Metotreksat ile Ön İşlem Yapılmış Metanol Zehirlenmesi Sıçan Modelinde Etanol ve Fomepizolün Nefroprotektif Etkileri

Özet

Bu çalışma, folata bağımlı format temizlenmesini azaltmak için tasarlanan metotreksat ön işlem görmüş bir rat metanol zehirlenmesi modelinde, etanol ve fomepizolün nefroprotektif etkilerini karşılaştırmaktadır. Renal sonuçlar; böbrek fonksiyonu ölçümleri, böbrek hasarı biyobelirteçleri, inflamatuar belirteçler, redoksla ilişkili biyobelirteçler ve histopatolojik bulgular kullanılarak değerlendirilmiştir.

Özet

Metanol zehirlenmesi metabolik asidoza, organ hasarına ve ölüme neden olur; renal hasar ise olumsuz sonuçların habercisidir. Metotreksat ile ön işlem uygulanmış bir metanol zehirlenmesi sıçan modelinde etanol ve fomepizol karşılaştırılmıştır. Otuz erkek Wistar sıçanı beş gruba ayrılmıştır: Kontrol, metotreksat (MTX), MTX + Metanol, MTX + Metanol + Fomepizol ve MTX + Metanol + Etanol (grup başına n = 6). MTX, 1–7. günlerde 0,3 mg/kg/gün dozunda oral gavaj yoluyla uygulanmıştır. Metanole maruz bırakılan üç grup, 8. günde oral gavajla 3 g/kg metanol almıştır. Fomepizol, metanol uygulamasından 4 saat sonra 15 mg/kg dozunda intraperitonal olarak uygulanmış, ardından 12, 24 ve 36. saatlerde 10 mg/kg dozunda uygulanmaya devam edilmiştir. Etanol, metanol uygulamasından 4 saat sonra tek doz 0,5 g/kg oral gavajla verilmiştir. Örnekler 10. günde toplanmıştır. Prospektif olarak belirlenmiş bir birincil sonlanım noktası yoktur. Renal fonksiyonlar, böbrek homojenat hasarı, inflamatuar biyobelirteçler, kan kaynaklı redoksla ilişkili biyobelirteçler ve histopatolojik bulgular değerlendirilmiştir. Varyans analizi (ANOVA), böbrek homojenatı sistatin C (p = 0,003), interlökin-6 (IL-6; p = 0,013), böbrek hasar molekülü-1 (KIM-1; p = 0,017), serum üre (p = 0,017) ve serum kreatinin (p < 0,001) seviyelerinde gruplar arasında anlamlı farklar olduğunu ortaya koymuştur. Duncan post hoc testi, her iki antidot grubunda da bu parametrelerin değerlerinin MTX + Metanol grubuna göre daha düşük olduğunu göstermiştir. İki antidot grubu arasında anlamlı bir biyokimyasal fark saptanmamıştır. Histopatolojik skorlar antidot gruplarında daha düşük bulunmuştur. Fomepizol daha olumlu bir tanımlayıcı patern sergilemiş olsa da, bulgular etanol üzerindeki üstünlüğünü kanıtlamamaktadır. Varyans heterojenliği, çoklu testleme, eşit olmayan antidot rejimleri, toksikokinetik ve asit-baz ölçümlerinin eksikliği ile kısa takip süresi yorumlamayı sınırlandırmaktadır. Gelecekteki çalışmalar; metanol ve formatın doğrudan ölçümlerini, renal sitozolik alkol dehidrogenaz aktivitesini, renal biyokimyasal sonuçlarla korelasyonları, daha uzun takip sürelerini ve karşılaştırılabilir antidot rejimlerini içermelidir.

Giriş

Metil alkol (metanol) zehirlenmesi, özellikle yasa dışı veya illegal olarak üretilmiş alkollü içeceklerin tüketimini takiben dünya çapında önemli morbidite ve mortalite ile ilişkili olan ciddi bir toksikolojik acil durumdur. Metanolün kendisi nispeten düşük toksisiteye sahip olsa da, öncelikle karaciğerde alkol dehidrogenaz (ADH) tarafından formaldehite ve ardından formik asite metabolize edilir; bunun sonucunda oluşan format birikimi, yüksek anyon açıklıklı metabolik asidoza, optik nöropatiye ve çoklu organ hasarına yol açabilir^1,2. Formaldehit kısa ömürlü bir ara üründür, oysa format birikiminin mitokondriyal sitokrom oksidaz inhibisyonu, hücresel hipoksi ve oksidatif stres yoluyla toksisiteye temel katkıda bulunan etken olduğu kabul edilir 3. Erken teşhis, metabolik asidozun düzeltilmesi, antidotal tedavi ve hemodiyaliz, mortaliteyi azaltmaya yönelik temel terapötik yaklaşımlardır².

Metanol zehirlenmesinde, klinik belirtiler genellikle latent bir dönemin ardından belirginleşir. Bulantı, kusma, karın ağrısı ve hafif merkezi sinir sistemi depresyonunu; yüksek anyon açıklıklı metabolik asidoz, dispne, zihinsel durum değişikliği ve görsel semptomlar takip edebilir^1,2. Görme bulanıklığı, fotofobi, midriyazis, optik disk ödemi ve ağır vakalarda kalıcı körlük, formik asit aracılı mitokondriyal sitokrom oksidaz inhibisyonu ile ilişkili en karakteristik toksik etkiler arasındadır^1,2. Mevcut tedavi stratejileri arasında destekleyici bakım; sodyum bikarbonat ile metabolik asidozun düzeltilmesi; folinik veya folik asit takviyesi; etanol veya fomepizol ile alkol dehidrogenaz inhibisyonu ve seçilmiş ağır vakalarda metanol ve format eliminasyonunu hızlandırmak için hemodiyaliz yer almaktadır^3,4. Fomepizol, daha öngörülebilir farmakokinetiği, daha basit dozajlaması ve daha düşük yan etki riski nedeniyle giderek daha fazla birinci basamak antidot olarak kabul edilmektedir; ancak etanol, ulaşılabilirliği ve düşük maliyeti nedeniyle önemli bir alternatif olmaya devam etmektedir^4,5,6,7.

