Yöntem makalesi

Subkonjonktival Enjeksiyonlar Kullanılarak TGF-β İndüklü Kemirgen Miyopi Modelinin Oluşturulması

10 görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/73178

⸱

6 Ekim 2026

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Veterinary Medicine, National Chung-Hsing University, 2School of Chinese Medicine, China Medical University, 3Department of Chemistry, National Central University, 4Department of Biomedical Engineering and Environmental Sciences, National Tsing Hua University, 5Department of Obstetrics and Gynecology, China Medical University Hospital

Bu makalede

Özet

Bu protokol, subkonjunktival TGF-β2 enjeksiyonları ile indüklenen, gözlük ve göz kapağı dikişi gerektirmeyen bir kemirgen miyopi modelini tanımlamaktadır; bu model, aksiyel uzamaya neden olmak için NLRP3/IL-1β-MMP2 aksını harekete geçirirken, bölünmüş bir biyometrik kayıt rejimi yüksek doğrulukta veriler elde etmek için anestezi artefaktlarını en aza indirir.

Özet

Miyopi, aşırı aksiyel uzama ve skleral hücre dışı matris (ECM) yeniden şekillenmesi ile karakterize, küresel çapta önemli bir halk sağlığı sorunudur. Bu mekanizmaların araştırılması için deneysel modeller temel öneme sahip olsa da, küçük kemirgenlerde kullanılan geleneksel optik defokus yöntemleri teknik kısıtlamalar sunmaktadır. Burada, transforming growth factor-beta (TGF-β) ile tekrarlayan subkonjunktival enjeksiyonlar aracılığıyla standardize edilebilir bir farmakolojik miyopi modeli kurulmuş ve değerlendirilmiştir. Hedefe yönelik iletim sağlamak amacıyla, üst göz kapağını dışa döndürmek için çift elli bir cerrahi stabilizasyon tekniği geliştirilmiş; böylece 33-gauge bir iğnenin palpebral konjunktiva'yı 20°–30°'lik sığ bir açıyla hedeflemesi sağlanmıştır. Sıçanlarda yapılan in vivo taramalar sonucunda, TGF-β2'nin (500 pg/göz) posterior göz büyümesinin belirgin bir tetikleyicisi olduğu belirlenmiştir. Farelerde yapılan sonraki doz-yanıt titrasyonu, ters U şeklinde bir profil ortaya çıkarmıştır. Birincil doğrulama kohortunda, en düşük doz (250 pg/göz), belirgin aksiyel uzama (0.197 ± 0.012 mm) ve miyopik refraktif kaymalar (−1.58 ± 0.63 D) oluşturmuştur. Moleküler düzeyde, tekrarlayan TGF-β2 uygulaması, her iki türde de retinal NOD-like receptor family pyrin domain-containing 3 (NLRP3) / interleukin-1β (IL-1β) inflamozom kaskadını aktive etmiş ve matrix metalloproteinase 2 (MMP2) ekspresyonunu artırmıştır. Anestezi ile ilişkili artefaktları minimize eden iki günlük bölünmüş biyometrik kayıt rejimi ile birleştirilen bu protokol, anti-miyopi müdahalelerini değerlendirmek için güvenilir ve ölçeklenebilir bir platform sunmaktadır.

Giriş

Miyopi, 2050 yılına kadar dünya nüfusunun yaklaşık %50'sini etkileyeceği öngörülen yaygınlığıyla önemli bir küresel halk sağlığı sorunu haline gelmiştir1,2. Progresif miyopinin temel patolojik itici gücü, aktif hücre dışı matris yeniden şekillenmesine ve doku dejenerasyonuna neden olarak posterior oküler tabakaların yapısal incelmesine yol açan gözün aşırı aksiyel uzamasıdır3. Bu dinamik değişiklikler, hem yapısal yeniden şekillenmeyi (sklera ECM dejenerasyonu, kolajen kaybı ve posterior tabaka incelmesi ile karakterize) hem de fonksiyonel yeniden şekillenmeyi (azalmış biyomekanik rijite, değişmiş koroidal perfüzyon ve aberrant retino-RPE inflamatuar sinyalleşme ile belirginleşen) kapsar; bunlar toplamda miyopik makulopati, retinal konveksite (ayrılma), glokom ve prematüre katarakt dahil olmak üzere görmeyi tehdit eden komplikasyonların ve geri dönüşümsüz görme kaybının ömür boyu riskini artırır4,5,6,7. Bu durumun yarattığı önemli klinik ve sosyoekonomik yüke rağmen, aberrant oküler büyümeyi yöneten kesin üst moleküler mekanizmalar henüz tam olarak anlaşılamamıştır. Bu nedenle, aksiyel uzamayı tetikleyen sinyal yolaklarının aydınlatılması ve tekrarlanabilir, standardize edilmiş hayvan modellerinin geliştirilmesi, yeni terapötik hedeflerin belirlenmesi ve küresel miyopi epidemisinin yönetilmesi açısından kritik adımlardır.

Form yoksunluğu miyopisi (FYM) ve lens kaynaklı miyopi (LKM), optik defokus ve emmetropizasyonun araştırılmasında altın standartlar olarak hizmet etse de8,9,10,11bu optik defokus modellerinin küçük kemirgenlerde —özellikle farelerde— uygulanması ciddi teknik zorluklar teşkil etmektedir. Farelerin aktif temizlenme davranışı sıklıkla gözlüğün yerinden çıkmasına yol açmakta, bu durum koruyucu yakalıklar gibi stres verici karşı önlemleri gerekli kılmaktadır12Ayrıca, mekanik sürtünme, göz kapağı sütürü ve oklüzyon cihazı altındaki değişen mikroortamlar; opaklık veya kornea ülserasyonu gibi sekonder kornea komplikasyonlarına rutin olarak neden olur.13,14,15FDM ve LIM, görsel defokusun incelenmesinde temel paradigmalar olmaya devam ederken; kornea opasitesi, mekanik sürtünme veya göz kapağı sütür irritasyonu gibi sekonder oküler yüzey komplikasyonları, optik biyometrik ölçümleri etkileyebilir.15Bu prosedürel artefaktlar, gözyaşı filmi stabilitesini ve kornea şeffaflığını bozarak daha yüksek deneysel hariç tutma oranlarına ve ölçüm gürültüsünün artmasına yol açmaktadır.13,16Buna karşılık, farmakolojik indüksiyon fiziksel tıkaçları baypas ederek korneal berraklığı korur ve güvenilir, tekrarlanabilir optik ve ultrasonik biyometriyi kolaylaştırır. Miyopide, aşırı oküler uzama, posterior skleranın değişmiş hücre dışı matriks (ECM) yeniden şekillenmesi tarafından tetiklenir.17, burada transforme büyüme faktörü-beta (TGF-β) izoformları, kolajen ve proteoglikan sentezinin kilit düzenleyicileri olarak görev yapar18,19Yeni kanıtlar, TGF-β sinyalizasyon, düşük dereceli oküler inflamasyon ve matriks metalloproteinaz 2 (MMP2) aracılı matriks yıkımı ile kesişebilir20, potansiyel olarak sklera yeniden şekillenmesine ve aksiyel uzamaya katkıda bulunarak21,22,23,24Bu durum, yükselmiş transforme büyüme faktörü-beta 2 (TGF-β2), interlökin-6 (IL-6) ve miyop gözlerin aqueous humorunda bildirilen MMP225,26,27yanı sıra TGF- aktivasyonu daβ / nükleer faktör kappa B (NF-κDeneysel modellerde B) / MMP2 ekseni20,21Bu bulgular, miyopik progresyon sırasındaki dinamik intraoküler moleküler sinyallemeyi yansıtsa da; ön bölgedeki lokal salgılamadan, subkonjonktival depo akışından veya posterior vitreus difüzyonundan kaynaklanan aqueous humor belirteçlerinin göreceli anatomik katkıları henüz tam olarak aydınlatılmamıştır. Bununla birlikte, bu farmakolojik modelin kapsamı ve doğal sınırlılıkları kabul edilmelidir. Subkonjonktival TGF-β iletimi optik defokus ve görsel işleme yolaklarını devre dışı bıraktığından, bu model downstream biyokimyasal kaskadların—özellikle TGF-β2 / NOD benzeri reseptör ailesi pyrin alanı içeren 3 (NLRP3) / interlökin-1β (IL-1β) / MMP2 aracılı skleral ECM yeniden yapılanması ve enflamatuar veya matriks degradasyon yollarını hedefleyen aday terapötik ajanların taranması için uygundur. Aksine; geleneksel FDM veya LIM modellerinin vazgeçilmez olmaya devam ettiği upstream görsel sinyal iletimi, retinadan skleraya optik sinyalleşme veya çevresel ışık kaynaklı emmetropizasyon mekanizmalarının araştırılması için uygun değildir.

Bu metodolojik boşlukları gidermek amacıyla, sıçanlarda ve farelerde tekrarlanan subkonjonktival TGF-β enjeksiyonları kullanılarak bir miyopi modeli oluşturulmuş ve doğrulanmıştır; bu yöntem, mekanik travmayı ve oküler yüzey irritasyonunu minimize eden geliştirilmiş bir yaklaşım sunmaktadır. Fiziksel oklüderlere olan ihtiyacı ortadan kaldıran bu protokol, başa takılan donanımlarla ilişkili potansiyel davranışsal karıştırıcı faktörleri önemli ölçüde azaltırken, farmakolojik dozaj ve deneysel zaman çizelgeleri üzerinde hassas kontrol sağlar. Bu çalışmada, üç rekombinant insan TGF-β izoformunun (sekans korunumunun desteklediği, kemirgen dokularda doğrulanmış fonksiyonel çapraz reaktiviteye sahip olan28) gücü sıçanlarda değerlendirilmiş ve farelerde TGF-β2'nin doğrusal olmayan doz-yanıt kinetiği haritalandırılmıştır. Önemli bir nokta olarak, bu standartlaştırılmış rejim, eş zamanlı aksiyel uzama ve miyopik refraktif kaymalarla karakterize edilen fenotipik miyopiyi etkin bir şekilde indüklemiş ve retinal NOD-benzeri reseptör ailesi pyrin alanı içeren 3 (NLRP3) / interlökin-1β (IL-1β) inflamozom ve MMP2 aksını aktive etmiştir. Nihayetinde bu protokol, spesifik operasyonel sınırlarını detaylandırırken, downstream skleral yeniden şekillenmeyi hedeflemek için uygulanabilir ve moleküler olarak tanımlanmış bir çerçeve sunmaktadır.

