,5 saat sonra başlanmış ve ardışık 3 gün boyunca günde bir kez devam edilmiştir. Renal fonksiyon indeksleri, oksidatif stres parametreleri, inflamatuar sitokinler, renal hasar biyobelirteçleri ve böbrek histopatolojisi değerlendirilmiştir. Tedavi edilmeyen CI-AKI grubu belirgin renal disfonksiyon, olumsuz bir oksidatif stres ve inflamatuar profil ile ciddi histopatolojik hasar sergilemiştir. Tedavi edilmeyen CI-AKI grubuyla karşılaştırıldığında, NAC, montelukast veya kombine rejim alan hayvanlar genel olarak daha iyi biyokimyasal ve histopatolojik bulgular göstermiştir. Glutasyon (GSH) seviyeleri kombinasyon grubunda en yüksek, ortalama histopatolojik hasar skorları ise sayısal olarak en düşük seviyedeydi; ancak kombine tedavi, değerlendirilen sonuçların tamamında monoterapiyi tutarlı bir şekilde geride bırakmamıştır. Bu protokol, CI-AKI'da kontrast sonrası müdahalelerin değerlendirilmesi için kontrollü bir preklinik çerçeve sunmaktadır ve bulgular, klinik etkinlik veya kombinasyona özgü bir avantaj kanıtlamaksızın NAC ve montelukastin daha fazla deneysel olarak araştırılmasını haklı çıkarmaktadır.

Giriş

Akut böbrek hasarı (ABH), hastanede yatan hastaların seyrinde sıklıkla komplikasyonlara yol açar; morbidite, mortalite ve sağlık kaynaklarının kullanımındaki artışa katkıda bulunur. İyodlu kontrast maddeler tanısal görüntülemede ve girişimsel prosedürlerde rutin olarak kullanıldığından, kontrast maruziyeti sonrası böbrek fonksiyonlarının bozulması önemli bir klinik sorun haline gelmiştir. Güncel terminoloji, kontrast maddelerin uygulanmasından sonra meydana gelen her türlü ABH atağını kapsayan kontrastla ilişkili akut böbrek hasarını (CA-AKI), renal hasarın nedensel olarak kontrast maddeye bağlandığı kontrast kaynaklı akut böbrek hasarından (CI-AKI) ayırır. Kontrast maruziyetinin doğrudan renal hasarla ilişkilendirilebildiği kontrollü deneysel modellerde, bu nedenle CI-AKI terimi yaygın olarak kullanılmaya devam etmektedir^1,2.

Kronik böbrek hastalığı, diabetes mellitus, ileri yaş, kalp yetmezliği veya diğer kardiyovasküler komorbiditeleri olan hastalar CI-AKI'ya karşı özellikle hassastır. Etkilenen birçok hastada böbrek fonksiyonları geri döner; ancak daha şiddetli vakalarda kalıcı renal bozulma, renal replasman tedavisi ihtiyacı ve artmış ölüm riski görülebilir. CI-AKI aynı zamanda daha uzun hastanede yatış süreleri ve sağlık kaynaklarının daha fazla kullanımı ile ilişkilidir. Bu olumsuz sonuçlar, kontrast maddeye bağlı renal hasar için etkili önleyici ve terapötik yaklaşımlar geliştirme konusundaki süregelen ihtiyacı vurgulamaktadır^1,3,4,5.

CI-AKI gelişimi; değişmiş renal perfüzyon, medüller oksijen dengesizliği, oksidatif stres, inflamasyon ve doğrudan tubüler toksisite dahil olmak üzere birbirleriyle ilişkili birkaç süreci kapsar. Kontrast maruziyeti, vazodilatör yanıtları zayıflatırken intrarenal vasküler tonusu vazokonstriksiyona doğru kaydırır ve böylece renal kan akışını azaltır. Dış medulla, fizyolojik koşullar altında bu bölgedeki oksijenye erişimin zaten sınırlı olması nedeniyle özellikle savunmasızdır. Bu nedenle, kontrast uygulaması sonrası oksijen iletimindeki daha fazla düşüş, hipoksik tubüler hasarı tetikleyebilir^2,6,7.

Kontrast maddelere maruz kalma sonrası gelişen renal hipoksiye, böbrek hasarına önemli ölçüde katkıda bulunan reaktif oksijen türlerinin (ROS) artan üretimi eşlik eder. ROS üretimi endojen antioksidan kapasiteyi aştığında, hücresel lipitlerde, proteinlerde ve DNA'da oksidatif hasar gelişebilirken, eş zamanlı olarak inflamatuar sinyalleme artar. Hem deneysel hem de klinik ortamlarda, kontrast madde uygulaması artmış oksidatif stres parametreleri ve bozulmuş antioksidan savunmaları ile ilişkilendirilmiştir. Bu yanıtta rol oynayan moleküler yolaklar arasında nikotinamid adenin dinükleotit fosfat (NADPH) oksidaz bağımlı radikal oluşumu ve nükleer faktör kappa-B (NF-κB) aktivasyonu yer almaktadır^1,6,8,9.

İnflamasyonun katkısı, CI-AKI'nın yalnızca hemodinamik bozuklukla açıklanamayacağını göstermektedir. Yakın tarihli kanıtlar, kontrast maddeye maruz kalma sonrası renal hasarda ferroptoz, nitrosatif stres ve nötrofil ekstrasellüler tuzaklarının da rol oynadığını ortaya koymuştur. Bu ek mekanizmaların tanınması, CI-AKI'nın önlenmesi ve tedavisi için araştırılan moleküler hedef yelpazesini genişletmiştir¹.

Serum kreatinin ve idrar çıkışı CI-AKI'yı belirlemek için yaygın olarak kullanılır, ancak her ikisi de ancak böbrek hasarı geliştikten sonra değişebilir. Bu sınırlama, tübüler hasarı yansıtan böbrek hasar molekülü-1 (KIM-1) ve glomerüler filtrasyondaki değişikliklerle ilişkili olan sistatin C dahil olmak üzere daha erken göstergelerin değerlendirilmesini teşvik etmiştir. Deneysel ve klinik çalışmalardan elde edilen kanıtlar, bu biyobelirteçlerdeki değişimlerin CI-AKI'nın erken evresinde tespit edilebilir hale gelebileceğini ve bu nedenle böbrek hasarının daha erken değerlendirilmesini destekleyebileceğini göstermektedir^9,10,11.

Kontrast Maddele İlişkili Akut Böbrek Hasarı'nın (CI-AKI) patofizyolojisinin anlaşılmasındaki ilerlemeler, oksidatif ve inflamatuar yolakları hedefleyen farmakolojik müdahalelerin değerlendirilmesini teşvik etmiştir. Yeterli hidrasyon temel önleyici tedbir olmaya devam ederken, ilaç temelli yaklaşımların bildirilen faydaları çalışmalar arasında farklılık göstermiştir. Sonuç olarak, hiçbir farmakolojik tedavi henüz CI-AKI için standart bir klinik müdahale olarak benimsenmeye yetecek düzeyde tutarlı bir etkinlik göstermemiştir^1,4,12,13.

N-asetilsistein (NAC), kontrast maddesine bağlı akut böbrek hasarının (CI-AKI) sınırlandırılması için farmakolojik bir yaklaşım olarak yaygın şekilde değerlendirilmiştir. Önerilen renoprotektif etkileri, reaktif türlerin temizlenmesi ve glutatyon rezervlerinin geri kazandırılması ile ilişkilidir. Erken dönem klinik destek, NAC'nin kontrasta bağlı renal disfonksiyon insidansını azalttığı, kronik böbrek hastalığı olan hastalarla yapılan dönüm noktası niteliğindeki bir çalışmadan gelmiştir¹⁴. Ancak daha sonraki klinik çalışmalar ve kanıt sentezleri, bazılarının fayda bildirdiği diğerlerinin ise anlamlı bir klinik etki göstermediği tutarsız bulgular ortaya koymuştur. Bu nedenle, NAC'nin CI-AKI üzerindeki etkinliği belirsizliğini korumaktadır^12,15,16,17.

Montelukast, sisteinil lökotrien reseptör-1'i seçici olarak bloke eder ve uzun süredir astım ile alerjik bozuklukların tedavisinde kullanılmaktadır. Deneysel kanıtlar ayrıca bu ajanın anti-inflamatuar, antioksidan ve anti-apoptotik etkiler gösterdiğine işaret etmektedir. Farklı böbrek hasarı modellerinde, montelukast uygulaması; azalmış lipid peroksidasyonu, güçlenmiş endojen antioksidan savunmaları, daha az şiddetli histopatolojik hasar ve böbrek hasarının hafiflemesi ile ilişkilendirilmiştir^{18,19,20,21,22}.

Kontrast maddelere bağlı akut böbrek hasarında (CI-AKI) spesifik olarak montelukastı inceleyen kanıtlar halen sınırlıdır. Mevcut deneysel bulgular, ilacın renal etkilerinin oksidatif ve inflamatuar sinyalizasyonun modülasyonunu içerebileceğini göstermektedir. NADPH oksidaz 4 (NOX4), p22phox ve NF-κB ekspresyonundaki azalma, montelukastın kontrasta bağlı böbrek hasarını hafifletebileceği bir mekanizma olarak öne sürülmüştür⁹.

NAC ve montelukast, böbrek hasarında yer alan, kısmen farklı ancak örtüşen yolakları etkiler. NAC öncelikle antioksidan savunmayı desteklerken, montelukast hem antiinflamatuar hem de antioksidan etkilere sahiptir. Bu nedenle, bu ajanların eş zamanlı uygulanması CI-AKI patofizyolojisinin birden fazla bileşenini etkileyebilir; ancak, etkileşimlerinin eklemeli veya sinerjik bir fayda sağlayıp sağlamadığı deneysel modellerde henüz belirlenmemiştir^{18,19,20,21,22}.

Önceki araştırmalar ağırlıklı olarak kontrast maruziyeti öncesinde uygulanan müdahaleleri değerlendirmiş, buna karşın maruziyet sonrası başlatılan tedavilere ilişkin kanıtlar yetersiz kalmıştır. Özellikle, montelukast'ın NAC ile birlikte kontrast sonrası uygulanması, deneysel CI-AKI modellerinde sınırlı düzeyde araştırılmıştır. Bu nedenle mevcut çalışma, kontrast maruziyeti sonrası ayrı ayrı veya kombinasyon şeklinde uygulanan montelukast ve NAC'ın, bir CI-AKI sıçan modelindeki böbrek fonksiyonu, oksidatif stres parametreleri ve antioksidan savunmalar, böbrek hasarı ve inflamatuar biyobelirteçler ile histopatolojik değişiklikler üzerindeki etkilerini değerlendirmiştir.

Protokol

Hayvanların kullanıldığı tüm deneysel prosedürler, laboratuvar hayvanlarının bakımı ve kullanımı için uluslararası kabul görmüş kılavuzlara uygun olarak yürütülmüş ve Hayvan Araştırmaları: In Vivo Deneylerin Raporlanması (ARRIVE) kılavuzlarına uygunluk sağlanmıştır. Deneysel protokol, Ahi Evran Üniversitesi Hayvan Deneyleri Yerel Etik Kurulu, Kırşehir, Türkiye tarafından onaylanmıştır (Karar No. 2, Toplantı No. 12, Tarih: 12 Haziran 2025). Çalışma boyunca hayvanların acı çekmesini en aza indirmek ve kullanılan hayvan sayısını azaltmak için her türlü çaba gösterilmiştir. Kullanılan tüm reaktiflerin ve ekipmanların detayları Materyal Tablosunda listelenmiştir.

Kimyasalların hazırlanması

Bu çalışmada Nω-nitro-L-arginine methyl ester (L-NAME), indometasin, ioheksol, montelukast sodyum ve NAC kullanılmıştır. 100 mL steril %0,9 normal salin içerisinde 1 g L-NAME kullanılarak 10 mg/mL'lik bir L-NAME solüsyonu hazırlanmıştır. Solüsyon, uygulama gününde taze olarak hazırlanmış ve o günün ötesinde saklanmadan kullanılmıştır. Deneysel CI-AKI modelinin indüksiyonu için, 10 mg/kg dozunda intravenöz (IV) olarak L-NAME uygulanmıştır. Yaklaşık 220 g ağırlığındaki bir sıçanda, hesaplanan miktar yaklaşık 2,2 mg olup bu da yaklaşık 0,22 mL uygulama hacmine karşılık gelmektedir. İndometasin, 100 mg'ın 10 mL son hacme çözünmesiyle %5 sodyum bikarbonat solüsyonu içerisinde 10 mg/mL konsantrasyonunda hazırlanmıştır. Hazırlanan karışım, görsel olarak homojen hale gelene kadar vortekslenmiştir. Hazırlanan indometasin solüsyonunun son pH değeri deney sırasında ölçülmemiş ve bu nedenle geriye dönük olarak belirlenememiştir. Hazırlanan indometasin solüsyonu için spesifik bir sterilizasyon veya filtrasyon prosedürü deney kayıtlarında belgelenmemiş ve dolayısıyla geriye dönük olarak rapor edilememiştir. Herhangi bir resmi stabilite aralığı belirlenmemiş veya değerlendirilmemiştir; solüsyon taze hazırlanmış ve aynı gün kullanılmıştır. Deneysel CI-AKI modelini indüklemek için, 10 mg/kg dozunda intravenöz olarak indometasin uygulanmıştır. Yaklaşık 220 g ağırlığındaki bir sıçan için hesaplanan miktar yaklaşık 2,2 mg olup bu da yaklaşık 0,22 mL uygulama hacmine karşılık gelmektedir.