Optik sinir ve merkezi sinir sistemi hasarı geleneksel olarak metanol toksisitesinin baskın belirtileri olarak kabul edilse de, böbreklerin klinik olarak ilgili bir hedef organ olduğu giderek daha fazla kabul edilmektedir^8,9,10. Metanole özgü kohortlarda, akut böbrek hasarı (AKI); daha şiddetli metabolik asidoz, solunum yetmezliği, çoklu organ yetmezliği, mekanik ventilasyon, ekstrakorporeal tedavi, daha uzun hastanede yatış süresi ve daha yüksek hastane içi mortalite ile ilişkilendirilmiştir; ayrıca hacim eksikliği, sepsis, rabdomiyoliz ve akut pankreatit de AKI gelişimi ile ilişkili faktörler olarak tanımlanmıştır^8,10. Chang ve ark. tarafından rapor edilen kohortta, çok değişkenli bir analizde AKI, hastane içi mortalite ile bağımsız olarak ilişkili kalmaya devam etmiştir; ancak, retrospektif gözlemsel tasarım, AKI'nin tek başına mortaliteye neden olduğunu kanıtlamamaktadır⁸. Buna göre AKI, metanol zehirlenmesinde daha yüksek hastalık şiddetinin ve daha kötü bir prognozun bir belirteci olarak yorumlanmalıdır. Buna karşılık, Wang ve ark. tarafından yapılan sistematik derleme, toksik alkol zehirlenmeleri sonrası böbrek sonuçlarını, temel olarak metanol ve etilen glikolü kapsayacak şekilde daha geniş bir çerçevede değerlendirmiştir; bu nedenle, sonuçları sadece metanole özgü değildir⁹. Söz konusu derleme, önemli düzeyde kısa vadeli mortalitenin yanı sıra uzun vadeli böbrek iyileşmesi, devam eden diyaliz ve standardize renal sonuç raporlamasıyla ilgili önemli kanıt boşlukları olduğunu saptamıştır⁹.

Metanol toksisitesi ile AKI arasındaki ilişkinin muhtemelen çok faktörlü olduğu düşünülmektedir. Toksik metabolit birikimi; mitokondriyal inhibisyon, hücresel hipoksi, şiddetli metabolik asidoz ve redoks dengesizliği yoluyla katkıda bulunabilirken, hacim kaybı, hemodinamik bozulma, rabdomiyoliz, sepsis, solunum yetmezliği ve çoklu organ disfonksiyonu dahil olmak üzere klinik kohortlarda belgelenen sistemik faktörler ek böbrek hasarlarına yol açabilir^1,2,3,8,10. Bu yolaklar, metanol zehirlenmesi ile böbrek hasarı arasında biyolojik ve klinik olarak makul bağlantılar sunar. Renal metabolik bozukluklar; dolaşımdaki format maruziyeti, mitokondriyal inhibisyon, metabolik asidoz ve sistemik hemodinamik stresten kaynaklanabilir. Bununla birlikte, metanol, formaldehit ve format konsantrasyonları, renal ADH aktivitesi ve mitokondriyal fonksiyonlar mevcut çalışmada doğrudan değerlendirilmediği için, böbrek dokusu içindeki alkol ve aldehit metabolizmasının spesifik katkısı belirsizliğini korumaktadır.

Metanol toksisitesi üzerine yapılan deneysel çalışmaların önündeki temel metodolojik zorluk, sıçanların formik asidi insanlardan daha hızlı metabolize etmesidir. İnsanlarda formik asit birikimi metanol toksisitesinin temel belirleyicisi olsa da, sıçanların oldukça etkili folat bağımlı format metabolizması nedeniyle benzer bir birikim ve buna bağlı organ hasarı oluşturmak daha zordur. Bu nedenle, metanol toksisitesinin deneysel modellerinde sıklıkla folat metabolizmasını baskılayan ajanlar kullanılır.^11,12Sıçanlarda folat bağımlı format klirensini azaltmak ve böylece metanol toksisitesine karşı duyarlılığı artırmak için Metotreksat (MTX) ön tedavisi uygulanmıştır.^11,12Metotreksat tek başına metanol toksisitesini indüklemez ve elde edilen model, insan metanol zehirlenmesinin tüm yönlerini yeniden üretmez. Metotreksat; renal, oksidatif ve inflamatuar sonuçları bağımsız olarak etkileyebileceği için, ön işlemle ilişkili değişiklikleri karakterize etmek amacıyla yalnızca MTX uygulanan bir grup dahil edilmiştir. Bu sınırlamalar dahilinde model; aynı metotreksat ön işlemi ve metanol maruziyeti protokolünü alan deneysel gruplar arasında renal sonuç modellerini karşılaştırmak ve bu sonuçları biyokimyasal, inflamatuar, oksidatif ve histopatolojik düzeylerde değerlendirmek için kontrollü bir preklinik platform sağlamaktadır.

Alkol dehidrojenaz inhibisyonu, metanol zehirlenmesinin antidotal tedavisinin temel taşını oluşturur. Klinik uygulamada bu amaçla en yaygın kullanılan iki ajan etanol ve fomepizoldür (4-metilpirazol). Etanol, ADH'ye karşı metanolden daha yüksek afiniteye sahip olduğu için toksik metabolit oluşumunu kompetitif olarak baskılar; buna karşın, potent ve selektif bir ADH inhibitörü olan fomepizol, metanolün formaldehit ve formik asite dönüşümünü doğrudan engeller^5,6. Ancak, bu iki antidotun karşılaştırmalı klinik etkinliği, güvenliği, uygulama kolaylığı ve organ koruyucu etkileri konusunda tam bir fikir birliği yoktur. Fomepizol; standardize dozaj rejimi, serum düzeyi izleme gereksiniminin olmaması, merkezi sinir sistemi depresyonuna yol açmaması ve daha öngörülebilir farmakokinetik özellikleri nedeniyle birçok merkezde avantajlı görülürken; etanol tedavisi, hipoglisemi, hepatotoksisite, mental durum değişikliği ve yoğun izleme ihtiyacı gibi potansiyel dezavantajlarla ilişkilendirilmektedir^6,7. Aksine, geniş ölçekli klinik karşılaştırmalar, iki antidotun mortalite ve klinik sonuçlar üzerindeki etkilerinin benzer olabileceğini öne sürmüştür. Kitlesel zehirlenme vakalarını değerlendiren Zakharov ve ark. tarafından yapılan çalışmada, fomepizol ve etanol arasında sağkalım açısından anlamlı bir fark gözlemlenmemiştir⁵.