Protokol

Tüm hayvan deneyleri, Çin Tıp Üniversitesi (CMU) Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC)'nin yönergeleri ve düzenlemelerine uygun olarak gerçekleştirildi. Tüm işlemler, Göz Hastalıkları ve Görme Araştırmalarında Hayvan Kullanımı ile İlgili Araştırma Derneği için Görme Araştırmaları (ARVO) açıklamasına uygun olarak yürütüldü. Tüm deneylerin başlamasından önce CMU-IACUC'den tam onay alınmıştır. Hayvanlar, deneyin son aşamasında Çin Tıp Üniversitesi (CMU) Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) ve yerel hayvan refahı düzenlemelerinin katı kurallarına göre sonlandırıldı.

1. Hayvanlar ve etik onay

  1. Erkek Brown Norway (BN) sıçanları (3–4 haftalık, 60–80 g) ve erkek C57BL/6 (B6) fareleri (3–4 haftalık yaş, 15–20 g) uygun bir laboratuvar hayvanı tedarikçisinden.
  2. Hayvanların tamamını kontrollü bir ortamda (12 saat aydınlık/karanlık döngüsü, 22 °C ± 2 °%50 C ± %10 nisbi nem) koşullarında standart yem ve suya serbest erişimle.
  3. Herhangi bir deneysel işlem başlamadan önce en az 3 gün boyunca alıştırma süresi bırakın.
  4. Sıçanları veya fareleri rastgele tedavi gruplarına ata: taşıyıcı kontrol grubu ve TGF-β2 enjeksiyon grubu. Yeterli istatistiksel güce sahip olmak için her kohortta en az N = 5 hayvan kullanın.
    NOT: Bireyler arası bir tasarım kullanıldı. Bireysel bir hayvanın her iki gözüne de aynı uygulama yapıldı (ya iki taraflı araç kontrolü [1–2 µL BSS] veya bilateral aktif rhTGF-β2).
    1. Her bir hayvan için bilateral oküler parametreleri (aksiyal uzunluk ve refraktif hata) ölçün.
      NOT: Yazılı CMU-IACUC onayının alındığından emin olun ve tüm prosedürleri gerçekleştiren personelin uygun şekilde eğitilmiş ve sertifikalı olduğundan emin olun.

2. TGF'nin Hazırlanmasıβ2 çözelti

NOT: Tüm yeniden çözme ve seyiltme adımlarını, sertifikalı bir biyogüvenlik kabini içinde katı aseptik teknikler kullanarak gerçekleştirin.

  1. Liofilize edilmiş rekombinant insan TGF-β'yı yeniden çözünβ2, bovine serum albüminin (BSA) %0,1'sini içeren steril %50 gliserolde çözülerek 100 µg/mL stok çözeltisi.
  2. Stok çözeltinin steril Dengeli Tuzlu Çözelti (BSS) içinde seri seyreltmelerini yaparak çalışma çözeltilerini hazırlayın.
    1. Sıçan grupları için (500 pg doz), stok çözeltiyi son konsantrasyonu 250 ng/mL (250 pg/µL) 2 için µGöz başına L enjeksiyon hacmi
    2. Fare doz-yanıt kohortları için 250 ng/mL, 375 ng/mL ve 500 ng/mL (250, 375 ve 500 pg/µL) 1 için µGöz başına L enjeksiyon hacmi.
  3. Tek kullanımlık 15–20 µL alikotlarını steril mikrosantrifüj tüplerine alın, sıvı azotda aniden dondurun ve -20°C'de saklayın °C. Çözmek için kullanımdan hemen önce buz üzerindeki alikotları çözün.
    DİKKAT: Sıvı azot, şiddetli soğuk yanıklarına neden olabilir ve asfiksi tehlikesi oluşturabilir. Kurumsal güvenlik prosedürlerine uygun olarak, uygun kriyojenik kişisel koruyucu ekipmanı giyin ve iyi havalandırılmış bir alanda kullanın.
  4. Araç kontrol çözeltisini, steril BSS'ye eşdeğer matriks olarak %50 gliserol ve %0,1 BSA ilave edilerek paralel olarak hazırlayın.

3. Subkonjunktival enjeksiyon prosedürü

  1. Hayvanları 3 ile indüksiyon odasına yerleştirin–% isofluran ile anestezi indüksiyonu. Daha sonra hayvanı 1,5–Anestezi devamı için %2 izofluran.
    UYARI: İzofluran, uçucu bir anesteziktir. Uygun bir emme sistemi kullanın ve kurumun mesleki sağlık ve güvenlik prosedürlerine uygun şekilde işlem yapın.
  2. Ayak parmaklarına pinç çekilmesiyle geri çekme refleksinin olmamasını doğrulayarak yeterli anestezi derinliğini kontrol edin.
  3. Hayvanı fiber-optik bir ışık noktası altında yüzüstü pozisyona yerleştirin. Palpebral konjunktiva ve konjunktival fornix'i tamamen açığa çıkarmak için ince uçlu mikroforceps kullanarak üst göz kapağını hafifçe tutun, kaldırın ve hafifçe evert edin (Şekil 1B).
  4. 10'un ön ıslatılması µL cam mikro şırınga ve 33 gauge iğne 2–çalışma çözeltisiyle 3 kez geçirerek ölü hacmi ortadan kaldırın. Hedef hacmi (2 µsıçanlar için L veya 1 µL fareler için) ve tüm mikro kabarcıkları giderin.
    UYARI: İğneleri ve diğer keskinleri dikkatli tutun ve kurumun düzenlemelerine uygun olarak onaylanmış bir keskinler kabına atın.
  5. 33-G iğneyi, eğimli kısmı yukarı bakacak şekilde (eğimli kısım yukarı) yerleştirin ve açığa çıkan palpebral konjonktiva yüzeyinde belirlenmiş giriş noktasını hedefleyin (Şekil 1B, C).
  6. Konjonktival epitelyuma iğne ucunu 20°'lik sığ bir açıyla geçirin°–30° açı (Şekil 1C).
  7. İğneyi nazikçe konjonktival forniks üzerinden dar submukozal boşluktan geçerek palpebral subkonjonktival bölgeye ilerletin (Şekil 1C).
    KRİTİK ADIM (kaçınılması gereken yapılar): Altta yer alan meibom bezlerine nüfuz etmekten veya daha derin göz yapılarını yanlışlıkla delmekten kesinlikle kaçının. İğne ucu öneği ilerlerken şeffaf konjonktival yüzeyin hemen altında görünür olacak şekilde kalarak, ışık altındaki doğru yüzeyel yerleşimini görsel olarak doğrulayın.
  8. 5 dakika boyunca çözeltiyi yavaşça enjekte edin–10 s. Sonra, sıvının geri kaçmasını önlemek için enjeksiyon iğnesini yavaşça geri çekmeden önce ek 5 s süreyle yerinde tutun.
    ​NOT: Uygun subkonjonktival uygulama, anında lokalize konjonktival kabarma ve solma (bleb oluşumu) ile doğrulanır.
    1. Eğer bir kabarcık oluşmazsa veya önemli sızma meydana gelirse, inferior palpebral konjunktival boşluğa tek bir yeniden enjeksiyon uygulayın ve deneysel kayıda bu sapmayı kaydedin.
      NOT: Tek bir seans başına her göz için yeniden enjeksiyonu kesinlikle bir denemeyle sınırlayın; sürekli teslimat başarısızlığı olan hayvanları uzunlamasına analizden çıkarın.
  9. Aynı gruptaki bireysel hayvan enjeksiyonları arasında mikro-enjektör boşluğunu dezenfekte etmek için 3 kez steril %70 etanol ve ardından 5 kez steril serum fizyolojik ile yıkayın.
  10. Büyüteç altında 33-G iğne ucunu her 3–5 enjeksiyon ve uçta körelme veya bükülme meydana gelirse hemen iğneyi değiştirin.
  11. Önce tüm taşıyıcı-kontrol hayvanlarını, tedavi grubu hayvanlara dokunmadan veya onlara enjekte etmeden önce enjekte ederek farmakolojik çapraz bulaşma riskini ortadan kaldırın. Tedavi gruplarına geçiş yapmadan önce şırınga dezenfeksiyon sürecini tekrarlayın.
  12. Her deneysel oturumdan sonra şırınga gövdesini ve iticiyi özel bir mikro şırınganın temizleme çözeltisiyle, ardından ultrapure su ve absüly alkollerle durulayın ve kuru ortamda saklayın.
  13. Subkonjunktival enjeksiyonları 3 ardışık hafta boyunca haftada bir kez tekrarlayın (0, 7 ve 14. Günler). Temel değer biyometrik değerlendirmeleri başlangıçta (0. Gün) ve takip süresince −1 ve 0) ve bitiş noktası (Gün 20 ve 21) Şekil 4'te ayrıntılı olarak belirtildiği gibi
  14. Hayvanı enjeksiyondan sonra kağıt havşuyla kaplı, sıcak bir iyileşme kafesine yerleştirin. Hayvan tam sternum recumbency'sini ve normal yürüyüş aktivitesini kazanana kadar sürekli olarak izleyin.
  15. Stereomikroskop altında, intraoküler kanamayı, kornea opaklığını veya akut mekanik travmayı dışlamak için iyileşme sonrası gözleri inceleyin. Hayvanları stres belirtileri veya lokal enfeksiyon açısından her gün gözlemleyin.

