Bu protokol, kontraste bağlı akut böbrek hasarının bir sıçan modelini sunmakta ve kontrast sonrası N-asetilsistein ile montelukastin ayrı ayrı ve kombinasyon halinde uygulanmasını değerlendirmektedir. Kombine tedavi monoterapiye göre tutarlı bir şekilde daha üstün sonuçlar vermese de, tedavi rejimlerinin daha az şiddetli renal disfonksiyon, oksidatif stres, inflamasyon ve histopatolojik hasar ile ilişkili olduğu görülmüştür.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Kontrast Maddeye Bağlı Akut Böbrek Hasarı Oluşturulmuş Sıçan Modelinde Kontrast Sonrası N-Asetilsistein ve Montelukast Tedavisinin Nefroprotektif Etkileri
Bu makalede
Özet
Özet
Kontrast maddeye bağlı akut böbrek hasarı (CI-AKI), oksidatif stres ve inflamatuar süreçlerin renal hasara katkıda bulunduğu, iyotlu kontrast maruziyetinin önemli bir komplikasyonudur. Bu çalışma, CI-AKI'nın deneysel bir sıçan modelini oluşturmuş ve kontrast uygulaması sonrası N-asetilsistein (NAC), montelukast veya her ikisinin kombinasyonu ile başlatılan tedavilerin etkilerini incelemiştir. Yetişkin erkek Wistar sıçanlara su kısıtlaması uygulanmış, ardından sırayla intravenöz olarak Nω-nitro-L-arginin metil ester (L-NAME), indometasin ve iohexol uygulanmıştır. Tedaviye, iohexol uygulamasının tamamlanmasından 1 saat sonra, L-NAME uygulamasından yaklaşık 1,5 saat sonra başlanmış ve ardışık 3 gün boyunca günde bir kez devam edilmiştir. Renal fonksiyon indeksleri, oksidatif stres parametreleri, inflamatuar sitokinler, renal hasar biyobelirteçleri ve böbrek histopatolojisi değerlendirilmiştir. Tedavi edilmeyen CI-AKI grubu belirgin renal disfonksiyon, olumsuz bir oksidatif stres ve inflamatuar profil ile ciddi histopatolojik hasar sergilemiştir. Tedavi edilmeyen CI-AKI grubuyla karşılaştırıldığında, NAC, montelukast veya kombine rejim alan hayvanlar genel olarak daha iyi biyokimyasal ve histopatolojik bulgular göstermiştir. Glutasyon (GSH) seviyeleri kombinasyon grubunda en yüksek, ortalama histopatolojik hasar skorları ise sayısal olarak en düşük seviyedeydi; ancak kombine tedavi, değerlendirilen sonuçların tamamında monoterapiyi tutarlı bir şekilde geride bırakmamıştır. Bu protokol, CI-AKI'da kontrast sonrası müdahalelerin değerlendirilmesi için kontrollü bir preklinik çerçeve sunmaktadır ve bulgular, klinik etkinlik veya kombinasyona özgü bir avantaj kanıtlamaksızın NAC ve montelukastin daha fazla deneysel olarak araştırılmasını haklı çıkarmaktadır.
Giriş
Akut böbrek hasarı (ABH), hastanede yatan hastaların seyrinde sıklıkla komplikasyonlara yol açar; morbidite, mortalite ve sağlık kaynaklarının kullanımındaki artışa katkıda bulunur. İyodlu kontrast maddeler tanısal görüntülemede ve girişimsel prosedürlerde rutin olarak kullanıldığından, kontrast maruziyeti sonrası böbrek fonksiyonlarının bozulması önemli bir klinik sorun haline gelmiştir. Güncel terminoloji, kontrast maddelerin uygulanmasından sonra meydana gelen her türlü ABH atağını kapsayan kontrastla ilişkili akut böbrek hasarını (CA-AKI), renal hasarın nedensel olarak kontrast maddeye bağlandığı kontrast kaynaklı akut böbrek hasarından (CI-AKI) ayırır. Kontrast maruziyetinin doğrudan renal hasarla ilişkilendirilebildiği kontrollü deneysel modellerde, bu nedenle CI-AKI terimi yaygın olarak kullanılmaya devam etmektedir1,2.
Kronik böbrek hastalığı, diabetes mellitus, ileri yaş, kalp yetmezliği veya diğer kardiyovasküler komorbiditeleri olan hastalar CI-AKI'ya karşı özellikle hassastır. Etkilenen birçok hastada böbrek fonksiyonları geri döner; ancak daha şiddetli vakalarda kalıcı renal bozulma, renal replasman tedavisi ihtiyacı ve artmış ölüm riski görülebilir. CI-AKI aynı zamanda daha uzun hastanede yatış süreleri ve sağlık kaynaklarının daha fazla kullanımı ile ilişkilidir. Bu olumsuz sonuçlar, kontrast maddeye bağlı renal hasar için etkili önleyici ve terapötik yaklaşımlar geliştirme konusundaki süregelen ihtiyacı vurgulamaktadır1,3,4,5.
CI-AKI gelişimi; değişmiş renal perfüzyon, medüller oksijen dengesizliği, oksidatif stres, inflamasyon ve doğrudan tubüler toksisite dahil olmak üzere birbirleriyle ilişkili birkaç süreci kapsar. Kontrast maruziyeti, vazodilatör yanıtları zayıflatırken intrarenal vasküler tonusu vazokonstriksiyona doğru kaydırır ve böylece renal kan akışını azaltır. Dış medulla, fizyolojik koşullar altında bu bölgedeki oksijenye erişimin zaten sınırlı olması nedeniyle özellikle savunmasızdır. Bu nedenle, kontrast uygulaması sonrası oksijen iletimindeki daha fazla düşüş, hipoksik tubüler hasarı tetikleyebilir2,6,7.
Kontrast maddelere maruz kalma sonrası gelişen renal hipoksiye, böbrek hasarına önemli ölçüde katkıda bulunan reaktif oksijen türlerinin (ROS) artan üretimi eşlik eder. ROS üretimi endojen antioksidan kapasiteyi aştığında, hücresel lipitlerde, proteinlerde ve DNA'da oksidatif hasar gelişebilirken, eş zamanlı olarak inflamatuar sinyalleme artar. Hem deneysel hem de klinik ortamlarda, kontrast madde uygulaması artmış oksidatif stres parametreleri ve bozulmuş antioksidan savunmaları ile ilişkilendirilmiştir. Bu yanıtta rol oynayan moleküler yolaklar arasında nikotinamid adenin dinükleotit fosfat (NADPH) oksidaz bağımlı radikal oluşumu ve nükleer faktör kappa-B (NF-κB) aktivasyonu yer almaktadır1,6,8,9.
İnflamasyonun katkısı, CI-AKI'nın yalnızca hemodinamik bozuklukla açıklanamayacağını göstermektedir. Yakın tarihli kanıtlar, kontrast maddeye maruz kalma sonrası renal hasarda ferroptoz, nitrosatif stres ve nötrofil ekstrasellüler tuzaklarının da rol oynadığını ortaya koymuştur. Bu ek mekanizmaların tanınması, CI-AKI'nın önlenmesi ve tedavisi için araştırılan moleküler hedef yelpazesini genişletmiştir1.
Serum kreatinin ve idrar çıkışı CI-AKI'yı belirlemek için yaygın olarak kullanılır, ancak her ikisi de ancak böbrek hasarı geliştikten sonra değişebilir. Bu sınırlama, tübüler hasarı yansıtan böbrek hasar molekülü-1 (KIM-1) ve glomerüler filtrasyondaki değişikliklerle ilişkili olan sistatin C dahil olmak üzere daha erken göstergelerin değerlendirilmesini teşvik etmiştir. Deneysel ve klinik çalışmalardan elde edilen kanıtlar, bu biyobelirteçlerdeki değişimlerin CI-AKI'nın erken evresinde tespit edilebilir hale gelebileceğini ve bu nedenle böbrek hasarının daha erken değerlendirilmesini destekleyebileceğini göstermektedir9,10,11.
Kontrast Maddele İlişkili Akut Böbrek Hasarı'nın (CI-AKI) patofizyolojisinin anlaşılmasındaki ilerlemeler, oksidatif ve inflamatuar yolakları hedefleyen farmakolojik müdahalelerin değerlendirilmesini teşvik etmiştir. Yeterli hidrasyon temel önleyici tedbir olmaya devam ederken, ilaç temelli yaklaşımların bildirilen faydaları çalışmalar arasında farklılık göstermiştir. Sonuç olarak, hiçbir farmakolojik tedavi henüz CI-AKI için standart bir klinik müdahale olarak benimsenmeye yetecek düzeyde tutarlı bir etkinlik göstermemiştir1,4,12,13.