647 mg iohexol/mL içeren ve 300 mg/mL eşdeğer iyot konsantrasyonuna sahip ticari iohexol formülasyonu, ek dilüsyon yapılmadan uygulandı. Enjeksiyon anındaki iohexol'ün kesin sıcaklığı kaydedilmemiştir. Mevcut deneysel kayıtlardan formülasyona özgü bir osmolalite değeri güvenilir şekilde doğrulanamamış ve bu nedenle rapor edilmemiştir. Deneysel CI-AKI modelinin indüksiyonu için iohexol, 3 g iyot/kg dozunda intravenr olarak uygulanmıştır. Yaklaşık 220 g ağırlığındaki bir sıçanda bu doz, yaklaşık 0,66 g iyot sağlamış ve yaklaşık 2,2 mL'lik bir enjeksiyon hacmine tekabül etmiştir.

%0,5 karboksimetil selüloz (CMC) içerisinde bir montelukast sodyum süspansiyonu hazırlandı. Süspansiyon, her uygulama gününde taze olarak hazırlandı ve askıdaki partiküllerin eşit dağılımını sağlamak için dozlama öncesinde hemen vortekslendi. Her hayvan için gereken montelukast dozu, çalışma başlangıcında kaydedilen vücut ağırlığı kullanılarak şu formül ile ayrı ayrı hesaplandı: gereken doz (mg) = vücut ağırlığı (kg) × 10 mg/kg. Yaklaşık 220 g ağırlığındaki bir hayvan için hesaplanan doz yaklaşık 2,2 mg idi ve oral gavaj yoluyla verildi. Süspansiyon her uygulamadan önce görsel olarak kontrol edildi ve çökelme gösteren her preparasyon kullanım öncesinde tekrar vortekslendi.

NAC, tedavi gruplarına ticari formülasyonundan, başka bir dilüsyon yapılmadan 100 mg/kg intraperitoneal dozda uygulandı. Her hayvan için gerekli doz, çalışma başlangıcında kaydedilen vücut ağırlığına göre bireysel olarak hesaplandı. Yaklaşık 220 g ağırlığındaki bir hayvan için bu miktar, yaklaşık 22 mg NAC'ye ve yaklaşık 0.15 mL uygulama hacmine tekabül etti. Dozlama öncesinde solüsyon görsel olarak incelendi ve yalnızca berrak, görünür partiküllerden arındırılmış preparatlar kullanıldı.

Her bir preparat, uygulama öncesinde görsel denetime tabi tutulmuştur. L-NAME, indometasin, ioheksol ve NAC çözeltileri, renk değişimi ve görünür partiküller açısından kontrol edilmiştir. Uygulamadan hemen önce, montelukast süspansiyonu vortexlemiş ve homojenliği doğrulamak için görsel olarak incelenmiştir. Bu kabul kriterlerini karşılamayan hiçbir preparat kullanılmamıştır. Tüm kimyasalların hazırlanması ve uygulanması sırasında laboratuvar önlüğü, koruyucu eldiven ve göz koruyucu kullanılmıştır. Tüm prosedürler, kurumsal laboratuvar güvenliği ve biyogüvenlik gerekliliklerine uygun olarak gerçekleştirilmiştir.

Hayvan seçimi, barındırma, deneysel gruplar ve randomizasyon

Ahi Evran Üniversitesi Deney Hayvanları Araştırma Laboratuvarı'ndan (Kırşehir, Türkiye), otuz yetişkin erkek Wistar albino sıçan (8–12 haftalık; vücut ağırlığı, 200–220 g) temin edilmiştir. Daha önce yayınlanmış deneysel CI-AKI modelleriyle metodolojik tutarlılığı sağlamak ve östrus döngüsü evresini ek bir biyolojik değişken olarak eklemekten kaçınmak amacıyla erkek sıçanlar seçilmiştir. Bu çalışmada cinsiyet, deneysel bir değişken olarak değerlendirilmemiştir. Hayvan tesisi 184 numaralı üretim/üretim lisansına sahipti ve sıçanlar orada standart laboratuvar koşulları altında üretilip barındırıldı. Kayıt sırasında, hayvanların belgelenmiş bir spesifik patojensiz (SPF) durumları veya resmi olarak atanmış başka bir mikrobiyolojik sağlık sınıflandırmaları bulunmamaktaydı. Her bir sıçan, altlık olarak kaba kıyılmış çam talaşı kullanılan 40 cm × 25 cm × 20 cm ölçülerinde bir polikarbonat kafeste ayrı olarak tutuldu. Oda koşulları, otomatik bir çevre kontrol ve havalandırma sistemi ile 24 °C ± 2 °C ve %35 ± 10 bağıl nemde sabit tutuldu. 07:00 ile 19:00 saatleri arasında aydınlatma olacak şekilde 12 saat ışık/12 saat karanlık programı uygulandı. 7 günlük alıştırma aşamasında veya sonraki deneysel dönemde özel bir çevresel zenginleştirme sağlanmadı. CI-AKI indüksiyonu öncesindeki tanımlanmış 16 saatlik su yoksunluğu süresi dışında, standart pelet şeklinde kemirgen yemi ve musluk suyu ad libitum olarak sunuldu. Yem bileşimi %24 ham protein, %3,94 ham selüloz, %5,08 ham yağ, %8,8 ham kül, %1,44 lizin, %0,61 metiyonin, %1,14 kalsiyum, %0,89 fosfor ve %0,28 sodyumdan oluşmaktaydı. Tüm hayvanlar, deneysel prosedürler başlamadan önce 7 gün boyunca alıştırıldı. Genel durum, yem ve su tüketimi, hareketlilik, duruş, tüy görünümü ve herhangi bir stres belirtisini değerlendirmek için hem alıştırma hem de deneysel dönem boyunca günlük gözlemler yapıldı. Seçim yanlılığını en aza indirmek için hayvanlar, bilgisayar tarafından oluşturulan rastgele bir atama dizisi kullanılarak, her gruba altı hayvan düşecek şekilde beş deneysel gruba ayrıldı. Örneklem büyüklüğü, G*Power versiyon 3.1.9.6 kullanılarak yapılan bir a priori güç analizi ile belirlendi.

Örneklem büyüklüğü, beş deney grubunu içeren sabit etkili tek yönlü varyans analizi için yapılan bir a priori güç analizi ile belirlenmiştir. 0,65 etki büyüklüğü (f), 0,05 tip I hata oranı (α) ve %80 istatistiksel güç varsayıldığında, gerekli toplam örneklem büyüklüğü, grup başına altı hayvana karşılık gelecek şekilde 30 hayvan olarak hesaplanmıştır. Etki büyüklüğünün (f = 0,65), beş grup arasındaki karşılaştırmada genel olarak büyük bir gruplar arası etkiyi temsil ettiği a priori olarak varsayılmıştır. Bu hesaplama, söz konusu genel etkiyi saptamak için gereken örneklem büyüklüğünü belirlemek amacıyla yapılmış olup, aktif tedavi grupları arasındaki daha küçük ikili farkları saptamak için özel olarak tasarlanmamıştır. Tüm analizlerde bireysel hayvan, deneysel birim olarak kabul edilmiştir.

Rutin bakım, günlük sağlık izlemi ve terminal prosedürler hariç, Kontrol grubundaki hayvanlar protokolle ilgili elleçleme veya kısıtlamaya, su yoksunluğuna, intravenöz veya intraperitoneal enjeksiyonlara, oral gavage'a veya araç madde uygulamasına tabi tutulmamıştır. CI-AKI grubu, 8. günde CI-AKI modelinin oluşturulduğu ve herhangi bir tedavi uygulanmayan hayvanlardan oluşmuştur. CI-AKI + Montelukast grubu, CI-AKI modelinin oluşturulduğu ve ardından montelukast ile tedavi edilen hayvanlardan oluşmuştur. CI-AKI + NAC grubu, CI-AKI modelinin oluşturulduğu ve ardından NAC ile tedavi edilen hayvanlardan oluşmuştur. CI-AKI + Montelukast + NAC grubu, CI-AKI modelinin oluşturulduğu ve ardından montelukast ve NAC kombinasyonu ile tedavi edilen hayvanlardan oluşmuştur. Ne Kontrol grubu ne de tedavi edilmeyen CI-AKI grubu, tedaviye eşdeğer sham prosedürlere tabi tutulmuştur. Spesifik olarak, bu gruplarda sham elleçleme, sham oral gavage, sham tedavi enjeksiyonları veya tedaviyle eşleştirilmiş araç madde uygulamaları gerçekleştirilmemiştir. L-NAME, indometasin ve montelukast hazırlığında kullanılan araç maddeler, kimyasalların hazırlanması bölümünde açıklandığı üzere sırasıyla %0.9 normal salin, %5 sodyum bikarbonat çözeltisi ve %0.5 CMC'dir. NAC, herhangi bir seyreltme yapılmadan ticari formülasyonundan uygulanmış ve NAC için ayrı bir araç madde hazırlanmamıştır. 8. günde, Kontrol grubundakiler hariç tüm hayvanlar 16 saatlik su yoksunluğuna tabi tutulmuş, ardından kontrast maddeye bağlı akut böbrek hasarını indüklemek için sırasıyla L-NAME (10 mg/kg), indometasin (10 mg/kg) ve iohexol (3 g iyot/kg) intravenöz olarak uygulanmıştır. Belirlenen tedavi gruplarında, montelukast (10 mg/kg, oral gavage) ve/veya NAC (100 mg/kg, intraperitoneal enjeksiyon), 8. günde iohexol uygulamasının tamamlanmasından 1 saat sonra (L-NAME uygulamasından yaklaşık 1,5 saat sonrasına tekabül edecek şekilde) ilk kez uygulanmış ve ardından 9. ve 10. günlerde aynı saatte günde bir kez uygulanmaya devam edilmiştir.

