Araştırma makalesi

Yangjing Kapsülü, IncRNA NONMMUT031883.2'yi Yukarı Regüle Ederek QKI-5/p38 MAPK Yolağını İnhibe Etmek Suretiyle Farelerdeki Spermatogenik Disfonksiyonu Hafifletmektedir

11 görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/73166

⸱

28 Ağustos 2026

 ,  ,  ,  , 
1Department of Andrology, The Affiliated Hospital of Nanjing University of Chinese Medicine/Jiangsu Provincial Hospital of Chinese Medicine, 2Medical College of Qinghai University, 3Department of Traditional Chinese Medicine, Zhongda Hospital, School of Medicine, Southeast University, 4Anorectal Surgery, Jiangbei Branch of Zhongda Hospital, School of Medicine, Southeast University, 5Department of Andrology, Shaanxi Provincial Hospital of Traditional Chinese Medicine

Bu makalede

Özet

Bu çalışma, Yangjing Kapsül'ün siklofosfamid kaynaklı spermatojenik disfonksiyon üzerindeki koruyucu etkilerini değerlendirmekte ve lncRNA NONMMUT031883.2/QKI-5/p38 MAPK sinyal yolunun bu süreçteki rolünü incelemektedir.

Özet

Spermatojenik disfonksiyon, erkek infertilitesinin önemli bir nedenidir ve siklofosfamid (CP), anormal spermatogoniyal apoptozu tetikleyerek spermatogenezi bozabilir. Yangjing Kapsülü (YC), reprodüktif fonksiyonu iyileştirmek için kullanılmıştır, ancak temelindeki moleküler mekanizma belirsizliğini korumaktadır. Bu çalışma, CP ile indüklenen bir spermatojenik disfonksiyon fare modelinde ve GC-1 spermatogoniyal hücrelerinde YC'nin koruyucu etkilerini araştırmıştır. Sperm sayısı ve motilitesi, erkek fertilitesi, serum seks hormonu seviyeleri ile testis ve epididimlerdeki histopatolojik değişiklikler değerlendirilmiştir. GC-1 hücrelerinde hücre canlılığı, laktat dehidrogenaz salınımı, apoptoz ve apoptozla ilişkili proteinler analiz edilmiştir. lncRNA NONMMUT031883.2, Quaking-5 (QKI-5) ve p38 mitojenle aktive olan protein kinaz (MAPK) sinyallenmesini incelemek için kantitatif ters transkripsiyon polimeraz zincir reaksiyonu, RNA pull-down analizleri, immünofloresan ve Western blotting yöntemleri kullanılmıştır. YC, CP ile tedavi edilen farelerde sperm kalitesini, serum seks hormonu seviyelerini, reprodüktif organ morfolojisini, testiküler histopatolojiyi ve fertiliteyi doz bağımlı olarak iyileştirmiştir. GC-1 hücrelerinde YC, hücre canlılığını artırmış, hücresel hasarı ve apoptozu azaltmıştır. LncRNA NONMMUT031883.2, QKI-5 ile fiziksel olarak etkileşime girmiş ve YC tedavisi, lncRNA NONMMUT031883.2 ekspresyonunu artırırken QKI-5 ekspresyonunu ve p38 fosforilasyonunu azaltmıştır. YC tedavisi, GC-1 hücrelerinde lncRNA NONMMUT031883.2 knockdown ile indüklenen apoptozu inhibe etmiş, buna karşın QKI-5 aşırı ekspresyonu YC'nin anti-apoptotik etkilerini azaltmıştır. Bu bulgular, YC'nin CP ile indüklenen spermatojenik disfonksiyonu hafiflettiğini ve koruyucu etkilerinin lncRNA NONMMUT031883.2/QKI-5/p38 MAPK yolunun düzenlenmesi aracılığıyla gerçekleştiğini göstermektedir.

Giriş

Spermatojenik disfonksiyon, erkek üreme sistemindeki sperm üretimi, olgunlaşması veya işlevindeki anormalliklerin neden olduğu üreme bozukluğunu ifade eder. Bu durum, azalmış sperm sayısı ve hareketliliği ile artmış sperm deformite oranı ile karakterize edilir1,2. Spermatojenik disfonksiyonun patogenezi karmaşıktır; genetik faktörler, otoimmün bozukluklar, çevresel toksinler, kemoterapi kaynaklı hasarlar ve üreme organı lezyonları ile ilişkilidir3-5. Siklofosfamid (CP) gibi kemoterapötik ilaçlar, testiküler seminifer tübüllere doğrudan zarar verebilir ve spermatogonal apoptozu tetikleyerek erkek spermatojenik disfonksiyonuna katkıda bulunabilir6,7. Klinik müdahaleler olarak günümüzde hormon replasman tedavisi, antioksidan takviyeleri ve yardımcı üreme teknolojileri kullanılmaktadır. Ancak, bu yaklaşımların etkinliği tutarsızdır ve önemli yan etkileri vardır8,9,10. Bu nedenle, güvenli ve etkili müdahalelerin belirlenmesi ve bunların moleküler hedeflerinin netleştirilmesi, spermatojenik disfonksiyonu olan hastalarda fertilite sonuçlarını iyileştirmek açısından klinik olarak önemlidir.

Çin bitkisel tıbbı, çok hedefli özellikleri ve nispeten düşük toksisitesi nedeniyle, erkek üreme fonksiyonlarını koruma ve spermatojenik disfonksiyonu tedavi etme konusunda potansiyel göstermiştir11,12. Yangjing Kapsülü (YC); Rehmannia glutinosa, Epimedium, plasenta, Polygonatum sibiricum, Angelica sinensis ve diğer Çin bitkisel ilaçlarından oluşan geleneksel bir Çin patentli ilacıdır. Böbreği ve özü güçlendirmek, kanı ve iliği beslemek ve üreme fonksiyonunu düzenlemek için kullanılır13. Önceki çalışmalar, YC'nin erkek hayvanlarda seks hormonu seviyelerini düzenleyebildiğini, sperm kalitesini artırabildiğini, testis dokusu hasarını onarabildiğini ve kimyasal maddelerin neden olduğu üreme hasarına karşı koruma sağlayabildiğini göstermiştir14,15. Spermatogonyal hücreler spermatogenezin temelini oluşturur ve anormal spermatogonyal apoptoz, spermatojenik disfonksiyonun gelişiminde merkezi bir olaydır16. YC'nin ayrıca spermatogonyal canlılığı artırdığı, S fazındaki hücre oranını yükselttiği ve apoptozu inhibe ettiği bildirilmiştir17. Ancak, CP kaynaklı spermatojenik disfonksiyondaki koruyucu etkileri ve spesifik moleküler mekanizmaları henüz netlik kazanmamıştır.

Uzun kodlamayan RNA'lar (lncRNA'lar), protein kodlama kapasitesine sahip olmayan 200 nükleotitten daha uzun RNA molekülleridir18. LncRNA'lar; kromozomal susturma, kromatin modifikasyonu, genomik imprinting ve transkripsiyonel aktivasyon dahil olmak üzere çeşitli mekanizmalar aracılığıyla gen ekspresyonunu düzenleyebilirler19,20. RNA-bağlayıcı protein Quaking-5 (QKI-5), aşağı akış genlerinin alternatif eklenmesini (alternative splicing) düzenleyerek hücre proliferasyonu ve apoptoz dahil olmak üzere fizyolojik ve patolojik süreçlerde yer alır21. p38 mitojenle aktive olan protein kinaz (MAPK) yolu, apoptoz düzenlemesinde görev alır ve ayrıca erkek fertilitesi ile testiküler gelişimde önemli bir rol oynar22,23. Önceki bir çalışma, QKI-5 aşırı ekspresyonunun hepatosellüler karsinom hücrelerinde p38 MAPK yolunu aktive ettiğini göstermiştir24. Ek olarak, lncRNA NONMMUT074098.2'nin spermatogonyumlarda QKI-5'e bağlandığı, buna karşın QKI-5 nakavtının p38 MAPK yolunu inhibe ettiği ve spermatogoniyal apoptozu azalttığı gösterilmiştir25. Bu çalışma, YC'nin lncRNA NONMMUT031883.2 ekspresyonunu ve QKI-5/p38 MAPK sinyal eksenini düzenleyip düzenlemediğini, böylece anormal spermatogoniyal apoptozu azaltıp azaltmadığını ve CP kaynaklı spermatojenik disfonksiyonu hafifletip hafifletmediğini araştırmak için CP kaynaklı bir fare spermatojenik disfonksiyon modeli kullanmıştır (Şekil 1). Amaç, YC'nin spermatogenez üzerindeki koruyucu etkilerinin altında yatan moleküler mekanizmayı aydınlatmak ve erkek üreme fonksiyonunu korumadaki farmakolojik rolüne ilişkin anlayışı genişletmektir.

figure-introduction-1
Şekil 1: Deneysel tasarımın şematik diyagramı. Üst panel, GC-1 spermatogonial hücrelerdeki in vitro deneyleri özetlemektedir. Apoptoz ve hücresel hasarı indüklemek için lncRNA NONMMUT031883.2 nakavt (knockdown) işlemi uygulanmış, ardından apoptoz ve hücre hasarı üzerindeki etkilerini değerlendirmek için QKI-5 nakavtı gerçekleştirilmiştir. Alt panel, siklofosfamid (CP)-indüklü fare spermatojenik disfonksiyon modellerindeki in vivo deneyleri özetlemektedir. Farelere Yangjing Kapsül tedavisi ve/veya lncRNA NONMMUT031883.2 veya QKI-5 müdahalesi uygulanmıştır. Ardından fertilite, serum hormon seviyeleri, testis ve epididim dokuları, sperm süspansiyonu, sperm rezervleri, sperm kalitesi ve testis histopatolojik hasarı değerlendirilmiştir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Protokol

Tüm hayvan deneyleri, ARRIVE kılavuzlarına ve National Institutes of Health Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu'na uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Tüm deneysel protokoller, Southeast University Hayvan Etik Komitesi tarafından incelenmiş ve onaylanmıştır (onay no. 20230216022).

1. YC içeren serumun hazırlanması
İki adet Yangjing Kapsülü (YC; kapsül başına 0.5 g) açıldı ve kapsül içeriğinden 0.8 g tartıldı. Final hacim 10 mL olacak şekilde normal salin eklendi ve 80 mg/mL'lik bir süspansiyon hazırlamak için karışım iyice vortekslendi. 22–25 g ağırlığında ve 8 haftalık, spesifik patojen taşımayan erkek BALB/c fareler; 22 °C sıcaklıkta, %55–60 nemde, 12 saatlik ışık/karanlık döngüsünde, yem ve suya ad libitum erişim sağlanarak beslendi. 1 haftalık aklimatizasyon süresinin ardından farelere, 5 ardışık gün boyunca günde bir kez, 10 mL/kg hacimde, vücut ağırlığı başına 800 mg dozunda oral gavaj yoluyla YC verildi. Son uygulamadan iki saat sonra fareler, intraperitonal %1 sodyum pentobarbital ile anestezi altına alındı ve YC içeren serum hazırlamak için kan örnekleri toplandı. Serum 56 °C'de 30 dakika boyunca inaktive edildi, 0.22 µm'lik bir membrandan süzüldü ve kullanıma kadar −80 °C'de saklandı.