4. Model doğrulama yöntemleri

  1. Göz refraktif kusur değerlendirmesi
    1. Kemirgenleri fizyolojik vücut sıcaklığını korumak ve anestezik kataraktları önlemek için termostatik kontrollü bir ısıtma pedi üzerine yerleştirin. Hayvanları hafif izofluran anestezisi altında tutun (1–%1,5) buharı bir burun konisi aracılığıyla verilerek anestezi derinliğinin tutarlı olması sağlanır.
    2. Her göze 1 damla Mydrin-P (0,5% tropikamid ve 0,5% fenilefrin hidroklorür) uygulayın 10–Ölçümün 15 dakika öncesinde tam siklopleji ve pupilla dilatasyonunu indüklemek için.
    3. Hayvanı zayıf, dolaylı ortam ışığı altında göğüs üstü yatış pozisyonuna yerleştirin. Kornea şeffaflığını korumak için steril BSS'yi optik görüntüleme anına kadar sürekli uygulayın.
    4. Otoleştirilmiş kızılötesi fotoresfraktometre kullanarak göze ait kırılma kuvvetini katı bir 5–Anestezi indüksiyonundan sonraki 10 dakikalık pencere. BN sıçanlar için, görüntüleme sırasında genişlemiş pupili tamamen açığa çıkarmak amacıyla göz kapaklarını elle nazikçe gerin.
    5. Her göz için üç bağımsız optik ölçüm alarak değerleri ortalamak ve bazal veya son nokta refraktif kusuru belirlemek.
      ​KRİTİK ADIM (Süre & Sıra): Değerlendirme sırasının 1. Gününde (Gün –Temel değerler için 1. gün; sonuç noktası için 20. gün) herhangi bir kontakt prosedüründen önce zayıf aydınlatma koşullarında fotorefraksiyon yapılmalıdır. Kontakt ultrasonografi veya akustik jel uygulamasından sonra fotorefraksiyon yapılması, kornea optiğini ciddi şekilde bozar, kızılötesi ışığı dağıtır ve otomatik refraktif ölçümleri geçersiz kılar.
  2. Yüksek frekanslı B-tipi tarama ultrasonografi ile aksiyel uzunluk ölçümü
    1. Bir sonraki gün (bazal değer için 0. Gün veya sonuç noktası için 21. Gün), hafif izofluran anestezi altında oküler aksiyel uzunluğu değerlendirin (1–%1,5) 16 MHz'lik bir el tipi lineer ultrason probu kullanılarak, kemirgen doku akustik hızına (1532–1550 m/s
      1. B6 fareleri için (doğrudan korneal arayüz): Korneaya doğrudan Ginpol karbomer jel (%0,2) bazal koruyucu katmanını uygulayın ve ardından standart akustik jel katmanı ekleyin.
        NOT: Jel katmanının hava kabarcığı kalmayacak şekilde kornea yüzeyini tamamen kapladığını doğrulayın; hava kabarcıkları akustik zayıflamaya neden olur.
      2. BN Sıçanları için (transpalpebral arayüz): Hayvanı kapalı göz kapaklarıyla yerleştirin, dış göz kapağının üzerine ultrason jeli uygulayın ve ölçümleri transpalpebral olarak alın.
        NOT: Transpalpebral ölçüm, kornea ile doğrudan teması ortadan kaldırarak büyük kemirgen gözlerinde kornea abrazyonu riskini önemli ölçüde azaltır.
    2. Ultrason probunu hizalayın ve ön oküler yüzeyden posterior skleral ekoya kadar merkezi optik eksen boyunca eksenel uzunluğu ölçün.
    3. Her göz için on bağımsız tekrarlı B-taraması izi elde edin ve ortalama eksenel uzunluğu hesaplayın.
    4. İşlem sonrası korneal irritasyonu önlemek için, elde edilen verilerin hemen ardından gözde kalan akustik jeli steril BSS ile nazikçe temizleyin.
      KRİTİK ADIM (sıfır basınç teması): Ultrason probunu jel arayüzüne son derece hafif, sıfır basınçlı bir dokunuşla yerleştirin. Kornea apeksine uygulanan herhangi bir aşağı yönlü fiziksel baskı, ön göz segmenti derinliğini yapay olarak azaltır ve yanlış eksenel uzunluk kısalmasına neden olur.
    5. Ortalama aksiyel uzunluk ve refraktif hata ölçümlerini sonraki analizler için kaydedin.

Sonuçlar

Subkonjonktival enjeksiyon modelinin oluşturulması ve anatomik doğrulaması
Optik gözlükleme veya göz kapağı sütürasyonu ile ilişkili teknik değişkenliği gidermek için, hedeflenen lokalize bir ilaç rezervuarı olarak palpebral ve bulbar konjonktivalar arasındaki subkonjonktival alan valide edilmiştir (Şekil 1A). Süperior forniks yoluyla sağlanan anatomik erişim, oküler yüzey bütünlüğünü korurken hedef bölgenin tutarlı bir şekilde açığa çıkmasını sağlamıştır (Şekil 1B). Modelin başarılı bir şekilde oluşturulduğu; sklera perforasyonu, doku hemorajisi veya meibomian bezi hasarı olmaksızın, hedef palpebral subkonjonktival alan üzerinde lokalize, sıvı dolu submukozal bir bleb (kemozis) oluşumunun anlık transilüminasyon doğrulaması (Şekil 1C) ve ayrıca 21. günde araçla tedavi edilen kontrollere kıyasla miyopik refraktif kayma (Δ Refraction < −1.0 D) ile birlikte eş zamanlı aksiyel uzamanın (farelerde Δ AL > 0.15 mm; sıçanlarda >0.40 mm) boylamsal biyometrik doğrulaması dahil olmak üzere spesifik operasyonel ve biyometrik kriterlerle onaylanmıştır. Aksine, başarısız veya suboptimal sonuçlar spesifik teknik ve fizyolojik hata modları ile tanımlanmıştır. İğne geri çekildiğinde meydana gelen erken sıvı reflüsü veya yanlışlıkla derin göz kapağı/orbital doku penetrasyonu gibi teknik hatalar, minimal veya hiç bleb oluşmamasına neden olmuş; bu durum yetersiz farmakolojik tutuluma ve miyopik kaymaların indüklenememesine yol açmıştır; sürekli sızıntı gösteren hayvanlar belgelenmiş ve Protokol Adım 3.8.1'e göre çalışma dışı bırakılmıştır. Ayrıca, iğnenin derin ve yanlış yerleştirilmesinden veya aşırı mekanik traksiyondan kaynaklanan oküler yüzey komplikasyonları, lokalize subkonjonktival hemorajiye veya kornea travmasına neden olarak karıştırıcı inflamatuar yanıtlar meydana getirmiştir. Doz-yanıt değerlendirmeleri sırasında, eşik üstü konsantrasyonların uygulanmasının (örneğin, farelerde göz başına 500 pg) azalmış aksiyel uzama ile sonuçlanan zayıflatılmış U şeklinde bir yanıta yol açtığı ve suboptimal fenotipik sonuçların gözlendiği görülmüştür; bu durum sıkı doz optimizasyonunun fizyolojik gerekliliğini vurgulamaktadır. Bu standart kriterler altında doğrulanan lokalize ilaç tutulumu, sonraki biyometrik ve moleküler analizler için yüksek sadakatli doku hedeflemesini sağlamıştır.

figure-results-1
Şekil 1: Kemirgenlerde subkonjonktival enjeksiyon prosedürünün anatomik işaretleri ve şematik illüstrasyonu. (A) Göz kapağı, kornea, konjonktival sak ve hedeflenen subkonjonktival alan dahil olmak üzere temel anatomik işaretleri gösteren kemirgen gözünün sagital kesiti. (B) Mikroforceps kullanılarak doku stabilizasyonunun ve palpebral konjonktiva ekspozisyonunun cerrahi gösterimi; mavi nokta, 33G şırınga kullanılarak yapılacak mikroenjeksiyon için hedef iğne giriş yerini göstermektedir. (C) İğne yönelimini ve palpebral konjonktival yüzey, konjonktival forniks ve alttaki oküler yapılarla ilgili giriş yörüngesini gösteren yüksek büyütmeli şema. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Sıçanlarda TGF-β izoformlarının taranması ve farelerde aksiyel uzama için TGF-β2 doz-yanıt titrasyonu
Deneyler; doz tarama kohortları (Şekil 2) ve birincil doğrulama kohortlarından (Şekil 3) oluşan ardışık, bağımsız deneysel kohortlarda yürütülmüştür. Kohortlar genelinde bilateral parametreler ölçülmüş ve bireysel hayvanlar (N) birincil biyolojik replika olarak belirlenmiştir. Gözler arası bağımlılıklar (aynı hayvan içindeki OD'ye karşı OS), uygun yerlerde iki yönlü tekrarlanan ölçümler ANOVA veya karma etkili modeller kullanılarak hesaba katılmıştır. Sürekli veriler ortalama ± SD olarak sunulmuştur. Kontrol ve tedavi grupları arasındaki farklar, uygun yerlerde iki kuyruklu Student t-testleri, tek yönlü ANOVA veya iki yönlü tekrarlanan ölçümler ANOVA kullanılarak değerlendirilmiştir. p-değeri < 0,05 istatistiksel olarak anlamlı kabul edilmiştir.

En etkili transforme büyüme faktörü-β (TGF-β) izoformunu belirlemek ve aksiyel uzamayı indüklemek için optimal bir dozaj rejimi oluşturmak amacıyla, sıçan ve fare kohortlarında başlangıçtan (Gün 0) 21. Güne kadar (Şekil 2>) tekrarlayan subkonjonktival enjeksiyonların etkileri değerlendirildi. Anestezi kaynaklı artefaktları önlemek için iki günlük bölünmüş rejim kullanılarak biyometrik kayıtlar gerçekleştirildi.

Üç rekombinant insan TGF-β izoformu (TGF-β1, TGF-β2 ve TGF-β3), öncelikle sıçan kohortunda 500 pg/göz standart konsantrasyonda taranmıştır (Şekil 2A). Tek yönlü ANOVA ve ardından yapılan post hoc çoklu karşılaştırmalar, 21 günlük süre boyunca her üç izoformun da araçla (vehicle) tedavi edilen kontrol grubuna kıyasla posterior oküler büyümeyi anlamlı derecede stimüle ettiğini ortaya koymuştur. Hem TGF-β1 (0,444 ± 0,042 mm) hem de TGF-β3 (0,454 ± 0,049 mm) anlamlı aksiyel uzamayı teşvik ederken (kontrol olan 0,328 ± 0,071 mm'ye karşı sırasıyla p < 0,05 ve p < 0,01), TGF-β2 en yüksek aksiyel uzunluk artışını (0,486 ± 0,074 mm) tetiklemiş ve en yüksek istatistiksel anlamlılığı (p < 0,001) göstererek miyopik fenotipin en etkili indükleyicisi olduğunu kanıtlamıştır.