İlaç uygulama protokolü

CI-AKI, 16 saatin su deprive edildikten sonra sırasıyla L-NAME, indometasin ve ioheksolün intravenöz olarak uygulanmasını içeren yayınlanmış bir deneysel protokole göre oluşturuldu^23,24,25. L-NAME ve indometasinle her biri 10 mg/kg dozunda uygulanırken, ioheksol 3 g iyot/kg dozunda verildi. Tedavi dozları montelukast sodyum için 10 mg/kg ve NAC için 100 mg/kg olarak belirlendi. Model indüksiyon ve tedavi dozlarının seçimi, daha önce yayınlanmış deneysel çalışmalara göre yapıldı^22,26,27. Öncül bir doz aralığı veya doz optimizasyon çalışması yürütülmedi. NAC ve montelukast dozları, bireysel ajanların daha önce yayınlanmış deneysel çalışmalarına dayanarak bağımsız olarak seçildi ve kombinasyona özgü bir doz belirleme çalışmasından türetilmedi. Seçilen dozların farmakolojik olarak eş değer maruziyetleri temsil etmesi amaçlanmadı ve herhangi bir doz-yanıt veya formal ilaç etkileşim analizi gerçekleştirilmedi. Bireysel hayvan düzeyinde başarılı model indüksiyonunu tanımlamak için önceden belirlenmiş sayısal veya laboratuvar eşiği kullanılmadı. Çalışma sonunda, böbrek hasarının başarılı bir şekilde oluşturulduğu, Kontrol grubuna kıyasla tedavi edilmeyen CI-AKI grubunda gözlemlenen karakteristik histopatolojik değişikliklerle desteklendi. 8. günde, Kontrol grubundakiler dışındaki tüm hayvanlar, kontrast maddeye bağlı akut böbrek yetmezliği indüksiyonundan hemen önce tek seferlik 16 saatlik bir su yoksunluğu dönemine tabi tutuldu. Deney süresinin geri kalanında su yoksunluğu tekrarlanmadı. Su yoksunluğu süreci boyunca standart pelet yem ad libitum olarak sağlandı. 16 saatlik tek seferlik su yoksunluğu döneminin tamamlanmasının ardından, ilk model indükleyici ajan olan L-NAME uygulanmadan önce, tüm su yoksunluğu uygulanan deneysel gruplarda musluk suyuna erişim eş zamanlı ve ad libitum olarak yeniden sağlandı ve deney süresinin geri kalanı boyunca sürdürüldü. Suyun yeniden sağlanmasının zamanlaması ve koşulları, tüm su yoksunluğu gruplarında aynıydı. Yeniden sağlandıktan sonraki su alımı önceden tanımlanmış bir hacimle sınırlandırılmadı ve kantitatif olarak ölçülmedi. 16 saatlik su yoksunluğu döneminden hemen önceki ve sonraki eşleştirilmiş vücut ağırlıkları ölçülmedi; bu nedenle, dehidrasyonla ilişkili yüzde vücut ağırlığı kaybı hesaplanamadı. İdrar çıkışı kantitatif olarak izlenmedi. Su erişiminin yeniden sağlanmasının ardından CI-AKI indüksiyonu başlatıldı. L-NAME, indometasin ve ioheksolün tüm ardışık intravenöz uygulamaları, steril 5 mL'lik bir şırıngaya takılı 26 G iğne kullanılarak lateral kuyruk veninden gerçekleştirildi. İntravenöz uygulamadan önce, lateral kuyruk venlerinin görünürlüğünü ve genişlemesini kolaylaştırmak için kuyruk birkaç dakika boyunca suda ısıtıldı. Her intravenöz uygulamayı takiben, ilgili model indükleyici ajanın hesaplanan uygulama hacmine ek olarak, ven 0,5 mL steril %0,9 normal salin ile yıkandı . Enjeksiyon bölgesi; uygulama ve yıkama boyunca şişme, sızıntı veya ekstravazasyon kanıtı açısından görsel olarak izlendi. Önce L-NAME (10 mg/kg) uygulandı. L-NAME uygulamasından on beş dakika sonra, indometasin (10 mg/kg) aynı lateral kuyruk veninden intravenöz olarak verildi. İndometasin uygulamasından on beş dakika sonra, ioheksol aynı lateral kuyruk veninden 3 g iyot/kg dozunda intravenöz olarak uygulandı. Her hayvan için ioheksol dozu ve buna karşılık gelen enjeksiyon hacmi, çalışma başlangıcında kaydedilen vücut ağırlığına ve 300 mg iyot/mL'lik ticari iyot konsantrasyonuna göre bireysel olarak hesaplandı. Bu, 10 mL/kg'lık bir uygulama hacmine ve dolayısıyla 200–220 g ağırlığındaki sıçanlar için yaklaşık 2,0–2,2 mL'ye karşılık geliyordu. Protokolde tanımlanmış ayrı bir maksimum izin verilen intravenöz hacim önceden belirlenmedi; bu çalışmada kullanılan en büyük tek ajan intravenöz uygulaması 10 mL/kg'lık ioheksol idi. Ioheksol yaklaşık 1–2 dakika boyunca yavaşça uygulandı. Başarılı intravenöz uygulama, enjeksiyon bölgesinde görünür şişme, sızıntı veya ekstravazasyon olmamasıyla doğrulandı. Kısmi ekstravazasyon gözlemlenmedi ve şüphelenilen ekstravazasyon nedeniyle herhangi bir enjeksiyonun yeniden denemeye veya doz tekrarına gerek kalmadı. Ioheksol uygulamasının tamamlanmasından bir saat sonra, belirlenen tedaviler tedavi gruplarına ilk kez uygulandı. Ioheksol uygulaması L-NAME uygulamasından 30 dakika sonra başlatılıp yaklaşık 1–2 dakika içinde tamamlandığından, tedavi başlangıcı L-NAME uygulamasından yaklaşık 91–92 dakika (yaklaşık 1,5 saat) sonra gerçekleşti. Montelukast sodyum (10 mg/kg) oral gavage ile, NAC (100 mg/kg) ise intraperitonal olarak uygulandı.

Oral gavage işlemi 22 G paslanmaz çelik besleme kanülü kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Her hayvan dik pozisyonda tutulmuş ve besleme kanülü yemek borusu üzerinden mideye doğru nazikçe ilerletilmiştir. Aşırı dirençle karşılaşıldığında, uygulama öncesinde kanül geri çekilmiş ve yeniden konumlandırılmıştır. Gavage sırasında ve hemen sonrasında hayvanlarda regürjitasyon olup olmadığı gözlemlenmiştir. Herhangi bir hayvanda gavage sırasında veya hemen sonrasında regürjitasyon veya eksik oral dozlamaya dair başka bir kanıta rastlanmamış ve başarısız oral uygulama şüphesiyle hiçbir hayvan çalışma dışı bırakılmamıştır. İntraperitonal enjeksiyonlar karnın sağ alt kadranına yapılmıştır. İğne yaklaşık 30°–45° açıyla yerleştirilmiş ve uygulama öncesinde yanlışlıkla damar yoluna girilip girilmediğini kontrol etmek için aspirasyon yapılmıştır. Enjeksiyon bölgesi, uygulama sırasında ve hemen sonrasında sızıntı, kanama veya diğer görünür komplikasyonlar açısından görsel olarak izlenmiştir. Belirlenen tedaviler 8, 9 ve 10. günlerde aynı saatte günde bir kez uygulanmıştır. Buna göre, CI-AKI + Montelukast grubundaki hayvanlar üç ardışık gün boyunca günde bir kez montelukast, CI-AKI + NAC grubundaki hayvanlar üç ardışık gün boyunca günde bir kez NAC ve CI-AKI + Montelukast + NAC grubundaki hayvanlar aynı 3 günlük tedavi programına göre günde bir kez hem montelukast hem de NAC almıştır. Tüm model indüksiyonu ve tedavi uygulamaları aynı araştırmacı tarafından gerçekleştirilmiştir. Vücut ağırlığı, çalışma başlangıcında her hayvan için bir kez ölçülmüş ve deneysel süreçte tekrar ölçülmemiştir. Her hayvan için, tüm model indükleyici ajanların ve çalışma tedavilerinin dozu ve karşılık gelen uygulama hacmi, çalışma başlangıcında kaydedilen vücut ağırlığı kullanılarak bireysel olarak hesaplanmıştır. Tüm intravenöz, intraperitonal ve oral gavage prosedürleri, uygulama kaynaklı değişkenliği minimize etmek için aynı standart teknik kullanılarak gerçekleştirilmiştir.

Ötanazi prosedürü, insani son noktalar ve örnek toplama

Hayvanlar, deney boyunca genel durum, yem ve su tüketimi, hareketlilik, duruş, tüy görünümü ve stres belirtileri açısından günde bir kez gözlemlenmiştir. Prospektif olarak belirlenen insani sonlanma noktaları; belirgin letarji, mevcut yem veya suya erişememe veya tüketememe, anormal duruş, azalmış hareketlilik, kalıcı piloereksiyon ve stresin diğer tüm açık belirtilerini kapsamaktaydı. Bu kriterlerden herhangi birini karşılayan hayvanlara derhal ötanazi uygulanacaktı; ancak çalışma süresince hiçbir hayvan insani sonlanma noktası kriterlerini karşılamamıştır. Son tedaviden 24 saat sonra, 11. günde, ketamin (80 mg/kg) ve ksilazin (10 mg/kg) intraperitoneal uygulamasıyla derin anestezi indüklenmiştir. Yeterli anestezi düzeyi, pedal çekilme refleksinin yokluğu ile doğrulanmıştır. Yeterli anestezi derinliği onaylandıktan sonra, her hayvandan intrakardiyak ponksiyon yoluyla yaklaşık 3–5 mL kan alınmıştır. Ötanazi, hayvan derin anestezi altındayken kan kaybı (eksanguinasyon) yoluyla tamamlanmıştır. Ölüm, hem kalp aktivitesinin hem de spontan solunumun yokluğu ile teyit edilmiştir.

Serum biyokimyasal ölçümleri için toplanan kan, antikoagülan içermeyen tüplere yerleştirildi ve pıhtılaşma tamamlanana kadar beklendi. Tüpler daha sonra 4 °C'de 10–15 dk boyunca 3,000 × g hızında santrifüj edildi; ardından serum fraksiyonu ayrıştırıldı ve analiz edilene kadar −80 °C'de saklandı. Glutatyon ölçümü için planlanan örnekler, etilendiamintetraasetik asit (EDTA) içeren tüplere ayrı olarak toplandı. Bu örnekler antikoagüle edildiği için, ilgili glutatyon analiz prosedürüne uygun olarak pıhtılaşma aşaması olmadan işlendiler. Elde edilen serum berrak olduğunda ve görünür bir hemoliz belirtisi göstermediğinde, serum ayrıştırma işlemi kabul edilebilir olarak değerlendirildi.

Ölüm teyit edildikten sonra, median laparotomi gerçekleştirildi ve her hayvandan her iki böbrek de dikkatlice çıkarıldı. Örneklerin çevresindeki adipoz ve bağ dokular temizlendi. Sağ böbrek yalnızca histopatolojik inceleme için ayrılırken, sol böbrek biyokimyasal analizlere tahsis edildi. Sol böbrekten alınan karma doku, renal korteks ve medulla ayrı ayrı disseke edilmeden analiz edildi. İki böbrek birbirinden bağımsız olarak işlendi ve farklı hayvanlardan alınan örnekler, havuzlama yapılmadan işlem süreci boyunca ayrı tutuldu. Sağ böbreğin tamamı %10 nötral tamponlu formaldehide konuldu ve histopatolojik değerlendirme için işlendi. Renal korteksi ve dış medullayı kapsayan kesitler hazırlandı ve histopatolojik işlem ve skorlama prosedürlerinde açıklanan yöntemlere göre incelendi. Her bir sol böbrek ayrı ayrı etiketlendi ve homojenizasyon ile biyokimyasal testler yapılana kadar -80 °C'de saklandı. Eksizyondan sonra, dokunun genel bütünlüğü kontrol edildi ve hedeflenen histopatolojik ve biyokimyasal değerlendirmeler için yeterli miktarda doku tutuldu.

Model indüksiyonu ve tedavi uygulamasından sorumlu araştırmacı, deney grupları farklı prosedürlere tabi tutulduğu için körleme işlemine dahil edilememiştir. Ancak, grup kimlikleri; biyokimyasal ve istatistiksel analizleri yapan araştırmacılardan ve histopatolojik değerlendirmeleri gerçekleştiren patologdan gizlenmiştir. Kayıt altına alınan tüm hayvanlar çalışmada tutulmuş ve sonraki analizlere dahil edilmiştir. Biyolojik örnekler, hayvan dokuları, formaldehit bazlı fiksatifler ve diğer kimyasal atık malzemeler uygun kişisel koruyucu donanım kullanılarak yönetilmiştir. Tüm biyolojik ve kimyasal atıkların imhası, kurumsal biyogüvenlik ve tehlikeli atık yönetimi gerekliliklerine uygun olarak gerçekleştirilmiştir.