Metil alkol zehirlenmesinde AKI'nin prognostik önemine rağmen^8,9,10, böbrek hasarı oküler ve nörolojik toksisiteye göre çok daha az ilgi görmüştür ve etanol ile fomepizolün karşılaştırmalı renal etkileri yetersiz şekilde karakterize edilmiştir. Bu nedenle, iki antidotal stratejinin farklı renal sonuç paternleri ile ilişkili olup olmadığını belirlemek için konvansiyonel böbrek fonksiyon testlerini, erken tübüler hasar biyobelirteçlerini, inflamatuar sitokinleri, redoksla ilişkili parametreleri ve histopatolojiyi içeren böbrek odaklı bir değerlendirme gereklidir. Ek olarak, bu kontrollü metotreksat ile ön işlem görmüş sıçan modeli, tanımlanmış deneysel koşullar altında aday antidotal, böbrek yönelimli ve destekleyici müdahalelerin preklinik değerlendirmesini kolaylaştırabilir. Bu modelin araştırma değeri, insan metil alkol zehirlenmesinin klinik ve metabolik karmaşıklığının doğrudan replikasyonundan ziyade, akut bir deneysel ortamdaki karşılaştırmalı değerlendirmede yatmaktadır.

Kemirgenler ve insanlar arasındaki metanol metabolizması farklılıkları ile folat bağımlı format klirensini azaltmak için farmakolojik ön tedavinin kullanılması, önemli metodolojik sınırlamalar olmaya devam etmektedir. Ayrıca, deneysel koşullar altında indüklenen akut toksisite, klinik uygulamada karşılaşılan değişken maruziyet sürelerini ve komorbid durumları tam olarak yansıtmayabilir. Buna bağlı olarak, bu hayvan modelinden elde edilen bulgular ön klinik kanıtlar olarak değerlendirilmelidir ve insanlardaki tedavi kararlarını doğrudan desteklemek için kullanılmamalıdır. Klinik çıkarımlar yapılmadan önce uygun şekilde tasarlanmış klinik çalışmalarda onaylanması gereklidir. Bu arka plan ışığında, temel bilgi boşluğu, metotreksat ile ön işlem görmüş bir sıçan modelinde etanol ve fomepizolün; geleneksel böbrek fonksiyon ölçümleri, tubüler hasar biyobelirteçleri, inflamatuar sitokinler, redoks ile ilgili parametreler ve histopatoloji üzerinden farklı renal sonuç paternleri ile ilişkili olup olmadığıdır. Çalışma hipotezi, alkol dehidrogenazın etanol veya fomepizol ile inhibisyonunun, değerlendirilen sonuç alanları arasında tedaviler arası potansiyel farklılıklar olmak üzere, renal hasarın hafifletilmesi ile ilişkili olacağı yönündeydi. Nefroproteksiyon, operasyonel olarak MTX + Metanol grubuna göre daha olumlu bir renal sonuç paterni olarak tanımlanmıştır. Bu patern; daha düşük serum üre ve kreatinin konsantrasyonlarını; daha düşük renal kidney injury molecule-1 (KIM-1), cystatin C, tumor necrosis factor-alpha (TNF-α), interleukin-6 (IL-6) ve interleukin-1 beta (IL-1β) seviyelerini; daha düşük serum malondialdehit (MDA) konsantrasyonlarını; daha yüksek serum süperoksit dismutaz (SOD) aktivitesini, kan indirgenmiş glutatyon (GSH) seviyelerini ve kan katalaz (CAT) aktivitesini; ayrıca tubüler dejenerasyon, tubüler nekroz, glomerüler hasar, vasküler konjesyon, interstisyel inflamasyon ve fibrozis için daha düşük histopatolojik skorları kapsamaktadır. Nefroproteksiyon tek bir kompozit skor olarak hesaplanmamış; bunun yerine bireysel sonuçlar bu tamamlayıcı alanlar genelinde kolektif olarak değerlendirilmiştir. Buna göre çalışma, bu modelde etanol ve fomepizolün renal fonksiyon, tubüler hasar, inflamasyon, redoks durumu ve renal histopatoloji üzerindeki etkilerini karşılaştırmayı amaçlamıştır.

Protokol

Tüm deneysel prosedürler, Kırşehir Ahi Evran Üniversitesi Hayvan Deneyleri Yerel Etik Kurulu tarafından onaylanmış (onay karar no. 1, toplantı no. 12, onay tarihi: 12 Haziran 2025) ve laboratuvar hayvanlarının bakımı ve kullanımıyla ilgili ulusal ve uluslararası kılavuzlara uygun olarak yürütülmüştür. Çalışma boyunca ağrı ve stresi en aza indirmek ve gerekli olan en az sayıda hayvanı kullanmak için önlemler alınmıştır.