Sıçan tarama sonuçlarına dayanarak, fare kohortunda üç farklı konsantrasyon (250, 375 ve 500 pg/eye) test edilerek TGF-β2'nin doz-yanıt titrasyonu gerçekleştirilmiştir (Şekil 2B). Subkonjonktival TGF-β2 uygulaması, ters U şeklinde bir doz-yanıt profili ile sonuçlanmıştır. En düşük doz (250 pg/eye), araç kontrollerine kıyasla aksiyel uzamada en belirgin hızlanmayı sağlamıştır (0.177 ± 0.038 mm'ye karşı 0.044 ± 0.011 mm; p < 0.0001). Daha yüksek dozlarda (375 ve 500 pg/eye), aksiyel uzunluk değişim miktarı kademeli olarak azalmış olsa da, kontrol grubuna göre anlamlı derecede yüksek kalmaya devam etmiştir (sırasıyla 0.123 ± 0.029 mm; p < 0.001 ve 0.095 ± 0.024 mm; p < 0.01).

Bu veriler birlikte, sıçanlar için göz başına 500 pg ve fareler için göz başına 250 pg'lik haftalık subkonjonktival rejimin, sonraki yapısal ve moleküler incelemeler için optimal parametreler olduğunu ortaya koymaktadır.

figure-results-2
Şekil 2transforming büyüme faktörü için doz seçimi taraması-β (TGF-β) izoformları ve konsantrasyonlarının sıçan ve fare gözlerinde aksiyel uzunluk üzerindeki etkileri. (A) Sıçanlarda (başlangıç tarama kohortu), üç ardışık TGF-β subkonjonktival enjeksiyonu sonrası, başlangıç (0. Gün, ilk enjeksiyondan önce) ve final son nokta (21. Gün) arasındaki fark olarak hesaplanan aksiyel uzunluktaki değişimβ1, TGF-β2, veya TGF-βaraçla (vehicle) işlem görmüş kontrollerle karşılaştırıldığında (0, 7 ve 14. günlerde göz başına 500 pg şeklinde uygulanan 3).B) Farelerde aksiyel uzunluktaki değişim (doz tarama kohortu); TGF-β'nın üç ardışık subkonjonktival enjeksiyonu sonrası, başlangıç (0. Gün) ve 21. Gün arasındaki fark olarak hesaplanmıştır.βüç farklı konsantrasyonda (0, 7 ve 14. günlerde göze uygulanan 250, 375 veya 500 pg), araçla işlem görmüş kontrollerle karşılaştırılmıştır. Veriler ortalama olarak sunulmuştur ± SD (N = grup başına 5 hayvan, grup başına 10 gözü temsil etmektedir). İstatistiksel anlamlılık, tek yönlü ANOVA ve ardından post hoc çoklu karşılaştırmalar ile değerlendirilmiştir; *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < araç kontrol grubuna kıyasla 0,0001. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tekrarlanan subkonjunctival TGF-β2 enjeksiyonları sıçanlarda ve farelerde oküler aksiyel uzama ve miyopik kaymaları indükler
Tekrarlanan subkonjunctival TGF-β2 uygulamasının (haftalık 3 enjeksiyon) biyometrik etkisini değerlendirmek için, hem sıçan hem de fare modellerinde başlangıçtan 3. Haftaya kadar olan oküler aksiyel uzunluk ve refraktif hata ile ilgili boylamsal değişiklikler izlendi (Şekil 3). İki günlük bölünmüş protokol (refraktif durum 20. Günde kaydedilmiş, ardından 21. Günde B-tarama ultrasonografisi yapılmıştır), potansiyel anestezik artefaktları ve oküler stresi minimize etmiştir. Her iki tür de bu çoklu doz rejimi sonrası deneysel miyopi gelişimiyle uyumlu fenotipik kaymalar göstermiştir.

Sıçan kohortunda, göz başına 500 pg TGF-β2 şeklinde tekrarlanan subkonjonktival enjeksiyonlar alan hayvanlar, taşıyıcı kontrollerine kıyasla 21 günlük süre boyunca aksiyel uzunlukta anlamlı derecede daha fazla artış göstermiştir (0,466 ± 0,045 mm'ye karşı 0,388 ± 0,032 mm; p < 0,01; Şekil 3A). Bu uzamaya, refraksiyon kusurunda anlamlı bir miyopik kayma eşlik etmiştir (p < 0,05; Şekil 3B). Taşıyıcı kontrol gözleri beklenen hafif bir hiperopik kayma (+0,31 ± 0,93 D) sergilerken, TGF-β2 ile tedavi edilen gözler miyopik bir refraksiyon durumuna (−1,38 ± 0,91 D) geçiş yapmıştır.

Sıçan verileriyle tutarlı olarak, göz başına 250 pg TGF-β2 ile tedavi edilen farelerde de belirgin yapısal ve refraktif değişiklikler gözlenmiştir. TGF-β2 ile tedavi edilen farelerde aksiyel uzama, araç kontrollerine kıyasla anlamlı derecede artmıştır (0.197 ± 0.012 mm'ye karşılık 0.110 ± 0.014 mm; p < 0.0001; Şekil 3C). Ayrıca, bu yapısal uzama anlamlı bir miyopik kaymaya yol açmış (p < 0.05; Şekil 3D), kontrol farelerinde görülen doğal hipermetropik refraksiyonu (+2.25 ± 1.77 D) etkili bir şekilde miyopik bir profile (−1.58 ± 0.63 D) dönüştürmüştür.

Oküler yanıt simetrisini doğrulamak ve bilateral oküler ölçümlerin birleştirilmesinin istatistiksel bir yanlılığa yol açmadığını teyit etmek amacıyla, her grup içindeki sol (OS, n = 5) ve sağ (OD, n = 5) gözler için aksiyel uzama dinamikleri ayrı ayrı değerlendirilmiştir (Ek Şekil 1). Hem sıçanlarda (Ek Şekil 1A) hem de farelerde (Ek Şekil 1B), vehicle-kontrol veya TGF-β2 uygulanan kohortların her ikisinde de OS ve OD gözler arasında istatistiksel olarak anlamlı bir fark gözlemlenmemiş, bu da gözler arasında simetrik yanıt dinamiklerinin olduğunu doğrulamıştır. Ayrıca, TGF-β2 uygulanan hayvanların hem OS hem de OD gözleri, ilgili vehicle kontrollerine kıyasla tutarlı ve belirgin bir aksiyel uzama göstermiştir (sıçanlar için p < 0.05; fareler için p < 0.0001), bu durum birincil biyometrik analizde bilateral ölçümlerin dikkate alınmasının geçerliliğini desteklemektedir.

Kolektif olarak bu bulgular, tekrarlayan subkonjonktival TGF-β2 uygulamalarının hem kemirgen modellerinde hem de (Şekil 3 ve Ek Şekil 1) posterior oküler büyümeyi ve buna bağlı miyopik refraktif kaymayı etkili bir şekilde tetiklediğini göstermektedir.

figure-results-3
Şekil 3: Bağımsız sıçan ve fare kohortlarında TGF-β2 etkilerinin aksiyel uzama ve refraktif hata üzerindeki birincil doğrulaması. (A) Subkonjonktival TGF-β2 (0, 7 ve 14. Günlerde ardışık olarak uygulanan 500 pg/göz) veya araç kontrolü alan gözlerde, bazal değer ile 3. Hafta nihai son nokta arasındaki fark olarak hesaplanan aksiyel uzunluktaki değişim. (B) Aynı sıçan gözlerindeki refraktif hatadaki değişim; TGF-β2 ile tedavi edilen grupta araç kontrol grubuyla karşılaştırıldığında anlamlı bir miyopik kayma görülmektedir. (C) Farelerde (bağımsız birincil doğrulama kohortu), subkonjonktival TGF-β2 (0, 7 ve 14. Günlerde uygulanan 250 pg/göz) veya araç kontrolü alan gözlerde, bazal değer ile 3. Hafta nihai son nokta arasındaki fark olarak hesaplanan aksiyel uzunluktaki değişim. (D) Aynı fare gözlerindeki refraktif hatadaki değişim; optimal TGF-β2 indüksiyonu altında buna karşılık gelen negatif diyoptrik bir kayma ortaya çıkmaktadır. Veriler ortalama ± SD (grup başına 10 gözü temsil eden N = 5 hayvan/grup) olarak sunulmuştur. İstatistiki anlamlılık, eşleştirilmemiş iki kuyruklu t-testleri kullanılarak titizlikle değerlendirilmiştir; karşılık gelen araç kontrol grubuna kıyasla *p < 0.05, **p < 0.01, ****p < 0.0001. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Subkonjonktival TGF-β2 uygulaması, deneysel miyopi ilerlemesi sırasında skleral MMP2 ekspresyonunu yukarı düzenler
Retino-skleral eksen boyunca gerçekleşen alt akış doku yeniden şekillenmesini değerlendirmek amacıyla, subkonjonktival TGF-β2 uygulamasının ardından sklera kesitlerindeki matriks metalloproteinaz 2 (MMP2) ekspresyonu incelendi (Şekil 4). Sıçan modelindeki posterior oküler kesitlerin kantitatif immunofloresan analizi, 21. Gün'de TGF-β2 ile tedavi edilen gözlerin (500 pg/göz) sklera stromasında, araç kontrollerine kıyasla MMP2 protein seviyelerinde anlamlı bir artış olduğunu göstermiştir (p < 0.0001; Şekil 4A, B).