Biyokimyasal analizler

Biyokimyasal ölçümler, her hayvandan toplanan serum, EDTA ile antikoagüle edilmiş kan ve sol böbrek dokusu homojenatları kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Prosedürler, her parametre için kullanılan biyolojik matrise göre aşağıda sunulmuştur. Serum; üre, kan üre azotu (BUN), kreatinin, süperoksit dismutaz (SOD) ve malondialdehit (MDA) açısından analiz edilmiştir. Üre, BUN ve kreatinin renal fonksiyon indeksleri olarak kullanılırken, SOD aktivitesi ve MDA konsantrasyonu oksidatif stres parametreleri olarak değerlendirilmiştir. Serum üre ve BUN değerleri, aynı enzimatik üreaz–glutamat dehidrogenaz analizi kullanılarak elde edilmiştir. Bu yöntemde, üre, üreaz tarafından hidroliz edilerek amonyak üretilmiş, amonyak daha sonra glutamat dehidrogenaz varlığında 2-oksoglutarat ve indirgenmiş nikotinamid adenin dinükleotit (NADH) ile reaksiyona girmiştir. Kullanılan analitik yöntem, enzimatik üreaz–glutamat dehidrogenaz kinetik analizidir. NADH tüketimi sonucu meydana gelen absorbans azalması, bir spektrofotometre kullanılarak kinetik olarak ölçülmüştür. Serum kreatinin konsantrasyonu, otomatik bir biyokimya analizörü kullanılarak kolorimetrik olarak ölçülmüştür. Serum SOD aktivitesi, aynı otomatik biyokimya analizöründe ticari olarak temin edilen bir analiz kiti kullanılarak kolorimetrik olarak ölçülmüştür. SOD analizi, ksantin–ksantin oksidaz sistemi tarafından süperoksit radikallerinin üretilmesine ve bunların renkli bir formazan ürünü oluşturmak üzere 2-(4-iyodofenil)-3-(4-nitrofenil)-5-feniltetrazolyum klorür ile reaksiyona girmesine dayanmaktadır. Bitiş noktası absorbansı 505 nm'de ölçülmüş ve SOD aktivitesi U/mL olarak ifade edilmiştir. Serum MDA konsantrasyonu, tiyobarbitürik asit reaksiyonu kullanılarak kolorimetrik olarak belirlenmiştir. Serum örnekleri, proteinleri çöktürmek için soğuk trikloroasetik asit ile karıştırılmış ve oluşan çökelti santrifügasyonla ayrılmıştır. Bu santrifügasyon işlemi 4 °C'de 5 dakika boyunca 7,500 × g hızda gerçekleştirilmiştir. Süpernatan, 90 °C'de 60 dakika boyunca tiyobarbitürik asit ile reaksiyona sokulmuş, soğutulmuş ve 532 nm'de ölçülmüştür. MDA konsantrasyonları ilgili kalibrasyon eğrisinden hesaplanmış ve nmol/mL olarak ifade edilmiştir. Glutatyon (GSH) analizi, EDTA ile antikoagüle edilmiş kan kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Proteinler trikloroasetik asit ile çöktürülmüş ve elde edilen proteinlerinden arındırılmış örnekler, modifiye edilmiş Ellman yöntemiyle kolorimetrik olarak analiz edilmiştir. Örnekler, pH 8.2'deki 500 mM Tris tamponunda 5,5′-ditiyobis(2-nitrobenzoik asit) (DTNB) ile birleştirilmiştir. GSH'nin tiyol gruplarının DTNB ile reaksiyonu renkli bir ürün oluşturmuş ve absorbans 412 nm'de kaydedilmiştir. Katalaz (CAT) aktivitesi, iki aşamalı kolorimetrik bir prosedür kullanılarak belirlenmiştir. Örnekler başlangıçta, katalazın suya ve moleküler oksijene dönüştürdüğü bilinen miktarda hidrojen peroksit ile inkübe edilmiştir. Enzimatik reaksiyon sonlandırıldıktan sonra, kalıntı hidrojen peroksit kromojenik bir reaktif kullanılarak ölçülmüştür. Absorbans 405 nm'de kaydedilmiş ve CAT aktivitesi U/mL olarak rapor edilmiştir. Renal doku ölçümleri için, korteks medulladan ayrılmadan her hayvanın sol böbreği karışık doku olarak kullanılmıştır. Prosedürde belirtildiği üzere, sağ böbrek yalnızca histopatolojik değerlendirme için saklanmıştır. Bireysel hayvanlara ait örnekler bağımsız olarak işlenmiş ve hiçbir aşamada havuzlanmamıştır. Her sol böbrek örneği, 1:10 (w/v) doku-tampon oranı kullanılarak pH 7.4'teki 50 mM fosfat tamponunda buz üzerinde homojenize edilmiştir. Her sıçan için bir adet hayvana özgü renal doku homojenatı oluşturulmuştur. Bu homojenatın ayrı alikotları, tüm parametrelerin aynı bireysel hayvandan türetilmesini sağlamak amacıyla farklı renal doku ölçümleri için kullanılmıştır. Elde edilen renal doku homojenatları 4 °C'de 10 dakika boyunca 14,000 × g hızda santrifüj edilmiştir. Santrifügasyonun ardından, her hayvandan elde edilen süpernatan ayrı ayrı toplanmış ve planlanan renal doku analizleri için alikotlara bölünmüştür. Renal doku süpernatanlarındaki tümör nekroz faktör-alfa (TNF-α), interlökin-1 beta (IL-1β), interlökin-6 (IL-6), sistatin C ve KIM-1 konsantrasyonları, sıçana özgü enzim bağlantılı immünosorbent analiz (ELISA) kitleri kullanılarak ölçülmüştür. Analizler, üretici protokollerine göre gerçekleştirilmiştir. İnkübasyon koşulları TNF-α, IL-1β, IL-6, sistatin C ve KIM-1 ELISA'ları için aynıdır. Her analiz için örnekler ve ELISA reaktifleri 37 °C'de 1 saat boyunca inkübe edilmiş; beş yıkama döngüsünden sonra substrat çözeltileri A ve B eklenmiş ve 37 °C'de 10 dakika boyunca inkübe edilmiştir. Kısaca; standartlar ve renal doku süpernatanları antikorla önceden kaplanmış kuyucuklara eklenmiş, ardından ilgili biyotinize tespit antikoru ve streptavidin–yaban horseradish peroksidaz konjugatı eklenmiştir. Belirtilen inkübasyon adımlarından sonra, bağlanmamış bileşenler otomatik bir mikroplaka yıkayıcı kullanılarak uzaklaştırılmıştır. Ardından substrat çözeltisi eklenmiş ve renk reaksiyonu asidik durdurma çözeltisi kullanılarak sonlandırılmıştır. Absorbans, bir mikroplaka okuyucu kullanılarak 450 nm'de ölçülmüş ve analit konsantrasyonları ilgili standart eğrilerden hesaplanmıştır. Renal doku ELISA ölçümleri duble olarak gerçekleştirilmiştir. Her analit için, tek bir hayvan düzeyinde değer elde etmek amacıyla iki teknik replika kuyucuğun ortalaması hesaplanmıştır. Aynı hayvana özgü homojenattan elde edilen teknik replika kuyucuklar ve ayrı alikotlar bağımsız gözlemler olarak değerlendirilmemiştir. Tüm biyokimyasal ölçümler, standartlaştırılmış analize özgü koşullar altında gerçekleştirilmiştir. Serum, EDTA ile antikoagüle edilmiş kan ve renal doku örnekleri, ilgili analitik yöntemlerin gerekliliklerine göre ayrı ayrı işlenmiştir. Biyokimyasal analizleri gerçekleştiren araştırmacılar, grup atamalarına karşı kör tutulmuştur. Her bir serum örneği, kan örneği, böbrek örneği, homojenat alikotu veya teknik replika kuyucuğu yerine, bireysel hayvan deneysel birim olarak kabul edilmiştir. Buna göre, her deneysel grup için istatistiksel analize altı bağımsız hayvan düzeyinde gözlem dahil edilmiştir.

Histopatolojik işlem ve skorlama

Sağ böbrek örnekleri, rutin histolojik işlemlerle mikroskobik değerlendirme için hazırlandı. Her hayvandan alınan sağ böbreğin tamamı, oda sıcaklığında 72 saat boyunca %10 nötr tamponlu formaldehit içinde bekletildi. Fiksasyondan sonra, doku dehydrasyonu sırasıyla %50, %70, %80, %96 ve %100'lük etanol çözeltilerinde, her konsantrasyonda 1 saat uygulanarak gerçekleştirildi. Örnekler, parafin gömme işleminden önce, her biri 30 dakika süren iki ksilen banyosuna maruz bırakıldı. Döner mikrotom kullanılarak, parafin bloklardan hem renal korteksi hem de dış medullayı içeren 5 µm kalınlığında kesitler alındı.

Hematoksilen ve eozin (HE) boyaması için kesitler deparafinize edilip yeniden hidrate edilmiş, 5 dk boyunca hematoksilene maruz bırakılmış ve ardından 5 dk boyunca akan musluk suyu altında yıkanmıştır. Diferansiyasyon için asit alkol kullanılmış, ardından kesitler 1 dk boyunca amonyaklı suda mavileştirilmiş ve 2 dk boyunca eozin ile karşıt boyanmıştır. Boyanan kesitler daha sonra artan alkol konsantrasyonlarında dehidrate edilmiş, ksilen ile şeffaflaştırılmış ve lameller altında kalıcı olarak monte edilmiştir.

Masson trikrom boyaması için ayrılan kesitler benzer şekilde deparafinize edildi ve rehidrate edildi. 56 °C'de 60 dk boyunca mordan işlemi uygulandı ve ardından 10 dk boyunca akan musluk suyunda durulama yapıldı. Kesitler daha sonra sırasıyla 10 dk Weigert demir hematoksilin, 15 dk Biebrich scarlet–asit fuksin çözeltisi, 10 dk fosfotungstik asit çözeltisi ve 10 dk anilin mavisi çözeltisi ile işleme tabi tutuldu. %1 asetik asitte 5 dk bekletildikten sonra kesitler dehydrate edildi, ksilen ile şeffaflaştırıldı ve lamellerle kapatıldı.

Mikroskobik değerlendirme öncesinde, boyamanın yeterliliği her yöntem için ayrı ayrı doğrulanmıştır. Çekirdek detaylarının ve sitoplazmik kontrastın net bir şekilde ayırt edilebildiği HE-boyalı kesitler uygun kabul edilirken, bağ dokusu yapılarının belirgin bir şekilde görüntülenebildiği Masson trikrom boyalı kesitler kabul edilmiştir. Her hayvan için üç HE-boyalı kesit ve üç Masson trikrom boyalı kesit incelenmiştir. Her kesitte, 40× objektif kullanılarak rastgele seçilen beş mikroskobik alan değerlendirilmiştir. Buna göre, her hayvan için boyama yöntemi başına 15 mikroskobik alan incelenmiştir. Tüm mikroskobik incelemeler, tüm hayvanlar ve deneysel gruplar genelinde aynı objektif ve standartlaştırılmış değerlendirme koşulları kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Masson trikrom boyalı kesitler; interstisiyel kollajen dağılımı ve birikimi, hücre dışı matris akümülasyonu ve tubulointerstisiyel mimari açısından kalitatif olarak değerlendirilmiştir. Bu kesitler, yarı-kantitatif 0–3 histopatolojik hasar skorlarının oluşturulmasında kullanılmamıştır. Temsili HE ve Masson trikrom boyalı fotomikroğraflar 40× objektif kullanılarak elde edilmiş ve her temsili görüntüye 100 µm ölçek çubuğu eklenmiştir. Bu fotomikroğraflar görselleştirme amacıyla elde edilmiş olup, histopatolojik skorlama veya istatistiksel analizlerde bağımsız gözlemler olarak değerlendirilmemiştir. Tüm histopatolojik değerlendirmeler, deneysel grup kimliklerine karşı kör olan deneyimli bir patolog tarafından yürütülmüştür. Tek bir kör değerlendirici kullanılması, değerlendirme yanlılığını ve gözlemciler arasındaki farklılıklardan kaynaklanan varyasyonu sınırlamayı amaçlamıştır. Tübüler nekroz, tübüler dilatasyon, hücresel dejenerasyon ve vasküler konjesyon, daha önce yayınlanmış böbrek hasarı modellerinden uyarlanan bir sisteme göre^28,29 HE-boyalı böbrek kesitlerinde yarı-kantitatif olarak skorlanmıştır. Her parametre için skorlar; sırasıyla yok, hafif, orta ve şiddetli histopatolojik hasara karşılık gelen 0 ile 3 arasında değişmiştir. Her hayvan için, üç HE-boyalı kesitin her birinde incelenen beş mikroskobik alandan elde edilen bulgular (toplamda 15 alan), her bir histopatolojik parametre için tek bir 0–3 skoru atamak amacıyla topluca değerlendirilmiştir. Böylece, her hayvan; tübüler nekroz, tübüler dilatasyon, hücresel dejenerasyon ve vasküler konjesyon için birer skor sağlamıştır. Histolojik kesitler ve mikroskobik alanlar, hayvan içi alt örnekler olarak ele alınmış ve bağımsız gözlemler olarak kabul edilmemiştir. Her kesit içerisinde, hayvanlar ve deneysel gruplar arasında anatomik örneklemeyi standartlaştırmak için karşılaştırılabilir renal kortikal ve dış medüller bölgelerden rastgele mikroskobik alanlar seçilmiştir. Deneysel birim olarak her bir böbrek, histolojik kesit veya mikroskobik alan yerine bireysel hayvan kabul edilmiştir. Buna göre, her deneysel grup için istatistiksel analize hayvan düzeyinde altı bağımsız gözlem dahil edilmiştir. Tablo 3'te sunulan değerler, her deneysel gruptaki altı hayvanın bireysel hayvan düzeyindeki skorlarından hesaplanan grup ortalamalarını temsil etmektedir.

İstatistiksel analiz

İstatistiksel analizler, istatistiksel analiz yazılımı kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Tüm istatistiksel analizler için bireysel hayvan, deneysel birim olarak kabul edilmiştir. Her deneysel grup altı bağımsız hayvandan oluşmuştur (grup başına n = 6). Teknik tekrarlar, analiz kuyucukları, doku kesitleri ve mikroskobik alanlar bağımsız gözlemler olarak değerlendirilmemiş ve istatistiksel örneklem boyutunu artırmak için kullanılmamıştır. Sürekli değişkenler ortalama ± standart sapma (SD) olarak sunulmuştur. Normallik, her bir deneysel grup içinde Shapiro–Wilk testi kullanılarak ayrı ayrı değerlendirilmiş ve varyansların homojenliği Levene testi ile incelenmiştir. Gruplar arası örneklem boyutlarının eşit olduğu tam dengeli deneysel tasarım nedeniyle, grupları karşılaştırmak için tek yönlü varyans analizi (ANOVA) kullanılmıştır. İkili karşılaştırmalar Duncan post hoc çoklu karşılaştırma testi kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Potansiyel aykırı değerler, kutu grafiklerinin grafiksel incelemesi ve bireysel gözlemlerin kontrolü ile değerlendirilmiştir. Hiçbir gözlem, bir ölçüm hatasını veya geçersiz bir deneysel sonucu temsil ettiği şeklinde değerlendirilmemiş ve istatistiksel nedenlerle herhangi bir veri noktası hariç tutulmamıştır. p-değeri < 0.05 olan sonuçlar istatistiksel olarak anlamlı kabul edilmiştir.