2. Hücre kültürü ve transfeksiyon
Fare GC-1 spermatogonyal hücreleri, %1 penisilin-streptomisin ve %10 fetal sığır serumu içeren DMEM içerisinde kültüre edildi. Tüm kültürler, %5 CO₂ (v/v) içeren bir atmosferde 37 °C'de tutuldu.

LncRNA-spesifik kısa saç tokası RNA (sh-lncRNA), bir QKI-5 aşırı ekspresyon plazmidi (OE-QKI-5), QKI-5 küçükleterek girişim yapan RNA (si-QKI-5) ve bunlara karşılık gelen negatif kontrolleri (sh-NC, OE-NC ve si-NC) sentezlenmiş ve oluşturulmuştur. GC-1 hücreleri, transfeksiyon reaktifi talimatlarına uygun olarak sh-lncRNA veya sh-NC, si-QKI-5 veya si-NC ya da OE-QKI-5 veya OE-NC ile transfekte edilmiştir. 48 saatlik inkübasyonun ardından, transfeksiyon verimliliği lncRNA NONMMUT031883.2 veya QKI-5 ekspresyonu ölçülerek değerlendirilmiştir.

sh-lncRNA + si-QKI-5 + etoposide grubu için, GC-1 hücreleri sh-lncRNA ve si-QKI-5 ile transfekte edilmiş ve ardından 12 saat boyunca 100 µM etoposide ile işleme tabi tutulmuştur26. Sonraki hücre canlılığı analizleri için, GC-1 hücreleri %5, %10 veya %20 YC içeren serum ile takviye edilmiş ortamda kültüre edilmiş ve sırasıyla düşük doz YC (L-YC), orta doz YC (M-YC) ve yüksek doz YC (H-YC) grupları olarak belirlenmiştir. YC içeren serum konsantrasyonları (%5, %10 ve %20 YC), öncül konsantrasyon gradyanı deneylerinin sonuçlarına göre belirlenmiştir. sh-lncRNA + H-YC + OE-NC ve sh-lncRNA + H-YC + OE-QKI-5 grupları için, GC-1 hücreleri 48 saat boyunca sh-lncRNA artı OE-NC veya sh-lncRNA artı OE-QKI-5 ile transfekte edilmiş ve ardından 24 saat boyunca %20 YC içeren seruma maruz bırakılmıştır.

3. Cell Counting Kit-8 deneyi
GC-1 hücreleri, 96 kuyucuklu plaklara kuyucuk başına 5 × 103 hücre olacak şekilde ekilmiş ve 24 saat boyunca kültüre edilmiştir. Hücre tutunmasını takiben, orijinal besiyeri YC içeren serum ile takviye edilmiş 100 µL tam besiyeri ile değiştirilmiş ve hücreler 6, 12 veya 24 saat boyunca inkübe edilmiştir. İnkübasyonun ardından, her kuyucuğa 10 µL Cell Counting Kit-8 reaktifi eklenmiş ve hücreler 37 °C'de, karanlıkta 2 saat boyunca inkübe edilmiştir. 450 nm'deki absorbans, bir mikroplaka okuyucu kullanılarak ölçülmüştür.

4. Laktat dehidrogenaz testi
sh-NC veya sh-lncRNA ile 48 saatlik transfeksiyondan sonra, GC-1 hücre kültür ortamı toplandı ve santrifüj ile süpernatant elde edildi. Laktat dehidrogenaz test kiti talimatlarına uygun olarak, süpernatant tespit çalışma çözeltisi ile nazikçe karıştırıldı ve 96 kuyucuklu bir plakaya aktarıldı. Plaka 25 °C'de, karanlıkta 30 dakika inkübe edildi. Bir mikroplaka okuyucu kullanılarak 490 nm'deki absorbans ölçüldü ve hücre hasarını değerlendirmek için laktat dehidrogenaz salınımı hesaplandı.

5. Calcein AM/propidium iyodür boyama
sh-NC veya sh-lncRNA ile 48 saatlik transfeksiyondan sonra, GC-1 hücre sağkalımı Calcein AM/propidium iyodür (PI) boyama kullanılarak değerlendirildi. Hücreler, 12 kuyucuklu plakalara kuyucuk başına 5 × 104 hücre olacak şekilde ekildi ve %60–70 konfluansa ulaşana kadar kültüre edildi. Hücreler fosfat tamponlu salin ile nazikçe durulandı ve her kuyucuğa 500 µL Calcein AM/PI boyama çözeltisi eklendi. Hücreler 37 °C'de karanlıkta 30 dakika inkübe edildi ve floresan mikroskobu altında gözlemlendi. Canlı ve ölü hücreler görüntü analiz yazılımı kullanılarak sayıldı ve sağkalan hücrelerin oranı hesaplandı.

6. Akış sitometrisi
GC-1 hücreleri santrifüj ile toplandı ve fosfat tamponlu salin ile nazikçe durulandı. Hücre peleti, 5 × 105 hücre/mL yoğunlukta 500 µL bağlanma tamponunda yeniden süspanse edildi. Ardından 5 µL'şer Annexin V-APC ve PI eklendi, süspansiyon iyice karıştırıldı ve 25 °C'de karanlıkta 10 dk inkübe edildi. Apoptoz, APC için 633/660 nm ve PI için 488/630 nm eksitasyon/emisyon dalga boyları kullanılarak akış sitometrisi ile analiz edildi. Apoptoz oranı, akış sitometrisi analiz yazılımı kullanılarak değerlendirildi.

7. Caspase-3 aktivite analizi
Belirtilen işlemlerden sonra, yaklaşık 1 × 106 GC-1 hücresi toplandı, durulandı ve fosfat tamponlu salin içerisinde yeniden süspanse edildi. Hücreler, caspase-3 aktivite analiz kiti içerisindeki 100 µL reaktif II ile karıştırıldı ve buz üzerinde 15 dk boyunca liz edildi. Santrifüjasyonun ardından, lizat süpernatantından 50 µL toplandı ve 40 µL reaktif I ile 10 µL reaktif III ile karıştırıldı. Karışım, 37 °C'de 2 sa boyunca inkübe edildi. 405 nm'deki absorbans bir mikroplaka okuyucu kullanılarak ölçüldü ve caspase-3 aktivitesi kit talimatlarına göre değerlendirildi.

8. RNA pull-down deneyi
lncRNA NONMMUT031883.2'nin sense ve antisense zincirleri, ilgili dizilime göre sentezlenmiş ve biotin ile işaretlenmiştir. Hücreler, buz üzerinde 30 dk boyunca immünopresipitasyon hücre lizis tamponunda lizize edilmiş ve protein içeren süpernatan santrifüjle toplanmıştır. Streptavidin manyetik boncuklar, RNA bağlama tamponu ile üç kez yıkanmış ve %1 sığır serum albümini içeren bağlama tamponunda 30 dk boyunca inkübe edilmiştir.

Ön işlemden geçirilmiş boncuklar, biotin işaretli problarla birleştirildi ve 25 °C'de 30 dk inkübe edildi. Bağlanmayan problar manyetik ayrıştırma ile uzaklaştırıldı. Ardından hücre lizat süpernatanı eklendi ve manyetik boncuk-RNA-protein kompleksleri oluşturmak için karışım 4 °C'de 4 sa boyunca inkübe edildi. Spesifik olmayan şekilde bağlanan proteinleri uzaklaştırmak için manyetik boncuklar yıkama tamponu ile üç kez yıkandı. Yıkama tamponu manyetik ayrıştırma ile uzaklaştırıldı ve 2× SDS örnek yükleme tamponu eklendi. Örnekler 95 °C'de 10 dk ısıtıldı ve sonraki Western blot analizi için süpernatan manyetik ayrıştırma ile toplandı.

9. Spermatojenik disfonksiyon fare modelinin oluşturulması
5 günlük alıştırma sürecinin ardından, spermatojenik disfonksiyon modeli oluşturmak için 22–25 g ağırlığında ve 8 haftalık, spesifik patojen taşımayan erkek BALB/c farelere 7 gün boyunca günde bir kez 50 mg/kg dozunda intraperitonal olarak siklofosfamid (CP) uygulanmıştır14,27. Başarıyla modelleme yapılan fareler, rastgele sayı tablosu kullanılarak CP, 200 mg/kg YC, 400 mg/kg YC, 800 mg/kg YC, 800 mg/kg YC + sh-NC ve 800 mg/kg YC + sh-lncRNA gruplarına her grupta altı fare olacak şekilde rastgele atanmıştır.

YC ile tedavi edilen gruplardaki farelere, 30 gün boyunca günde bir kez oral gavaj yoluyla ilgili dozda YC verilmiştir13. 800 mg/kg YC + sh-NC ve 800 mg/kg YC + sh-lncRNA grupları için, model başarıyla oluşturulduktan sonra fareler %2 izofluran inhalasyonu ile anestezi altına alınmıştır. Her farenin ayak çekme refleksinin kaybolduğu ve solunum hızının stabil olduğu onaylandıktan sonra, cerrahi bölge tıraş edilmiş ve povidon-iyod ile dezenfekte edilmiştir. Aseptik koşullar altında, genital bölgenin önünden deri ve vücut duvarı boyunca ventral orta hat insizyonu yapılmıştır. Vasküler hasardan kaçınmaya özen gösterilerek, epididimal yağ yastığı dikkatle manipüle edilerek testis açığa çıkarılmıştır. Bir mikromanipülatör kullanılarak seminifer tübüller görüntülenmiş ve bir mikroenjeksiyon iğnesi kullanılarak 1 µL adenoviral süspansiyon (1 × 1010 TU/mL) yavaşça enjekte edilmiştir28. İğne, enjeksiyondan sonra 5 dakika boyunca yerinde bırakılmış ve ardından yavaşça geri çekilmiş, hemostaz ise steril bir pamuklu çubukla sağlanmıştır. Aynı prosedür daha sonra karşı taraftaki testise uygulanmıştır. Ardından insizyon dikilmiş ve farelerin ameliyat sonrası ısıtma pedi üzerinde iyileşmesine izin verilmiştir. Kontrol farelerine günlük olarak gavaj ve enjeksiyon yoluyla eşit hacimde salin solüsyonu verilmiştir.

10. Fertilite değerlendirmesi
İlaç uygulaması tamamlandıktan sonra, her gruptaki erkek fareler 1:2 oranında dişi BALB/c fareleri ile 7 gün boyunca serbestçe çiftleştirilmiştir. Dişi farelerde vajinal tıkaç oluşumu günlük olarak izlenmiş ve kaydedilmiştir. Başarılı çiftleşme onaylandıktan sonra erkek fareler uzaklaştırılmış ve dişi fareler doğal doğum gerçekleşene kadar ayrı ayrı barındırılmıştır. Grup başına dokuz gebe dişi fare elde edilmiş ve analize dahil edilmiştir. Her gruptaki erkek fertiliteyi değerlendirmek için ortalama batın büyüklüğü kaydedilmiştir.