N-asetilsistein (NAC), kontrast maddesine bağlı akut böbrek hasarının (CI-AKI) sınırlandırılması için farmakolojik bir yaklaşım olarak yaygın şekilde değerlendirilmiştir. Önerilen renoprotektif etkileri, reaktif türlerin temizlenmesi ve glutatyon rezervlerinin geri kazandırılması ile ilişkilidir. Erken dönem klinik destek, NAC'nin kontrasta bağlı renal disfonksiyon insidansını azalttığı, kronik böbrek hastalığı olan hastalarla yapılan dönüm noktası niteliğindeki bir çalışmadan gelmiştir14. Ancak daha sonraki klinik çalışmalar ve kanıt sentezleri, bazılarının fayda bildirdiği diğerlerinin ise anlamlı bir klinik etki göstermediği tutarsız bulgular ortaya koymuştur. Bu nedenle, NAC'nin CI-AKI üzerindeki etkinliği belirsizliğini korumaktadır12,15,16,17.
Montelukast, sisteinil lökotrien reseptör-1'i seçici olarak bloke eder ve uzun süredir astım ile alerjik bozuklukların tedavisinde kullanılmaktadır. Deneysel kanıtlar ayrıca bu ajanın anti-inflamatuar, antioksidan ve anti-apoptotik etkiler gösterdiğine işaret etmektedir. Farklı böbrek hasarı modellerinde, montelukast uygulaması; azalmış lipid peroksidasyonu, güçlenmiş endojen antioksidan savunmaları, daha az şiddetli histopatolojik hasar ve böbrek hasarının hafiflemesi ile ilişkilendirilmiştir18,19,20,21,22.
Kontrast maddelere bağlı akut böbrek hasarında (CI-AKI) spesifik olarak montelukastı inceleyen kanıtlar halen sınırlıdır. Mevcut deneysel bulgular, ilacın renal etkilerinin oksidatif ve inflamatuar sinyalizasyonun modülasyonunu içerebileceğini göstermektedir. NADPH oksidaz 4 (NOX4), p22phox ve NF-κB ekspresyonundaki azalma, montelukastın kontrasta bağlı böbrek hasarını hafifletebileceği bir mekanizma olarak öne sürülmüştür9.
NAC ve montelukast, böbrek hasarında yer alan, kısmen farklı ancak örtüşen yolakları etkiler. NAC öncelikle antioksidan savunmayı desteklerken, montelukast hem antiinflamatuar hem de antioksidan etkilere sahiptir. Bu nedenle, bu ajanların eş zamanlı uygulanması CI-AKI patofizyolojisinin birden fazla bileşenini etkileyebilir; ancak, etkileşimlerinin eklemeli veya sinerjik bir fayda sağlayıp sağlamadığı deneysel modellerde henüz belirlenmemiştir18,19,20,21,22.
Önceki araştırmalar ağırlıklı olarak kontrast maruziyeti öncesinde uygulanan müdahaleleri değerlendirmiş, buna karşın maruziyet sonrası başlatılan tedavilere ilişkin kanıtlar yetersiz kalmıştır. Özellikle, montelukast'ın NAC ile birlikte kontrast sonrası uygulanması, deneysel CI-AKI modellerinde sınırlı düzeyde araştırılmıştır. Bu nedenle mevcut çalışma, kontrast maruziyeti sonrası ayrı ayrı veya kombinasyon şeklinde uygulanan montelukast ve NAC'ın, bir CI-AKI sıçan modelindeki böbrek fonksiyonu, oksidatif stres parametreleri ve antioksidan savunmalar, böbrek hasarı ve inflamatuar biyobelirteçler ile histopatolojik değişiklikler üzerindeki etkilerini değerlendirmiştir.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Hayvanların kullanıldığı tüm deneysel prosedürler, laboratuvar hayvanlarının bakımı ve kullanımı için uluslararası kabul görmüş kılavuzlara uygun olarak yürütülmüş ve Hayvan Araştırmaları: In Vivo Deneylerin Raporlanması (ARRIVE) kılavuzlarına uygunluk sağlanmıştır. Deneysel protokol, Ahi Evran Üniversitesi Hayvan Deneyleri Yerel Etik Kurulu, Kırşehir, Türkiye tarafından onaylanmıştır (Karar No. 2, Toplantı No. 12, Tarih: 12 Haziran 2025). Çalışma boyunca hayvanların acı çekmesini en aza indirmek ve kullanılan hayvan sayısını azaltmak için her türlü çaba gösterilmiştir. Kullanılan tüm reaktiflerin ve ekipmanların detayları Materyal Tablosunda listelenmiştir.
Kimyasalların hazırlanması
Bu çalışmada Nω-nitro-L-arginine methyl ester (L-NAME), indometasin, ioheksol, montelukast sodyum ve NAC kullanılmıştır. 100 mL steril %0,9 normal salin içerisinde 1 g L-NAME kullanılarak 10 mg/mL'lik bir L-NAME solüsyonu hazırlanmıştır. Solüsyon, uygulama gününde taze olarak hazırlanmış ve o günün ötesinde saklanmadan kullanılmıştır. Deneysel CI-AKI modelinin indüksiyonu için, 10 mg/kg dozunda intravenöz (IV) olarak L-NAME uygulanmıştır. Yaklaşık 220 g ağırlığındaki bir sıçanda, hesaplanan miktar yaklaşık 2,2 mg olup bu da yaklaşık 0,22 mL uygulama hacmine karşılık gelmektedir. İndometasin, 100 mg'ın 10 mL son hacme çözünmesiyle %5 sodyum bikarbonat solüsyonu içerisinde 10 mg/mL konsantrasyonunda hazırlanmıştır. Hazırlanan karışım, görsel olarak homojen hale gelene kadar vortekslenmiştir. Hazırlanan indometasin solüsyonunun son pH değeri deney sırasında ölçülmemiş ve bu nedenle geriye dönük olarak belirlenememiştir. Hazırlanan indometasin solüsyonu için spesifik bir sterilizasyon veya filtrasyon prosedürü deney kayıtlarında belgelenmemiş ve dolayısıyla geriye dönük olarak rapor edilememiştir. Herhangi bir resmi stabilite aralığı belirlenmemiş veya değerlendirilmemiştir; solüsyon taze hazırlanmış ve aynı gün kullanılmıştır. Deneysel CI-AKI modelini indüklemek için, 10 mg/kg dozunda intravenöz olarak indometasin uygulanmıştır. Yaklaşık 220 g ağırlığındaki bir sıçan için hesaplanan miktar yaklaşık 2,2 mg olup bu da yaklaşık 0,22 mL uygulama hacmine karşılık gelmektedir.
647 mg iohexol/mL içeren ve 300 mg/mL eşdeğer iyot konsantrasyonuna sahip ticari iohexol formülasyonu, ek dilüsyon yapılmadan uygulandı. Enjeksiyon anındaki iohexol'ün kesin sıcaklığı kaydedilmemiştir. Mevcut deneysel kayıtlardan formülasyona özgü bir osmolalite değeri güvenilir şekilde doğrulanamamış ve bu nedenle rapor edilmemiştir. Deneysel CI-AKI modelinin indüksiyonu için iohexol, 3 g iyot/kg dozunda intravenr olarak uygulanmıştır. Yaklaşık 220 g ağırlığındaki bir sıçanda bu doz, yaklaşık 0,66 g iyot sağlamış ve yaklaşık 2,2 mL'lik bir enjeksiyon hacmine tekabül etmiştir.
%0,5 karboksimetil selüloz (CMC) içerisinde bir montelukast sodyum süspansiyonu hazırlandı. Süspansiyon, her uygulama gününde taze olarak hazırlandı ve askıdaki partiküllerin eşit dağılımını sağlamak için dozlama öncesinde hemen vortekslendi. Her hayvan için gereken montelukast dozu, çalışma başlangıcında kaydedilen vücut ağırlığı kullanılarak şu formül ile ayrı ayrı hesaplandı: gereken doz (mg) = vücut ağırlığı (kg) × 10 mg/kg. Yaklaşık 220 g ağırlığındaki bir hayvan için hesaplanan doz yaklaşık 2,2 mg idi ve oral gavaj yoluyla verildi. Süspansiyon her uygulamadan önce görsel olarak kontrol edildi ve çökelme gösteren her preparasyon kullanım öncesinde tekrar vortekslendi.