Sonuçlar

Serum böbrek fonksiyon belirteçleri (üre, kan üre azotu ve kreatinin)

Bu çalışmanın deneysel tasarımı, hayvan gruplandırması, tedavi çizelgesi ve örnek toplama zaman çizelgesi  Şekil 1'de özetlenmiştir. Serum üre, BÜA ve kreatinin düzeyleri arasında gruplar arasında istatistiksel olarak anlamlı farklılıklar gözlemlenmiştir (p = 0.003, p = 0.003 ve p = 0.002, sırasıyla). Kontrol grubunda ortalama serum üre düzeyi 67,43 mg/dL ± 53,11 mg/dL idi ve CI-AKI grubunda 606,71 mg/dL ± 429,42 mg/dL'ye yükseldi. Benzer şekilde, ortalama BÜA düzeyi Kontrol grubunda 31,51 mg/dL ± 24,82 mg/dL'den CI-AKI grubunda 268,63 mg/dL ± 190,84 mg/dL'ye yükseldi. Serum kreatinin düzeyleri de Kontrol grubunda 0,60 mg/dL ± 0,05 mg/dL'den CI-AKI grubunda 3,27 mg/dL ± 2,14 mg/dL'ye belirgin şekilde arttı. Duncan'ın post-hoc karşılaştırmaları, serum üre, BÜA ve kreatinin düzeylerinin tedavi grubunun her birinde, yani CI-AKI + Montelukast, CI-AKI + NAC ve CI-AKI + Montelukast + NAC gruplarında, tedavi görmeyen CI-AKI grubuna kıyasla anlamlı şekilde daha düşük olduğunu gösterdi (tümü p < 0,05). Serum böbrek fonksiyon belirteçlerine ilişkin veriler Tablo 1'de sunulmuştur.

Oksidatif stres parametreleri ve antioksidan enzim aktiviteleri

Gruplar arasında SOD, GSH, CAT ve MDA düzeyleri açısından istatistiksel olarak anlamlı farklılıklar gözlemlendi (p = 0,044, p = 0,001, p = 0,003 ve p = 0,001, sırasıyla; Tablo 1). Duncan'ın post-hoc analizi, GSH düzeylerinin monotelukast, NAC ve kombine tedavi gruplarında tedavi görmemiş CI-AKI grubuna göre anlamlı şekilde daha yüksek olduğunu gösterdi (tümü p < 0,05). Kombine tedavi grubunun GSH düzeyi, Kontrol grubuna göre de anlamlı düzeyde daha yüksekti (p < 0,05). Ancak, kombine tedavi grubu ile her iki monoterapi grubu arasında ya da iki monoterapi grubu arasında istatistiksel olarak anlamlı fark gözlemlenmedi (tümü p > 0,05). En düşük SOD düzeyi CI-AKI grubunda (92,23 U/mL ± 16,37 U/mL) gözlemlendi, buna karşılık Kontrol grubunda 147,81 U/mL ± 33,27 U/mL bulundu. GSH düzeyleri CI-AKI grubunda en düşük (66,05 mmol/L ± 24,72 mmol/L), CI-AKI + Montelukast + NAC grubunda en yüksek (172,44 mmol/L ± 60,48 mmol/L) idi. CAT aktivitesi Kontrol grubunda en yüksek (93,35 U/mL ± 18,75 U/mL), CI-AKI grubunda en düşük (33,22 U/mL ± 17,07 U/mL) seviyedeydi. MDA düzeyleri açısından en yüksek değer CI-AKI grubunda (54,13 nmol/mL ± 19,37 nmol/mL) gözlemlenirken, en düşük değer CI-AKI + NAC grubunda (21,53 nmol/mL ± 5,07 nmol/mL) kaydedildi. Oksidatif stres parametreleri ve antioksidan enzim aktivitelerine ilişkin veriler Tablo 1'de sunulmuştur.

Böbrek hasarı ve inflamatuar biyobelirteçler (KIM-1, Cystatin C, TNF-α, IL-1β ve IL-6)

Gruplar arasında böbrek kistatin C, IL-6, KIM-1, TNF-α ve IL-1β düzeyleri açısından istatistiksel olarak anlamlı farklılıklar gözlemlendi (p < 0,001, p = 0,008, p = 0,027, p = 0,006 ve p < 0,001, sırasıyla; Tablo 2). Duncan’ın ileri dönük karşılaştırmaları, kistatin C, IL-6, KIM-1, TNF-α ve IL-1β düzeylerinin, tedavi edilmemiş CI-AKI grubuna kıyasla her bir tedavi grubunda, yani CI-AKI + Montelukast, CI-AKI + NAC ve CI-AKI + Montelukast + NAC gruplarında anlamlı şekilde daha düşük olduğunu gösterdi (tümü p < 0,05). IL-1β için, CI-AKI + Montelukast ve CI-AKI + NAC grupları arasında da istatistiksel olarak anlamlı bir fark gözlemlendi (p < 0,05). Böbrek kistatin C düzeyleri CI-AKI grubunda en yüksek seviyeydi (18,43 ng/mL ± 1,06 ng/mL), kontrol grubu ise 10,30 ng/mL ± 0,78 ng/mL değerini gösterdi. Benzer şekilde, IL-6 düzeyleri CI-AKI grubunda en yüksek (13,41 ng/L ± 2,14 ng/L) ve kontrol grubunda en düşük (9,29 ng/L ± 2,70 ng/L) seviyeydi. KIM-1 düzeyleri, kontrol grubundaki 2,25 ng/mL ± 0,54 ng/mL değerine kıyasla CI-AKI grubunda en yüksek seviyeydi (3,07 ng/mL ± 0,36 ng/mL). Aynı şekilde, TNF-α düzeyleri CI-AKI grubunda en yüksek (161,69 ng/L ± 26,14 ng/L) iken, en düşük değer kontrol grubunda (95,49 ng/L ± 16,98 ng/L) gözlendi. IL-1β düzeyleri CI-AKI grubunda en yüksek (9,28 ng/mL ± 0,68 ng/mL) iken, en düşük değer CI-AKI + Montelukast grubunda (7,34 ng/mL ± 0,57 ng/mL) tespit edildi. Böbrek hasarı ve inflamatuar biyobelirteçlere ilişkin veriler Tablo 2'de sunulmuştur. Önemli olan, CI-AKI + Montelukast + NAC grubundaki bazı biyokimyasal belirteç değerlerinin sayısal olarak CI-AKI + Montelukast grubundan daha yüksek olmasına rağmen, Duncan’ın ileri dönük karşılaştırmaları, oksidatif stres parametreleri, böbrek hasarı biyobelirteçleri ve inflamatuar biyobelirteçler dahil değerlendirilen tüm biyokimyasal değişkenler açısından bu iki tedavi grubu arasında istatistiksel olarak anlamlı bir fark olmadığını gösterdi (p > 0,05).

Histopatolojik değerlendirme

Histopatolojik bulgular

HE ile boyanmış böbrek kesitlerinde, Kontrol grubunda normal glomerüler ve tübüler morfoloji ile birlikte böbrek mimarisinin korunduğu görüldü. Buna karşılık, tedavi edilmemiş CI-AKI grubunda tübüler epitel hasarı, yaygın hücresel dejenerasyon, tübüler dilatasyon, tübüler lümen içinde hücresel artıklar ve vasküler konjesyon da dahil olmak üzere belirgin histopatolojik değişiklikler saptandı. Nekrotik değişiklikler özellikle proksimal tübül segmentlerinde belirgindi. CI-AKI + Montelukast grubunda, tedavi edilmemiş CI-AKI grubuyla karşılaştırıldığında tübüler hasarın şiddeti azalmıştı, ancak hâlâ odaklanmış dejeneratif değişiklikler gözlendi. Benzer şekilde, CI-AKI + NAC grubunda tübüler epitel bütünlüğünün daha iyi korunduğu ve nekrotik alanların daha az olduğu görüldü. Nitel histopatolojik incelemede, CI-AKI + Montelukast + NAC grubunda böbrek mimarisinin korunduğu, kortikal ve medüller yapıların büyük ölçüde korunduğu ve tübüler nekroz, tübüler dilatasyon, hücresel dejenerasyon ile vasküler konjesyonun nispeten sınırlı olduğu izlendi. Masson trikrom ile boyanmış kesitlerde, Kontrol grubunda interstisyel kollajenin normal dağılımı gözlendi. Tedavi edilmemiş CI-AKI grubunda artmış interstisyel kollajen birikimi, tübulo-interstisyel mimari bozukluğu ve ekstraselüler matriks birikimi görüldü. Bu değişiklikler, tedavi gruplarında, birlikte tedavi grubu dahil olmak üzere, tedavi edilmemiş CI-AKI grubuna kıyasla daha az belirgin görünüyordu. Bu bulguları gösteren temsili HE ve Masson trikrom ile boyanmış böbrek kesitleri Şekil 2'de sunulmuştur.

Yarı nicel histopatolojik skorlama

Yarı nicel histopatolojik değerlendirme, tübüler nekroz, tübüler dilatasyon, hücresel dejenerasyon ve vasküler konjesyon puanlarının tedavi edilmemiş KI-AKİ grubunda en yüksek olduğunu gösterdi. Bu gruptaki ortalama puanlar sırasıyla 2,67, 2,83, 2,67 ve 2,50 idi. 0–3 ölçeğinin üst sınırına yaklaşan nispeten yüksek ortalama puanlar, aynı grupta nitel histopatolojik incelemede gözlenen yaygın ve şiddetli tübüler ve vasküler değişikliklerle uyumluydu. Buna karşılık, tüm parametreler Kontrol grubunda yoktu. Tüm tedavi gruplarında, tedavi edilmemiş KI-AKI grubuna kıyasla daha düşük hasar puanları gözlendi. KI-AKI + Montelukast grubunda tübüler nekroz için ortalama puan 1,33, tübüler dilatasyon için 1,50, hücresel dejenerasyon için 1,17 ve vasküler konjesyon için 1,00 idi. KI-AKI + NAC grubundaki ilgili değerler sırasıyla 1,17, 1,17, 0,83 ve 0,83 idi. Sayısal olarak, en düşük ortalama histopatolojik hasar puanları KI-AKI + Montelukast + NAC grubunda gözlendi ve tübüler nekroz, tübüler dilatasyon, hücresel dejenerasyon ve vasküler konjesyon için ortalama değerler sırasıyla 0,50, 0,67, 0,50 ve 0,17 idi. Detaylı histopatolojik puanlama verileri Tablo 3'te sunulmuştur.

Tüm biyokimyasal ve histopatolojik analizlerin temel aldığı ham veriler, orijinal kırpılmamış HE ve Masson trikrom histoloji görüntüleri Ek Dosya 1 olarak verilmiştir.

Şekil 1: Deneysel tasarım ve çalışma zaman çizelgesi. Deneysel iş akışının şematik gösterimi. Otuz yetişkin erkek Wistar sıçan, 7 günlük alıştırma süresinin ardından beş gruba (her grup için n = 6) rastgele dağıtıldı. Kontrol grubuna su kısıtlaması, CI-AKI indüksiyonu veya tedavi uygulanmadı. Diğer gruplara tek bir 16 saatlik su kısıtlaması uygandıktan sonra, L-NAME (10 mg/kg), indometasin (10 mg/kg) ve iohexol (3 g iyot/kg) intravenöz olarak sırayla verilerek CI-AKI oluşturuldu. İohexol uygulamasından bir saat sonra, belirlenen tedavi gruplarına montelukast (10 mg/kg, oral gavaj), NAC (100 mg/kg, intraperiton enjeksiyonu) veya her ikisi birlikte 8-10. günlerde günde bir kez verildi; tedavi almayan CI-AKI grubuna ise herhangi bir tedavi uygulanmadı. Tüm gruplarda 11. günde son işlemleri ve örnek toplama gerçekleştirildi. Lütfen bu şeklin daha büyük halini görmek için buraya tıklayınız.

Şekil 2: Deneysel gruplardan elde edilen temsili HE ve Masson trikrom ile boyanmış böbrek kesitleri. Temsili HE ve Masson trikrom ile boyanmış böbrek kesitleri (A) Kontrol, (B) CI-AKI, (C) CI-AKI + Montelukast, (D) CI-AKI + NAC ve (E) CI-AKI + Montelukast + NAC gruplarından elde edilmiştir. HE ile boyanmış kesitler (üst satır), kontrol grubunda böbrek yapısının korunduğunu gösterirken, CI-AKI grubunda belirgin tübüler nekroz (*), tübüler dilatasyon (+), hücresel dejenerasyon (×) ve vasküler konsepsiyon (↑) görülür. Bu histopatolojik değişiklikler, tedavi grubundan alınan temsili kesitlerde tedavi görmemiş CI-AKI grubuna kıyasla daha hafif görünür. Masson trikrom ile boyanmış kesitler (alt satır), CI-AKI grubunda interstisyel kollajen birikiminin arttığını ve tübülointerstisyel yapı bozukluğunu gösterirken, bu değişiklikler tedavi gruplarından alınan temsili kesitlerde daha az belirgindi. Ölçek çubuğu = 100 µm. Bu şeklin daha büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Değişken	Kontrol	CI-AKI	CI-AKI+M	CI-AKI+NAC	CI-AKI+NAC+M	p
ÜRE (mg/dL)	67.43±53.11a	606.71±429.42b	105.89±28.63a	243.14±135.99a	293.61±212.05a	0.003
BUN (mg/dL)	31.51±24.82a	268.63±190.84b	51.53±14.69a	129.54±73.54a	108.38±87.36a	0.003
Kreatinin (mg/dL)	0.60±0.05a	3.27±2.14b	0.61±0.12a	1.53±1.17a	1.28±0.55a	0.002
SOD (U/mL)	147.81±33.27a	92.23±16.37b	130.96±42.19a	137.87±31.95a	141.71±30.27a	0.044
GSH (mmol/L)	124.29±21.24b	66.05±24.72a	133.87±26.95bc	139.31±30.10bc	172.44±60.48c	0.001
CAT (U/mL)	93.35±18.75c	33.22±17.07a	58.67±32.95ab	52.64±19.97ab	75.46±26.85bc	0.003
MDA (nmol/mL)	23.42±13.48a	54.13±19.37b	22.40±14.81a	21.53±5.07a	37.01±9.29a	0.001
Her satırda, en az bir üst simge harfi paylaşan gruplar arasında anlamlı fark yokken, ortak üst simge harfi bulunmayan gruplar arasında Duncan’ın post-hoc testine göre anlamlı fark vardır (p < 0.05).