Deney süresinin sonunda fareler, 100 mg/kg dozunda intraperitoneal pentobarbital sodyum uygulanarak ötanize edildi. Bu ötanazi yöntemi, Southeast Üniversitesi Hayvan Etik Komitesi tarafından onaylanmıştır (onay no. 20230216022). Testisler ve epididimler dikkatlice ayrıldı, fotoğrafları çekildi ve tartıldı. Testis ve epididim indeksleri, organ ağırlığı/vücut ağırlığı olarak hesaplandı. Her fareden bir epididim toplandı, parçalara bölündü, 1 mL önceden ısıtılmış fosfat tamponlu salin (37 °C) içine yerleştirildi ve spermlerin dışarı çıkmasına izin vermek için 20 dk inkübe edildi29. Sperm süspansiyonu nazikçe karıştırıldı ve 10 µL sperm süspansiyonu önceden ısıtılmış bir kan hücresi sayım lamı üzerine yerleştirildi. Spermler, ışık mikroskobu altında 200× büyütmede manuel olarak sayıldı ve sonuçlar 106/L olarak ifade edildi. Ayrıca, toplam spermatozoon sayısına oranla progresif hareketli spermatozoonların yüzdesi, sperm motilitesi olarak hesaplandı13.

11. Seks hormonu düzeylerinin belirlenmesi
Her gruptaki farelerin orbital veninden kan toplandı ve 25 °C'de 30 dk boyunca bekletildi. Serum, 3.000 × g'de 10 dk santrifüj edilerek toplandı30. Serum testosteron, luteinizan hormon (LH) ve folikül uyarıcı hormon (FSH) düzeyleri, ilgili enzimle bağlanan immünosorbent assay kitleri kullanılarak ölçüldü.

12. RNA stabilitesi analizi
GC-1 hücreleri 96 kuyucuklu kültür plaklarına ekilmiş, si-QKI-5 veya si-NC ile transfekte edilmiş ve 48 saat boyunca kültüre edilmişti. Ardından 5 µg/mL konsantrasyonda Aktinomisin D eklenmiş ve hücreler 0, 3, 6 ve 9. saatlerde toplanmıştı. Toplam RNA izole edilmiş ve ters transkripsiyonu takiben kantitatif ters transkripsiyon polimeraz zincir reaksiyonu ile lncRNA NONMMUT031883.2'nin bağıl ekspresyon düzeyi belirlenmişti. Her bir zaman noktasındaki bağıl RNA düzeyi, 0. saatteki ekspresyon düzeyi %100 kabul edilerek hesaplanmıştı.

13. Kantitatif ters transkripsiyon polimeraz zincir reaksiyonu
GC-1 hücreleri ve fare testis dokuları fosfat tamponlu salin ile durulandı ve toplam RNA izolasyonu için lizlendi. AMV ters transkriptaz kullanılarak ters transkripsiyon ile tamamlayıcı DNA üretildi. Amplifikasyon şablonu olarak tamamlayıcı DNA kullanılarak, gerçek zamanlı PCR sistemi ve kantitatif PCR kiti ile polimeraz zincir reaksiyonu amplifikasyonu gerçekleştirildi. lncRNA NONMMUT031883.2 için iç referans olarak U6, QKI-5 için ise iç referans olarak GAPDH kullanıldı. Göreceli hedef gen ekspresyonu 2−ΔΔCt yöntemi kullanılarak hesaplandı25. lncRNA NONMMUT031883.2'nin hücre altı lokalizasyonunu belirlemek için RNA ayrıca sitoplazmik ve nükleer fraksiyonlardan ayrı ayrı izole edildi. Primer dizileri Tablo 1'de verilmiştir.

Genİleri primer (5' - 3')Ters primer (5' - 3')
QKI-5CTGTCATGCCAAACGGAACGATGGACACGCATATCGTG
GAPDHAGGTCGGTGTGAACGGATTTGTGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA
lncRNA NONMMUT031883.2CCACTGTGGCACATTGAAGTATTAAGTTAATGGGTGCTGTGTT
U6 RNACTCGCTTCGGCAGCACAAACGCTTCACGAATTTGCGT

Tablo 1: Kantitatif ters transkripsiyon polimeraz zincir reaksiyonu için kullanılan primer dizileri. lncRNA NONMMUT031883.2, QKI-5, U6 ve GAPDH için ileri ve geri primer dizileri 5′–3′ yönünde listelenmiştir.

14. Hematoksilin ve eozin boyama
Fare testis ve epididim dokuları %4 paraformaldehit içerisine daldırılmış ve 4 °C'de 24 sa boyunca fikse edilmiştir. Fosfat tamponlu salin ile durulandıktan sonra dokular, dereceli etanol serisi ileydehidre edilmiş, parafine gömülmüş ve 5 µm kalınlığında kesitler alınmıştır. Kesitler 60 °C'de 60 dk ısıtılmış ve ksilen içinde 30 dk boyunca dewaks edilmiştir.

Kademeli etanol serisi ile hidratasyonun ardından, kesitler 5 dk boyunca hematoksilen ile boyanmış, 10 sn boyunca hidroklorik asit-etanol diferansiyasyon çözeltisi ile işleme tabi tutulmuş, mavileştirme için musluk suyu ile yıkanmış ve 2 dk boyunca %1 eosin ile boyanmıştır. Kesitler daha sonra %95 etanol ve absolut etanol iley dehidrate edilmiş ve 30 dk boyunca ksilen ile şeffaflaştırılmıştır. Hava ile kurutmanın ardından kesitler nötr gum ile lam üzerine monte edilmiştir. Testis ve epididimlerdeki morfolojik değişiklikler mikroskop altında gözlemlenmiştir.

15. İmmünofloresan
Fare testis parafin kesitleri, dereceli bir etanol serisi ile dewaks ve hidratasyon işlemlerinden geçirilmiş, ardından pH 6.0 sitrat tamponunda mikrodalga yardımıyla antijen geri kazanımı uygulanmıştır. Kesitler oda sıcaklığına kendiliğinden soğuduktan sonra %0.3 Triton X-100 ile 10 dk inkübe edilmiştir. Kesitler, 25 °C'de 60 dk boyunca %5 sığır serum albümini ile bloke edilmiş, fosfat tamponlu salin ile durulanmış ve Ki67'ye karşı bir primer antikor ile 4 °C'de gece boyunca inkübe edilmiştir. Ertesi gün, florokrom işaretli bir sekonder immünoglobulin G antikoru uygulanmış ve kesitler 37 °C'de karanlıkta 60 dk inkübe edilmiştir. Fosfat tamponlu salin ile durulamanın ardından, kesitler 10 dk boyunca DAPI ile karşıt boyanmış ve floresan mikroskobu altında incelenmiştir. Floresan yoğunluğu, görüntü analiz yazılımı kullanılarak analiz edilmiştir.

GC-1 hücrelerinin immunofloresan boyaması için, hücreler 12 kuyucuklu plakalara kuyucuk başına 1 × 105 hücre olacak şekilde ekilmiş ve 24 sa boyunca inkübe edilmiştir. Hücreler %4 paraformaldehit ile 30 dk sabitlenmiş, %0,3 Triton X-100 ile 10 dk permeabilize edilmiş, %5 sığır serum albümini ile bloke edilmiş ve QKI-5'e karşı bir primer antikor ile 4 °C'de gece boyunca inkübe edilmiştir. Geri kalan prosedür, testis doku kesitleri için tanımlandığı şekilde gerçekleştirilmiştir.

16. TUNEL boyama
Fare testis parafin kesitleri deparafine edildi, dereceli etanol serisi ile hidrate edildi ve hücre membranı geçirgenliğini artırmak için %0.1 Triton X-100 ile 5 dk inkübe edildi. DNase içermeyen 20 µg/mL konsantrasyonundaki Proteinaz K çalışma çözeltisi kesitlere homojen şekilde uygulandı ve ardından kesitler 37 °C'de 15 dk inkübe edildi. TUNEL tespit çözeltisi eklendi ve kesitler karanlıkta 37 °C'de 90 dk inkübe edildi. DAPI ile 10 dk inkübasyonun ardından, solmayı önleyici (antifade) kapatma medyumu uygulandı ve testis dokusu floresan mikroskobu altında gözlemlendi.

GC-1 hücreleri 12 kuyucuklu plakalara ekildi ve %4 paraformaldehit ile 30 dk boyunca fikse edildi. %0,1 Triton X-100 ile 5 dk boyunca permeabilizasyon işleminden sonra, hücrelere TUNEL tespit solüsyonu uygulandı ve ardından 60 dk boyunca karanlıkta inkübasyona bırakıldı. Hücreler daha sonra 10 dk boyunca DAPI ile boyandı ve floresan mikroskobu altında gözlemlendi.

17. Western blotting
Fare testis dokuları ve GC-1 hücreleri, buz üzerinde 30 dk boyunca immünopresipitasyon hücre lizis tamponu ile lize edilmiş ve ultrasonikasyonla parçalanmıştır. Santrifüjden sonra, protein içeren süpernatan toplanmış ve protein konsantrasyonu bir bisinkoninik asit analiz kiti kullanılarak belirlenmiştir. Protein süpernatanı SDS yükleme tamponu ile karıştırılmış ve kaynar suda 10 dk boyunca ısıtılmıştır. Jel elektroforezi ile ayrıştırmanın ardından, proteinler poliviniliden florür membranlara aktarılmış ve %5 sığır serum albümini ile 2 sa boyunca bloklanmıştır31.

Membranlar cleaved caspase-3 (1:500), Bcl-2 (1:1000), caspase-3 (1:2000), Bax (1:500), QKI-5 (1:1000), fosforile p38 (1:1000) veya p38 (1:500) karşıtı primer antikorlarla 4 °C'de gece boyunca inkübe edildi. Ertesi gün membranlar, Tween 20 içeren Tris-tamponlu salin ile durulandı ve 1:10000 oranında keçi anti-tavşan immünoglobulin G ile 25 °C'de 2 sa boyunca inkübe edildi. Membran yüzeyine geliştirilmiş kemilüminesans çalışma çözeltisi uygulandı ve protein bantları bir jel görüntüleme sistemi ile görüntülendi. Bant yoğunluğu görüntü analiz yazılımı kullanılarak analiz edildi ve göreceli protein ekspresyonu GAPDH (1:3000) ile normalize edildi.

Protein sentezini inhibe etmek için 50 µg/mL konsantrasyonda sikloheksimid kullanılmıştır. QKI-5'in yarı ömrünü belirlemek için hücreler 0, 3, 6 ve 9. saatlerde toplanmış ve ardından QKI-5 protein seviyeleri Western blotting ile belirlenmiştir25.

18. İstatistiksel analiz
Tüm veriler istatistiksel, grafikleme ve görüntü analiz yazılımları kullanılarak istatistiksel olarak analiz edilmiş ve grafiğe dökülmüştür. Verilerin normalliğini değerlendirmek için Shapiro-Wilk testi kullanılmıştır. Deneysel veriler ortalama ± standart sapma olarak sunulmuştur. Gruplar arasındaki farkları değerlendirmek için tek yönlü varyans analizi kullanılmıştır. Varyanslar homojen olduğunda post hoc ikili karşılaştırmalar için LSD-t testi, varyanslar heterojen olduğunda ise Dunnett’s T3 testi kullanılmıştır. p < 0.05 değeri istatistiksel olarak anlamlı kabul edilmiştir.