Belirgin bir MMP2 floresan sinyali, retinal pigment epitelyumu (RPE) ve koroid tabakalarının altında yer alan skleral matriks boyunca lokalize olmuştu; bu durum, deneysel miyopi gelişimi sırasında dış oküler kılıfta lokalize MMP2 ile ilişkili hücre dışı matriks (ECM) yeniden şekillenmesini doğrulamaktaydı. Skleradaki bu yapısal değişiklikler, bitişik retinadaki yukarı akışlı moleküler değişikliklerin daha derinlemesine araştırılmasını sağlamıştır.

figure-results-4
Şekil 4: Subkonjonktival TGF-β2 uygulaması sıçan sklerasında MMP2 ekspresyonunu yukarıye düzenler. (A) Kontrol ve TGF-β2 ile işlem görmüş (göz başına 500 pg) sıçanlarda 21. gündeki skleral MMP2 ekspresyonunu (kırmızı) gösteren posterior oküler kesitlerin temsilci immünofloresan görüntüleri. Hücre çekirdekleri DAPI (mavi) ile karşıt boyanmıştır. Brightfield bindirme (Merge+BF), RPE, koroid ve skleranın anatomik sınırlarını belirler. Ölçek çubuğu = 50 µm. (B) TGF-β2 ile işlem görmüş sıçan gözlerinde skleral MMP2 ekspresyonundaki anlamlı artışı doğrulayan floresan boyama yoğunluğunun kantitatif analizi. Veriler ortalama ± SD (grup başına N = 3 bağımsız biyolojik replika, hayvan başına 1 göz) olarak sunulmuştur. İstatistiki anlamlılık, eşleştirilmemiş iki kuyruklu t-testi kullanılarak değerlendirilmiştir; kontrol grubuna kıyasla ****p < 0.0001. Kısaltmalar: RPE, retinal pigment epitelyumu; BF, brightfield. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

TGF-β2 indüksiyonu, hem sıçan hem de fare retinalarında MMP2 ve inflamazomla ilişkili proteinleri yukarıye düzenler
Tekrarlayan subkonjonktival enjeksiyonların neden olduğu downstream moleküler değişiklikleri araştırmak amacıyla, 21. Gündeki (Şekil 5A–D) Brown Norway sıçanları ve C57BL/6 farelerinden alınan posterior oküler kesitlerde immünofloresan boyama gerçekleştirilmiştir. Tüm değerlendirmeler, tutarlı bir uzamsal yönelim sağlamak için optik sinir başına kesin olarak hizalanmış sagital retinal kesitler üzerinde yapılmıştır. Kantitatif analizler, haftalık TGF-β2 uygulamasının, her iki türde de taşıyıcı kontrollere kıyasla retinal laminalar boyunca belirli protein ekspresyon profillerini önemli ölçüde değiştirdiğini ortaya koymuştur (Şekil 5E,F).

Sıçan modelinde, göz başına 500 pg TGF-β2 uygulanması, retinal TGF-β2 seviyelerinde anlamlı bir artışa yol açmıştır (p < 0.0001; Şekil 5A,E). Bu yukarı regülasyona, aktif hücre dışı matriks yeniden şekillenmesine işaret eden matriks metalloproteinaz 2 (MMP2) ekspresyonundaki artış eşlik etmiştir (p < 0.0001; Şekil 5B,E). Ayrıca, TGF-β2 tedavisi, inflamozom sensörü NLRP3'ün (p < 0.0001; Şekil 5C,E) ve pro-inflamatuar sitokin IL-1β'nin (p < 0.0001; Şekil 5D,E) yukarı regülasyonu ile kanıtlandığı üzere retinal inflamatuar kaskadı aktive etmiştir.

Benzer şekilde, göz başına 250 pg TGF-β2 ile tedavi edilen fareler, bu biyobelirteçlerde tutarlı artış eğilimleri göstermiştir (Şekil 5F). Retinal TGF-β2 (p < 0.01; Şekil 5A,F) ve MMP2 (p < 0.001; Şekil 5B,F) ekspresyonları anlamlı derecede yükselmiştir. Fare retinasında inflamozom yolu da aktive olmuş olup, kontrol grubundaki neredeyse saptanamayan bazal seviyelere kıyasla NLRP3 ekspresyonunda anlamlı artışlar (p < 0.01; Şekil 5C,F) ve belirgin bir IL-1β regülasyon artışı (p < 0.0001; Şekil 5D,F) gözlemlenmiştir.

Bu bulgular birlikte, subkonjonktival TGF-β2 uygulamasının retinal MMP2 aracılı matriks yeniden şekillendirme sürücülerini teşvik ettiğini ve her iki kemirgen türünün posterior retinasında NLRP3/IL-1β inflamozom yolunu aktive ettiğini göstermektedir.

figure-results-5
Şekil 5: Tekrarlanan subkonjonktival TGF-β2 uygulaması, sıçanların ve farelerin posterior retinasında MMP2 ve inflamozomla ilişkili protein ekspresyonunu yukarı regüle eder. (A–D) Sıçanlarda (üst paneller) ve farelerde (alt paneller) kontrol ve TGF-β2 ile tedavi edilen gruplardan alınan retinal sagital kesitlerin (A) TGF-β2, (B) MMP2, (C) NLRP3 ve (D) IL-1β (kırmızı) için boyanmış temsilci immünofloresan görüntüleri; çekirdekler DAPI (mavi) ile karşıt boyanmıştır. Ölçek çubuğu = 50 µm. Temsilci alanlar, dış pleksiform tabakadan (OPL) bazal retinal pigment epitelyumu (RPE) kompleksine kadar uzanan belirgin protein ekspresyonunu vurgulayarak, dış retinal tabakalardaki değişiklikleri seçici olarak göstermektedir. (E) Kontrol grubu ve TGF-β2 ile tedavi edilen grup (500 pg) sıçan retinalarındaki TGF-β2, MMP2, NLRP3 ve IL-1β için floresan boyama yoğunluğunun kantifikasyonu. (F) Kontrol grubu ve TGF-β2 ile tedavi edilen grup (250 pg) fare retinalarındaki TGF-β2, MMP2, NLRP3 ve IL-1β için floresan boyama yoğunluğunun kantifikasyonu. Veriler ortalama ± SD olarak sunulmuştur (grup başına N = 3 bağımsız biyolojik replika, hayvan başına 1 göz). İstatistiksel anlamlılık, eşleştirilmemiş iki kuyruklu t-testleri kullanılarak titizlikle değerlendirilmiştir; ilgili araç-kontrol grubuna kıyasla **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001. Kısaltmalar: OPL, dış pleksiform tabaka; ONL, dış nükleer tabaka; PIS, fotoreseptör iç segmentleri; POS, fotoreseptör dış segmentleri; RPE, retinal pigment epitelyumu. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil 1: Subkonjonktival TGF-β2 uygulaması sonrası inter-oküler simetri ve bilateral veri havuzlamanın değerlendirilmesi. (A) Araç kontrolü veya bilateral subkonjonktival TGF-β2 (göz başına 500 pg) verilen sıçanlarda sol gözler (OS, n = 5) ve sağ gözler (OD, n = 5) arasındaki aksiyel uzunluk değişikliklerinin karşılaştırmalı analizi. (B) Araç kontrolü veya bilateral TGF-β2 tedavisi (göz başına 250 pg) altındaki farelerde OS (n = 5) ve OD (n = 5) gözler arasındaki ilgili inter-oküler karşılaştırma. İstatistiksel testler, aynı tedavi kohortu içindeki OS ve OD gözler arasında anlamlı bir fark olmadığını doğrulayarak, bilateral ölçüm havuzlamanın interoküler yanlılığa yol açmadığını kanıtlamıştır. Eş zamanlı olarak, TGF-β2 ile tedavi edilen hayvanlarda hem OS hem de OD gözler, ilgili araç kontrollerine kıyasla anlamlı aksiyel uzama göstermiştir. Veriler ortalama ± SD olarak sunulmuştur (grup başına N = 5 hayvan, grup başına 5 OS ve 5 OD gözü temsil eder). İstatistiksel anlamlılık, iki yönlü tekrarlanan ölçümler ANOVA ve ardından Sidak post hoc testi kullanılarak değerlendirilmiştir; *p < 0.05, ****p < 0.0001 ilgili araç kontrolüne göre. Kısaltmalar: OS, oculus sinister (sol göz); OD, oculus dexter (sağ göz). Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Figür 2: Subkonjunkteval TGF- sonrası yapısal retinal bütünlüğün ve elektrofizyolojik fonksiyonun güvenlik değerlendirmesiβ2 uygulama. (A) Temsili hematoksilin ve eosin (H&Kontrol ve TGF-β ile boyanmış sagital retinal kesitlerβ21. Günde 2 ile tedavi edilen fareler (göz başına 250 pg) ve sıçanlar (göz başına 500 pg), türler genelinde korunmuş retinal tabaka mimarisini göstermektedir (grup başına N = 3 bağımsız biyolojik tekrar). Ölçek çubukları = 20 µm. (B) 21. günde farelerden kaydedilen, araç kontrol gözleri (gri çizgi) ile TGF-β ile karşılaştırmalı temsili skotopik elektroretinografi (ERG) dalga formlarıβ2 ile tedavi edilen gözler (kırmızı çizgi). Benzer a-dalga ve b-dalga yanıt dinamikleri, korunan retinal ışık duyarlılığını ve elektrofizyolojik güvenliği doğrulamaktadır (grup başına N = 3 fare, grup başına 6 gözü temsil etmektedir). Kısaltmalar: GCL, ganglion hücre tabakası; INL, iç nükleer tabaka; ONL, dış nükleer tabaka. Lütfen bu dosyayı indirmek için buraya tıklayın.

Tartışma

Çalışmada dikkat çekici bir bulgu, TGF'nin doğrusal olmayan, ters U şeklindeki doz-yanıt profilini oluşturmasıdırβ2 fare grubunda, en düşük uygulanan dozun (250 pg/göz) en belirgin aksiyel uzamaya neden olmasıylaŞekil 2B). Bu iki fazlı fenomen, TGF- dahil birçok güçlü sitokin sinyal yolu için karakteristiktir.β süperfamilya29,30. Aşırı yüksek konsantrasyonlarda eksojen TGF-β2, reseptör doygunluğuna neden olabilir veya intrasellüler negatif geri bildirim döngülerini tetikleyebilir—inhibitör SMAD ailesi üyesi 7'nin (Smad7) artışına veya reseptör aracılı endositoze örnek verilebilir—böylece downstream biyolojik yanıtların azalmasına neden olur31,32İmmünofloresans verileri bu farmakolojik pencereyi daha da desteklemektedir; farelerde 250 pg doz (sıçanlarda 500 pg) retina TGF-β2 retansiyonu, aynı zamanda güçlü bir aşağı yönlü inflamatuar kaskadı tetikledi (Şekil 5F). Bu, optimize edilmiş düşük doz eşiğinin, hedef dokuya yönelik etkinliği en üst düzeye çıkarırken ligand kaynaklı desensitizasyonu veya lokalize baskılanmayı önleyen oldukça duyarlı bir fizyolojik pencere içinde yer aldığını göstermektedir.33Bu nedenle, kimyasal kaynaklı miyopinin tekrarlanabilir kemirgen modellerini oluştururken katı doz ayarlamasının gerekliliğini vurgulamaktadır.