Tablo 1: Deneysel gruplardaki biyokimyasal ve oksidatif stres parametreleri. Önemli ikili farklar: üre, BUN, kreatinin (CREA), SOD ve MDA, CI-AKI grubu ile Kontrol, CI-AKI+M, CI-AKI+NAC ve CI-AKI+M+NAC grupları arasında; GSH, CI-AKI grubu ile diğer tüm gruplar arasında ve Kontrol ile CI-AKI+M+NAC arasında; CAT, Kontrol ile CI-AKI, CI-AKI+M ve CI-AKI+NAC grupları arasında ve CI-AKI ile CI-AKI+M+NAC arasında. Veriler ortalama ± SD olarak sunulmuştur (n = 6) ve tek yönlü ANOVA ile Duncan çoklu karşılaştırma testi kullanılarak analiz edilmiştir. Aynı üst simge harfine sahip olmayan değerler arasında istatistiksel olarak önemli fark vardır (p < 0,05).

Değişken	Kontrol	CI-AKI	CI-AKI+M	CI-AKI+NAC	CI-AKI+NAC+M	p
Cystatin C (ng/mL)	10.30±0.78a	18.43±1.06b	10.90±1.13a	11.00±0.59a	11.13±0.84a	<0.001
IL-6 (ng/L)	9.29±2.70a	13.41±2.14b	10.24±0.86a	10.66±0.83a	10.85±1.63a	0.008
KIM-1 (ng/mL)	2.25±0.54a	3.07±0.36b	2.39±0.60a	2.45±0.33a	2.45±0.17a	0.027
TNF-α (ng/L)	95.49±16.98a	161.69±26.14b	110.26±38.12a	119.42±35.35a	127.76±15.13a	0.006
IL-1β (ng/mL)	7.65±0.53ab	9.28±0.68c	7.34±0.57a	8.24±0.73b	8.11±0.72ab	<0.001
Her satırda, en az bir üst simge harfi paylaşan gruplar arasında anlamlı fark yoktu, Duncan’ın post-hoc testine göre ortak üst simge harfi bulunmayan gruplar arasında ise anlamlı fark vardı (p < 0.05).

Tablo 2: Deneysel gruplarda renal hasar ve inflamatuar biyobelirteç düzeyleri. Önemli ikili farklar: kistatin C, IL-6, KIM-1 ve TNF-α, CI-AKI karşı kontrol, CI-AKI+M, CI-AKI+NAC ve CI-AKI+M+NAC; IL-1β, CI-AKI karşı diğer tüm gruplar ve CI-AKI+M karşı CI-AKI+NAC. Veriler ortalama ± SD olarak sunulmuştur (n = 6) ve tek yönlü ANOVA ile Duncan’ın post-hoc testi kullanılarak analiz edilmiştir. Aynı üst simge harfine sahip olmayan değerler arasında istatistiksel olarak önemli fark vardır (p < 0,05).

Gruplar	Tübüler nekroz	Tübüler dilatasyon	Hücresel dejenerasyon	Vasküler konjesyon
Kontrol	0	0	0	0
CI-AKI	2.67	2.83	2.67	2.5
CI-AKI+M	1.33	1.5	1.17	1
CI-AKI+NAC	1.17	1.17	0.83	0.83
CI-AKI+NAC+M	0.5	0.67	0.5	0.17

Tablo 3: Deneysel gruplarda böbrek dokusunun histopatolojik hasar parametrelerinin karşılaştırılması. Yarı niceliksel HE bazlı histopatolojik hasar puanları, grup ortalamaları olarak verilmiştir (n = 6 hayvan/grup). Puanlar 0 (hasar yok), 1 (hafif), 2 (orta) ve 3 (şiddetli hasar) olarak derecelendirilmiştir ve daha yüksek puanlar daha fazla histopatolojik hasarı göstermektedir.

Ek Dosya 1: Bu çalışmanın bulgularını destekleyen veriler.Lütfen bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.

Tartışma

Bu deneysel CI-AKI çalışması, kontrast sonrası montelukast, NAC veya bunların kombinasyonu ile yapılan tedavmenin böbrek fonksiyonları, oksidatif stres parametreleri, inflamatuar yanıtlar, böbrek hasarı biyobelirteçleri ve histopatolojik sonuçlar üzerindeki etkilerini değerlendirmiştir. Kontrast maruziyeti, serum üre, BUN ve kreatinin seviyelerinde önemli artışlara neden olmuş ve oksidatif stres parametreleri ile inflamatuar biyobelirteçlerdeki olumsuz değişikliklerle birlikte seyretmiştir. Artan KIM-1 ve sistatin C seviyeleri, böbrek hasarına dair ek kanıtlar sağlamıştır.

Kontrast sonrası montelukast, NAC veya bunların kombinasyonu ile yapılan tedavi, değerlendirilen birçok parametrede olumlu değişikliklerle ilişkilendirilmiştir. Bununla birlikte, kombinasyon tedavisi biyokimyasal sonuçlar genelinde montelukast monoterapisinden tutarlı bir şekilde daha üstün performans göstermemiştir. Birlikte değerlendirildiğinde, bu gözlemler CI-AKI'de oksidatif stres ve inflamasyonun rolüyle uyumludur ve mevcut çalışmada temel sinyal yolakları doğrudan incelenmemiş olsa da, bu süreçler üzerinde etkili olan müdahalelerin renal hasarı azaltabileceğini göstermektedir^1,30.

Kontrast uygulaması sonrası serum üre, BUN ve kreatinin düzeylerindeki belirgin artışlar, bu deneysel CI-AKI modelinde renal disfonksiyonun başarıyla indüklendiğini desteklemektedir. Kontrast maruziyeti; intrarenal vazokonstriksiyon, medüller hipoksi, oksidatif hasar ve tübüler hücre hasarını içeren etkileşimli süreçler aracılığıyla böbrek fonksiyonlarını bozabilir. Renal perfüzyonda ve glomerüler filtrasyonda meydana gelen bu azalma, azotlu atık ürünlerin eliminasyonunu kısıtlayarak dolaşımdaki konsantrasyonlarını artırabilir. Tedavi edilmeyen CI-AKI grubunda gözlenen renal fonksiyon değişiklikleri, önceki deneysel çalışmalarda bildirilenlerle tutarlıdır^1,30,31,32.

Tedavi edilmeyen CI-AKI grubunda, serum üre ve BUN için görece yüksek standart sapmalarla yansıtıldığı üzere, grup içi önemli bir değişkenlik gözlemlenmiştir. Bu dağılım; su yoksunluğuna verilen renal yanıt, nitrik oksit ve prostaglandin yollarının inhibisyonu ve kontrast maruziyeti dahil olmak üzere, hassaslaştırılmış CI-AKI indüksiyon protokolüne karşı bireyler arası biyolojik duyarlılık farklarını yansıtıyor olabilir. Hayvanlar arasındaki renal fonksiyonel rezerv ve fizyolojik yanıtların küçük farklılıkları da renal hasarın heterojen şiddetine katkıda bulunmuş olabilir. Bu nedenle, yüksek standart sapmalar ölçüm hatasından ziyade, bu deneysel model içindeki önemli biyolojik değişkenliğin bir kanıtı olarak yorumlanmalıdır. Bununla birlikte, her gruptaki hayvan sayısının azlığı göz önüne alındığında, dağılım özellikleri ve tedaviyle ilişkili farkların büyüklüğü ihtiyatla yorumlanmalıdır.

Mevcut çalışmada, serum üre, BUN ve kreatinin değerleri, NAC uygulanan grupta uygulanmamış CI-AKI grubuna göre sayısal olarak daha düşüktü; bu durum, renal disfonksiyonun olası bir hafiflemesiyle tutarlı bir seyirdir. NAC, CI-AKI üzerinde kapsamlı bir şekilde çalışılmıştır, ancak renal fonksiyonlar üzerindeki bildirilen etkileri çalışmalar arasında farklılık göstermiştir^14,15,16,17. Öne sürülen mekanizmalar arasında reaktif türlerin süpürülmesi, glutatyon sentezinin desteklenmesi ve renal dokudaki oksidatif hasarın sınırlandırılması yer almaktadır¹. Bu nedenle, NAC tedavisi sonrası gözlemlenen renal fonksiyon profili, her ne kadar bu mekanizma mevcut çalışmada doğrudan incelenmemiş olsa da, NAC'nin antioksidan özellikleriyle ilişkili olabilir.

Mevcut çalışmada, serum üre, BUN ve kreatinin değerleri montelukast tedavisi gören grupta, tedavi edilmeyen CI-AKI grubuna göre sayısal olarak daha düşük çıkmıştır; bu durum, böbrek disfonksiyonunun olası bir azalmasına işaret etmektedir. CI-AKI araştırmaları da dahil olmak üzere önceki deneysel çalışmalar, montelukast uygulaması sonrası benzer şekilde daha düşük serum kreatinin ve üre seviyeleri bildirmiştir^9,18,19. Kombinasyon grubu da tedavi edilmeyen CI-AKI grubuna göre sayısal olarak daha düşük böbrek fonksiyon belirteçleri göstermiştir. Bununla birlikte, üre, BUN ve kreatinin değerleri montelukast monoterapisinde, kombine tedaviye göre sayısal olarak daha düşüktü ve Duncan post hoc karşılaştırmaları bu iki grup arasında istatistiksel olarak anlamlı bir fark göstermemiştir (p > 0.05). Bu nedenle, kombinasyon tedavisi söz konusu böbrek fonksiyon belirteçleri açısından montelukast monoterapisine göre bir üstünlük göstermemiştir.

Oksidatif hasarın, CI-AKI patofizyolojisine önemli bir katkıda bulunduğu kabul edilmektedir. Kontrast maddeye maruz kalmanın tetiklediği medüller hipoksi, hücresel lipidlere ve mitokondrilere zarar verebilen, tubüler epitel hücrelerini yaralayabilen ve inflamatuar sinyalleri artırabilen aşırı ROS üretimini teşvik eder^1,12,30.

Tedavi edilmemiş CI-AKI grubu, kontrast madde maruziyeti sonrası oksidatif yük ile antioksidan savunmalar arasında bir dengesizlik olduğunu gösteren en yüksek MDA konsantrasyonunun yanı sıra en düşük SOD ve CAT aktiviteleri ile en düşük GSH seviyesini sergilemiştir. Artmış MDA ve azalmış antioksidan kapasite ile karakterize benzer profiller, diğer deneysel CI-AKI modellerinde de bildirilmiştir^18,19. Bu bulgular, oksidatif stresin yalnızca ikincil bir sonuç olarak ortaya çıkmasından ziyade, böbrek hasarının gelişimine ve ilerlemesine katkıda bulunduğu görüşüyle tutarlıdır^1,30.

Tedavi edilmemiş CI-AKI grubuyla karşılaştırıldığında, NAC ve montelukast ile tedavi edilen gruplar genel olarak, oksidatif hasarın azalmasıyla uyumlu bir model sergileyerek daha düşük MDA değerlerinin yanı sıra daha yüksek SOD, GSH ve CAT değerleri göstermiştir. NAC'ın önerilen antioksidan etkileri, reaktif türlerin nötralizasyonunu ve hücre içi glutatyon kullanılabilirliğinin sürdürülmesini içerir^1,14. Montelukast, böbrek dokusu içindeki oksidatif yanıtların baskılanması da dahil olmak üzere, sisteinyllökotrien reseptör blokajının ötesine geçen mekanizmalar aracılığıyla böbrek oksidatif hasarını da sınırlayabilir^18,33. CI-AKI modelleri de dahil olmak üzere böbrek hasarıyla ilgili önceki çalışmalar, montelukast tedavisi sonrası benzer şekilde azalmış lipid peroksidasyonu ve iyileşmiş antioksidan savunmaları bildirmiştir^9,19,27. Kombinasyon grubunda da olumlu oksidatif stres parametreleri gözlemlenmiş olsa da, kombine tedavi tutarlı bir şekilde herhangi bir monoterapiyi geride bırakmamıştır. Buna bağlı olarak, bu bulgular birlikte uygulanan NAC ve montelukastın eklemeli veya sinerjik bir antioksidan etkisi olduğunu kanıtlamamaktadır.