Sonuçlar

lncRNA NONMMUT031883.2 nakavdownu spermatogonial apoptozu indükler
lncRNA NONMMUT031883.2 ekspresyonunu nakdown etmek için GC-1 hücreleri sh-lncRNA ile transfekte edildi. sh-NC transfekte edilen hücrelerle karşılaştırıldığında, sh-lncRNA transfeksiyonu sonrası lncRNA NONMMUT031883.2'nin transkripsiyonel düzeyi belirgin şekilde azalmış olup başarılı nakdown doğrulanmıştır (Şekil 2A). lncRNA NONMMUT031883.2 nakdownu sonrası, GC-1 hücre canlılığı önemli ölçüde azalmış (Şekil 2B), LDH salınımı ise önemli ölçüde artarak daha fazla hücresel hasara işaret etmiştir (Şekil 2C). Calcein-AM/PI boyaması, sh-lncRNA grubunda PI-pozitif GC-1 hücre sayısında artış ve hayatta kalan hücre oranında azalma göstermiştir (Şekil 2D, E). lncRNA NONMMUT031883.2 nakdownu sonrası GC-1 hücrelerinin apoptoz hızı belirgin şekilde artmıştır (Şekil 2F, G). TUNEL-pozitif oranı da sh-lncRNA grubunda anlamlı derecede yükselerek artan apoptoza daha fazla işaret etmiştir (Şekil 2H, I). Ayrıca, lncRNA NONMMUT031883.2 nakdownu GC-1 hücrelerinde caspase-3 aktivitesini önemli ölçüde artırmıştır (Şekil 2J). sh-lncRNA grubunda Bax ekspresyonu belirgin şekilde artmış, Bcl-2 ekspresyonu azalmış ve cleaved caspase-3/caspase-3 oranı anlamlı derecede yükselmiştir (Şekil 2K, L). Bu sonuçlar, lncRNA NONMMUT031883.2 nakdownunun GC-1 hücrelerinde apoptozu indüklediğini göstermektedir. Tüm nicel veriler n = 6 ile elde edilmiştir.

figure-results-1
Şekil 2: lncRNA NONMMUT031883.2 nakavtının spermatogonyal apoptozu indüklemesi. (A) GC-1 hücrelerinde lncRNA NONMMUT031883.2 ekspresyonunun kantitatif ters transkripsiyon polimeraz zincir reaksiyonu (qRT-PCR) analizi. (B) lncRNA NONMMUT031883.2 nakavtı sonrası GC-1 hücre canlılığının Hücre Sayım Kiti-8 (CCK-8) analizi. (C) lncRNA NONMMUT031883.2 nakavtı sonrası GC-1 hücrelerinden laktat dehidrogenaz (LDH) salınımı. (D, E) GC-1 hücre sağkalımının Calcein-AM/propidyum iyodür (PI) boyaması (20×; ölçek çubuğu, 100 µm). (F, G) lncRNA NONMMUT031883.2 nakavtı sonrası apoptozun akış sitometrik analizi. (H, I) GC-1 hücrelerinin Terminal deoksinükleotidil transferaz dUTP uç etiketleme (TUNEL) analizi (40×; ölçek çubuğu, 50 µm). (J) lncRNA NONMMUT031883.2 nakavtı sonrası Caspase-3 aktivitesi. (K, L) sh-lncRNA transfeksiyonu sonrası Bcl-2, Bax, caspase-3 ve cleaved caspase-3 ekspresyonlarının Western blot analizi. Veriler ortalama ± standart sapma olarak sunulmuştur; n = 6. ***p < 0.001 sh-NC'ye kıyasla. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

LncRNA NONMMUT031883.2, QKI-5 ile etkileşime girer
Spermatogonial apoptozun altında yatan moleküler mekanizmayı aydınlatmak için lncRNA NONMMUT031883.2 ve QKI-5 arasındaki etkileşim incelenmiştir. Nükleer ve sitoplazmik fraksiyonların ayrılmasını takiben, qRT-PCR analizi lncRNA NONMMUT031883.2'nin öncelikle GC-1 hücrelerinin çekirdeklerinde lokalize olduğunu göstermiştir (Şekil 3A). İmmünofloresan analizi, QKI-5'in de çekirdekte yoğunlaştığını göstererek lncRNA NONMMUT031883.2 ile QKI-5 arasındaki etkileşim için mekansal bir temel sağlamıştır (Şekil 3B). QKI-5'in lncRNA stabilitesini düzenleyip düzenlemediğini değerlendirmek amacıyla, aktinomisin D tedavisi sonrası lncRNA NONMMUT031883.2'nin yarı ömrü ölçülmüştür. QKI-5 knockdown'ının lncRNA transkriptinin yarı ömrü üzerinde belirgin bir etkisi olmamıştır (Şekil 3C). Sikloheksimid ile protein sentezinin inhibisyonunu takiben, lncRNA NONMMUT031883.2 knockdown'ı QKI-5 protein ekspresyonunu değiştirmemiştir (Şekil 3D, E). Ardından, lncRNA NONMMUT031883.2'yi hedefleyen biyotin işaretli antisense probun yakalama verimliliği qRT-PCR ile değerlendirilmiştir. Antisense prob, hedef lncRNA'yı verimli bir şekilde zenginleştirmiş ve bu nedenle sonraki RNA pull-down analizi için kullanılmıştır (Şekil 3F). RNA pull-down ve ardından yapılan Western blotting, lncRNA NONMMUT031883.2 ile QKI-5 arasında spesifik bir fiziksel etkileşim olduğunu göstermiştir (Şekil 3G, H). Bu sonuçlar, lncRNA NONMMUT031883.2 ve QKI-5'in GC-1 hücrelerinin çekirdeklerinde kolokalize olduğunu ve spesifik olarak etkileşime girdiğini göstermektedir. Şekil 3C ve Şekil 3D, F'deki nicel veriler n = 3 ile, diğer tüm nicel veriler ise n = 6 ile elde edilmiştir.

figure-results-2
Şekil 3: LncRNA NONMMUT031883.2, QKI-5 ile etkileşime girer. (A) GC-1 hücrelerinde lncRNA NONMMUT031883.2'nin nükleer ve sitoplazmik dağılımının qRT-PCR analizi. (B) GC-1 hücrelerinde QKI-5'in hücre altı lokalizasyonunun immünofloresan analizi (40×; ölçek çubuğu, 50 µm). (C) Aktinomisin D uygulaması ve QKI-5 nakavt sonrası lncRNA NONMMUT031883.2'nin yarı ömrünün qRT-PCR analizi (n = 3). (D, E) Sikloheksimid uygulaması ve lncRNA NONMMUT031883.2 nakavt sonrası QKI-5 protein ekspresyonunun Western blot analizi (n = 3). (F) LncRNA NONMMUT031883.2'yi hedefleyen biyotin işaretli antisens probun zenginleştirme verimliliğinin qRT-PCR doğrulaması. (G, H) LncRNA NONMMUT031883.2 ve QKI-5 arasındaki etkileşimin RNA pull-down ve Western blot analizi. Veriler ortalama ± standart sapma olarak sunulmuştur; n = 6. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

QKI-5 nakavt ile p38 MAPK yolunun baskılanması spermatogonyal apoptozu inhibe eder
QKI-5'in ve aşağı akıştaki p38 MAPK yolunun spermatogonyal apoptoz üzerindeki rolü incelenmiştir. si-QKI-5 ile transfeksiyondan sonra, GC-1 hücrelerinde QKI-5 protein seviyeleri önemli ölçüde azalmış ve nakavtın başarılı olduğu doğrulanmıştır (Şekil 4A, B). LncRNA NONMMUT031883.2 nakavtı p-p38/p38 oranını önemli ölçüde artırırken, eş zamanlı QKI-5 nakavtı bu oranı düşürerek p38 MAPK yolu aktivasyonunun inhibe edildiğini göstermiştir (Şekil 4C, D). QKI-5 nakavtı, lncRNA NONMMUT031883.2 nakavtının GC-1 hücrelerinde neden olduğu hasarı hafifletmiş, ancak apoptoz indükleyici etoposid tedavisi hücre canlılığını önemli ölçüde azaltmıştır (Şekil 4E). QKI-5 nakavtı, GC-1 hücrelerinin apoptoz oranını önemli ölçüde azaltırken, etoposid tedavisi apoptozu belirgin şekilde artırmıştır (Şekil 4F, G). si-QKI-5 ile transfeksiyon kaspaz-3 aktivitesini de önemli ölçüde azaltırken, etoposid tedavisi kaspaz-3 aktivitesini artırmıştır (Şekil 4H). QKI-5 nakavtı Bax ekspresyonunu azaltmış, Bcl-2 ekspresyonunu artırmış ve cleaved kaspaz-3/kaspaz-3 oranını önemli ölçüde düşürmüş; etoposid tedavisi ise bu ekspresyon modellerini tersine çevirmiştir (Şekil 4I, J). Bu sonuçlar, QKI-5 nakavtının p38 MAPK yolunu inhibe ederek GC-1 spermatogonialarında apoptozu baskıladığını göstermektedir. Tüm nicelleştirilmiş veriler n = 6 ile elde edilmiştir.

figure-results-3
Şekil 4: QKI-5 knockdown'u, p38 MAPK yolunu baskılayarak spermatogonyal apoptozu inhibe eder. (A, B) si-NC veya si-QKI-5 ile transfeksiyon sonrası GC-1 hücrelerinde QKI-5 ekspresyonunun Western blot analizi. (C, D) Fosforile p38 (p-p38) ve toplam p38 ekspresyonunun Western blot analizi. (E) Farklı tedavi gruplarında GC-1 hücre canlılığının CCK-8 analizi. (F, G) Etoposide tedavisi sonrası apoptozun akış sitometrik analizi. (H) Farklı tedavi gruplarında Caspase-3 aktivitesi. (I, J) GC-1 hücrelerinde Bax, Bcl-2, caspase-3 ve cleaved caspase-3 ekspresyonunun Western blot analizi. Veriler ortalama ± standart sapma olarak sunulmuştur; n = 6. ***p < 0.001 si-NC veya sh-NC'ye kıyasla; ###p < 0.001 sh-lncRNA'ya kıyasla; &&&p < 0.001 sh-lncRNA + si-QKI-5'e kıyasla. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

YC, lncRNA NONMMUT031883.2/QKI-5/p38 MAPK yolu aracılığıyla spermatogoniyal apoptozu inhibe eder
GC-1 hücrelerinin YC içeren serum ile 6, 12 ve 24 saat boyunca tedavi edilmesinin ardından, hücre canlılığı artan YC konsantrasyonları ve uzayan maruziyet süreleri ile kademeli olarak artmıştır. Bu nedenle, 24 saatlik bir tedavi süresi ile bu konsantrasyonlar sonraki deneyler için seçilmiştir (Şekil 5A). 24 saatlik YC tedavisi, GC-1 hücrelerinde lncRNA NONMMUT031883.2'nin transkripsiyonel seviyesini belirgin şekilde artırmış (Şekil 5B) ve QKI-5'e bağlanma kapasitesini güçlendirmiştir (Şekil 5C, D). YC tedavisinin ardından, GC-1 hücrelerinde QKI-5 ekspresyonu ve p-p38/p38 oranı belirgin şekilde azalmış olup, bu durum p38 MAPK yolunun inhibe edildiğini düşündürmektedir (Şekil 5E, F). YC tedavisi ayrıca apoptoz oranını belirgin şekilde düşürmüş (Şekil 5G, H), kaspaz-3 aktivitesini azaltmış (Şekil 5I), Bcl-2 ekspresyonunu artırmış ve Bax ekspresyonu ile cleaved kaspaz-3/kaspaz-3 oranını azaltmıştır (Şekil 5J, K).