NAC, tedavi gruplarına ticari formülasyonundan, başka bir dilüsyon yapılmadan 100 mg/kg intraperitoneal dozda uygulandı. Her hayvan için gerekli doz, çalışma başlangıcında kaydedilen vücut ağırlığına göre bireysel olarak hesaplandı. Yaklaşık 220 g ağırlığındaki bir hayvan için bu miktar, yaklaşık 22 mg NAC'ye ve yaklaşık 0.15 mL uygulama hacmine tekabül etti. Dozlama öncesinde solüsyon görsel olarak incelendi ve yalnızca berrak, görünür partiküllerden arındırılmış preparatlar kullanıldı.
Her bir preparat, uygulama öncesinde görsel denetime tabi tutulmuştur. L-NAME, indometasin, ioheksol ve NAC çözeltileri, renk değişimi ve görünür partiküller açısından kontrol edilmiştir. Uygulamadan hemen önce, montelukast süspansiyonu vortexlemiş ve homojenliği doğrulamak için görsel olarak incelenmiştir. Bu kabul kriterlerini karşılamayan hiçbir preparat kullanılmamıştır. Tüm kimyasalların hazırlanması ve uygulanması sırasında laboratuvar önlüğü, koruyucu eldiven ve göz koruyucu kullanılmıştır. Tüm prosedürler, kurumsal laboratuvar güvenliği ve biyogüvenlik gerekliliklerine uygun olarak gerçekleştirilmiştir.
Hayvan seçimi, barındırma, deneysel gruplar ve randomizasyon
Ahi Evran Üniversitesi Deney Hayvanları Araştırma Laboratuvarı'ndan (Kırşehir, Türkiye), otuz yetişkin erkek Wistar albino sıçan (8–12 haftalık; vücut ağırlığı, 200–220 g) temin edilmiştir. Daha önce yayınlanmış deneysel CI-AKI modelleriyle metodolojik tutarlılığı sağlamak ve östrus döngüsü evresini ek bir biyolojik değişken olarak eklemekten kaçınmak amacıyla erkek sıçanlar seçilmiştir. Bu çalışmada cinsiyet, deneysel bir değişken olarak değerlendirilmemiştir. Hayvan tesisi 184 numaralı üretim/üretim lisansına sahipti ve sıçanlar orada standart laboratuvar koşulları altında üretilip barındırıldı. Kayıt sırasında, hayvanların belgelenmiş bir spesifik patojensiz (SPF) durumları veya resmi olarak atanmış başka bir mikrobiyolojik sağlık sınıflandırmaları bulunmamaktaydı. Her bir sıçan, altlık olarak kaba kıyılmış çam talaşı kullanılan 40 cm × 25 cm × 20 cm ölçülerinde bir polikarbonat kafeste ayrı olarak tutuldu. Oda koşulları, otomatik bir çevre kontrol ve havalandırma sistemi ile 24 °C ± 2 °C ve %35 ± 10 bağıl nemde sabit tutuldu. 07:00 ile 19:00 saatleri arasında aydınlatma olacak şekilde 12 saat ışık/12 saat karanlık programı uygulandı. 7 günlük alıştırma aşamasında veya sonraki deneysel dönemde özel bir çevresel zenginleştirme sağlanmadı. CI-AKI indüksiyonu öncesindeki tanımlanmış 16 saatlik su yoksunluğu süresi dışında, standart pelet şeklinde kemirgen yemi ve musluk suyu ad libitum olarak sunuldu. Yem bileşimi %24 ham protein, %3,94 ham selüloz, %5,08 ham yağ, %8,8 ham kül, %1,44 lizin, %0,61 metiyonin, %1,14 kalsiyum, %0,89 fosfor ve %0,28 sodyumdan oluşmaktaydı. Tüm hayvanlar, deneysel prosedürler başlamadan önce 7 gün boyunca alıştırıldı. Genel durum, yem ve su tüketimi, hareketlilik, duruş, tüy görünümü ve herhangi bir stres belirtisini değerlendirmek için hem alıştırma hem de deneysel dönem boyunca günlük gözlemler yapıldı. Seçim yanlılığını en aza indirmek için hayvanlar, bilgisayar tarafından oluşturulan rastgele bir atama dizisi kullanılarak, her gruba altı hayvan düşecek şekilde beş deneysel gruba ayrıldı. Örneklem büyüklüğü, G*Power versiyon 3.1.9.6 kullanılarak yapılan bir a priori güç analizi ile belirlendi.
Örneklem büyüklüğü, beş deney grubunu içeren sabit etkili tek yönlü varyans analizi için yapılan bir a priori güç analizi ile belirlenmiştir. 0,65 etki büyüklüğü (f), 0,05 tip I hata oranı (α) ve %80 istatistiksel güç varsayıldığında, gerekli toplam örneklem büyüklüğü, grup başına altı hayvana karşılık gelecek şekilde 30 hayvan olarak hesaplanmıştır. Etki büyüklüğünün (f = 0,65), beş grup arasındaki karşılaştırmada genel olarak büyük bir gruplar arası etkiyi temsil ettiği a priori olarak varsayılmıştır. Bu hesaplama, söz konusu genel etkiyi saptamak için gereken örneklem büyüklüğünü belirlemek amacıyla yapılmış olup, aktif tedavi grupları arasındaki daha küçük ikili farkları saptamak için özel olarak tasarlanmamıştır. Tüm analizlerde bireysel hayvan, deneysel birim olarak kabul edilmiştir.
Rutin bakım, günlük sağlık izlemi ve terminal prosedürler hariç, Kontrol grubundaki hayvanlar protokolle ilgili elleçleme veya kısıtlamaya, su yoksunluğuna, intravenöz veya intraperitoneal enjeksiyonlara, oral gavage'a veya araç madde uygulamasına tabi tutulmamıştır. CI-AKI grubu, 8. günde CI-AKI modelinin oluşturulduğu ve herhangi bir tedavi uygulanmayan hayvanlardan oluşmuştur. CI-AKI + Montelukast grubu, CI-AKI modelinin oluşturulduğu ve ardından montelukast ile tedavi edilen hayvanlardan oluşmuştur. CI-AKI + NAC grubu, CI-AKI modelinin oluşturulduğu ve ardından NAC ile tedavi edilen hayvanlardan oluşmuştur. CI-AKI + Montelukast + NAC grubu, CI-AKI modelinin oluşturulduğu ve ardından montelukast ve NAC kombinasyonu ile tedavi edilen hayvanlardan oluşmuştur. Ne Kontrol grubu ne de tedavi edilmeyen CI-AKI grubu, tedaviye eşdeğer sham prosedürlere tabi tutulmuştur. Spesifik olarak, bu gruplarda sham elleçleme, sham oral gavage, sham tedavi enjeksiyonları veya tedaviyle eşleştirilmiş araç madde uygulamaları gerçekleştirilmemiştir. L-NAME, indometasin ve montelukast hazırlığında kullanılan araç maddeler, kimyasalların hazırlanması bölümünde açıklandığı üzere sırasıyla %0.9 normal salin, %5 sodyum bikarbonat çözeltisi ve %0.5 CMC'dir. NAC, herhangi bir seyreltme yapılmadan ticari formülasyonundan uygulanmış ve NAC için ayrı bir araç madde hazırlanmamıştır. 8. günde, Kontrol grubundakiler hariç tüm hayvanlar 16 saatlik su yoksunluğuna tabi tutulmuş, ardından kontrast maddeye bağlı akut böbrek hasarını indüklemek için sırasıyla L-NAME (10 mg/kg), indometasin (10 mg/kg) ve iohexol (3 g iyot/kg) intravenöz olarak uygulanmıştır. Belirlenen tedavi gruplarında, montelukast (10 mg/kg, oral gavage) ve/veya NAC (100 mg/kg, intraperitoneal enjeksiyon), 8. günde iohexol uygulamasının tamamlanmasından 1 saat sonra (L-NAME uygulamasından yaklaşık 1,5 saat sonrasına tekabül edecek şekilde) ilk kez uygulanmış ve ardından 9. ve 10. günlerde aynı saatte günde bir kez uygulanmaya devam edilmiştir.