Kimyasalların hazırlanması
Metotreksat, deneysel metanol toksisite modelinin oluşturulmasını kolaylaştırmak için ön işlem ajanı olarak kullanılmıştır. Folata bağımlı format oksidasyonu sıçanlarda insanlara göre daha verimli olduğundan, format klirensini azaltmak ve metanol toksisitesine olan duyarlılığı artırmak için metotreksat ön işlemi uygulanmıştır; bu işlem metanol maruziyeti için bir vekil olarak değil, modeli duyarlılaştıran bir müdahale olarak kullanılmıştır^11,12. Metotreksat, 100 mg/mL'lik bir stok konsantrasyona karşılık gelen 500 mg/5 mL'lik formülasyon şeklinde temin edilmiştir. Formülasyon, 0,06 mg/mL'lik nihai bir çalışma konsantrasyonu elde etmek için steril %0,9 sodyum klorür çözeltisi ile seyreltilmiştir. Çalışma çözeltisi, 0,3 mg/kg'lık bir MTX dozuna karşılık gelen 5 mL/kg dozunda oral gavage yoluyla uygulanmıştır. Çalışma başlangıcında 200–220 g ağırlığındaki sıçanlar için günlük uygulama hacmi hayvan başına 1,00 ile 1,10 mL arasında değişmiş ve çalışma başlangıcında kaydedilen vücut ağırlığı kullanılarak bireysel olarak hesaplanmıştır. 7 günlük MTX ön işlem süresince vücut ağırlığı yeniden ölçülmemiştir. Metotreksat, 7 ardışık gün boyunca günde bir kez uygulanmış (çalışma günleri 1–7) ve MTX ön işlem protokolünün tamamlanmasının ardından 8. çalışma gününde metanol uygulanmıştır. Bu rejim, daha önce yayınlanmış oral-gavage MTX ön işlem modelleri ile tutarlıdır¹³.

Metanol (≥%99,8 saflıkta), uygulama gününde steril distile su ile seyreltilerek %20'lik (v/v) sulu çalışma çözeltisi şeklinde taze olarak hazırlandı. Çalışma çözeltisi, 1 hacim metanolün 4 hacim steril distile su ile karıştırılmasıyla hazırlandı. Daha önce tanımlanmış metotreksat ile ön işlem görmüş metanol zehirlenmesi sıçan modellerine uygun olarak, çalışma gününün 8. gününde Grup 3–5'e oral gavage yoluyla 3 g/kg tek doz metanol uygulandı. Metanol uygulamasından önce herhangi bir yiyecek veya su kısıtlaması yapılmadı. Gerekli uygulama hacmi her bir hayvanın vücut ağırlığına göre bireysel olarak hesaplandı ve %20'lik metanol çözeltisi için yaklaşık olarak 18,9 mL/kg idi. Yaklaşık 220 g ağırlığındaki bir sıçan için bu doz, 0,66 g metanole ve yaklaşık 4,2 mL'lik bir nihai gavage hacmine karşılık geliyordu. Bu metanol maruziyet rejimi, daha önce yayınlanmış akut metanol toksisitesine ilişkin metotreksat ile ön işlem görmüş sıçan modelleriyle karşılaştırılabilirliği korumak amacıyla seçilmiştir^13,14,15.

Fomepizole çalışma çözeltisi, steril %0.9 sodyum klorür çözeltisi içerisinde 10 mg/mL nihai konsantrasyonda hazırlandı. Metanol uygulamasından 4 saat sonra 15 mg/kg intraperitonal yükleme dozu verildi ve bunu 12, 24 ve 36. saatlerde 10 mg/kg intraperitonal idame dozlar izledi. 10 mg/mL çalışma konsantrasyonunda uygulama hacimleri, yükleme dozu için 1.5 mL/kg ve her bir idame dozu için 1.0 mL/kg idi. Çalışma başlangıcı vücut ağırlığı yaklaşık 220 g olan bir sıçan için bu dozlar, yükleme dozu için yaklaşık 0.33 mL ve her bir idame dozu için 0.22 mL'ye karşılık geliyordu. Tüm uygulama hacimleri, çalışma başlangıcında kaydedilen vücut ağırlığı kullanılarak hesaplandı. Fomepizole yükleme ve idame dozları, kabul görmüş metanol zehirlenmesi tedavi önerileri referans alınarak seçilmiştir^1,6.

Antidotal karşılaştırma tedavisi olarak etanol kullanılmıştır. Mutlak etanol (≥99.8% saflıkta), 1 hacim mutlak etanolün 4 hacim steril distile su ile karıştırılmasıyla seyreltilerek nihai %20 (v/v) sulu çalışma çözeltisi elde edilmiştir. Metanol uygulamasından 4 s sonra, 0.5 g/kg dozunda tek bir etanol dozu oral gavaj yoluyla uygulanmış; idame etanol dozları uygulanmamıştır. Uygulama hacmi yaklaşık olarak 3.2 mL/kg'dır. Çalışma başlangıç vücut ağırlığı yaklaşık 220 g olan bir sıçan için bu değer, yaklaşık 0.70 mL'lik bir nihai gavaj hacmine tekabül etmektedir. Uygulama hacmi, çalışma başlangıcında kaydedilen vücut ağırlığı kullanılarak hesaplanmıştır. Etanol konsantrasyonu, dozu, uygulama yolu ve zamanlaması, antidotal karşılaştırıcı olarak etanol kullanan, önceden yayınlanmış metotreksat ön işlem görmüş sıçan modellerine dayanarak seçilmiştir^13,14.

Tüm çözeltiler, uygulama gününde taze olarak hazırlanmış ve homojen görünüm ile görünür partikül maddelerin yokluğu açısından kontrol edilmiştir. Oral uygulamalar, paslanmaz çelik bir gavaj kanülü kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Gavaj sırasında kanül, ağız boşluğundan özofagusa dikkatlice ilerletilmiş; regürjitasyon, oral sızıntı, aspirasyon ve solunum sıkıntısı oluşmamasına dikkat edilmiştir. İntraperitonal enjeksiyonlar, steril tek kullanımlık şırıngalar ve iğneler kullanılarak aseptik koşullar altında yapılmıştır. Kimyasalların hazırlanması ve uygulanmasıyla ilgili tüm prosedürler, kurumsal laboratuvar güvenlik yönetmeliklerine uygun olarak yürütülmüştür.