Yol özgüllüğünü daha ayrıntılı değerlendirmek için GC-1 hücreleri OE-NC veya OE-QKI-5 ile transfekte edildi. OE-QKI-5-transfekte edilen hücrelerde QKI-5 protein ekspresyonu anlamlı derecede artarak başarılı aşırı ekspresyonu doğruladı (Şekil 5L, M). lncRNA NONMMUT031883.2'nin susturulması hücre canlılığını anlamlı derecede azaltırken, YC tedavisi bu etkiyi geri çevirdi. QKI-5 aşırı ekspresyonu, YC'nin sitoprotektif etkisini hafifletti (Şekil 5N). YC tedavisi ayrıca lncRNA NONMMUT031883.2 susturulmasının tetiklediği apoptozu azalttı (Şekil 5O, P), kaspaz-3 aktivitesini düşürdü (Şekil 5Q), Bax ekspresyonunu azalttı, Bcl-2 ekspresyonunu artırdı ve cleaved kaspaz-3/kaspaz-3 oranını düşürdü (Şekil 5R, S). Buna karşılık, QKI-5 aşırı ekspresyonu YC'nin anti-apoptotik etkilerini hafifletti. Bu sonuçlar, YC'nin lncRNA NONMMUT031883.2'yi yukarı regüle ettiğini ve QKI-5'e bağlanmasını teşvik ettiğini, böylece p38 MAPK yolunu inhibe ederek GC-1 hücrelerinde apoptozu baskıladığını göstermektedir. Tüm nicel veriler n = 6 ile elde edilmiştir.

figure-results-4
Şekil 5: YC, spermatogonyal apoptozu lncRNA NONMMUT031883.2/QKI-5/p38 MAPK yolu aracılığıyla inhibe eder. (A) GC-1 hücrelerinin Yangjing Kapsül (YC) içeren serumla 6, 12 ve 24 saat boyunca inkübe edilmesi sonrası hücre canlılığının CCK-8 analizi. (B) 24 saatlik YC uygulaması sonrası GC-1 hücrelerinde lncRNA NONMMUT031883.2 ekspresyonunun qRT-PCR analizi. (C, D) YC uygulaması sonrası lncRNA NONMMUT031883.2'nin QKI-5'e bağlanmasının RNA pull-down analizi. (E, F) YC uygulaması sonrası QKI-5, p-p38 ve p38 ekspresyonlarının Western blot analizi. (G, H) YC uygulaması sonrası GC-1 hücre apoptozunun akış sitometrisi analizi. (I) YC uygulaması sonrası Caspase-3 aktivitesi. (J, K) YC uygulaması sonrası Bcl-2, Bax, caspase-3 ve cleaved caspase-3 ekspresyonlarının Western blot analizi. (L, M) OE-NC veya OE-QKI-5 transfeksiyonu sonrası QKI-5 ekspresyonunun Western blot analizi. (N) GC-1 hücre canlılığının CCK-8 analizi. (O, P) QKI-5 aşırı ekspresyonu sonrası GC-1 hücrelerinde apoptozun akış sitometrisi analizi. (Q) QKI-5 aşırı ekspresyonu sonrası Caspase-3 aktivitesi. (R, S) QKI-5 aşırı ekspresyonu sonrası Bax, Bcl-2, caspase-3 ve cleaved caspase-3 ekspresyonlarının Western blot analizi. Veriler ortalama ± standart sapma olarak sunulmuştur; n = 6. ***p < 0.001 kontrol grubuna göre; ###p < 0.001 sh-lncRNA grubuna göre; &&&p < 0.001 sh-lncRNA + H-YC + OE-NC grubuna göre. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

YC, farelerde CP kaynaklı spermatojenik disfonksiyonu iyileştirir
YC'nin koruyucu etkileri, spermatojenik disfonksiyonu olan farelerde değerlendirilmiştir. CP grubundaki farelerin testisleri ve epididimleri belirgin atrofi, azalmış hacim ve donuk bir görünüm sergilemiştir. Farklı dozlarda YC tedavisi sonrası, üreme organlarının morfolojisi, dolgunluğu ve rengi kademeli olarak iyileşmiştir (Şekil 6A). Testislerin ve epididimlerin bağıl ağırlıkları anlamlı düzeyde artmış olup, en belirgin etki 800 mg/kg YC grubunda gözlemlenmiştir (Şekil 6B, C).

CP grubunda sperm deformite oranı önemli ölçüde artmış olup; baş distorsiyonu, kuyruk kıvrılması ve yapısal hasar dahil olmak üzere sık rastlanan anomaliler görülmüştür. Sperm sayısı ve motilitesi de belirgin şekilde azalmıştır. YC tedavisi sonrası sperm morfolojisi iyileşmiş (Şekil 6D), sperm sayısı artmış (Şekil 6E) ve sperm motilitesi önemli ölçüde gelişmiştir (Şekil 6F). Çiftleşme deneyleri, CP grubunda fertilite ve batın boyutunun belirgin şekilde azaldığını, YC tedavisinin ise fertiliteyi artırdığını göstermiştir (Şekil 6G). Serum testosteron, folikül uyarıcı hormon ve luteinizan hormon seviyeleri de CP grubunda belirgin şekilde azalmış ve YC tedavisi sonrası artmıştır (Şekil 6H-J). Bu bulgular, YC'nin spermatojenik disfonksiyonu olan farelerde üreme organı atrofisini, sperm kalitesini, fertiliteyi ve seks hormonu salgılanmasını iyileştirdiğini göstermektedir. Şekil 6G'deki kantitatif veriler n = 9 ile, diğer kantitatif veriler ise n = 6 ile elde edilmiştir.

figure-results-5
Şekil 6: YC, farelerde CP kaynaklı spermatogenik disfonksiyonu iyileştirir. (A-C) Kontrol, siklofosfamid (CP) ve YC tedavi gruplarındaki üreme organlarının morfolojisi (A), testis indeksi (B) ve epididim indeksi (C). (D-F) Sperm morfolojisi (D) (40×; ölçek çubuğu, 50 µm), sperm yoğunluğu (E) ve sperm motilitesi (F). (G) Çiftleşme deneyleri ile değerlendirilen erkek fertilitesi (n = 9). (H-J) Enzimle bağlantılı immünosorbent assay kitleri kullanılarak ölçülen serum folikül uyarıcı hormon (FSH), testosteron ve luteinize edici hormon (LH) seviyeleri. Veriler ortalama ± standart sapma olarak sunulmuştur; n = 6. ***p < 0.001 kontrol grubuna göre; #p < 0.05, ##p < 0.01 ve ###p < 0.001 CP grubuna göre. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

YC, spermatojenik disfonksiyonu olan farelerdeki testis histopatolojik hasarını iyileştirir
YC'nin testis doku hasarı üzerindeki onarıcı etkisi histolojik boyama ile değerlendirilmiştir. Hematoksilen ve eozin boyaması, kontrol grubunda sağlam doku yapısı, belirgin hücresel tabakalar ve yeterli hücre sayısı göstermiştir. Buna karşılık, CP grubu belirgin seminifer tübül atrofisi ve yapısal düzensizlik, azalmış hücre sayısı ve epididimal lümen çökmesi göstermiştir. YC tedavisi sonrası, testis ve epididimal hasar azalmış, seminifer tübül yapısı kademeli olarak geri kazanılmış ve hücreler daha düzenli hale gelerek sayıca artmıştır (Şekil 7A, B).

Testis dokusundaki TUNEL-pozitif hücrelerin oranı CP grubunda anlamlı derecede artmış ve YC tedavisi sonrası anlamlı derecede azalmıştır (Şekil 7C, D). Bax ekspresyonu ve cleaved caspase-3/caspase-3 oranı CP grubunda belirgin şekilde artarken, Bcl-2 ekspresyonu azalmıştır. YC tedavisi bu ekspresyon modellerini tersine çevirmiştir (Şekil 7E, F). İmmünofloresan analiz, Ki67 floresans yoğunluğunun CP grubunda belirgin şekilde azaldığını ve YC tedavisi sonrası anlamlı derecede arttığını göstermiştir; bu durum spermatojenik hücre proliferasyonunun geri kazandığını düşündürmektedir (Şekil 7G, H). Bu bulgular, YC'nin testislerde ve epididimlerde CP kaynaklı histopatolojik hasarı azalttığını, aşırı apoptozu inhibe ettiğini ve spermatojenik hücre proliferasyonunu teşvik ettiğini göstermektedir. Tüm kantitatif veriler n = 6 ile elde edilmiştir.

figure-results-6
Şekil 7: YC, fare testis dokusundaki CP kaynaklı histopatolojik hasarı iyileştirir. (A, B) YC tedavisi sonrası testislerin (A) ve epididimlerin (B) hematoksilin ve eozin (HE) boyaması (20×; ölçek çubuğu, 100 µm). (C, D) Fare testis dokusundaki apoptozun TUNEL analizi (40×; ölçek çubuğu, 50 µm). (E, F) YC tedavisi sonrası testis dokusundaki Bax, Bcl-2, caspase-3 ve cleaved caspase-3 ekspresyonunun Western blot analizi. (G, H) Fare testis dokusundaki Ki67 ekspresyonunun immunofloresan analizi (40×; ölçek çubuğu, 50 µm). Veriler ortalama ± standart sapma olarak sunulmuştur; n = 6. ***p < 0.001 kontrol grubuna göre; p < 0.001 CP grubuna göre. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

YC, lncRNA NONMMUT031883.2/QKI-5/p38 MAPK yolu aracılığıyla farelerde spermatojenik disfonksiyonu ve testiküler patolojik hasarı iyileştirir
YC'nin etkilerinde lncRNA NONMMUT031883.2/QKI-5/p38 MAPK yolunun rolü daha ayrıntılı olarak değerlendirildi. CP grubundaki farelerin testis dokularında lncRNA NONMMUT031883.2 ekspresyonu belirgin şekilde azalırken, QKI-5 ekspresyonu ve p-p38/p38 oranı belirgin şekilde artmıştır (Şekil 8A-D). YC tedavisi sonrası, lncRNA NONMMUT031883.2 ekspresyonu artmış, buna karşın QKI-5 ekspresyonu ve p-p38/p38 oranı azalmıştır.