İlaç uygulama protokolü
CI-AKI, 16 saatin su deprive edildikten sonra sırasıyla L-NAME, indometasin ve ioheksolün intravenöz olarak uygulanmasını içeren yayınlanmış bir deneysel protokole göre oluşturuldu23,24,25. L-NAME ve indometasinle her biri 10 mg/kg dozunda uygulanırken, ioheksol 3 g iyot/kg dozunda verildi. Tedavi dozları montelukast sodyum için 10 mg/kg ve NAC için 100 mg/kg olarak belirlendi. Model indüksiyon ve tedavi dozlarının seçimi, daha önce yayınlanmış deneysel çalışmalara göre yapıldı22,26,27. Öncül bir doz aralığı veya doz optimizasyon çalışması yürütülmedi. NAC ve montelukast dozları, bireysel ajanların daha önce yayınlanmış deneysel çalışmalarına dayanarak bağımsız olarak seçildi ve kombinasyona özgü bir doz belirleme çalışmasından türetilmedi. Seçilen dozların farmakolojik olarak eş değer maruziyetleri temsil etmesi amaçlanmadı ve herhangi bir doz-yanıt veya formal ilaç etkileşim analizi gerçekleştirilmedi. Bireysel hayvan düzeyinde başarılı model indüksiyonunu tanımlamak için önceden belirlenmiş sayısal veya laboratuvar eşiği kullanılmadı. Çalışma sonunda, böbrek hasarının başarılı bir şekilde oluşturulduğu, Kontrol grubuna kıyasla tedavi edilmeyen CI-AKI grubunda gözlemlenen karakteristik histopatolojik değişikliklerle desteklendi. 8. günde, Kontrol grubundakiler dışındaki tüm hayvanlar, kontrast maddeye bağlı akut böbrek yetmezliği indüksiyonundan hemen önce tek seferlik 16 saatlik bir su yoksunluğu dönemine tabi tutuldu. Deney süresinin geri kalanında su yoksunluğu tekrarlanmadı. Su yoksunluğu süreci boyunca standart pelet yem ad libitum olarak sağlandı. 16 saatlik tek seferlik su yoksunluğu döneminin tamamlanmasının ardından, ilk model indükleyici ajan olan L-NAME uygulanmadan önce, tüm su yoksunluğu uygulanan deneysel gruplarda musluk suyuna erişim eş zamanlı ve ad libitum olarak yeniden sağlandı ve deney süresinin geri kalanı boyunca sürdürüldü. Suyun yeniden sağlanmasının zamanlaması ve koşulları, tüm su yoksunluğu gruplarında aynıydı. Yeniden sağlandıktan sonraki su alımı önceden tanımlanmış bir hacimle sınırlandırılmadı ve kantitatif olarak ölçülmedi. 16 saatlik su yoksunluğu döneminden hemen önceki ve sonraki eşleştirilmiş vücut ağırlıkları ölçülmedi; bu nedenle, dehidrasyonla ilişkili yüzde vücut ağırlığı kaybı hesaplanamadı. İdrar çıkışı kantitatif olarak izlenmedi. Su erişiminin yeniden sağlanmasının ardından CI-AKI indüksiyonu başlatıldı. L-NAME, indometasin ve ioheksolün tüm ardışık intravenöz uygulamaları, steril 5 mL'lik bir şırıngaya takılı 26 G iğne kullanılarak lateral kuyruk veninden gerçekleştirildi. İntravenöz uygulamadan önce, lateral kuyruk venlerinin görünürlüğünü ve genişlemesini kolaylaştırmak için kuyruk birkaç dakika boyunca suda ısıtıldı. Her intravenöz uygulamayı takiben, ilgili model indükleyici ajanın hesaplanan uygulama hacmine ek olarak, ven 0,5 mL steril %0,9 normal salin ile yıkandı . Enjeksiyon bölgesi; uygulama ve yıkama boyunca şişme, sızıntı veya ekstravazasyon kanıtı açısından görsel olarak izlendi. Önce L-NAME (10 mg/kg) uygulandı. L-NAME uygulamasından on beş dakika sonra, indometasin (10 mg/kg) aynı lateral kuyruk veninden intravenöz olarak verildi. İndometasin uygulamasından on beş dakika sonra, ioheksol aynı lateral kuyruk veninden 3 g iyot/kg dozunda intravenöz olarak uygulandı. Her hayvan için ioheksol dozu ve buna karşılık gelen enjeksiyon hacmi, çalışma başlangıcında kaydedilen vücut ağırlığına ve 300 mg iyot/mL'lik ticari iyot konsantrasyonuna göre bireysel olarak hesaplandı. Bu, 10 mL/kg'lık bir uygulama hacmine ve dolayısıyla 200–220 g ağırlığındaki sıçanlar için yaklaşık 2,0–2,2 mL'ye karşılık geliyordu. Protokolde tanımlanmış ayrı bir maksimum izin verilen intravenöz hacim önceden belirlenmedi; bu çalışmada kullanılan en büyük tek ajan intravenöz uygulaması 10 mL/kg'lık ioheksol idi. Ioheksol yaklaşık 1–2 dakika boyunca yavaşça uygulandı. Başarılı intravenöz uygulama, enjeksiyon bölgesinde görünür şişme, sızıntı veya ekstravazasyon olmamasıyla doğrulandı. Kısmi ekstravazasyon gözlemlenmedi ve şüphelenilen ekstravazasyon nedeniyle herhangi bir enjeksiyonun yeniden denemeye veya doz tekrarına gerek kalmadı. Ioheksol uygulamasının tamamlanmasından bir saat sonra, belirlenen tedaviler tedavi gruplarına ilk kez uygulandı. Ioheksol uygulaması L-NAME uygulamasından 30 dakika sonra başlatılıp yaklaşık 1–2 dakika içinde tamamlandığından, tedavi başlangıcı L-NAME uygulamasından yaklaşık 91–92 dakika (yaklaşık 1,5 saat) sonra gerçekleşti. Montelukast sodyum (10 mg/kg) oral gavage ile, NAC (100 mg/kg) ise intraperitonal olarak uygulandı.
Oral gavage işlemi 22 G paslanmaz çelik besleme kanülü kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Her hayvan dik pozisyonda tutulmuş ve besleme kanülü yemek borusu üzerinden mideye doğru nazikçe ilerletilmiştir. Aşırı dirençle karşılaşıldığında, uygulama öncesinde kanül geri çekilmiş ve yeniden konumlandırılmıştır. Gavage sırasında ve hemen sonrasında hayvanlarda regürjitasyon olup olmadığı gözlemlenmiştir. Herhangi bir hayvanda gavage sırasında veya hemen sonrasında regürjitasyon veya eksik oral dozlamaya dair başka bir kanıta rastlanmamış ve başarısız oral uygulama şüphesiyle hiçbir hayvan çalışma dışı bırakılmamıştır. İntraperitonal enjeksiyonlar karnın sağ alt kadranına yapılmıştır. İğne yaklaşık 30°–45° açıyla yerleştirilmiş ve uygulama öncesinde yanlışlıkla damar yoluna girilip girilmediğini kontrol etmek için aspirasyon yapılmıştır. Enjeksiyon bölgesi, uygulama sırasında ve hemen sonrasında sızıntı, kanama veya diğer görünür komplikasyonlar açısından görsel olarak izlenmiştir. Belirlenen tedaviler 8, 9 ve 10. günlerde aynı saatte günde bir kez uygulanmıştır. Buna göre, CI-AKI + Montelukast grubundaki hayvanlar üç ardışık gün boyunca günde bir kez montelukast, CI-AKI + NAC grubundaki hayvanlar üç ardışık gün boyunca günde bir kez NAC ve CI-AKI + Montelukast + NAC grubundaki hayvanlar aynı 3 günlük tedavi programına göre günde bir kez hem montelukast hem de NAC almıştır. Tüm model indüksiyonu ve tedavi uygulamaları aynı araştırmacı tarafından gerçekleştirilmiştir. Vücut ağırlığı, çalışma başlangıcında her hayvan için bir kez ölçülmüş ve deneysel süreçte tekrar ölçülmemiştir. Her hayvan için, tüm model indükleyici ajanların ve çalışma tedavilerinin dozu ve karşılık gelen uygulama hacmi, çalışma başlangıcında kaydedilen vücut ağırlığı kullanılarak bireysel olarak hesaplanmıştır. Tüm intravenöz, intraperitonal ve oral gavage prosedürleri, uygulama kaynaklı değişkenliği minimize etmek için aynı standart teknik kullanılarak gerçekleştirilmiştir.