Deney hayvanları, barındırma koşulları ve randomizasyon
Toplam 30 adet, 8–12 haftalık ve 220 ± 20 g ağırlığındaki yetişkin erkek Wistar albino sıçan, Kırşehir Ahi Evran Üniversitesi Deney Hayvanları Araştırma Laboratuvarı'ndan temin edilmiştir. Wistar sıçanları, deneysel toksisite ve nefroproteksiyon çalışmalarında yaygın olarak kullanılmış olmaları ve daha önce yayınlanmış çalışmalarla karşılaştırmaya olanak sağlamaları nedeniyle seçilmiştir. Hayvanlar, 24 ± 2 °C sıcaklıkta, 12 saat aydınlık/12 saat karanlık döngüsü altında barındırılmıştır. 10 günlük deney süresi boyunca standart pelet yem ve musluk suyu ad libitum olarak sağlanmıştır. Deneysel prosedürlerden önce tüm hayvanlar 7 günlük bir aklimatizasyon süresine tabi tutulmuştur.

Otuz sıçan, bilgisayar destekli rastgele atama prosedürü kullanılarak, grup başına altı hayvan hedefiyle beş deney grubuna ayrılmıştır. Her sıçan için 1 ile 5 arasında rastgele bir tam sayı üretilmiş ve hayvan ilgili deney grubuna atanmıştır. Bir grup altı hayvana ulaştığında, o grubu belirleyen sonraki her çekiliş iptal edilmiş ve uygun pozisyonu olan bir grup seçilene kadar yeni bir rastgele sayı üretilmiştir. Bu prosedür, tüm 30 sıçan atanana kadar devam etmiş ve grup başına 6 hayvan ile sonuçlanmıştır. Rastgele atamaları aynı araştırmacı gerçekleştirmiş ve atamayı uygulamıştır; ayrı bir atama operatörü kullanılmamıştır. Grup 1 (Kontrol) herhangi bir deneysel ilaç tedavisi almamış ve hayvanlar diğer gruplarla aynı planlı son nokta örneklemesine tabi tutulmuştur. Grup 2 (MTX), 7 gün boyunca 0,3 mg/kg dozunda oral gavaj yoluyla metotreksat almıştır. Grup 3 (MTX + Metanol), 7 gün metotreksat almış, ardından çalışma gününün 8. gününde 3 g/kg metanol almıştır. Grup 4 (MTX + Metanol + Fomepizol), metotreksat ön tedavisi ve ardından metanol almış, 4 saat sonra 4-metilpirazol tedavisine başlanmıştır. Grup 5 (MTX + Metanol + Etanol), metotreksat ön tedavisi ve ardından metanol almış, 4 saat sonra etanol uygulanmıştır.

Metanole maruz kalan her üç grup da aynı MTX ön tedavisi ve metanol uygulama protokolünü almış olup, yalnızca maruziyet sonrası antidotal tedavi bakımından farklılık göstermiştir. Deneysel grup tahsisi, uygulama protokolü, antidotal tedavinin zamanlaması ve örnek toplama süreci Şekil 1'de özetlenmiştir. Beş bağımsız grup ile sabit etkili tek yönlü ANOVA için a priori bir güç analizi yapılmıştır. Büyük bir standartlaştırılmış etki boyutu (Cohen’s f = 0.70), 0.05 anlamlılık düzeyi ve %80 istatistiksel güç varsayılarak, gereken minimum toplam örneklem büyüklüğü, grup başına altı hayvana tekabül edecek şekilde 30 hayvan olarak hesaplanmıştır. Toplam 30 örneklem büyüklüğü için hesaplanan güç yaklaşık %80.9'dur. Varsayılan etki boyutu (Cohen’s f = 0.70), araştırmacıların bu akut toksisite modelinde gruplar arasında genel olarak büyük bir etki beklemeleri üzerine deneyden önce belirlenmiştir. Bu varsayım, pilot verilerden veya belirli bir önceki çalışmadan türetilen bir tahminden ziyade, araştırmacının değerlendirmesine dayanmaktadır. Bu çalışma için prospektif olarak belirlenmiş tek bir birincil sonuç bulunmamaktadır; örneklem büyüklüğü hesaplaması, beş deneysel grup arasındaki genel bir karşılaştırmada varsayılan büyük bir genel etkiye dayandırılmıştır. Bir birincil sonuç, retrospektif olarak prospektif olarak belirlenmiş bir son nokta şeklinde tanımlanamaz. Buna göre, örneklem büyüklüğü hesaplaması, her bir bireysel sonuç veya ikili karşılaştırmalar için yeterli güç sağlamamaktadır.

Metanol zehirlenmesi ve antidotal tedavi protokolü
Alıştırma döneminin ardından, Grup 2–5'teki hayvanlara 7 ardışık gün boyunca (çalışma günleri 1–7) günde bir kez metotreksat verildi. Çalışma gününün 8. gününde, Grup 3–5'teki hayvanlara oral gavaj yoluyla 3 g/kg dozunda %20'lik metanol çözeltisinin tek bir dozu uygulandı. Metanol uygulaması öncesinde açlık veya başka herhangi bir gıda veya su kısıtlaması uygulanmadı.

MTX + Metanol + Fomepizol grubunda, metanol uygulamasından 4 saat sonra 15 mg/kg intraperitoneal yükleme dozu uygulanmış, ardından metanol uygulamasından 12, 24 ve 36 saat sonra 10 mg/kg intraperitoneal idame dozları verilmiştir. MTX + Metanol + Etanol grubunda, metanol uygulamasından 4 saat sonra 0,5 g/kg dozunda tek bir etanol dozu oral gavaj yoluyla uygulanmış; herhangi bir idame etanol dozu uygulanmamıştır. İki antidotal rejim, yerleşik fomepizol dozaj önerilerini ve daha önce yayınlanmış etanol karşılaştırma protokollerini ^1,6,13,14 yansıtacak şekilde seçilmiştir. Rejimler; doz, yol veya maruziyet bakımından eşleştirilmiş bir tedavi sağlamak üzere tasarlanmamıştır. Bu nedenle, tekrarlanan intraperitoneal fomepizol rejimi ile tek doz oral etanol, eşitsiz bir farmakolojik karşılaştırma oluşturmuştur. Başarılı gavaj uygulaması, prosedür sırasında regürjitasyon, oral sızıntı veya solunum sıkıntısının olmamasıyla doğrulanmıştır. Başarılı intraperitoneal uygulama ise enjeksiyon bölgesinde sızıntı, kanama veya belirgin şişliğin olmamasıyla doğrulanmıştır.