KIM-1 ve sistatin C bulguları, kontrast maruziyeti sonrası renal hasarın tamamlayıcı kanıtlarını sağlamıştır. KIM-1 önceliklele tübüler epitel hasarı ile ilişkilendirilirken, sistatin C renal filtrasyon ve hasarla ilgili değişikliklerin bir göstergesi olarak kullanılır; her ikisi de deneysel CI-AKI modellerinde erken biyobelirteçler olarak değerlendirilmiştir^1,10. Tedavi edilmeyen CI-AKI grubunda, her iki biyobelirtecin en yüksek seviyeleri, konvansiyonel renal fonksiyon parametrelerindeki belirgin kötüleşmeye eşlik etmiştir. Bu patern, kontrastla indüklenen renal hasar sonrası KIM-1 ve sistatin C seviyelerinde artış bildiren önceki deneysel çalışmalarla tutarlıdır^1,10.

Tedavi edilmemiş CI-AKI grubuyla karşılaştırıldığında, tedavi grupları böbrek hasarının hafiflemesiyle uyumlu bir seyir gösteren daha düşük KIM-1 ve sistatin C değerleri sergilemiştir. Bu biyobelirteç profili, tedavi sonrası gözlemlenen sayısal olarak daha düşük serum üre ve kreatinin konsantrasyonlarıyla paralellik göstermiştir. Önceki deneysel çalışmalar, montelukast uygulamasını CI-AKI ve diğer böbrek hasarı modellerinde azalmış KIM-1 ekspresyonu, daha az şiddetli tübüler hasar ve böbrek fonksiyonlarının korunması ile ilişkilendirmiştir^9,18,19. NAC'nin de benzer şekilde, potansiyel olarak oksidatif stres kaynaklı hücresel hasarın sınırlandırılması yoluyla, daha olumlu akut böbrek hasarı biyobelirteç profilleriyle ilişkili olduğu görülmüştür^14,15,16,17. Ancak, kombinasyon tedavisi ve montelukast monoterapisi grupları arasında KIM-1 veya sistatin C açısından istatistiksel olarak anlamlı bir fark saptanmamıştır (p > 0.05). Buna bağlı olarak, mevcut bulgular kombine tedavinin ek bir biyobelirteç faydası olduğunu göstermemektedir.

CI-AKI sırasında oksidatif ve inflamatuar yanıtlar birbirini güçlendirebilir. Fazla ROS, proinflamatuar sinyallemeyi stimüle edebilir ve bunu takiben TNF-α, IL-1β ve IL-6 seviyelerindeki artışlar renal doku hasarını potansiyel olarak amplifiye edebilir^1,12,13,30.

Tedavi edilmeyen CI-AKI grubu en yüksek TNF-α, IL-1β ve IL-6 konsantrasyonlarını sergilemiş olup, bu durum kontrast maddeye maruz kalma sonrası bir inflamatuar yanıtın varlığını desteklemektedir. Deneysel CI-AKI modellerinde, bu sitokinlerdeki artışlar tübüler hasar, inflamatuar hücre infiltrasyonu ve bozulmuş böbrek fonksiyonu ile ilişkilendirilmiştir^10,12,13. Mevcut çalışmada gözlemlenen inflamatuar sitokin profili, kontrast madde uygulaması sonrası rapor edilen önceki deneysel bulgularla tutarlılık göstermektedir¹.

NAC ve montelukast uygulanan gruplar, tedavi edilmemiş CI-AKI grubuna göre daha düşük TNF-α, IL-1β ve IL-6 değerleri göstermiştir; bu durum, inflamatuar yanıtın hafifletilmesiyle uyumlu bir örüntüdür. NAC için öne sürülen anti-inflamatuar aktivite, kısmen azalmış oksidatif yükten ve bunun sonucunda proinflamatuar sitokin üretiminin sınırlanmasından kaynaklanıyor olabilir^{1,14,15,16,17}. Montelukast, diğer inflamatuar sinyalizasyon süreçlerinin modülasyonunun yanı sıra sisteiniil lökotrien reseptör blokajı yoluyla sitokin ekspresyonunu etkileyebilir^18,33. Deneysel böbrek hasarı çalışmaları, montelukast tedavisini azalmış NF-κB ile ilişkili sinyalizasyon ve proinflamatuar aktivite ile ilişkilendirmiştir^9,19,27. Buna göre, bu çalışmada gözlemlenen sitokin profili, NF-κB ve NOD benzeri reseptör ailesi pirin alanı içeren 3 (NLRP3) inflamozom gibi yolakları içeren inflamatuar süreçlerin modülasyonu ile uyumludur. Ancak, NF-κB, NLRP3 ve NOX4 doğrudan ölçülmemiştir; bu nedenle biyobelirteç bulguları yalnızca dolaylı destekleyici kanıtlar sunmakta olup yolak spesifik aktivasyon veya inhibisyonu kanıtlayamaz.

İnflamatuar sitokin değerleri, kombinasyon tedavi grubunda tedavi edilmemiş CI-AKI grubuna göre daha düşüktü; ancak kombine tedavi, montelukast tek başına kullanımına göre tutarlı bir şekilde daha düşük değerler üretmedi. TNF-α, IL-1β veya IL-6 için CI-AKI + Montelukast ve CI-AKI + Montelukast + NAC grupları arasında istatistiksel olarak anlamlı bir fark saptanmadı (p > 0.05). Bu nedenle, mevcut sonuçlar montelukasta NAC eklenmesinin ek bir anti-inflamatuar fayda sağladığına dair bir kanıt sunmamaktadır.

Histopatolojik değerlendirmeler, kontrast madde uygulamasının ciddi yapısal böbrek hasarına yol açtığını daha ileri düzeyde göstermiştir. CI-AKI grubunda gözlenen tübüler nekroz, tübüler dilatasyon, hücresel dejenerasyon ve vasküler konjesyon bulguları, CI-AKI'nın karakteristik histopatolojik özelliklerini temsil etmektedir ve bozulmuş renal perfüzyon, oksidatif stres ve tübüler hücre hasarı ile ilişkilendirilmiştir^1,12,18,19. Biyokimyasal bulgularla birlikte, bu histopatolojik değişiklikler kontrast madde uygulamasının ciddi böbrek dokusu hasarına yol açtığını doğrulamaktadır. Montelukast ve NAC ile tedavi edilen gruplarda gözlenen daha düşük dereceli histopatolojik hasar, bu ajanların böbrek dokusu üzerinde koruyucu etkiler gösterebileceğini düşündürmektedir. Özellikle, kombinasyon tedavi grubu, tedavi grupları arasında sayısal olarak en düşük histopatolojik hasar skorlarını sergilemiştir. Ayrıca, Masson trikrom boyalı kesitlerin kalitatif değerlendirmesi, tedavi gruplarında tedavi edilmemiş CI-AKI grubuna kıyasla daha az belirgin interstisyel kolajen depozisyonu ve daha iyi korunmuş tübulointerstisyel mimari göstermiştir. Akut gözlem süresi ve Masson trikrom değerlendirmesinin kalitatif doğası göz önüne alındığında, bu bulgular uzun vadeli hücre dışı matriks yeniden şekillenmesinin değiştiğine dair bir kanıttan ziyade, incelenen zaman noktasında daha iyi yapısal korunmanın bir kanıtı olarak yorumlanmalıdır.

Yarı nicel histopatolojik değerlendirme, tedavi edilmemiş CI-AKI grubuyla karşılaştırıldığında tüm tedavi gruplarında daha düşük yaralanma skorları göstererek nitel gözlemlerle uyumlu çıkmıştır. Kombinasyon grubu sayısal olarak en düşük histopatolojik yaralanma skorlarını sergilemiş olsa da bu bulgu, biyokimyasal sonuçlarda tutarlı bir üstünlükle desteklenmemiştir. Bu nedenle, kombine tedaviyle gözlemlenen olumlu histopatolojik bulgular, mevcut çalışma tasarımına dayanarak additif veya sinerjik bir etkinin kanıtı olarak yorumlanmamalıdır. Benzer şekilde, CI-AKI ve diğer akut böbrek yetmezliği türlerinin deneysel modelleri üzerine yapılan önceki çalışmalar, oksidatif stresin ve inflamasyonun baskılanmasının histopatolojik hasarı azalttığını ve tübüler bütünlüğün korunmasına katkıda bulunduğunu bildirmiştir^9,18,19,27.

Biyokimyasal ve histopatolojik bulgular arasında belirgin bir farklılık gözlemlenmiştir. Bazı biyokimyasal değişkenler sayısal olarak montelukast monoterapisi grubunda kombinasyon grubuna göre daha olumlu olsa da, bu farklılıklar istatistiksel olarak anlamlı değildir. Buna karşılık, kombinasyon grubu sayısal olarak en düşük histopatolojik hasar skorlarını sergilemiştir. Bu kısmi uyumsuzluk, iki değerlendirme yaklaşımının yakaladığı biyolojik süreçlerdeki ve zamansal profillerdeki farklılıkları yansıtıyor olabilir. Histopatolojik inceleme, renal doku içindeki lokal hücresel ve yapısal hasarı doğrudan değerlendirir; bu nedenle, serum renal fonksiyon belirteçleri ve diğer biyokimyasal ölçümler aynı ölçüde iyileşmese bile, incelenen zaman noktasında doku düzeyinde korunma olduğunu ortaya çıkarabilir. Buna karşılık, biyokimyasal sonuçlar dolaylı fonksiyonel veya moleküler veriler sağlar ve renal fonksiyonel rezerv, kompanse mekanizmalar, hayvanlar arası biyolojik değişkenlik ve örnek toplama zamanlamasından etkilenebilir. Tüm son noktalar tek bir terminal zaman noktasında değerlendirildiği için, yapısal korunma ve biyokimyasal iyileşme senkronize olmamış olabilir. Buna göre, kombinasyon grubundaki daha olumlu histopatolojik görünüm, genel etkinliğin üstünlüğüne dair bir kanıttan ziyade, değerlendirme modaliteleri arasındaki bir fark olarak yorumlanmalıdır. Bununla birlikte, histopatolojik değerlendirmeler gözlemci yanlılığını en aza indirmek için körleme koşulları altında yapılmış olsa da, tüm doku kesitleri tek bir patolog tarafından değerlendirilmiş olup, bu durum gözlemciler arası değişkenliğin değerlendirilmesini engellemiştir. Gelecekte birden fazla bağımsız değerlendiricinin dahil olduğu çalışmalar, histopatolojik bulguların güvenilirliğini ve tekrarlanabilirliğini daha da artırabilir.

Bu modelin tekrarlanabilir uygulaması, çeşitli prosedürel adımların tutarlı bir şekilde yürütülmesine bağlıdır. Su kısıtlamasının süresi, L-NAME, indometasin ve ioheksol uygulamaları arasındaki önceden belirlenmiş aralıklar ve ioheksolün yavaş intravenöz iletimi hayvanlar arasında standart hale getirilmelidir. Kuyruk veni ekstravazasyonu, etkili kontrast dozunu azaltabilir ve böbrek hasarının şiddetindeki değişkenliği artırabilir; bu nedenle, uygulama boyunca enjeksiyon bölgesi dikkatle izlenmelidir. Enjeksiyon sırasında sızıntı, ekstravazasyon veya ciddi bir direnç oluştuğunda, ilgili bulgular yorumlanırken kontrast iletiminin tamamlanmamış olma olasılığı göz önünde bulundurulmalıdır. Doz tutarlılığı, oral gavaj sırasında geri kaçırma veya montelukast preparasyonunun yetersiz resüspansiyonu ile de etkilenebilir. Tüm hayvanlara aynı standart prosedürlerin uygulanması ve mümkün olduğunca uygulamaların aynı araştırmacı tarafından gerçekleştirilmesi, önlenebilir prosedürel değişkenliği azaltabilir.

Bu protokol, aynı hayvan modelinde biyokimyasal ve histopatolojik sonuçların incelenmesine olanak tanırken, nispeten kısa bir deneysel süre içinde CI-AKI'nin oluşturulmasını sağlar^1,2,9.

Bu çalışmanın güçlü bir yönü, böbrek hasarının tamamlayıcı fonksiyonel, biyokimyasal, inflamatuar ve histopatolojik sonuçlar kullanılarak karakterize edilmiş olmasıdır. Renal fonksiyon indekslerinin oksidatif stres parametreleri, inflamatuar sitokinler, KIM-1, sistatin C ve böbrek doku morfolojisi ile birlikte değerlendirilmesi, CI-AKI'nın çeşitli bileşenlerinin aynı deney kapsamında incelenmesine olanak sağlamıştır. KIM-1 ve sistatin C'nin dahil edilmesi, değerlendirmeyi geleneksel serum kreatinin ölçümlerinin ötesine taşımıştır. Montelukast ve NAC'nin hem ayrı ayrı hem de birlikte test edilmesi, tedavi stratejilerinin doğrudan karşılaştırılmasını sağlamıştır; ancak bulgular, değerlendirilen sonuçlar genelinde kombinasyon tedavisinin monoterapiden tutarlı bir şekilde üstün olduğunu göstermemiştir. Ayrıca, yalnızca kontrast maddeye maruziyete dayalı indüksiyon yaklaşımlarının aksine, mevcut model renal vazokonstriksiyon ve medüller hipoksiyi de içermekte, böylece tedaviyle ilişkili biyolojik değişikliklerin değerlendirilebileceği belirgin bir böbrek hasarı ortamı oluşturmaktadır.