Geleneksel form-deprivasyon miyopisi (FDM) veya hiperopik defokus lensle indüklenen miyopi (LIM) modellerine kıyasla—özel donanım gerektiren ve lens yer değiştirmesi, tüy dökülmesine bağlı ayrılma ve kornea komplikasyonlarına yatkın olan—subkonjunktival protokol, doğrudan farmakolojik kontrol ve minimum ekipman maliyeti sunar13,34. Daha önceki çalışmalara uygun olarak, perioküler uygulamanın skleral ve retinal TGF-β sinyal iletimi35, bu veriler, anterior subkonjunktival TGF-β2 uygulaması (Şekil 4 ve Şekil 5). Bu etkili posterior hedefleme, küçük kemirgenlerin eşsiz oküler skalasına ve sıvı dinamiklerine atfedilir. Kemirgen gözlerinin kompakt aksiyel uzunluğunu göz önünde bulundurarak (farelerde yaklaşık 3 mm ve sıçanlarda yaklaşık 6 mm), subkonjunktival uygulama, episkleral düzlemin nispeten büyük bir kısmını kaplar. Yüksek transskleral geçirgenlik ve sub-Tenon boşluğunun anatomik sürekliliği ile yönlendirilen enjekte edilen formülasyon, sklerayı ve koroidi geçerek posterior karpese doğru difüze olabilir. Önemli olan, bu yol, küçük kemirgenlerde derin posterior sub-Tenon veya intravitreal enjeksiyonlara özgü olan globo perforasyonu ve optik sinir hasarı gibi ciddi risklerden kaçınırken posterior oküler dokularda biyolojik etkilerle ilişkilidir. Bu yaklaşım, başa takılan lenslerin mekanik ve davranışsal karıştırıcı etkilerinden de kaçınır.13,36, ayrıca intravitreal enjeksiyonla ilişkili retina dekolmanı ve endoftalmi gibi iyi belgelenmiş riskler37,38Ayrıca, biyometrik ölçümlerin iki kısa oturuma ayrılması, geleneksel tek oturumlu yöntemlerin üstünlüğünü sağlar. Uzun süreli anestezik maruziyet sıklıkla oküler bozukluklara neden olur.—farelerde anestezik nedenli kataraktlar ve sıçanlarda spontan palpebral kapanma—ki bu, refraktif ve aksiyel ölçümlerin doğruluğunu etkiler39,40. Kırma kusurunu ayırarak (Günler –1 ve 20) ve aksiyel uzunluk (0. ve 21. Gün) değerlendirmeleri için protokol, potansiyel kümülatif oküler stresi en aza indirmeyi ve tutarlı görüntüleme koşullarını korumayı amaçlar; bu, deneysel içi değişkenliği azaltmaya yardımcı olabilir. Sistemik çapraz bulaşmadan kaynaklanabilecek olası karıştırıcı değişkenleri daha da ortadan kaldırmak için—sistemik damar emilimi veya hedef dışı dokuları etkileyen lenfatik taşıma gibi—ayrıca karşıt sempatik yanıtlar ve kesinlikle bireyler arası bir tasarım uygulandı. İkili taraf araç kontrolü veya ikili taraf aktif rhTGF-β2 bireysel hayvanlarda, bu paradigm, farmakolojik değerlendirmeyi sağlamlaştırırken aynı zamanda gözler arası kontaminasyonun önüne geçer. Tutarlı bir şekilde, eşleştirilmiş sol ve sağ gözlerin ayrı ayrı biyometrik analizleri, yüksek gözler arası simetriyi doğrulayarak tedavi kohortları boyunca çift taraflı verilerin birleştirilmesinin istatistiksel veya fizyolojik yanlılığa neden olmadığını doğruladı.Ek Şekil 1).

Bu kemirgen modeli, TGF-β2–önceden yazarların yaptığı çalışmalarda ortaya konmuş olan inflamatuar ve matriks remodellenme eksenini ağaç sıçanlarında ve Brown Norway sıçanlarında21,41. Yazarların önceki araştırmaları, eksojen TGF-β veya TGF-β2 amplifiye intraoküler inflamasyon—özellikle NF-κB ve IL-1β aktivasyon—MMP2 ekspresyonunu artırırken, skleral kollajen I'ı azaltır ve aksiyel uzamayı teşvik eder42,43Buna karşılık, komplement yıkım hızlandırıcı faktör (CD55) aracılığıyla komplement ve inflamazom aktivitesinin azaltılması, lokalize inflamasyonu ve miyop ilerlemesini bastırdı.41,44Benzer kronik inflamatuar imzalar, artmış MMP2 aktivasyonu ve ardından gelen kollajen I kaybı ile belirginleşir ve klasik forma privasyon modellerinde ve patolojik yüksek miyopi hastalarında da görülür.42,43,45,46. Önemli olan, TGF-'nin tüm dokularda tek başına ve evrensel bir şekilde işleyen birincil bir indüktör olarak değil,β (özellikle TGF-β2 izoformu) bağlama bağımlı bir sinyal iletim köprüsü olarak işlev görür. Erken evre retina/RPE inflamatuvar sinyal iletimini bağlar—özellikle NLRP3 inflamazomu ve kompleman aktivasyonu yoluyla—saküler ekstraselüler matriks (ECM) işleminin aşağı akışına21,41. Bu mekânsal-zamansal geçişi tanımlamak, TGF ile ilgili literatürdeki görünür tutarsızlıkları çözümlerβ ifadesi, retina/RPE'deki erken yerel inflamatuar amplifikasyon ile skleradaki geç MMP'ye bağlı matriks degradasyonu arasında dinamiklerinin değişmesi nedeniyle47,48. Özellikle, skleral ECM'nin yıkımının yapısal gerçekleşmesi, sonucunda fiziksel göz uzamasını belirler (Şekil 4), moleküler bulgular, dış retina ve RPE'yi birincil üst akış sinyal kaynağını vurgulamaktadır (Şekil 5). Burada, bu çalışma bu belirteçlerin in situ mekânsal dağılımını ve laminar artışını eşleştirmek için yalnızca nicel immünofloresans (IF) kullandı; ancak retina fosforile nükleer faktör kappa B'nin (p-NF-κB)/IL-1β/tümör nekroz faktörü-alfa (TNF-α)/NLRP3 kaskadı aynı TGF-βÖnceki çalışmalarda yazarlar tarafından bağımsız olarak 2 indüksiyon paradigması geliştirilmiştir46,49. Subkonjunktival TGF-β2, NLRP3/IL-1'yi aktive ederβ–Retina/RPE içindeki MMP2 kaskadı, retina-koroidea-sklera ekseninde yayılırak sklerada aşağı yönlü MMP2 ekspresyonunu ve matris yeniden yapılanmasını başlatır. Bu benzetmeler, gözün hızlandırılmış büyümesinde düşük düzeyli inflamasyonun ve skleral ekstrasellüler matriksin (ECM) MMP aracılığıyla yeniden yapılanmasının merkezi rolünü güçlü bir şekilde destekler.

Bu prosedürel avantajlara rağmen, mevcut protokolün dikkate alınması gereken birkaç sınırlaması vardır. İlk olarak, ekzojen sitokin uygulamasına dayalı olarak tamamen farmakolojik bir model olan bu yaklaşım, geleneksel şekil-deprivasyon miyopisi (FDM) veya lensle indüklenen miyopi (LIM) modellerinin karakteristik özelliği olan optik defokus ve retina-sklere arasındaki ışık sinyal iletim yollarını atlar.16,50. Sonuç olarak, aşağı akıştaki biyokimyasal kaskadları hedeflemek için oldukça uygun olsa da—özellikle inflamatuar-MMP2 yeniden yapılanma aksı—yukarı yönlü görsel işleme veya optik manipülasyonları inceleyen modellerin yerini almak yerine, bunlara tamamlayıcıdır51İkinci olarak, subkonjunktival enjeksiyon sistemik toksisiteyi ve intravitreal riskleri kaçındığı halde, tekrarlanan mikro-enjeksiyonların (3 hafta boyunca haftada bir kez) yapılması geçici lokalize mekanik bozulmaya ve kısa süreli anesteziye maruz kalınmasına neden olur ve bu durum, dikkatle uygulanmazsa oküler yüzey homeostazını hafifçe etkileyebilir.38,52. Bu yoldan deneysel miyopinin tekrarlanabilir şekilde indüksiyonuna ulaşmak, subkonjunktival uygulama sırasında hassas teknik uygulamaya büyük ölçüde bağlıdır. Başarının temel teknik belirleyicisi, lokalize, iyi sınırlanmış bir submukozal bleb (kemosis) oluşturmak için palpebral konjunktiva altına doğru doğru şekilde sığ bir eğimle girilmesidir. Hemen ardından yapılan transiluminasyon ile sıvının doku düzlemi içinde kaldığından emin olunur; bu, yanlışlıkla sklerada delinme, derin orbital ekstravazasyon veya mikrovasküler yırtılmayı önler. Enjeksiyon sonrası sıvı geri kaçışını veya aktif sızıntıyı önlemek için—etkili farmakolojik dozlamayı bozan yaygın bir hata türü—mikroiğne, tedavi sonrası 5 saniye boyunca yerinde tutulmalı ve ardından yavaş, dengeli ve görsel kontrol altında geri çekilmelidir. Geri çekilirken hemen refüzyon, yetersiz bleb yüksekliği veya yanlışlıkla doku kanaması oluşursa, hayvanlar önceden belirlenmiş kriterlere göre belgelenmeli ve değişkenliği karıştırmamak amacıyla çıkarılmalıdır. Bu katı teknik standartlara uyulması, hedefe yönelik yüksek sadakatli posterior ilaç tutulumunu sağlarken oküler yüzey travmasını en aza indirir. Ayrıca, kemirgen modellerde mutlak refraktif durumun (örneğin farelerde -1,58 D ve sıçanlarda -1,38 D) temel yüksek diyoptri gücüne kıyasla hafif görünmesine rağmen, taşıyıcı kontrollere göre net miyop kaymalar belirgin düzeydedir (+3,83 D farelerde ve +1,69 D sıçanlarda; her ikisi için p < 0,05) ve her iki türde de yapısal aksiyel uzama ile aşağı yönlü skleral MMP2 artışına kesin olarak uymaktadır. Önemli olan, güvenlik ve fizyolojik tolere edilebilirlik değerlendirmeleri, bu düşük doz subkonjunktival uygulama rejiminin sitotoksik olmayan yapısını doğrulamıştır. Histolojik kesitler (H&E) hem farelerde hem de sıçanlarda iyi korunmuş retina katman yapısını ortaya koydu, oysa skotopik elektroretinografi (ERG) Günü 21'de gizil süre gecikmesi veya genlik azalması olmadan bütüncül a-dalgası ve b-dalgası yanıtlarını gösterdi (Ek Şekil 2), lokalize TGF-β2. teslimi, yapısal retina hastalığına veya elektrofizyolojik bozulmaya neden olmaksızın hedefe yönelik aksiyel uzamaya neden olur. Üçüncüsü, 3. haftadaki son nokta değerlendirmeleri, akut-altyakın inflamatuar yanıtları ve matris remodellenmesini yakalar; bu fenotipik değişikliklerin tedaviden sonra kalıcı olup olmadığını ya da yıkım sonrası kurtarılma dinamiklerinin olup olmadığını belirlemek için uzun vadeli çalışmalara ihtiyaç vardır41,53Son olarak, ekzojen TGF'nin doğrudan farmakokinetik ve oküler doku penetrasyon analizleri yapılmadığından,β2, bu model doğrulama çalışmasının kapsamı dışında kalmış olsa da, eksenel uzama ve refraktif hata değişikliği gibi sağlam ve tutarlı biyometrik değişimler ile yazarların önceki çalışmalarında ortaya konan spesifik retina/RPE moleküler aktivasyonları46,49, arka göz yapılarında etkili biyolojik etkinliği destekler. İleride yapılacak çalışmalarda ek protein ekspresyon profilleme (örneğin, Batı blot), RT-qPCR veya floresan etiketli TGF-β2 izlemenin, dokuya dağılımının ve temizlenme kinetiğinin daha da net ortaya konmasını sağlayacaktır. Bu sınırların farkına varılması, araştırmacıların uygun terapötik tarama ve mekanistik doğrulama için bu modeli seçmelerine yol gösterecektir.