Yol özgüllüğünü daha ayrıntılı değerlendirmek için, farelerde sh-lncRNA kullanılarak lncRNA NONMMUT031883.2 susturulmuştur. lncRNA NONMMUT031883.2 ekspresyon seviyesinin önemli ölçüde azaldığı görülmüş ve böylece susturmanın başarılı olduğu doğrulanmıştır (Şekil 8E). lncRNA NONMMUT031883.2 susturulduktan sonra, testis dokusundaki QKI-5 seviyesi anlamlı bir değişim göstermezken, p-p38/p38 seviyesi önemli ölçüde artmıştır (Şekil 8F, G). Sh-lncRNA tedavisi, 800 mg/kg YC'nin etkilerini hafifletmiş; bu durum testis dokusunda lncRNA NONMMUT031883.2 ekspresyonunun azalmasıyla (Şekil 8H) ve p-p38/p38 seviyelerinin artmasıyla (Şekil 8I, J) sonuçlanmıştır. YC tedavisi, CP indüksiyonu sonrası sperm sayısı ve motilitesini anlamlı derecede artırmış, lncRNA NONMMUT031883.2 susturulması ise bu etkileri hafifletmiştir (Şekil 8K, L). YC tedavisi ayrıca CP grubunda testosteron, folikül uyarıcı hormon ve luteinize edici hormon seviyelerini artırmış, lncRNA susturulması ise bu etkileri hafifletmiştir (Şekil 8M-O).

Hematoksilin ve eozin boyaması, YC'nin seminifer tübül atrofisi ve düzensiz spermatojenik hücre dizilimi dahil olmak üzere CP kaynaklı testis hasarını iyileştirdiğini göstermiştir. LncRNA NONMMUT031883.2 susturulması bu koruyucu etkileri hafifletmiştir (Şekil 8P). YC tedavisi sonrası Bax ekspresyonu ve aktive caspase-3/caspase-3 oranı azalırken, Bcl-2 ekspresyonu artmıştır. LncRNA NONMMUT031883.2 susturulması, apoptozla ilişkili proteinler üzerindeki bu etkileri tersine çevirmiştir (Şekil 8Q, R). Bu bulgular, YC'nin lncRNA NONMMUT031883.2'yi yukarı regüle ederek, QKI-5'i aşağı regüle ederek ve p38 MAPK yolunu inhibe ederek CP indüksiyonu sonrası sperm kalitesini iyileştirdiğini ve testis dokusu hasarını azalttığını göstermektedir. Tüm nicelleştirilmiş veriler n = 6 ile elde edilmiştir.

figure-results-7
Şekil 8: YC, lncRNA NONMMUT031883.2/QKI-5/p38 MAPK yolu aracılığıyla spermatogenezi iyileştirir ve testis histopatolojik hasarını azaltır. (A) Fare testis dokusunda lncRNA NONMMUT031883.2 ekspresyonunun qRT-PCR analizi. (B-D) YC tedavisi sonrası fare testis dokusunda QKI-5, p-p38 ve p38 ekspresyonunun Western blot analizi. (E) sh-lncRNA uygulaması sonrası fare testis dokusunda lncRNA NONMMUT031883.2 knockdown'ının qRT-PCR doğrulaması. (F, G) lncRNA NONMMUT031883.2 knockdown'ı sonrası farelerin testis dokusundaki QKI-5 ve p-p38/p38 seviyelerinin Western blot analizi. (H) YC tedavisi ve sh-lncRNA uygulaması sonrası fare testis dokusunda lncRNA NONMMUT031883.2 ekspresyonunun qRT-PCR analizi. (I, J) Fare testis dokusunda p-p38 ve p38 ekspresyonunun Western blot analizi. (K, L) Farklı tedavi gruplarında sperm sayısı (K) ve sperm motilitesi (L) . (M-O) Serum FSH, testosteron ve LH seviyeleri enzimle bağlantılı immünosorbent assay kitleri kullanılarak ölçülmüştür. (P) CP ile tedavi edilen farelerde testis dokusunun HE boyaması (20×; ölçek çubuğu, 100 µm). (Q, R) Fare testis dokusunda Bcl-2, Bax, cleaved caspase-3 ve caspase-3 ekspresyonunun Western blot analizi. Veriler ortalama ± standart sapma olarak sunulmuştur; n = 6. ***p < 0.001 kontrol grubuna göre; p < 0.001 CP grubuna göre; p < 0.001 800 mg/kg YC + sh-NC grubuna göre. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Veri Erişilebilirliği:
Bu çalışmanın bulgularını destekleyen ham veriler, Ek Dosya 1 olarak sunulmuştur.

Ek Dosya 1: Orijinal veriler.Bu Excel dosyası, Şekil 2–8'de sunulan nicel analizlerin temelini oluşturan ham sayısal verileri içermektedir. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

Kemoterapi kaynaklı edinilmiş spermatojenik disfonksiyon, erkek kısırlığının önemli bir nedenidir32,33,34. Ancak, spesifik moleküler mekanizmalar henüz tam olarak anlaşılamamıştır. Bu çalışmanın bulguları, Yangjing Kapsülü'nün (YC), siklofosfamid (CP) kaynaklı seks hormonu anomalilerini, testiküler histopatolojik hasarı ve erkek farelerdeki fertilite bozukluğunu doz bağımlı olarak iyileştirdiğini göstermektedir. Bu iyileşmeler, lncRNA NONMMUT031883.2'nin yukarı regülasyonu ve QKI-5/p38 MAPK yolağının inhibisyonu ile ilişkilendirilmiştir; bu durum, YC'nin anormal spermatogonyal apoptozu azaltmak için bu eksen üzerinden etki edebileceğini düşündürmektedir.

CP'nin reprodüktif toksisitesi yaygın olarak belgelenmiştir. Metaboliti akrolein, testis dokusunda birikebilir ve oksidatif stres, DNA hasarı ve diğer yollar aracılığıyla germ hücresi apoptozunu tetikleyebilir. Spermatogenezin başlangıç hücreleri olan spermatogonyumlar, CP'nin sitotoksik etkilerine karşı özellikle hassastır35,36. Cao et al., CP kemoterapisi sonrası azoospermi hastalarının testis dokusunda DNA hasarı kontrol noktası sinyalizasyonunun belirgin şekilde zenginleştiğini, buna karşın sperm gelişimi ile ilişkili genlerin belirgin şekilde downregüle olduğunu ve seminifer tübüllerin yapısal bütünlüğünün bozulduğunu saptamıştır37. Bcl-2, mitokondriyal membran bütünlüğünü koruyarak işlev gören anti-apoptotik bir proteindir38. Bax ise pro-apoptotik bir proteindir ve upregülasyonu, sitokrom c'nin mitokondriden sitoplazmaya salınımını teşvik edebilir, kaspaz kaskadını aktive edebilir ve apoptozu indükleyebilir39,40. Saleh et al., farelerde CP maruziyetinin, Bcl-2 downregülasyonu ve Bax upregülasyonu ile birlikte seminifer tübül atrofisine ve interstisyel ödeme neden olduğunu, bunun sonucunda sperm sayısı ve motilitesinde azalma meydana geldiğini göstermiştir41. Bu nedenle, CP ile indüklenen aşırı spermatogonyal apoptozun inhibisyonu, kemoterapi sonrası reprodüktif fonksiyonların korunması için önemli bir hedef olabilir. Mevcut çalışmada, YC müdahalesi, CP ile indüklenen serum seks hormonu salgılamasındaki anormallikleri doz bağımlı olarak azaltmış, seminifer tübül hasarını onarmış ve sperm motilitesi ile erkek fertilitesini iyileştirmiştir. YC ayrıca testis dokusunda Bcl-2 ekspresyonunu artırmış; Bax ekspresyonunu, cleaved caspase-3/caspase-3 oranını ve TUNEL-pozitif hücre sayısını azaltmıştır. In vitro, YC içeren serum, GC-1 hücresi apoptozunu belirgin şekilde azaltmış ve hücre viabilitesini artırarak spermatogonyal apoptoz üzerindeki inhibitör etkiyi daha da desteklemiştir.

Uzun kodlamayan RNA'lar (lncRNA'lar), spermatogenez ve germ hücresi apoptozu da dahil olmak üzere fizyolojik ve patolojik süreçlerde önemli düzenleyici roller oynamaktadır.42,43Anormal lncRNA ekspresyonu, oksidatif stres ve apoptotik yolakların regülasyonu aracılığıyla testiküler spermatojenik fonksiyonu bozabilmekte ve erkek infertilitesinin önemli bir moleküler mekanizmasını oluşturmaktadır.44. Wang ve ark. lncRNA DNM3OS'un miR-214-5p/E2F2 aksını düzenlediği, bunun sonucunda spermatogoniyal hücre aktivitesinin azaldığı, apoptoz ve senesensin arttığı ve nihayetinde obstrüktif olmayan azoospermiye katkıda bulunduğu saptanmıştır45Önceki araştırmalar ayrıca, spermatogonyumlarda lncRNA NONMMUT074098.2'nin nakavt edilmesinin apoptozu tetiklediğini göstermiştir.25Bu çalışmalar, lncRNA'ların spermatogonyal apoptoz ve spermatogenezin önemli düzenleyicileri olduğunu göstermektedir. Mevcut çalışmada, lncRNA NONMMUT031883.2'nin nakavt edilmesi spermatogonyal apoptozu tetiklemiştir. CP indüksiyonunun ardından fare testis dokusunda ekspresyonu önemli ölçüde azalırken, YC müdahalesi bu ekspresyonu kısmen geri kazandırmıştır. Ayrıca, YC müdahalesi lncRNA NONMMUT031883.2 nakavtının neden olduğu anormal spermatogonyal apoptozu hafifletmiş olup bu durum, YC'nin koruyucu etkisinin bu lncRNA'nın düzenlenmesi ile ilişkili olabileceğini düşündürmektedir.

STAR ailesine ait bir RNA-bağlayıcı protein olan QKI-5; hedef mRNA ekleme (splicing), stabilitesi ve translasyonel verimliliğini düzenleyerek çeşitli fizyolojik ve patolojik süreçlerde rol oynar.46,47Önceki araştırmalar, QKI-5'in üreme sisteminde önemli bir düzenleyici olduğunu ve anormal ekspresyonunun, downstream p38 MAPK yolağının aktivasyonu aracılığıyla germ hücresi apoptozunu teşvik edebileceğini ve sperm fonksiyonunu bozabileceğini ortaya koymuştur.25. Li ve ark. p38 MAPK yolak aktivasyonunun inhibisyonunun, sıçanlarda CP kaynaklı testiküler doku hasarını azalttığı ve kan-testis bariyeri fonksiyonunu geri kazandırdığı bulunmuştur48Bu bulgular, QKI-5/p38 MAPK ekseninin spermatogonial apoptozu düzenleyen önemli bir yolak olabileceğini ve spermatojenik disfonksiyon tedavisi için potansiyel bir hedef teşkil edebileceğini göstermektedir. Mevcut çalışmada, CP indüksiyonunu takiben fare testis dokusunda QKI-5 ekspresyonu ve p38 fosforilasyonu anlamlı derecede artmış, YC müdahalesi ise QKI-5 ekspresyonunu ve p38 MAPK yolak aktivasyonunu azaltmıştır. LncRNA NONMMUT031883.2 doğrudan QKI-5'e bağlanmış, ancak QKI-5 ekspresyonu lncRNA stabilitesini etkilememiştir; bu durum, lncRNA NONMMUT031883.2'nin doğrudan etkileşim yoluyla QKI-5 fonksiyonunu düzenleyebileceğini düşündürmektedir. QKI-5 nakavtı, lncRNA NONMMUT031883.2 nakavtının GC-1 hücrelerinde yol açtığı hasarı hafifletmiş, öte yandan QKI-5 aşırı ekspresyonu YC'nin GC-1 hücreleri üzerindeki koruyucu etkilerini azaltmıştır. Li ve ark. lncRNA NONMMUT074098.2'nin QKI-5'e bağlanarak germ hücresi apoptozunu düzenlediği rapor edilmiştir25Mevcut bulgular, lncRNA NONMMUT031883.2'nin ayrıca QKI-5'e bağlandığını ve spermatogonal apoptozun düzenlenmesinde rol oynadığını göstermektedir. Toplamda bu veriler, YC'nin lncRNA NONMMUT031883.2'yi yukarı regüle edebileceğini, QKI-5/p38 MAPK yolunu inhibe edebileceğini, anormal spermatogonal apoptozu azaltabileceğini ve CP kaynaklı spermatojenik disfonksiyonu hafifletebileceğini düşündürmektedir. Ancak, YC'nin muhtemelen birden fazla hedef üzerinde etkili olan çok bileşenli bir herbal formülasyon olduğu unutulmamalıdır. YC bileşenlerinin doğrudan antioksidan etkileri, diğer sinyal yolaklarının modülasyonu veya lncRNA-QKI-5 aksından bağımsız epigenetik düzenleme gibi diğer mekanizmalar dışlanamaz ve gözlemlenen koruyucu etkilere katkıda bulunabilir.