Kontrast maruziyeti ile tedavi başlangıcı arasındaki 1 sa.lik aralık, bu deneysel protokolde incelenen tek zaman noktasını temsil eder ve klinik olarak doğrulanmış bir terapötik pencere olarak yorumlanmamalıdır. Bilinen bir kontrast maruziyetinden hemen sonra tedavi uygulanması gelecekteki translasyonel araştırmalar için ilgili olsa da, mevcut hayvan çalışması bunun klinik ortamlardaki fizibilitesini veya etkinliğini belirleyemez. Özellikle, optimal başlangıç zamanı, doz, uygulama yolu, tedavi süresi ve hasta popülasyonu bilinmemektedir. Kontrast sonrası NAC veya montelukast uygulamasının klinik kullanım için değerlendirilebilmesi öncesinde, bu faktörlerin özel translasyonel ve klinik çalışmalarda araştırılması gerekmektedir.

Mevcut çalışmanın bazı kısıtlamaları kabul edilmelidir. Bulgular klinik öncesi bir hayvan modelinden elde edilmiştir ve bu nedenle doğrudan klinik uygulamaya genellenemez. Protokol, su kısıtlamasını nitrik oksit ve prostaglandin yollarının inhibisyonu ile birleştirdiği için, ortaya çıkan böbrek hasarı, hastalarda kontrast maruziyeti sonrası tipik olarak karşılaşılan hasardan daha şiddetli olabilir. Sonuçlar, dolayısıyla bu duyarlılaştırılmış deneysel ortam bağlamında yorumlanmalıdır. Model, aday renoprotektif tedavilere verilen biyolojik yanıtların kontrollü bir şekilde değerlendirilmesine izin verse de, klinik CI-AKI'nın tüm heterojenliğini veya şiddet aralığını yeniden üretmemektedir. Bu nedenle, bu çalışmada gözlemlenen tedaviyle ilişkili değişiklikler, daha hafif veya daha çeşitli risk profillerine sahip hastalarda farklılık gösterebilir. Bu etkilerin büyüklüğü veya klinik önemi belirlenmeden önce, yaygın klinik durumları daha yakından taklit eden daha az yoğun modellerde tekrarlanması ve ardından uygun şekilde tasarlanmış klinik çalışmaların yapılması gereklidir. Ek bir kısıtlama ise çalışmaya sadece erkek sıçanların dahil edilmiş olmasıdır. Bu nedenle, CI-AKI'ya yatkınlıkta ve NAC ile montelukast yanıtlarında cinsiyete bağlı potansiyel farklılıklar değerlendirilmemiştir ve mevcut bulguların dişi hayvanlara genelenebileceği varsayılmamalıdır. Cinsiyetin böbrek hasarının şiddetini veya tedavi yanıtını etkileyip etkilemediğini belirlemek için her iki cinsiyeti de içeren gelecek çalışmalara ihtiyaç vardır.

Bir diğer kısıtlama, protokol ile ilgili tutma, kısıtlama, su yoksunluğu, enjeksiyonlar, oral gavage ve taşıyıcı madde uygulaması için deneysel gruplarla eşleştirilmiş prosedürel bir sham grubunun bulunmamasıdır. Kontrol grubu bu prosedürlere tabi tutulmadığı için, kısıtlama, tekrarlanan tutma, enjeksiyonlar, oral gavage ve taşıyıcı maddeya maruz kalma ile ilgili eşit olmayan prosedürel stresin ve spesifik olmayan etkilerin, Kontrol ve deneysel gruplar arasında gözlemlenen bazı farklılıklara potansiyel katkıda bulunma ihtimali tamamen dışlanamaz. Gelecekteki çalışmalara uygun şekilde eşleştirilmiş prosedürel sham ve taşıyıcı kontrol gruplarının dahil edilmesi, bu spesifik olmayan prosedürle ilgili etkilerin, CI-AKI indüksiyonu ve tedavisine spesifik olarak atfedilebilen etkilerden ayırt edilmesine yardımcı olacaktır.

Önceden belirlenen örneklem büyüklüğü, beş deneysel grup genelinde varsayılan büyük bir genel etkiyi saptamak için %80 güç sağlayacak şekilde hesaplanmış olsa da, çalışma monoterapi ve kombinasyon tedavi grupları arasındaki daha küçük ikili farkları saptamak için özel olarak güçlendirilmemiştir. Bu nedenle, çalışma tedavi grupları arasındaki bu tür farkları saptama konusunda sınırlı güce sahip olabilir ve anlamlı olmayan sayısal eğilimler eşdeğerlik kanıtı olarak yorumlanmamalıdır. Bu eğilimlerin tekrarlanabilir tedavi farklarını temsil edip etmediğini belirlemek için daha büyük örneklem büyüklüklerine sahip çalışmalara ihtiyaç duyulacaktır.

Her bir ajandan yalnızca tek bir doz değerlendirildiği için, mevcut çalışma optimal bir NAC–montelukast doz kombinasyonunu belirleyemez, doza bağlı sinerjik veya antagonistik etkileşimleri karakterize edemez veya kombinasyon tedavisiyle gözlemlenen etkilere her bir ajanın göreceli katkısını nicelendiremez. Bu nedenle, bir ajan belirli sonuçlara daha güçlü katkıda bulunmuş olabilir, ancak bu durum mevcut çalışma tasarımıyla saptanamaz. Doz-yanıt ilişkilerini karakterize etmek ve optimal bir kombinasyon rejimi belirlemek için birden fazla doz seviyesini ve resmi ilaç etkileşim analizlerini içeren gelecek çalışmalara ihtiyaç duyulacaktır.

Çalışma, oksidatif stres ve inflamasyonun biyokimyasal göstergelerini değerlendirmiş ancak ilişkili hücre içi sinyal yollarını doğrudan incelememiştir. Bu nedenle, gözlemlenen biyobelirteç profilleri, NF-κB, NLRP3 veya NOX4 ile ilişkili sinyal iletiminin tedavi tarafından aktive edilip edilmediğini veya inhibe edilip edilmediğini kanıtlayamaz. Montelukast ve NAC'ın renal etkilerine bu yolların nasıl katkıda bulunduğunu belirlemek için Western blotting ve kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu (qPCR) dahil olmak üzere moleküler yaklaşımların kullanıldığı gelecekteki araştırmalar gereklidir.

Değerlendirmeler akut fazla sınırlı kaldığı için, mevcut çalışma sonraki böbrek iyileşmesi veya daha uzun süreli doku yeniden şekillenmesi hakkında bilgi sağlamamaktadır. Bu nedenle, incelenen bitiş noktasında tedavi gruplarında gözlenen nispeten sınırlı kolajen birikimi, kronik renal fibrozisin önlendiğine dair bir kanıttan ziyade, erken dönemde ortaya çıkan yapısal bir bulgu olarak değerlendirilmelidir. Bu bulgu, bunun yerine başlangıçtaki böbrek hasarının hafifletilmesini yansıtıyor olabilir. Bu erken değişikliklerin kalıcı olup olmadığını ve uzun süreli böbrek fonksiyonlarını veya doku yeniden şekillenmesini etkileyip etkilemediğini belirlemek için daha geç değerlendirme noktalarını içeren boylamsal çalışmalara ihtiyaç vardır.

Genel olarak, montelukast ve NAC'nin kontrast sonrası tek başına veya kombinasyon şeklinde uygulanması, bu deneysel CI-AKI modelinde renal disfonksiyonun, oksidatif stresin, inflamatuar yanıtların ve histopatolojik hasarın azalmasıyla ilişkilendirilmiştir. Bununla birlikte, kombinasyon tedavisi, değerlendirilen sonuçların genelinde monoterapiye kıyasla tutarlı bir üstünlük göstermemiştir. Bu bulgular mevcut preklinik model ile sınırlıdır ve klinik uygulamaya doğrudan ekstrapolasyon yerine daha ileri deneysel araştırmaları desteklemektedir.

Sonuç olarak, kontrast sonrası montelukast, NAC veya bunların kombinasyonu ile yapılan tedavi, bu deneysel CI-AKI modelinde daha olumlu biyokimyasal ve histopatolojik bulgularla ilişkilendirilmiştir. Bununla birlikte, kombine rejimin değerlendirilen sonuçların tamamında monoterapiden tutarlı bir şekilde daha üstün olduğu görülmemiştir. Bu gözlemler preklinik bir hayvan çalışmasında elde edildiği için, klinik etkinlik veya uygulanabilirlik kanıtı olarak değil, daha fazla deneysel doğrulamaya temel oluşturacak veriler olarak değerlendirilmelidir. Bu kontrast sonrası tedavi yaklaşımlarının klinik CI-AKI ile olan potansiyel ilişkisini belirlemek için ek araştırmalar yapılması gerekmektedir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Otomatik Strip Yıkayıcı	Bio-Tek Instruments, USA	ELx50	Otomatik ELISA plak yıkama.
Mikroplaka Okuyucu	Bio-Tek Instruments, USA	ELx800	ELISA absorbans ölçümleri. RRID:SCR_028651
%10 Nötral Tamponlu Formalin	Merck	Kayıt dışı	Histopatoloji için doku fiksasyonu.
Masaüstü Santrifüj	Nüve	NF048	Numune hazırlama ve santrifügasyon.
Karboksimetilselüloz (CMC)	Sigma-Aldrich, USA	C5678	Montelukast süspansiyonu için kullanılan taşıyıcı.
CAT Kit Universal	Otto Scientific	Otto3051	Mindray BS-400 kimya analizörü kullanılarak serumdaki CAT aktivitesinin kolorimetrik ölçümü.
Dijital Homojenizatör	Daihan Scientific	HG-15D	Doku homojenizasyonu.
Eozin Y (Sarımsı)	Merck	1.15935.0025	HE boyama.
Harris Hematoksilin Solüsyonu	BSLAB	BS-002	HE boyama.
Indometasin	Sigma-Aldrich, USA	I7378	CI-AKI indüksiyonu için kullanıldı.
Iohexol (Omnipaque 300)	GE HealthCare	Kayıt dışı	CI-AKI'yı indüklemek için kullanılan kontrast madde.
Ketamin hidroklorür (Ketalar)	Pfizer, USA	Kayıt dışı	Numune toplamadan önce genel anestezi.
Işık Mikroskobu (Nikon Eclipse)	Nikon	Ni-U	Histopatolojik inceleme ve görüntüleme. RRID:SCR_024835
L-NAME (Nω-nitro-L-arginin metil ester)	Sigma-Aldrich, USA	N5751	CI-AKI indüksiyonu için kullanıldı.
Masson Trikrom Boyama Kiti	MOSLAB, Türkiye	BKMTO001	Masson trikrom boyama.
Mindray Kimya Analizörü	Mindray	BS-400	Biyokimyasal analizler.
Montelukast sodyum	Sigma-Aldrich, USA	SML0101	Tedavi olarak gavage yoluyla oral olarak uygulandı.
N-asetilsistein (ASIST 300 mg/2 mL)	MAC laç, Türkiye	Kayıt dışı	Tedavi olarak intraperitonal olarak uygulandı.
Sıçan Cystatin C ELISA Kiti	BT Lab, China	E0145Ra	Renal doku süpernatantlarında cystatin C'nin ELISA ölçümü.
Sıçan IL-1β ELISA Kiti	BT Lab, China	E0119Ra	Renal doku süpernatantlarında IL-1β'nin ELISA ölçümü.
Sıçan IL-6 ELISA Kiti	BT Lab, China	E0135Ra	Renal doku süpernatantlarında IL-6'nın ELISA ölçümü.
Sıçan KIM-1 ELISA Kiti	BT Lab, China	E0549Ra	Renal doku süpernatantlarında KIM-1'in ELISA ölçümü.
Sıçan TNF-α ELISA Kiti	BT Lab, China	E0764Ra	Renal doku süpernatantlarında TNF-α'nın ELISA ölçümü.
Paslanmaz Çelik Besleme İğnesi (22 G Oral Gavage Kanülü)	Instech Laboratories, USA	Kayıt dışı	Oral gavage uygulaması.
Standart pelet kemirgen yemi (Optima)	Optima, Türkiye	Kayıt dışı	Lot no. 58931. Besin bileşimi: %24 ham protein, %3,94 ham selüloz, %5,08 ham yağ, %8,8 ham kül, %1,44 lizin, %0,61 metiyonin, %1,14 kalsiyum, %0,89 fosfor ve %0,28 sodyum.
Universal Kreatinin Kiti	Otto Scientific	OttoBC139	Serumda kreatininin kolorimetrik ölçümü.
Universal GSH Kiti	Otto Scientific	Otto3053	Modifiye Ellman yöntemi kullanılarak EDTA-antikoagüle kandaki GSH'nin kolorimetrik ölçümü.
Universal MDA Kiti	Otto Scientific	Otto1001	ELx800 mikroplaka okuyucu kullanılarak serumda MDA'nın kolorimetrik ölçümü.
Universal SOD Kiti	Otto Scientific	Otto3047	Mindray BS-400 kimya analizörü kullanılarak serumdaki SOD aktivitesinin kolorimetrik ölçümü.
Universal Üre Kiti	Otto Scientific	OttoBC157	Serumda üre ve BUN'un kolorimetrik ölçümü.
Ksilazin hidroklorür (Rompun)	Bayer, Germany	Kayıt dışı	Numune toplamadan önce genel anestezi.