Subkonjunktival TGF-β2, NLRP3/IL-1'yi aktive ederβ–MMP2 ekseni, hem Brown Norway sıçanları hem de C57BL/6 farelerinin dış retina ve retina pigment epiteli (RPE) düzeyinde, bu inflamatuar ve matris yeniden yapılanma yollarını kemirgen türleri boyunca doğrulayan farmakolojik olarak tanımlanmış bir çerçeve sunar. Sonuç olarak, TGF-β2–indüklenen model, aksiyel uzamanın indüksiyonunun standartlaştırılması, retina-skleral sinyal iletim kaskatlarının analizi ve TGF'yi hedef alan klinik öncesi girişimlerin taraması için güvenilir bir platform görevi görürβ2, tamamlayıcı bileşenler, inflamazom veya MMP2.

Açıklamalar

Yazarların bu çalışma ile ilgili beyan edecekleri herhangi bir açıklama veya çıkar çatışması yoktur. AI destekli dil araçları, yalnızca taslak hazırlama sürecinde dil bilgisi düzenlemesi ve İngilizce söz dizimi iyileştirmeleri için kullanılmıştır. Veri toplama, görüntü işleme, kantitatif analiz veya şekil oluşturma aşamalarında herhangi bir üretken AI aracı kullanılmamıştır.

Teşekkürler

Deneyler ve veri analizlerinin bir kısmı Tıp Araştırmaları Temel Tesisleri, Araştırma Ofisi aracılığıyla gerçekleştirilmiştir. & Çin Tıbbi Üniversitesi, Taichung, Tayvan, Çin Cumhuriyeti'nde geliştirilmiştir. Yazarlar, sözleşmeli üreme ve hayvan temini hizmetlerindeki olağanüstü teknik destekleri nedeniyle Ulusal Biyomodel Merkezi (NCB, NIAR, Tayvan) ve BioLASCO Tayvan A.Ş.'ye içtenlikle teşekkür eder. Ek olarak, Şekil 1'de gösterilen şematik yapılar ve mikrocerrahi prosedürler, Mind the Graph (mindthegraph.com, Premium Lisans) tarafından sağlanan yüksek çözünürlüklü vektör görselleri kullanılarak tasarlanmış ve özelleştirilmiş olup, profesyonel bir şekilde Affinity Designer (Serif Europe Ltd.) ile bir araya getirilmiş ve geliştirilmiştir. Araştırma finansmanının bir kısmı, Tayvan, Çin Cumhuriyeti Ulusal Bilim ve Teknoloji Konseyi (NSTC-112-2314-B-039-029; 115-2320-B-039-056), Çin Tıbbi Üniversite Hastanesi, Taichung, Tayvan (DMR-114-091; DMR-115-117) ve Çin Tıbbi Üniversitesi, Taichung, Tayvan (CMU114-MF-78; CMU-114-ASIA-10) tarafından sağlanmıştır. Destekleyen kurumlar, çalışma tasarımında, veri toplama ve analizinde, yayımlama kararı vermede veya makalenin hazırlanmasında herhangi bir role sahip değildir. Sponsor veya finansal destek sağlayan kuruluş, bu çalışmanın tasarımı veya yürütülmesinde herhangi bir role sahip değildir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Otomatik Kızılötesi FotorefraktometreStriaTech GmbH (Tübingen, Germany)ST-PR.01Fare/sıçan türüne özgü ön ayarlar ile
Dengeli Tuz Çözeltisi (BSS)Alcon Laboratories, Inc. (Fort Worth, USA)N/ASteril intraoküler irrigasyon çözeltisi
Sığır Serum Albümini (BSA)Sigma-Aldrich (St. Louis, USA)A3059Liyofilize toz, %0,1 fraksiyon V
Brown Norway (BN) sıçanlarıBioLASCO Taiwan Co., Ltd. ve/veya National Center for Biomodelshttps://www.biolasco.com.tw/product/brown-norway-rats/
C57BL/6 (B6) farelerBioLASCO Taiwan Co., Ltd. ve/veya National Center for Biomodelshttps://www.ncb.niar.org.tw/p3_animal2_detail.asp?cid=1&nid=3&ppage=0&type=1
DAPI Çözeltisi (1 mg/mL)Thermo Scientific (Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA)62248İmmünofloresans için 1:500 çalışma dilüsyonunda kullanıldı.
Mutlak Etanol (≥99,5%)J.T.Baker (Avantor Performance Materials, Radnor, USA)N/AReaktif grade, durulama için %75,dehidratasyon için %20–%100
Fiber-Lite Aydınlatıcı (150W, Çift Kaz Boynu)Stoelting Co. (Wood Dale, USA)N/AYüksek yoğunluklu ışık kaynağı
İnce uçlu MikropensStephens Instruments (Lexington, USA)S5-1375Düz, tırtıklı, kılavuz pimli
Ginpol Oftalmik JelWinston Medical Supply Co., Ltd. (Tainan, Taiwan)N/AKarbomer %0,2, kornea koruması
Gliserol (Moleküler Biyoloji, ≥99,0%)Sigma-Aldrich (St. Louis, USA)G5516Reaktif grade, %50 çalışma matrisi
Keçi anti-Tavşan IgG (H+L) Sekonder Antikor, Alexa Fluor Plus 555Invitrogen (Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA)A32732İmmünofloresans için 1:800 çalışma dilüsyonunda kullanıldı.
El tipi Çok Türlü Elektroretinograf Sistemi (HMSERG)OcuScience (Henderson, USA)Model 2000 (HMsERG-2000), ERGView yazılımlı kemirgenler için tam alan flaş ERG sistemi.
Hartman′s Fiksatifi (Davidson Fiksatifi)Sigma-Aldrich (St. Louis, USA)H0290Oküler geometri için hızlı fiksasyon kokteyli
Yüksek frekanslı Ultrason ProbuASUSTeK Computer Inc. (Taipei, Taiwan)LU710LHEl tipi, 16 MHz frekans
Mikroenjeksiyon İğnesi (33-G)Hamilton Company (Reno, USA)7803-05Uç stili 4, sığ eğim açılı
Mikroenjeksiyon Şırıngası (10 µL)Hamilton Company (Reno, USA)80014 (#1701)Gastight mikrolitre şırınga
Mydrin-P Oftalmik ÇözeltiSanten Pharmaceutical Co., Ltd. (Osaka, Japan)N/A%0,5 Tropikamid / %0,5 Fenilefrin
Normal Keçi SerumuJackson ImmunoResearch Laboratories, Inc. (West Grove, USA)005-000-121İmmünofloresans için %10'luk bloklama çözeltisi olarak kullanıldı.
Fotorefraktometre Edinme YazılımıStriaTech GmbH (Tübingen, Germany)N/AOtomatik Ortalama Sferik Eşdeğer işleme
Tavşan anti-IL1 beta Monoklonal Antikor (HL1421)GeneTex, Inc. (Irvine, USA)GTX636887İmmünofloresans için 1:500 çalışma dilüsyonunda kullanıldı.
Tavşan anti-MMP2 Poliklonal AntikorGeneTex, Inc. (Irvine, USA)GTX104577İmmünofloresans için 1:500 çalışma dilüsyonunda kullanıldı.
Tavşan anti-NLRP3 Poliklonal AntikorAbcam (Cambridge, UK)ab214185İmmünofloresans için 1:400 çalışma dilüsyonunda kullanıldı.
Tavşan anti-TGF-beta 2 Poliklonal AntikorAbboMax, Inc. (San Jose, USA)500-3784İmmünofloresans için 1:250 çalışma dilüsyonunda kullanıldı.
Rekombinant İnsan TGF-β1PeproTech (Thermo Fisher Scientific, Cranbury, USA)100-21Liyofilize toz, yüksek saflıkta
Rekombinant İnsan TGF-β2PeproTech (Thermo Fisher Scientific, Cranbury, USA)100-35Liyofilize toz, yüksek saflıkta
Rekombinant İnsan TGF-β3PeproTech (Thermo Fisher Scientific, Cranbury, USA)100-36Liyofilize toz, yüksek saflıkta
Steril Aquasonic 100 Ultrason JeliParker Laboratories, Inc. (Fairfield, USA)N/AStandart akustik bağlantı matrisi
Ultrason Görüntüleme YazılımıASUSTeK Computer Inc. (Taipei, Taiwan)N/ACanlı B-scan görselleştirme ve kumpaslar için