Bazı kısıtlamalar kabul edilmelidir. Çalışma yalnızca bir fare modeli ve GC-1 hücre hattında yürütülmüş olup, infertilite şikayeti olan hastalardan alınan klinik örnekler kullanılarak doğrulanmamıştır. Spermatogenez karmaşık bir süreçtir ve farelerin tam spermatojenik döngüsü yaklaşık 35 gün sürer49,50. Bu çalışmada kullanılan 30 günlük YC rejimi, tam bir spermatojenik döngüyü kapsamamıştır. Bu nedenle, YC'nin tüm bir spermatojenik döngü üzerindeki terapötik etkilerini sistematik olarak değerlendirmek için ≥35 günlük müdahale protokollerinin uygulandığı gelecek çalışmalara ihtiyaç vardır. Ek olarak, lncRNA NONMMUT031883.2'nin QKI-5'e bağlanmasını takiben meydana gelen; QKI-5 ekleme (splicing) aktivitesindeki değişiklikler ve hücre altı lokalizasyonu ile aşağı akış ekleme hedeflerinin tanınması ve düzenlenmesi gibi kesin moleküler olaylar henüz keşfedilmeyi beklemektedir. Ayrıca, YC tedavisi lncRNA NONMMUT031883.2 ekspresyonunu artırmış olsa da, yukarı akış transkripsiyon faktörleri ve epigenetik mekanizmalar henüz aydınlatılmamıştır. YC tarafından indüklenen lncRNA NONMMUT031883.2 ekspresyonunun moleküler temelini netleştirmek için promoter analizi ve kromatin immünopresipitasyon deneylerini içeren gelecek çalışmalara gereksinim duyulmaktadır. Dahası, gelecek çalışmalarda YC'nin kemoterapi ilişkili erkek infertilitesi olan hastalardaki etkileri değerlendirilmeli ve lncRNA NONMMUT031883.2'nin tanısal veya terapötik bir belirteç olarak potansiyel klinik değerini belirlemek için testis dokusundaki veya semendeki ekspresyonu analiz edilmelidir.

Sonuç olarak YC, lncRNA NONMMUT031883.2'yi yukarı yönlü düzenler ve QKI-5/p38 MAPK yolağının aktivasyonunu inhibe eder; böylece farelerde spermatogonyal apoptozu ve testis hasarını azaltarak spermatojenik disfonksiyonu hafifletir. Bu bulgular, YC'nin spermatojenik disfonksiyona karşı koruyucu etkilerinin altında yatan moleküler mekanizmayı aydınlatmakta ve lncRNA NONMMUT031883.2 ile QKI-5/p38 MAPK yolağının spermatogenezin düzenlenmesindeki rollerine ilişkin mevcut anlayışı genişletmektedir. LncRNA NONMMUT031883.2 ve QKI-5, erkek spermatojenik disfonksiyonu için potansiyel terapötik hedefleri temsil edebilir.

Açıklamalar

Yazarlar, finansal veya finansal olmayan herhangi bir çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.

Teşekkürler

Bu çalışma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (hibe no. 82374257), Jiangsu Geleneksel Çin Tıbbı Eyalet Hastanesi'nin Dördüncü Dönem Tepe Akademik Yetenek Eğitim Programı (hibe no. k2026yrc74) ve Jiangsu Eyaleti Geleneksel Çin Tıbbı ve Entegre Geleneksel Çin ve Batı Tıbbı Bilimsel Araştırma Projeleri (hibe no. CYTF2026019) tarafından desteklenmiştir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Actinomycin DMedChemExpress, Monmouth Junction, NJ, USAHY-17559RNA stabilitesi assayleri için kullanılan transkripsiyon inhibitörü
AMV ters transkriptazTakara, Tokyo, Japonya2621Komplementer DNA sentezi için enzim
Annexin V-APC/PI saptama kitiBioLab Technology, Pekin, ÇinKFS191Apoptozun akış sitometrik analizi için kit
Antifade kapatma medyumuMedChemExpress, Monmouth Junction, NJ, USAHY-K1042Floresans koruması için kapatma medyumu
Bax birincil antikoruAffinity Biosciences, OH, USAAF0120Bax saptaması için birincil antikor
BCA kitiMacklin, Şanghay, ÇinB917925Protein konsantrasyonu tayini için kit
Bcl-2 birincil antikoruAffinity Biosciences, OH, USAAF0769Bcl-2 saptaması için birincil antikor
Sığır serum albüminiBioLab Technology, Pekin, ÇinBTN131070Bloklama reaktifi
Calcein/PI saptama kitiBeyotime, Şanghay, ÇinC2015MCanlı/ölü hücre boyama kiti
Kaspaz-3 aktivite assay kitiBioLab Technology, Pekin, ÇinQN2866Kaspaz-3 aktivitesini ölçmek için kit
Kaspaz-3 birincil antikoruAbcam, MA, USAab184787Kaspaz-3 saptaması için birincil antikor
CCK-8 reaktifiMedChemExpress, Monmouth Junction, NJ, USAHY-K0301Hücre canlılığı değerlendirmesi için reaktif
Kesilmiş kaspaz-3 birincil antikoruAbcam, MA, USAab32042Kesilmiş kaspaz-3 saptaması için birincil antikor
SikloheksimidMacklin, Şanghay, ÇinH823111Protein stabilitesi assayleri için kullanılan protein sentez inhibitörü
SiklofosfamidMedChemExpress, Monmouth Junction, NJ, USAHY-17420Spermatojenik disfonksiyon oluşturmak için kullanılır
DAPI reaktifiBeyotime, Şanghay, ÇinC1006Nükleer karşıt boya
DMEM medyumuWuhan Sunncell Biotechnology, Hubei, ÇinSNLM-302GC-1 hücreleri için hücre kültürü medyumu
ECL çalışma çözeltisiSolarbio, Pekin, ÇinSW2030Protein bandı saptaması için kemilüminesans substrat
EtoposidMedChemExpress, Monmouth Junction, NJ, USAHY-13629Apoptoz indükleyici ajan
Akış sitometresiBD Biosciences, CA, USABD FACSCaliburApoptoz analizi için cihaz
FlowJo yazılımıBD Biosciences, CA, USAv10.8Akış sitometrisi veri analizi için yazılım
Floresans mikroskobuLeica, Heidelberg, AlmanyaDM3000Floresans görüntüleme için cihaz
Floresans işaretli ikincil antikor IgGServicebio, Wuhan, ÇinGB22303İmmünofloresans saptaması için ikincil antikor
Folikül uyarıcı hormon ELISA kitiHuamei Biotech, Wuhan, ÇinCSB-E06871mSerum folikül uyarıcı hormonunu ölçmek için kit
GAPDH birincil antikoruAffinity Biosciences, OH, USAT0004Western blotting için yükleme kontrol antikoru
GC-1 hücreleriWuhan Sunncell Biotechnology, Hubei, ÇinSNL-302Fare spermatogonial hücre hattı
Jel görüntüleme sistemiJinpeng Analysis Instrument, Şanghay, ÇinJP-2880Jel ve blot görselleştirme için görüntüleme sistemi
Jel görüntüleme sistemiInvitrogen, Carlsbad, CA, USAiBright CL1500Western blotlar için kemilüminesans görüntüleme sistemi
Keçi anti-tavşan IgGServicebio, Wuhan, ÇinGB23303Western blotting için ikincil antikor
Hematoksilin çözeltisiBioLab Technology, Pekin, ÇinYT165Histolojik analiz için nükleer boya
Hidroklorik asit etanol diferansiyasyon çözeltisiBeyotime, Şanghay, ÇinC0163SHematoksilin boyama için diferansiyasyon reaktifi
ImageJ yazılımıNational Institutes of Health, USA1.54hGörüntü kantifikasyonu için yazılım
IP hücre lizis tamponuBeyotime, Şanghay, ÇinP0013İmmünopresipitasyon ve protein ekstraksiyonu için lizis tamponu
Ki67 birincil antikoruAffinity Biosciences, OH, USAAF0198Ki67 saptaması için birincil antikor
LDH Sitotoksisite Assay KitiBeyotime, Şanghay, ÇinC0016Laktat dehidrogenaz salınımını ve hücresel hasarı ölçmek için kit
Işık mikroskobuOlympus, Tokyo, JaponyaCKX53Sperm sayımı ve morfolojik gözlem için kullanılır
Lipofectamine 3000Invitrogen, Carlsbad, CA, USAL3000001Transfeksiyon reaktifi
Mikroplaka okuyucuMolecular Devices, CA, USASpectraMax MiniAbsorbans ölçümleri için cihaz
Fare luteinizan hormon ELISA kitiHuamei Biotech, Wuhan, ÇinCSB-E12770mSerum luteinizan hormonunu ölçmek için kit
Fare testosteron ELISA kitiHuamei Biotech, Wuhan, ÇinCSB-E05101mSerum testosteronunu ölçmek için kit
Nötr zamkBioLab Technology, Pekin, ÇinQN1253Histolojik kesitler için kapatma medyumu
p38 birincil antikoruAffinity Biosciences, OH, USAAF6456Toplam p38 saptaması için birincil antikor
ParaformaldehitMedChemExpress, Monmouth Junction, NJ, USAHY-Y0333Hücreler ve dokular için tespit edici
PARIS kitiInvitrogen, Carlsbad, CA, USAAM1921Nükleer ve sitoplazmik RNA fraksiyonlaması için kit
PCR sistemiABI, CA, USAABI PRISM 7300Real-time PCR cihazı
p-p38 birincil antikoruAffinity Biosciences, OH, USAAF3455Fosforile p38 saptaması için birincil antikor
Proteinaz K çözeltisiBeyotime, Şanghay, ÇinST532TUNEL boyama öncesi doku permeabilizasyonu için reaktif
PVDF membranlarMillipore, MA, USAISEQ00010Western blottingde protein transferi için membranlar
QKI-5 birincil antikoruAbcam, MA, USAab126742QKI-5 saptaması için birincil antikor
RNA bağlanma tamponuInvitrogen, Carlsbad, CA, USA65040DRNA-protein bağlanma reaksiyonları için tampon
SDS yükleme tamponuBeyotime, Şanghay, ÇinP0286SDS-PAGE için örnek yükleme tamponu
Streptavidin manyetik boncuklarMedChemExpress, Monmouth Junction, NJ, USAHY-K0208Biotin işaretli RNA problarının yakalanması için manyetik boncuklar
TB Green FAST qPCR KitiTakara, Tokyo, JaponyaCN830SKantitatif PCR için reaktif kiti
Triton X-100Macklin, Şanghay, ÇinT824275Permeabilizasyon reaktifi
TRIzol reaktifiInvitrogen, Carlsbad, CA, USA15596018CNToplam RNA ekstraksiyonu için reaktif
TUNEL saptama çözeltisiBeyotime, Şanghay, ÇinC1086DNA fragmantasyonunun saptanması için reaktif
KsilenMacklin, Şanghay, ÇinX821391Parafin giderme ve doku şeffaflaştırma için reaktif