Uygulama sonrası hayvanlar; genel sağlık durumu, mobilite, gıda alımı, duruş, kürk görünümü ve toksisite belirtileri açısından düzenli olarak izlendi. Tedavi programı, metanolden toksik metabolit oluşumunun başlamasına izin verirken, antidotal ajanların koruyucu ve terapötik etkilerinin değerlendirilmesine olanak sağlayacak şekilde tasarlanmıştır.

Ötanazi, insani sonlanım noktaları ve örnek toplama
Deney boyunca tüm hayvanlar; genel sağlık durumları, yem ve su tüketimleri, hareketlilikleri ve davranışsal değişiklikler açısından günlük olarak değerlendirildi. İnsani sonlanım noktası kriterleri; belirgin letarji, yem veya su tüketememe, şiddetli kilo kaybı, kısıtlı hareketlilik, anormal duruş, kalıcı piloereksiyon veya belirgin distress belirtileri olarak önceden tanımlandı. Bu kriterlerden herhangi birini karşılayan hayvanların insani ötanaziye tabi tutulması planlandı. Ancak, çalışma süresince hiçbir hayvan önceden tanımlanmış insani sonlanım noktası kriterlerine ulaşmadı.

Beş deneysel gruptaki tüm hayvanlar, çalışmanın 10. gününde ötanize edilmiştir. MTX + Metanol, MTX + Metanol + Fomepizol ve MTX + Metanol + Etanol grupları için bu sonlanım noktası, çalışmanın 8. gününde yapılan tek doz metanol uygulamasından 48 saat sonrasına tekabül etmiştir. Kontrol grubu çalışmanın 10. gününe kadar tedavi edilmeden kalırken, sadece MTX grubu, 7 günlük MTX uygulama protokolünün tamamlanmasının ardından çalışmanın 10. gününe kadar izlenmiştir. Böylece, beş grubun tamamı aynı toplam çalışma süresine sahip olmuş ve aynı çalışma gününde ötanazi ve örnekleme işlemlerine tabi tutulmuştur.

Derin anesteziyi indüklemek için ketamin ve ksilazin kullanıldı. Anestezi derinliği, pedal çekilme refleksinin kaybı ile doğrulandı. Derin anestezi sağlandıktan sonra, intrakardiyak ponksiyon ile kan örnekleri toplandı. Uygun bir şırınga ve iğne kullanılarak yaklaşık 3–5 mL kan elde edildi. Serum üre ve kreatinin konsantrasyonlarının, serum SOD aktivitesinin ve serum MDA konsantrasyonunun ölçümü için toplanan kanlar, antikoagülan içermeyen tüplere aktarıldı ve tamamen pıhtılaşması beklendi. GSH düzeyi ve CAT aktivitesi ölçümü için amaçlanan kan, etilendiamintetraasetik asit (EDTA) içeren tüplere ayrı olarak toplandı ve pıhtılaşma adımı olmadan işlendi. Pıhtı oluşumu tamamlandıktan sonra, serum örnekleri 4 °C'de 10–15 dk boyunca 3,000 × g hızında santrifüj edildi. Ayrıştırılan serum, analiz edilene kadar −80 °C'de saklandı. Başarılı serum ayrımı, berrak ve hemoliz olmamış görünüm ile doğrulandı. Kan toplama işleminin ardından ötanazi, derin anestezi altında eksanguinasyon ile gerçekleştirildi. Ardından median laparotomi uygulandı ve her iki böbrek dikkatle çıkarıldı. Çevredeki yağ ve bağ dokuları temizlendikten sonra böbrekler soğuk fizyolojik tuzlu solüsyon ile durulandı. Doku örnekleri histopatolojik ve biyokimyasal analizler için bölündü. Histopatolojik inceleme için ayrılan örnekler %10 nötral tamponlu formaldehide yerleştirildi. Biyokimyasal analizler için ayrılan örnekler uygun şekilde etiketlendi ve −80 °C'de saklandı.

Numune toplama, biyokimyasal analizler ve sonuç değerlendirmeleri, deney gruplarına karşı körleme uygulanan araştırmacılar tarafından gerçekleştirilmiştir. Analizlerin dışında tutulan hayvan olmamıştır.

Biyokimyasal analizler
Serum üre konsantrasyonu, otomatik bir biyokimya analizöründe enzimatik üreaz–glutamat dehidrogenaz kinetik testi kullanılarak ölçülmüştür. Üre, üreaz tarafından hidroliz edilerek amonyak üretmiş; amonyak daha sonra glutamat dehidrogenaz varlığında 2-oksoglutarat ve indirgenmiş nikotinamid adenin dinükleotid (NADH) ile reaksiyona girmiştir. NADH tüketiminden kaynaklanan absorbans azalması kinetik olarak ölçülmüştür. Serum kreatinin konsantrasyonu, aynı otomatik biyokimya analizörü kullanılarak kolorimetrik olarak ölçülmüştür.