Ötanazi prosedürü, insani son noktalar ve örnek toplama
Hayvanlar, deney boyunca genel durum, yem ve su tüketimi, hareketlilik, duruş, tüy görünümü ve stres belirtileri açısından günde bir kez gözlemlenmiştir. Prospektif olarak belirlenen insani sonlanma noktaları; belirgin letarji, mevcut yem veya suya erişememe veya tüketememe, anormal duruş, azalmış hareketlilik, kalıcı piloereksiyon ve stresin diğer tüm açık belirtilerini kapsamaktaydı. Bu kriterlerden herhangi birini karşılayan hayvanlara derhal ötanazi uygulanacaktı; ancak çalışma süresince hiçbir hayvan insani sonlanma noktası kriterlerini karşılamamıştır. Son tedaviden 24 saat sonra, 11. günde, ketamin (80 mg/kg) ve ksilazin (10 mg/kg) intraperitoneal uygulamasıyla derin anestezi indüklenmiştir. Yeterli anestezi düzeyi, pedal çekilme refleksinin yokluğu ile doğrulanmıştır. Yeterli anestezi derinliği onaylandıktan sonra, her hayvandan intrakardiyak ponksiyon yoluyla yaklaşık 3–5 mL kan alınmıştır. Ötanazi, hayvan derin anestezi altındayken kan kaybı (eksanguinasyon) yoluyla tamamlanmıştır. Ölüm, hem kalp aktivitesinin hem de spontan solunumun yokluğu ile teyit edilmiştir.
Serum biyokimyasal ölçümleri için toplanan kan, antikoagülan içermeyen tüplere yerleştirildi ve pıhtılaşma tamamlanana kadar beklendi. Tüpler daha sonra 4 °C'de 10–15 dk boyunca 3,000 × g hızında santrifüj edildi; ardından serum fraksiyonu ayrıştırıldı ve analiz edilene kadar −80 °C'de saklandı. Glutatyon ölçümü için planlanan örnekler, etilendiamintetraasetik asit (EDTA) içeren tüplere ayrı olarak toplandı. Bu örnekler antikoagüle edildiği için, ilgili glutatyon analiz prosedürüne uygun olarak pıhtılaşma aşaması olmadan işlendiler. Elde edilen serum berrak olduğunda ve görünür bir hemoliz belirtisi göstermediğinde, serum ayrıştırma işlemi kabul edilebilir olarak değerlendirildi.
Ölüm teyit edildikten sonra, median laparotomi gerçekleştirildi ve her hayvandan her iki böbrek de dikkatlice çıkarıldı. Örneklerin çevresindeki adipoz ve bağ dokular temizlendi. Sağ böbrek yalnızca histopatolojik inceleme için ayrılırken, sol böbrek biyokimyasal analizlere tahsis edildi. Sol böbrekten alınan karma doku, renal korteks ve medulla ayrı ayrı disseke edilmeden analiz edildi. İki böbrek birbirinden bağımsız olarak işlendi ve farklı hayvanlardan alınan örnekler, havuzlama yapılmadan işlem süreci boyunca ayrı tutuldu. Sağ böbreğin tamamı %10 nötral tamponlu formaldehide konuldu ve histopatolojik değerlendirme için işlendi. Renal korteksi ve dış medullayı kapsayan kesitler hazırlandı ve histopatolojik işlem ve skorlama prosedürlerinde açıklanan yöntemlere göre incelendi. Her bir sol böbrek ayrı ayrı etiketlendi ve homojenizasyon ile biyokimyasal testler yapılana kadar -80 °C'de saklandı. Eksizyondan sonra, dokunun genel bütünlüğü kontrol edildi ve hedeflenen histopatolojik ve biyokimyasal değerlendirmeler için yeterli miktarda doku tutuldu.
Model indüksiyonu ve tedavi uygulamasından sorumlu araştırmacı, deney grupları farklı prosedürlere tabi tutulduğu için körleme işlemine dahil edilememiştir. Ancak, grup kimlikleri; biyokimyasal ve istatistiksel analizleri yapan araştırmacılardan ve histopatolojik değerlendirmeleri gerçekleştiren patologdan gizlenmiştir. Kayıt altına alınan tüm hayvanlar çalışmada tutulmuş ve sonraki analizlere dahil edilmiştir. Biyolojik örnekler, hayvan dokuları, formaldehit bazlı fiksatifler ve diğer kimyasal atık malzemeler uygun kişisel koruyucu donanım kullanılarak yönetilmiştir. Tüm biyolojik ve kimyasal atıkların imhası, kurumsal biyogüvenlik ve tehlikeli atık yönetimi gerekliliklerine uygun olarak gerçekleştirilmiştir.
Biyokimyasal analizler
Biyokimyasal ölçümler, her hayvandan toplanan serum, EDTA ile antikoagüle edilmiş kan ve sol böbrek dokusu homojenatları kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Prosedürler, her parametre için kullanılan biyolojik matrise göre aşağıda sunulmuştur. Serum; üre, kan üre azotu (BUN), kreatinin, süperoksit dismutaz (SOD) ve malondialdehit (MDA) açısından analiz edilmiştir. Üre, BUN ve kreatinin renal fonksiyon indeksleri olarak kullanılırken, SOD aktivitesi ve MDA konsantrasyonu oksidatif stres parametreleri olarak değerlendirilmiştir. Serum üre ve BUN değerleri, aynı enzimatik üreaz–glutamat dehidrogenaz analizi kullanılarak elde edilmiştir. Bu yöntemde, üre, üreaz tarafından hidroliz edilerek amonyak üretilmiş, amonyak daha sonra glutamat dehidrogenaz varlığında 2-oksoglutarat ve indirgenmiş nikotinamid adenin dinükleotit (NADH) ile reaksiyona girmiştir. Kullanılan analitik yöntem, enzimatik üreaz–glutamat dehidrogenaz kinetik analizidir. NADH tüketimi sonucu meydana gelen absorbans azalması, bir spektrofotometre kullanılarak kinetik olarak ölçülmüştür. Serum kreatinin konsantrasyonu, otomatik bir biyokimya analizörü kullanılarak kolorimetrik olarak ölçülmüştür. Serum SOD aktivitesi, aynı otomatik biyokimya analizöründe ticari olarak temin edilen bir analiz kiti kullanılarak kolorimetrik olarak ölçülmüştür. SOD analizi, ksantin–ksantin oksidaz sistemi tarafından süperoksit radikallerinin üretilmesine ve bunların renkli bir formazan ürünü oluşturmak üzere 2-(4-iyodofenil)-3-(4-nitrofenil)-5-feniltetrazolyum klorür ile reaksiyona girmesine dayanmaktadır. Bitiş noktası absorbansı 505 nm'de ölçülmüş ve SOD aktivitesi U/mL olarak ifade edilmiştir. Serum MDA konsantrasyonu, tiyobarbitürik asit reaksiyonu kullanılarak kolorimetrik olarak belirlenmiştir. Serum örnekleri, proteinleri çöktürmek için soğuk trikloroasetik asit ile karıştırılmış ve oluşan çökelti santrifügasyonla ayrılmıştır. Bu santrifügasyon işlemi 4 °C'de 5 dakika boyunca 7,500 × g hızda gerçekleştirilmiştir. Süpernatan, 90 °C'de 60 dakika boyunca tiyobarbitürik asit ile reaksiyona sokulmuş, soğutulmuş ve 532 nm'de ölçülmüştür. MDA konsantrasyonları ilgili kalibrasyon eğrisinden hesaplanmış ve nmol/mL olarak ifade edilmiştir. Glutatyon (GSH) analizi, EDTA ile antikoagüle edilmiş kan kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Proteinler trikloroasetik asit ile çöktürülmüş ve elde edilen proteinlerinden arındırılmış örnekler, modifiye edilmiş Ellman yöntemiyle kolorimetrik olarak analiz edilmiştir. Örnekler, pH 8.2'deki 500 mM Tris tamponunda 5,5′-ditiyobis(2-nitrobenzoik asit) (DTNB) ile birleştirilmiştir. GSH'nin tiyol gruplarının DTNB ile reaksiyonu renkli bir ürün oluşturmuş ve absorbans 412 nm'de kaydedilmiştir. Katalaz (CAT) aktivitesi, iki aşamalı kolorimetrik bir prosedür kullanılarak belirlenmiştir. Örnekler başlangıçta, katalazın suya ve moleküler oksijene dönüştürdüğü bilinen miktarda hidrojen peroksit ile inkübe edilmiştir. Enzimatik reaksiyon sonlandırıldıktan sonra, kalıntı hidrojen peroksit kromojenik bir reaktif kullanılarak ölçülmüştür. Absorbans 405 nm'de kaydedilmiş ve CAT aktivitesi U/mL olarak rapor edilmiştir. Renal doku ölçümleri için, korteks medulladan ayrılmadan her hayvanın sol böbreği karışık doku olarak kullanılmıştır. Prosedürde belirtildiği üzere, sağ böbrek yalnızca histopatolojik değerlendirme için saklanmıştır. Bireysel hayvanlara ait örnekler bağımsız olarak işlenmiş ve hiçbir aşamada havuzlanmamıştır. Her sol böbrek örneği, 1:10 (w/v) doku-tampon oranı kullanılarak pH 7.4'teki 50 mM fosfat tamponunda buz üzerinde homojenize edilmiştir. Her sıçan için bir adet hayvana özgü renal doku homojenatı oluşturulmuştur. Bu