Kaynaklar

  1. Holden BA, et al. Myopia: a growing global problem with sight-threatening complications. Community eye health. 2015;28(90):35.
  2. Holden BA, et al. Global prevalence of myopia and high myopia and temporal trends from 2000 through 2050. Ophthalmology. 2016;123(5):1036-42.
  3. McMonnies CW. An examination of the relation between intraocular pressure, fundal stretching, and myopic pathology. Clinical and Experimental Optometry. 2016;99(2):113-9.
  4. Fledelius HC. Myopia and significant visual impairment: global aspects [Presentation]. Presented at: 7th International Conference on Myopia; Taipei, Taiwan; 1998.
  5. Park SC, Liebmann JM, Ritch R. Glaucoma in myopia. Pathologic Myopia: Springer; 2013. p. 283-92.
  6. Gale J, Ikuno Y. Ii. B. Myopic Vitreopathy. Vitreous: In Health and Disease: Springer; 2014. p. 113-29.
  7. Saw SM, Gazzard G, Shih-Yen EC, Chua WH. Myopia and associated pathological complications. Ophthalmic and Physiological Optics. 2005;25(5):381-91.
  8. Tkatchenko TV, Shen Y, Tkatchenko AV. Mouse Experimental Myopia Has Features of Primate Myopia. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 2010;51(3):1297-303.
  9. Morgan IG, Ashby RS, Nickla DL. Form deprivation and lens-induced myopia: are they different? Ophthalmic Physiol Opt. 2013;33(3):355-61.
  10. Barathi VA, Boopathi VG, Yap EP, Beuerman RW. Two models of experimental myopia in the mouse. Vision Res. 2008;48(7):904-16.
  11. Zhao HL, Wang RQ, Wu MQ, Jiang J. Dynamic changes of ocular biometric parameters: a modified form-deprivation myopia model of young guinea pigs. Int J Ophthalmol. 2011;4(5):484-8.
  12. Wu XH, et al. Unaltered retinal dopamine levels in a C57BL/6 mouse model of form-deprivation myopia. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2015;56(2):967-77.
  13. Faulkner AE, Kim MK, Iuvone PM, Pardue MT. Head-mounted goggles for murine form deprivation myopia. J Neurosci Methods. 2007;161(1):96-100.
  14. Wang Y, Zhang Y, Tian N. Cause and Management of Suture-related Ocular Complications after Buried-suture Double-eyelid Blepharoplasty. J Plast Reconstr Aesthet Surg. 2021;74(12):3431-6.
  15. Pang K, Lennikov A, Yang M. Hypoxia adaptation in the cornea: Current animal models and underlying mechanisms. Animal Model Exp Med. 2021;4(4):300-10.
  16. Schaeffel F, Feldkaemper M. Animal models in myopia research. Clinical and Experimental Optometry. 2015;98(6):507-17.
  17. Harper AR, Summers JA. The dynamic sclera: extracellular matrix remodeling in normal ocular growth and myopia development. Exp Eye Res. 2015;133:100-11.
  18. Jobling AI, Nguyen M, Gentle A, McBrien NA. Isoform-specific changes in scleral transforming growth factor-beta expression and the regulation of collagen synthesis during myopia progression. J Biol Chem. 2004;279(18):18121-6.
  19. Vranka JA, Kelley MJ, Acott TS, Keller KE. Extracellular matrix in the trabecular meshwork: intraocular pressure regulation and dysregulation in glaucoma. Exp Eye Res. 2015;133:112-25.
  20. Tien P-T, et al. Diacerein inhibits myopia progression through lowering inflammation in retinal pigment epithelial cell. Mediators of Inflammation. 2021;2021(1):6660640.
  21. Ku H, et al. The role of transforming growth factor beta in myopia development. Molecular immunology. 2024;167:34-42.
  22. Yin X, Ge J. The role of scleral changes in the progression of myopia: a review and future directions. Clinical Ophthalmology. 2025:1699-707.
  23. Schippert R, Brand C, Schaeffel F, Feldkaemper MP. Changes in scleral MMP-2, TIMP-2 and TGFβ-2 mRNA expression after imposed myopic and hyperopic defocus in chickens. Experimental eye research. 2006;82(4):710-9.
  24. Xin J, et al. Crosstalk between myopia and inflammation: a mini review. International journal of medical sciences. 2024;21(9):1589.
  25. Zhang K, et al. Elevated Transforming Growth Factor-β2 in the Aqueous Humor: A Possible Explanation for High Rate of Capsular Contraction Syndrome in High Myopia. Journal of Ophthalmology. 2016;2016(1):5438676.
  26. Zhang M, et al. Complement and local ocular inflammatory response: Chronic immune factors in myopia. Science Progress. 2025;108(3):00368504251383046.
  27. Meng L, et al. Aqueous Humour Cytokines as Predictors of Axial Elongation in High Myopia: A 2-Year Longitudinal Cohort Study. Clinical & Experimental Ophthalmology. 2026;54(6):756-768.
  28. Miller DA, et al. Murine transforming growth factor-β2 cDNA sequence and expression in adult tissues and embryos. Molecular Endocrinology. 1989;3(7):1108-14.
  29. Langer JC, Henckaerts E, Orenstein J, Snoeck HW. Quantitative trait analysis reveals transforming growth factor-beta2 as a positive regulator of early hematopoietic progenitor and stem cell function. J Exp Med. 2004;199(1):5-14.
  30. Shinar DM, Rodan GA. Biphasic effects of transforming growth factor-beta on the production of osteoclast-like cells in mouse bone marrow cultures: the role of prostaglandins in the generation of these cells. Endocrinology. 1990;126(6):3153-8.
  31. Heldin CH, Moustakas A. Signaling Receptors for TGF-β Family Members. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2016;8(8).
  32. Zhao B, Chen YG. Regulation of TGF-β Signal Transduction. Scientifica (Cairo). 2014;2014:874065.
  33. Akhurst RJ. Targeting TGF-β Signaling for Therapeutic Gain. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2017;9(10).
  34. Pardue MT, Stone RA, Iuvone PM. Investigating mechanisms of myopia in mice. Exp Eye Res. 2013;114:96-105.
  35. Cordeiro MF, Gay JA, Khaw PT. Human Anti-Transforming Growth Factor-β2 Antibody: A New Glaucoma Anti-Scarring Agent. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 1999;40(10):2225-34.
  36. Guo ZV, et al. Procedures for Behavioral Experiments in Head-Fixed Mice. PLOS ONE. 2014;9(2):e88678.
  37. Jager RD, Aiello LP, Patel SC, Cunningham ET, Jr. Risks of intravitreous injection: a comprehensive review. Retina. 2004;24(5):676-98.
  38. Lommatzsch AP, et al. Endophthalmitis als schwere Komplikation der intravitrealen Medikamentengabe. Klin Monbl Augenheilkd. 2013;230(11):1130-4.
  39. Li XT, Qin Y, Zhao JY, Zhang JS. Acute lens opacity induced by different kinds of anesthetic drugs in mice. Int J Ophthalmol. 2019;12(6):904-8.
  40. Tkatchenko TV, Tkatchenko AV. Ketamine-xylazine anesthesia causes hyperopic refractive shift in mice. J Neurosci Methods. 2010;193(1):67-71.
  41. Lin S-C, et al. The Function of Transforming Growth Factor 2 in Facilitating Inflammas ome Activation to Enhance the Development of Myopia via Complement Sys tem. Cells. 2025;14(16):1295.
  42. Wei CC, et al. Allergic Conjunctivitis-induced Retinal Inflammation Promotes Myopia Progression. EBioMedicine. 2018;28:274-86.
  43. Wei CC, et al. Corrigendum to "Allergic Conjunctivitis-induced Retinal Inflammation Promotes Myopia Progression" [EBioMedicine 28 (2018) 274-286]. EBioMedicine. 2019;41:717-8.
  44. Lin HJ, et al. Role of Chronic Inflammation in Myopia Progression: Clinical Evidence and Experimental Validation. EBioMedicine. 2016;10:269-81.
  45. Lin HJ, et al. Sclera-related gene polymorphisms in high myopia. Mol Vis. 2009;15:1655-63.
  46. Lin CF, et al. Harnessing Lactiplantibacillus plantarum EP21 and its membrane vesicles to inhibit myopia development. Gut Microbes. 2025;17(1):2534677.
  47. Chou Y-L, et al. Complement decay-accelerating factor inhibits inflammation-induced myopia development. Molecular Immunology. 2024;171:47-55.
  48. Ku H, et al. Myopia development in tree shrew is associated with chronic inflammatory reactions. Current Issues in Molecular Biology. 2022;44(9):4303-13.
  49. Chou Y-L, et al. Vitamin D3 Reshapes Gut Microbiota and Metabolite Profiles in a Rat Model of Inflammation-Induced Myopia. Biomolecules. 2026;16(7):939.
  50. Wallman J, Winawer J. Homeostasis of eye growth and the question of myopia. Neuron. 2004;43(4):447-68.
  51. Morgan IG, et al. IMI Risk Factors for Myopia. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 2021;62(5).
  52. Wildsoet C, et al. IMI-interventions for controlling myopia onset and progression report. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 2019;60(3):M106-M31.
  53. Rada JAS, Shelton S, Norton TT. The sclera and myopia. Experimental eye research. 2006;82(2):185-200.

Yeniden basım ve izinler

Daha fazla makale keşfet

TGF-Beta EnjeksiyonlarıSubkonjonktival EnjeksiyonAksiyel UzamaSkleral Yeniden ŞekillenmeHücre Dışı MatriksÇift Elli StabilizasyonNLRP3 İnflamazomuMMP2 EkspresyonuAnti-Miyopi Müdahaleleri

Bu makale yayımlandı

Video yakında

Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.