Serum süperoksit dismutaz (SOD) aktivitesi, ksantin-ksantin oksidaz sistemi tarafından süperoksit radikali üretimine ve bunun renkli bir formazan ürünü oluşturmak için 2-(4-iyodofenil)-3-(4-nitrofenil)-5-feniltetrazolyum klorür ile reaksiyonuna dayanan kolorimetrik bir analiz kullanılarak belirlenmiştir. Bitiş absorbansı 505 nm'de ölçülmüştür. Serum malondialdehit (MDA) konsantrasyonu, tiyobarbitürik asit reaksiyonu kullanılarak belirlenmiştir. Serum örnekleri, proteinleri çöktürmek için soğuk trikloroasetik asit ile karıştırılmış ve 4 °C'de 5 dk boyunca 7,500 × g hızında santrifüj edilmiştir. Elde edilen süpernatan, eşit hacimde tiyobarbitürik asit ile karıştırılmış ve 90 °C'de 60 dk boyunca inkübe edilmiştir. Reaksiyon tüpleri daha sonra soğuk su banyosunda 10 dk boyunca soğutulmuş ve absorbans 532 nm'de ölçülmüştür. MDA konsantrasyonları, ilgili kalibrasyon eğrisinden hesaplanmıştır. İndirgenmiş glutatyon (GSH), EDTA ile antikoagüle edilmiş kanda modifiye bir Ellman yöntemi kullanılarak ölçülmüştür. Trikloroasetik asit ile protein çöktürme işleminin ardından, proteinleri uzaklaştırılmış örnekler pH 8.2'de 500 mM Tris tamponunda 5,5′-ditiyobis(2-nitrobenzoik asit) ile reaksiyona sokulmuş ve absorbans 412 nm'de ölçülmüştür. Katalaz (CAT) aktivitesi, EDTA ile antikoagüle edilmiş kanda iki aşamalı kolorimetrik bir analiz kullanılarak ölçülmüştür. Örnekler bilinen miktarda hidrojen peroksit ile inkübe edilmiş ve enzimatik reaksiyon sonlandırıldıktan sonra, kalıntı hidrojen peroksit kromojenik bir reaktif kullanılarak 405 nm'de ölçülmüştür.

SOD aktivitesi ve MDA konsantrasyonu serumda, GSH seviyesi ve CAT aktivitesi ise böbrek dokusu homojenatları yerine EDTA ile antikoagüle edilmiş kanda ölçüldüğü için, bu redoksla ilişkili parametrelerin doku toplam protein konsantrasyonuna göre normalizasyonu uygulanmamıştır. Redoksla ilişkili biyobelirteç profilinin yorumlanmasında, daha yüksek serum MDA konsantrasyonları daha fazla lipid peroksidasyonu ile uyumlu kabul edilirken; daha düşük serum SOD aktivitesi, kan GSH seviyeleri ve kan CAT aktivitesi, azalmış antioksidan kapasitenin göstergesi olarak kabul edilmiştir; ters yöndeki değişimler ise daha elverişli bir redoks profili olarak yorumlanmıştır.

Böbrek dokusu enzimle bağlı immünosorbent assay (ELISA) ölçümleri için, −80 °C'de saklanan yaklaşık 50 mg böbrek dokusu, 1:10 (w/v) sabit doku-tampon oranına karşılık gelen, proteaz inhibitör kokteyli içeren 500 µL homojenizasyon tamponunda buz üzerinde homojenize edildi. Her sıçan için bir adet hayvana özgü böbrek dokusu homojenatı hazırlandı. Farklı hayvanlardan alınan örnekler bağımsız olarak işlendi ve hiçbir aşamada birleştirilmedi. Homojenatlar 4 °C'de 10 dakika boyunca 14,000 × g hızda santrifüj edildi ve her hayvandan elde edilen süpernatant ayrı ayrı toplandı ve planlanan böbrek dokusu analizleri için alikotlara bölündü. Toplam protein konsantrasyonu ayrıca ölçülmedi; bu nedenle, doku ELISA sonuçları buna göre normalize edilmedi. İlgili assay-özel standart eğrilerinden hesaplanan final konsantrasyonlar TNF-α ve IL-6 için ng/L, IL-1β, KIM-1 ve cystatin C için ise ng/mL olarak ifade edildi.

Böbrek hasarı molekülü-1 (KIM-1) ve sistatin C böbrek hasarı biyobelirteçleri olarak, tümör nekroz faktörü-α (TNF-α), interlökin-6 (IL-6) ve interlökin-1β (IL-1β) ise böbrek enflamasyon belirteçleri olarak değerlendirildi. Beş analitin tamamı, üretici protokollerine uygun olarak sıçanlara özgü ELISA kitleri kullanılarak böbrek dokusu homojenatlarında ölçüldü. İlgili analizler için analitik duyarlılıklar ve ölçüm aralıkları sırasıyla; TNF-α için 2,51 ng/L ve 5–1.000 ng/L, IL-6 için 0,052 ng/L ve 0,1–40 ng/L, IL-1β için 0,08 ng/mL ve 0,2–60 ng/mL, KIM-1 için 0,01 ng/mL ve 0,05–10 ng/mL ve sistatin C için 0,25 ng/mL ve 0,5–100 ng/mL idi. Analizden önce tüm reaktifler, standartlar ve böbrek dokusu süpernatantları oda sıcaklığına getirildi. Standart eğriler, üretici tavsiyelerine göre her analiz çalışması için ayrı ayrı oluşturuldu. Standartlar ve böbrek dokusu süpernatantları, antikorla önceden kaplanmış kuyucuklara eklendi ve ardından ilgili biyotinillenmiş saptama antikoru ve streptavidin-yaban turpu peroksidaz konjugatı eklendi. Numuneler ve ELISA reaktifleri 37 °C'de 1 s boyunca inkübe edildi. Otomatik bir mikroplaka yıkayıcı kullanılarak beş yıkama döngüsünden sonra, substrat çözeltileri A ve B eklenerek 37 °C'de 10 dk inkübe edildi. Renk reaksiyonu asidik bir durdurma solüsyonu kullanılarak sonlandırıldı ve absorbans 450 nm'de ölçüldü. Her bir analit için, kör düzeltmeli absorbans değerleri, ilgili analize özgü standart eğri kullanılarak konsantrasyonlara dönüştürüldü.

Tüm biyokimyasal analizler standartlaştırılmış koşullar altında gerçekleştirilmiş ve tüm örnekler aynı prosedürler kullanılarak işlenmiştir. Renal doku ELISA ölçümleri duble olarak yapılmıştır. Her bir analit için, tek bir hayvan düzeyinde değer elde etmek amacıyla iki teknik replika kuyucuğun ortalaması hesaplanmıştır. Aynı hayvana özgü homojenattan elde edilen teknik replika kuyucuklar ve ayrı alikotlar bağımsız gözlemler olarak değerlendirilmemiştir. Bireysel hayvan deneysel birim olarak kabul edilmiş ve her parametre için bir hayvan düzeyindeki sonuç istatistiksel analize dahil edilmiştir.