homojenatın ayrı alikotları, tüm parametrelerin aynı bireysel hayvandan türetilmesini sağlamak amacıyla farklı renal doku ölçümleri için kullanılmıştır. Elde edilen renal doku homojenatları 4 °C'de 10 dakika boyunca 14,000 × g hızda santrifüj edilmiştir. Santrifügasyonun ardından, her hayvandan elde edilen süpernatan ayrı ayrı toplanmış ve planlanan renal doku analizleri için alikotlara bölünmüştür. Renal doku süpernatanlarındaki tümör nekroz faktör-alfa (TNF-α), interlökin-1 beta (IL-1β), interlökin-6 (IL-6), sistatin C ve KIM-1 konsantrasyonları, sıçana özgü enzim bağlantılı immünosorbent analiz (ELISA) kitleri kullanılarak ölçülmüştür. Analizler, üretici protokollerine göre gerçekleştirilmiştir. İnkübasyon koşulları TNF-α, IL-1β, IL-6, sistatin C ve KIM-1 ELISA'ları için aynıdır. Her analiz için örnekler ve ELISA reaktifleri 37 °C'de 1 saat boyunca inkübe edilmiş; beş yıkama döngüsünden sonra substrat çözeltileri A ve B eklenmiş ve 37 °C'de 10 dakika boyunca inkübe edilmiştir. Kısaca; standartlar ve renal doku süpernatanları antikorla önceden kaplanmış kuyucuklara eklenmiş, ardından ilgili biyotinize tespit antikoru ve streptavidin–yaban horseradish peroksidaz konjugatı eklenmiştir. Belirtilen inkübasyon adımlarından sonra, bağlanmamış bileşenler otomatik bir mikroplaka yıkayıcı kullanılarak uzaklaştırılmıştır. Ardından substrat çözeltisi eklenmiş ve renk reaksiyonu asidik durdurma çözeltisi kullanılarak sonlandırılmıştır. Absorbans, bir mikroplaka okuyucu kullanılarak 450 nm'de ölçülmüş ve analit konsantrasyonları ilgili standart eğrilerden hesaplanmıştır. Renal doku ELISA ölçümleri duble olarak gerçekleştirilmiştir. Her analit için, tek bir hayvan düzeyinde değer elde etmek amacıyla iki teknik replika kuyucuğun ortalaması hesaplanmıştır. Aynı hayvana özgü homojenattan elde edilen teknik replika kuyucuklar ve ayrı alikotlar bağımsız gözlemler olarak değerlendirilmemiştir. Tüm biyokimyasal ölçümler, standartlaştırılmış analize özgü koşullar altında gerçekleştirilmiştir. Serum, EDTA ile antikoagüle edilmiş kan ve renal doku örnekleri, ilgili analitik yöntemlerin gerekliliklerine göre ayrı ayrı işlenmiştir. Biyokimyasal analizleri gerçekleştiren araştırmacılar, grup atamalarına karşı kör tutulmuştur. Her bir serum örneği, kan örneği, böbrek örneği, homojenat alikotu veya teknik replika kuyucuğu yerine, bireysel hayvan deneysel birim olarak kabul edilmiştir. Buna göre, her deneysel grup için istatistiksel analize altı bağımsız hayvan düzeyinde gözlem dahil edilmiştir.
Histopatolojik işlem ve skorlama
Sağ böbrek örnekleri, rutin histolojik işlemlerle mikroskobik değerlendirme için hazırlandı. Her hayvandan alınan sağ böbreğin tamamı, oda sıcaklığında 72 saat boyunca %10 nötr tamponlu formaldehit içinde bekletildi. Fiksasyondan sonra, doku dehydrasyonu sırasıyla %50, %70, %80, %96 ve %100'lük etanol çözeltilerinde, her konsantrasyonda 1 saat uygulanarak gerçekleştirildi. Örnekler, parafin gömme işleminden önce, her biri 30 dakika süren iki ksilen banyosuna maruz bırakıldı. Döner mikrotom kullanılarak, parafin bloklardan hem renal korteksi hem de dış medullayı içeren 5 µm kalınlığında kesitler alındı.
Hematoksilen ve eozin (HE) boyaması için kesitler deparafinize edilip yeniden hidrate edilmiş, 5 dk boyunca hematoksilene maruz bırakılmış ve ardından 5 dk boyunca akan musluk suyu altında yıkanmıştır. Diferansiyasyon için asit alkol kullanılmış, ardından kesitler 1 dk boyunca amonyaklı suda mavileştirilmiş ve 2 dk boyunca eozin ile karşıt boyanmıştır. Boyanan kesitler daha sonra artan alkol konsantrasyonlarında dehidrate edilmiş, ksilen ile şeffaflaştırılmış ve lameller altında kalıcı olarak monte edilmiştir.
Masson trikrom boyaması için ayrılan kesitler benzer şekilde deparafinize edildi ve rehidrate edildi. 56 °C'de 60 dk boyunca mordan işlemi uygulandı ve ardından 10 dk boyunca akan musluk suyunda durulama yapıldı. Kesitler daha sonra sırasıyla 10 dk Weigert demir hematoksilin, 15 dk Biebrich scarlet–asit fuksin çözeltisi, 10 dk fosfotungstik asit çözeltisi ve 10 dk anilin mavisi çözeltisi ile işleme tabi tutuldu. %1 asetik asitte 5 dk bekletildikten sonra kesitler dehydrate edildi, ksilen ile şeffaflaştırıldı ve lamellerle kapatıldı.
Mikroskobik değerlendirme öncesinde, boyamanın yeterliliği her yöntem için ayrı ayrı doğrulanmıştır. Çekirdek detaylarının ve sitoplazmik kontrastın net bir şekilde ayırt edilebildiği HE-boyalı kesitler uygun kabul edilirken, bağ dokusu yapılarının belirgin bir şekilde görüntülenebildiği Masson trikrom boyalı kesitler kabul edilmiştir. Her hayvan için üç HE-boyalı kesit ve üç Masson trikrom boyalı kesit incelenmiştir. Her kesitte, 40× objektif kullanılarak rastgele seçilen beş mikroskobik alan değerlendirilmiştir. Buna göre, her hayvan için boyama yöntemi başına 15 mikroskobik alan incelenmiştir. Tüm mikroskobik incelemeler, tüm hayvanlar ve deneysel gruplar genelinde aynı objektif ve standartlaştırılmış değerlendirme koşulları kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Masson trikrom boyalı kesitler; interstisiyel kollajen dağılımı ve birikimi, hücre dışı matris akümülasyonu ve tubulointerstisiyel mimari açısından kalitatif olarak değerlendirilmiştir. Bu kesitler, yarı-kantitatif 0–3 histopatolojik hasar skorlarının oluşturulmasında kullanılmamıştır. Temsili HE ve Masson trikrom boyalı fotomikroğraflar 40× objektif kullanılarak elde edilmiş ve her temsili görüntüye 100 µm ölçek çubuğu eklenmiştir. Bu fotomikroğraflar görselleştirme amacıyla elde edilmiş olup, histopatolojik skorlama veya istatistiksel analizlerde bağımsız gözlemler olarak değerlendirilmemiştir. Tüm histopatolojik değerlendirmeler, deneysel grup kimliklerine karşı kör olan deneyimli bir patolog tarafından yürütülmüştür. Tek bir kör değerlendirici kullanılması, değerlendirme yanlılığını ve gözlemciler arasındaki farklılıklardan kaynaklanan varyasyonu sınırlamayı amaçlamıştır. Tübüler nekroz, tübüler dilatasyon, hücresel dejenerasyon ve vasküler konjesyon, daha önce yayınlanmış böbrek hasarı modellerinden uyarlanan bir sisteme göre28,29 HE-boyalı böbrek kesitlerinde yarı-kantitatif olarak skorlanmıştır. Her parametre için skorlar; sırasıyla yok, hafif, orta ve şiddetli histopatolojik hasara karşılık gelen 0 ile 3 arasında değişmiştir. Her hayvan için, üç HE-boyalı kesitin her birinde incelenen beş mikroskobik alandan elde edilen bulgular (toplamda 15 alan), her bir histopatolojik parametre için tek bir 0–3 skoru atamak amacıyla topluca değerlendirilmiştir. Böylece, her hayvan; tübüler nekroz, tübüler dilatasyon, hücresel dejenerasyon ve vasküler konjesyon için birer skor sağlamıştır. Histolojik kesitler ve mikroskobik alanlar, hayvan içi alt örnekler olarak ele alınmış ve bağımsız gözlemler olarak kabul edilmemiştir. Her kesit içerisinde, hayvanlar ve deneysel gruplar arasında anatomik örneklemeyi standartlaştırmak için karşılaştırılabilir renal kortikal ve dış medüller bölgelerden rastgele mikroskobik alanlar seçilmiştir. Deneysel birim olarak her bir böbrek, histolojik kesit veya mikroskobik alan yerine bireysel hayvan kabul edilmiştir. Buna göre, her deneysel grup için istatistiksel analize hayvan düzeyinde altı bağımsız gözlem dahil edilmiştir. Tablo 3'te sunulan değerler, her deneysel gruptaki altı hayvanın bireysel hayvan düzeyindeki skorlarından hesaplanan grup ortalamalarını temsil etmektedir.