Kaynaklar

  1. Bhattacharya I, Sharma SS, Majumdar SS. Etiology of male infertility: an update. Reprod Sci. 2024;31(4):942-965.
  2. Dong S, et al. Testicular aging, male fertility and beyond. Front Endocrinol (Lausanne). 2022;13:1012119.
  3. Wang X, et al. Decoding the pathogenesis of spermatogenic failure in cryptorchidism through single-cell transcriptomic profiling. Cell Rep Med. 2024;5(9):101709.
  4. Stallmeyer B, et al. Inherited defects of piRNA biogenesis cause transposon de-repression, impaired spermatogenesis, and human male infertility. Nat Commun. 2024;15(1):6637.
  5. Szlachcikowska D, Koszła O, Sołek P, Tabęcka-Łonczyńska A. Non-canonical apoptosis mediates oxaliplatin-induced disruption of spermatogenic cells: implications for male fertility. Chem Biol Interact. 2026;431:112009.
  6. Chi YN, et al. Geniposide attenuates spermatogenic dysfunction via .inhibition of endoplasmic reticulum stress in male mice. Chem Biol Interact. 2022;366:110144.
  7. Guo XB, et al. Protective effect of bone marrow mesenchymal stem cell-derived exosomes against the reproductive toxicity of cyclophosphamide is associated with the p38 MAPK/ERK and AKT signaling pathways. Asian J Androl. 2021;23(4):386-391.
  8. Lamb DJ. Chromosome defects and male factor infertility. Fertil Steril. 2025;123(6):933-942.
  9. Kathrins M, Niederberger C. Diagnosis and treatment of infertility-related male hormonal dysfunction. Nat Rev Urol. 2016;13(6):309-323.
  10. Piechka A, et al. Molecular mechanisms of cellular dysfunction in testes from men with non-obstructive azoospermia. Nat Rev Urol. 2024;21(2):67-90.
  11. Li Z, et al. The role of Cistanches Herba and its ingredients in improving reproductive outcomes: a comprehensive review. Phytomedicine. 2024;129:155681.
  12. Jiang X, et al. Shenling Baizhu San improves spermatogenic dysfunction in hyperuricemia mice by regulating Sirt3/Nrf2 to inhibit testicular ferroptosis. J Ethnopharmacol. 2025;340:119310.
  13. Deng W, Sun D, Cai B, Jin B. Yangjing capsule improves oligoasthenozoospermia by promoting nitric oxide production through the PLCγ1/AKT/eNOS pathway. Front Pharmacol. 2023;14:1056091.
  14. Zhao H, et al. Yangjing Capsule ameliorates spermatogenesis in male mice exposed to cyclophosphamide. Evid Based Complement Alternat Med. 2015;2015:980583.
  15. Jin B, et al. Yangjing Capsule improves testicular angiogenesis by activating the VEGFA/eNOS signaling pathway. Evid Based Complement Alternat Med. 2020;2020:1957267.
  16. Guo W, et al. Chlorocholine chloride exposure induced spermatogenic dysfunction via .iron overload caused by AhR/PERK axis-dependent ferritinophagy activation. Ecotoxicol Environ Saf. 2024;274:116193.
  17. Wang Z, et al. Yangjing Capsule extract promotes proliferation of GC-1 Spg cells. Evid Based Complement Alternat Med. 2014;2014:640857.
  18. Zhang P, et al. LncRNA-mediated adipogenesis in different adipocytes. Int J Mol Sci. 2022;23(13).
  19. Núñez-Martínez HN, Recillas-Targa F. Emerging functions of lncRNA loci beyond the transcript itself. Int J Mol Sci. 2022;23(11).
  20. Herman AB, Tsitsipatis D, Gorospe M. Integrated lncRNA function upon genomic and epigenomic regulation. Mol Cell. 2022;82(12):2252-2266.
  21. Wang JZ, et al. QKI-5 regulates the alternative splicing of the cytoskeletal gene ADD3 in lung cancer. J Mol Cell Biol. 2021;13(5):347-360.
  22. Zeng Y, et al. Nickel induces blood-testis barrier damage through ROS-mediated p38 MAPK pathways in mice. Redox Biol. 2023;67:102886.
  23. Luo D, He Z, Yu C, Guan Q. Role of p38 MAPK signaling in testis development and male fertility. Oxid Med Cell Longev. 2022;2022:6891897.
  24. Xia C, et al. LncRNA CCAT1 enhances chemoresistance in hepatocellular carcinoma by targeting QKI-5. Sci Rep. 2022;12(1):7826.
  25. Li K, et al. A long noncoding RNA binding to QKI-5 regulates germ cell apoptosis via .the p38 MAPK signaling pathway. Cell Death Dis. 2019;10(10):699.
  26. Zhou X, et al. ANKRD49 inhibits etoposide-induced intrinsic apoptosis of GC-1 cells by modulating NF-κB signaling. Mol Cell Biochem. 2019;457(1-2):21-29.
  27. Fang C, et al. Integrative proteomics and metabolomics approach to identify the key roles of icariin-mediated protective effects against cyclophosphamide-induced spermatogenesis dysfunction in mice. Front Pharmacol. 2022;13:1040544.
  28. Li K, et al. Adeno-associated-virus-mediated delivery of CRISPR-CasRx induces efficient RNA knockdown in the mouse testis. Theranostics. 2024;14(10):3827-3842.
  29. Yi H, et al. Retinoic acid mitigates NSC319726-induced spermatogenesis dysfunction through cuproptosis-independent mechanisms. Cell Biol Toxicol. 2024;40(1):26.
  30. Guo Y, Wang A, Liu X, Li E. Effects of resveratrol on reducing spermatogenic dysfunction caused by high-intensity exercise. Reprod Biol Endocrinol. 2019;17(1):42.
  31. Beeraka NM, et al. Ginsenoside Rh4 suppresses Notch3 and PI3K/Akt signaling to inhibit the growth and metastasis of gastric cancer cells. J Cancer Biomol Ther. 2025;2(1):145-156.
  32. Li P, et al. Proteomic analysis of cisplatin-induced spermatogenesis defects in mice. Ann Med. 2026;58(1):2612816.
  33. Wang Z, et al. Melatonin ameliorates paclitaxel-induced spermatogenesis and fertility defects in mice. J Cell Mol Med. 2022;26(4):1219-1228.
  34. Abdi M, et al. Cyclophosphamide-induced infertility and the impact of antioxidants. Am J Reprod Immunol. 2024;92(6):e70014.
  35. Özbilgin MK, Demirören S, Üçöz M, Oztatlici M. Cyclophosphamide suppresses spermatogenesis in the testes of mice through downregulation of miR-34b and miR-34c. Andrologia. 2021;53(7):e14071.
  36. Poojary KK, et al. Curcumin nanocrystals attenuate cyclophosphamide-induced testicular toxicity in mice. Toxicol Appl Pharmacol. 2021;433:115772.
  37. Cao J, et al. Single-cell map of human azoospermic testes caused by cyclophosphamide chemotherapy. Sci Data. 2024;11(1):163.
  38. Dong Y, et al. New insights into polycyclic aromatic hydrocarbons: Phenanthrene targets ribosomes to induce neuronal apoptosis. Aquat. Toxicol. 2026;298:107884.
  39. Wang Y, et al. Interplay between elemental imbalance-related PI3K/Akt/mTOR-regulated apoptosis and autophagy in arsenic (III)-induced jejunum toxicity of chicken. Environ. Sci. Pollut. Res. Int. 2018;25(19):18662-18672.
  40. Liu H, et al. Integrating network toxicology, transcriptomics and experimental validation to elucidate the potential mechanisms of fluoride-induced neurotoxicity in zebrafish. Comp. Biochem. Physiol. C Toxicol. Pharmacol. 2026;306:110549.
  41. Saleh DO, et al. Cyclophosphamide-induced testicular injury: the role of chrysin in mitigating iron overload and ferroptosis. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 2025;398(5):5475-5489.
  42. Dong S, et al. Loss of lncRNAs 1700101O22Rik and 1700027A15Rik causes sperm malformation and subfertility. Andrology. 2025;13(5):1223-1235.
  43. Liu W, et al. A novel meiosis-related lncRNA, Rbakdn, contributes to spermatogenesis by stabilizing Ptbp2. Front Genet. 2021;12:752495.
  44. Sun TC, et al. LncRNAs induce oxidative stress and spermatogenesis by regulating endoplasmic reticulum genes and pathways. Aging (Albany NY). 2021;13(10):13764-13787.
  45. Hua R, et al. DNM3OS enhances the apoptosis and senescence of spermatogonia associated with nonobstructive azoospermia by providing miR-214-5p and decreasing E2F2 expression. Anal Cell Pathol (Amst). 2023;2023:1477658.
  46. Wang S, et al. Quaking 5 suppresses TGF-β-induced epithelial-mesenchymal transition and cell invasion in lung adenocarcinoma. EMBO Rep. 2021;22(6):e52079.
  47. Chen X, et al. The emerging roles of the RNA-binding protein QKI in cardiovascular development and function. Front Cell Dev Biol. 2021;9:668659.
  48. Li J, et al. Qiangjing tablets repair blood-testis barrier dysfunction in rats by regulating oxidative stress and the p38 MAPK pathway. BMC Complement Med Ther. 2022;22(1):133.
  49. Tang Z, et al. MRE11 is essential for the long-term viability of undifferentiated spermatogonia. Cell Prolif. 2024;57(9):e13685.
  50. Jiao Y, Feng Z, Zhang T, Chen X. Impact of Vitamin D(3) Supplementation on Androgens and Semen Parameters in Infertile Men: A Systematic Review and Meta-Analysis Based on Prospective Randomised Controlled Trials. Arch. Esp. 2025;78(6):772-781.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

BiologyYangjing Capsulesspermatogenic dysfunctionlncRNA NONMMUT031883 2Quaking I 5p38 MAPK pathway

İlgili makaleler