İstatistiksel analiz
İstatistiksel analizler, istatistiksel analiz yazılımı kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Tüm istatistiksel analizler için bireysel hayvan, deneysel birim olarak kabul edilmiştir. Her deneysel grup altı bağımsız hayvandan oluşmuştur (grup başına n = 6). Teknik tekrarlar, analiz kuyucukları, doku kesitleri ve mikroskobik alanlar bağımsız gözlemler olarak değerlendirilmemiş ve istatistiksel örneklem boyutunu artırmak için kullanılmamıştır. Sürekli değişkenler ortalama ± standart sapma (SD) olarak sunulmuştur. Normallik, her bir deneysel grup içinde Shapiro–Wilk testi kullanılarak ayrı ayrı değerlendirilmiş ve varyansların homojenliği Levene testi ile incelenmiştir. Gruplar arası örneklem boyutlarının eşit olduğu tam dengeli deneysel tasarım nedeniyle, grupları karşılaştırmak için tek yönlü varyans analizi (ANOVA) kullanılmıştır. İkili karşılaştırmalar Duncan post hoc çoklu karşılaştırma testi kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Potansiyel aykırı değerler, kutu grafiklerinin grafiksel incelemesi ve bireysel gözlemlerin kontrolü ile değerlendirilmiştir. Hiçbir gözlem, bir ölçüm hatasını veya geçersiz bir deneysel sonucu temsil ettiği şeklinde değerlendirilmemiş ve istatistiksel nedenlerle herhangi bir veri noktası hariç tutulmamıştır. p-değeri < 0.05 olan sonuçlar istatistiksel olarak anlamlı kabul edilmiştir.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Serum böbrek fonksiyon belirteçleri (üre, kan üre azotu ve kreatinin)
Bu çalışmanın deneysel tasarımı, hayvan gruplandırması, tedavi çizelgesi ve örnek toplama zaman çizelgesi Şekil 1'de özetlenmiştir. Serum üre, BÜA ve kreatinin düzeyleri arasında gruplar arasında istatistiksel olarak anlamlı farklılıklar gözlemlenmiştir (p = 0.003, p = 0.003 ve p = 0.002, sırasıyla). Kontrol grubunda ortalama ser...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Bu deneysel CI-AKI çalışması, kontrast sonrası montelukast, NAC veya bunların kombinasyonu ile yapılan tedavmenin böbrek fonksiyonları, oksidatif stres parametreleri, inflamatuar yanıtlar, böbrek hasarı biyobelirteçleri ve histopatolojik sonuçlar üzerindeki etkilerini değerlendirmiştir. Kontrast maruziyeti, serum üre, BUN ve kreatinin seviyelerinde önemli artışlara neden olmuş ve oksidatif stres parametreleri ile inflamatuar biyobelirteçlerdeki olumsuz değişikliklerle birlikte seyretmiştir. Artan KIM-1 ve sistatin C sevi...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar, herhangi bir çıkar çatışması olmadığını beyan ederler. Bu taslağın hazırlanması sırasında, yapay zeka destekli araçlar yalnızca dil düzenlemesi ve dilbilgisi düzeltmeleri için kullanılmıştır. Verilerin oluşturulması, analizi veya yorumlanmasında ya da herhangi bir şekil, tablo veya grafik unsurun oluşturulmasında yapay zeka araçları kullanılmamıştır. Yazarlar, taslağın içeriğinin tüm sorumluluğunu üstlenmektedir.
YAZARLARIN KATKILARI:
YS, CS ve OK çalışmanın kavramlaştırılmasına ve tasarımına katkıda bulundu. YS deneysel prosedürleri ve veri toplama sürecini gerçekleştirdi. OK histopatolojik incelemeleri yürüttü. YS ve CS istatistiksel analizleri gerçekleştirdi ve verileri yorumladı. YS taslağı hazırladı. Tüm yazarlar makaleyi kritik olarak gözden geçirdi ve son versiyonu onayladı.
Teşekkürler
Bu çalışma, Kırşehir Ahi Evran Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Koordinasyon Birimi tarafından desteklenmiştir (Proje No: TIP.A3.26.006).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Otomatik Strip Yıkayıcı | Bio-Tek Instruments, USA | ELx50 | Otomatik ELISA plak yıkama. |
| Mikroplaka Okuyucu | Bio-Tek Instruments, USA | ELx800 | ELISA absorbans ölçümleri. RRID:SCR_028651 |
| %10 Nötral Tamponlu Formalin | Merck | Kayıt dışı | Histopatoloji için doku fiksasyonu. |
| Masaüstü Santrifüj | Nüve | NF048 | Numune hazırlama ve santrifügasyon. |
| Karboksimetilselüloz (CMC) | Sigma-Aldrich, USA | C5678 | Montelukast süspansiyonu için kullanılan taşıyıcı. |
| CAT Kit Universal | Otto Scientific | Otto3051 | Mindray BS-400 kimya analizörü kullanılarak serumdaki CAT aktivitesinin kolorimetrik ölçümü. |
| Dijital Homojenizatör | Daihan Scientific | HG-15D | Doku homojenizasyonu. |
| Eozin Y (Sarımsı) | Merck | 1.15935.0025 | HE boyama. |
| Harris Hematoksilin Solüsyonu | BSLAB | BS-002 | HE boyama. |
| Indometasin | Sigma-Aldrich, USA | I7378 | CI-AKI indüksiyonu için kullanıldı. |
| Iohexol (Omnipaque 300) | GE HealthCare | Kayıt dışı | CI-AKI'yı indüklemek için kullanılan kontrast madde. |
| Ketamin hidroklorür (Ketalar) | Pfizer, USA | Kayıt dışı | Numune toplamadan önce genel anestezi. |
| Işık Mikroskobu (Nikon Eclipse) | Nikon | Ni-U | Histopatolojik inceleme ve görüntüleme. RRID:SCR_024835 |
| L-NAME (Nω-nitro-L-arginin metil ester) | Sigma-Aldrich, USA | N5751 | CI-AKI indüksiyonu için kullanıldı. |
| Masson Trikrom Boyama Kiti | MOSLAB, Türkiye | BKMTO001 | Masson trikrom boyama. |
| Mindray Kimya Analizörü | Mindray | BS-400 | Biyokimyasal analizler. |
| Montelukast sodyum | Sigma-Aldrich, USA | SML0101 | Tedavi olarak gavage yoluyla oral olarak uygulandı. |
| N-asetilsistein (ASIST 300 mg/2 mL) | MAC  laç, Türkiye | Kayıt dışı | Tedavi olarak intraperitonal olarak uygulandı. |
| Sıçan Cystatin C ELISA Kiti | BT Lab, China | E0145Ra | Renal doku süpernatantlarında cystatin C'nin ELISA ölçümü. |
| Sıçan IL-1β ELISA Kiti | BT Lab, China | E0119Ra | Renal doku süpernatantlarında IL-1β'nin ELISA ölçümü. |
| Sıçan IL-6 ELISA Kiti | BT Lab, China | E0135Ra | Renal doku süpernatantlarında IL-6'nın ELISA ölçümü. |
| Sıçan KIM-1 ELISA Kiti | BT Lab, China | E0549Ra | Renal doku süpernatantlarında KIM-1'in ELISA ölçümü. |
| Sıçan TNF-α ELISA Kiti | BT Lab, China | E0764Ra | Renal doku süpernatantlarında TNF-α'nın ELISA ölçümü. |
| Paslanmaz Çelik Besleme İğnesi (22 G Oral Gavage Kanülü) | Instech Laboratories, USA | Kayıt dışı | Oral gavage uygulaması. |
| Standart pelet kemirgen yemi (Optima) | Optima, Türkiye | Kayıt dışı | Lot no. 58931. Besin bileşimi: %24 ham protein, %3,94 ham selüloz, %5,08 ham yağ, %8,8 ham kül, %1,44 lizin, %0,61 metiyonin, %1,14 kalsiyum, %0,89 fosfor ve %0,28 sodyum. |
| Universal Kreatinin Kiti | Otto Scientific | OttoBC139 | Serumda kreatininin kolorimetrik ölçümü. |
| Universal GSH Kiti | Otto Scientific | Otto3053 | Modifiye Ellman yöntemi kullanılarak EDTA-antikoagüle kandaki GSH'nin kolorimetrik ölçümü. |
| Universal MDA Kiti | Otto Scientific | Otto1001 | ELx800 mikroplaka okuyucu kullanılarak serumda MDA'nın kolorimetrik ölçümü. |
| Universal SOD Kiti | Otto Scientific | Otto3047 | Mindray BS-400 kimya analizörü kullanılarak serumdaki SOD aktivitesinin kolorimetrik ölçümü. |
| Universal Üre Kiti | Otto Scientific | OttoBC157 | Serumda üre ve BUN'un kolorimetrik ölçümü. |
| Ksilazin hidroklorür (Rompun) | Bayer, Germany | Kayıt dışı | Numune toplamadan önce genel anestezi. |
Kaynaklar
- Wang Z, Wang Q, Gong X. Unveiling the mysteries of contrast-induced acute kidney injury: new horizons in pathogenesis and prevention. Toxics. 2024;12(8):620.
- Cho E, Ko GJ. Pathophysiology and management of radiocontrast-induced nephropathy. Diagnostics. 2022;12(1):180.
- Shuka N, et al. Contrast-induced nephropathy in interventional cardiology: incidence, risk factors, and identification of high-risk patients. Cureus. 2023;15(12):e51283.
- Shams E, Mayrovitz HN. Contrast-induced nephropathy: a review of mechanisms and risks. Cureus. 2021;13(5):e14842.
- Mehran R, et al. A simple risk score for prediction of contrast-induced nephropathy after percutaneous coronary intervention: development and initial validation. J Am Coll Cardiol. 2004;44(7):1393-1399.
- Heyman SN, Reichman J, Brezis M. Pathophysiology of radiocontrast nephropathy: a role for medullary hypoxia. Invest Radiol. 1999;34(11):685-691.
- Geenen RWF, Kingma HJ, van der Molen AJ. Contrast-induced nephropathy: pharmacology, pathophysiology and prevention. Insights Imaging. 2013;4:811-820.
- Manisaligil YA, et al. Assessment of Rac1 and β-PAK expressions in a mouse model for contrast-induced nephropathy. J Basic Clin Health Sci. 2020;4(3):230-236.
- Simsek O, et al. Preventative effect of montelukast in mild to moderate contrast-induced acute kidney injury in rats via NADPH oxidase 4, p22phox and nuclear factor kappa-B expressions. Int Urol Nephrol. 2025;57(7):2313-2325.
- Banda J, et al. Biomarkers for diagnosis and prediction of outcomes in contrast-induced nephropathy. Int J Nephrol. 2020;2020:8568139.
- Zisis IE, et al. Renoprotective effect of vardenafil and avanafil in contrast-induced nephropathy: emerging evidence from an animal model. J Pers Med. 2022;12(5):670.
- Walker H, et al. Systematic review and meta-analysis of prophylaxis use with intravenous contrast exposure to prevent contrast-induced nephropathy. Eur J Radiol. 2022;153:110368.
- Hossain MA, et al. Contrast-induced nephropathy: pathophysiology, risk factors, and prevention. Saudi J Kidney Dis Transpl. 2018;29(1):1-9.
- Tepel M, et al. Prevention of radiographic-contrast-agent-induced reductions in renal function by acetylcysteine. N Engl J Med. 2000;343(3):180-184.
- Liu R, et al. N-acetylcysteine for the prevention of contrast-induced nephropathy: a systematic review and meta-analysis. J Gen Intern Med. 2005;20(2):193-200.
- Zhu R, et al. Association of N-acetylcysteine use with contrast-induced nephropathy: an umbrella review of meta-analyses of randomized clinical trials. Front Med (Lausanne). 2023;10:1235023.
- Sandilands EA, et al. Acetylcysteine has no mechanistic effect in patients at risk of contrast-induced nephropathy: a failure of academic clinical science. Clin Pharmacol Ther. 2022;111(6):1222-1238.
- Sarmadian R, et al. The renoprotective potential of montelukast: a scoping review. Ann Med Surg (Lond). 2024;86(6):3568-3576.
- Kokate D, Marathe P. Evaluation of effect of montelukast in the model of streptozotocin-induced diabetic nephropathy in rats. Indian J Endocrinol Metab. 2024;28(1):47-54.
- Mojtahedi SY, Ghodsi M, Pourpashang P. Renoprotective efficacy of montelukast: an overview on recent advancements. J Nephropharmacol. 2025;14(1):e12759.
- Sener G, et al. Chronic renal failure-induced multiple-organ injury in rats is alleviated by the selective CysLT1 receptor antagonist montelukast. Prostaglandins Other Lipid Mediat. 2007;83(4):257-267.
- Sener G, et al. Montelukast protects against renal ischemia/reperfusion injury in rats. Pharmacol Res. 2006;54(1):65-71.
- Li LP, et al. Intrarenal oxygenation by blood oxygenation level-dependent MRI in contrast nephropathy model: effect of the viscosity and dose. J Magn Reson Imaging. 2012;36(5):1162-1167.
- Liu K, et al. A novel rat model of contrast-induced nephropathy based on dehydration. J Pharmacol Sci. 2019;141(1):49-55.
- Alshogran OY, Al Tahrawi AY, Nusair SD. Exploring the effects of edaravone in rats with contrast-induced acute kidney injury. Life Sci. 2022;309:121006.
- Suddek GM. Montelukast ameliorates kidney function and urinary bladder sensitivity in experimentally induced renal dysfunction in rats. Fundam Clin Pharmacol. 2013;27(2):186-191.
- Aydin A, et al. The examination of the nephroprotective effect of montelukast sodium and N-acetylcysteine in renal ischemia with dimercaptosuccinic acid imaging in a placebo-controlled rat model. Acta Cir Bras. 2020;35(9):e202000905.
- Kara O, Kilitci A, Daglioglu G. Protective effect of resveratrol on cisplatin-induced damage in rat kidney. Cukurova Med J. 2022;47(3):990-995.
- Pandir D, Kara O. Cisplatin-induced kidney damage and the protective effect of bilberry (Vaccinium myrtillus L.): an experimental study. Turk J Med Sci. 2013;43(6):951-956.
- Iordache AM, et al. Phosphodiesterase-5 inhibitors ameliorate structural kidney damage in a rat model of contrast-induced nephropathy. Food Chem Toxicol. 2020;143:111535.
- Morcos SK, Thomsen HS, Webb JA. Contrast-media-induced nephrotoxicity: a consensus report. Eur Radiol. 1999;9:1602-1613.
- Rudnick MR, et al. Nephrotoxicity of ionic and nonionic contrast media in 1196 patients: a randomized trial. Kidney Int. 1995;47(1):254-261.
- Modi K, Padala SA, Gupta M. Contrast-induced nephropathy. In: StatPearls [Internet]. Treasure Island (FL): StatPearls Publishing; 2025 Jan–. Updated 2025 May 5. Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK448066/
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.