Histopatolojik işlem ve böbrek hasarı skorlaması
Doku örnekleri, standart histopatolojik prosedürler kullanılarak mikroskobik değerlendirme için işlenmiştir. Böbrek dokuları, oda sıcaklığında 72 saat boyunca %10 nötr tamponlu formaldehit ile fikse edilmiştir. Fiksasyonun ardından dokular; %50, %70, %80, %96 ve %100'lük dereceli etanol konsantrasyonları ile her bir konsantrasyonda 1 saat bekletilereky eksiksuya çıkarılmıştır. Sonrasında dokular, iki aşamalı ksilen işlemiyle şeffaf hale getirilmiş ve parafin bloklara gömülmüştür. Rotari mikrotom kullanılarak parafin bloklardan 5 µm kalınlığında kesitler alınmıştır.

Hematoksilen ve eozin boyaması için kesitler deparafinize edilip yeniden hidrate edilmiş, 5 dk boyunca hematoksilen ile boyanmış ve 5 dk boyunca akan musluk suyu altında yıkanmıştır. Diferansiyasyon asit alkol kullanılarak gerçekleştirilmiş, ardından kesitler 1 dk boyunca amonyaklı suda tutulmuştur. Kesitler daha sonra 2 dk boyunca eozin ile karşı boyanmıştır. Sonrasında kesitler, artan alkol serisi ile dehidrate edilmiş, ksilenle şeffaflaştırılmış ve uygun bir kapatma ortamı ile kapatılmıştır.

Masson trikrom boyaması için kesitlerin parafinleri uzaklaştırılıp yeniden hidrate edilmiş, ardından 56 °C'de 60 dk boyunca mordan çözeltisinde inkübe edilmiş ve 10 dk boyunca akan su altında yıkanmıştır. Kesitler daha sonra sırasıyla 10 dk boyunca Weigert demir hematoksilin, 15 dk boyunca Biebrich scarlet-asit fuksin, 10 dk boyunca fosfotungstik asit ve 10 dk boyunca anilin mavisi ile işleme tabi tutulmuştur. Son olarak kesitler 5 dk boyunca %1 asetik asitte bekletilmiş, dehidrate edilmiş, ksilen ile şeffaf hale getirilmiş ve kapatılmıştır.

Başarılı boyama; net nükleer boyama, korunmuş sitoplazmik kontrast, böbrek mimarisinin korunması ve bağ doku yapılarının belirgin görselleştirilmesi ile doğrulanmıştır. Boyanan tüm lamlar, dijital görüntüleme sistemiyle donatılmış bir ışık mikroskobu kullanılarak standardize edilmiş koşullar altında değerlendirilmiştir.

Histopatolojik değerlendirmeler, deney gruplarından habersiz olan deneyimli tek bir patolog tarafından gerçekleştirilmiştir. Histopatolojik skorlama 200× büyütmede yapılmıştır. Her hayvan ve her histopatolojik parametre için rastgele seçilen 10 mikroskobik alan incelenmiştir. Değerlendirilen parametre için en şiddetli değişikliği gösteren alan, hayvanın 0–4 ölçeğindeki tek tam sayı skorunu atamak için kullanılmıştır. Tübüler hasar; tübüler dilatasyon, tübüler lümende proteinli materyal birikimi, tübüler epitel dejenerasyonu ve tübüler nekroza göre değerlendirilmiştir. Glomerüler hasar; glomerüler dejenerasyon veya atrofi, Bowman boşluğunun genişlemesi ve vasküler konjesyona göre değerlendirilmiştir. İnterstisyel hasar, interstisyel inflamasyon ve fibrozis temel alınarak değerlendirilmiştir. Histopatolojik değerlendirme için her hayvandan alınan beş mikrometrelik hematoksilen-eozin ve Masson trikrom boyalı böbrek kesitleri kullanılmıştır. Temsili fotomikrograflar 200× büyütmede elde edilmiş olup, ölçek çubukları 100 µm'yi temsil etmektedir. Hayvan başına incelenen ayrı histolojik kesitlerin sayısı çalışma kayıtlarından geri getirilememiş ve bu nedenle raporlanamamıştır.

Masson trikrom bulguları, yalnızca mavi boyanma yoğunluğu yerine kolajen birikiminin lokalizasyonu ve morfolojik paterni dikkate alınarak histomorfolojik olarak yorumlanmıştır. Semikantitatif interstisyel fibrozis skoru bu histomorfolojik değerlendirmeye dayandırılmış ve kolajen pozitif alan yüzdesi nicelendirilmemiştir. Histopatolojik skorlama, daha önce tanımlanmış böbrek hasarı değerlendirme kriterleri^16,17 kullanılarak semikantitatif olarak gerçekleştirilmiştir. Her hayvana, her bir histopatolojik parametre için 0-4 ölçeğinde (0 = yok, 1 = minimal, 2 = hafif, 3 = orta, 4 = şiddetli) bir tam sayı puanı verilmiştir. Derecelendirme kategorileri, sürekli bir morfometrik ölçümden ziyade, körleme yöntemiyle çalışan patoloğun her bir lezyonun morfolojik şiddetine ilişkin genel değerlendirmesini temsil etmiştir.

Güvenlik önlemleri ve atık yönetimi
Metanol, formaldehit, ksilen, biyolojik örnekler ve hayvan dokuları ile çalışırken uygun kişisel koruyucu ekipman kullanılmıştır. Laboratuvar önlüğü, eldiven ve göz koruyucu kullanılmıştır. Metanolün sistemik toksisitesi ve uçuculuğu nedeniyle tüm işlemler dikkatle gerçekleştirilmiştir. Formaldehit ve ksilen içeren prosedürler, mümkün olan her durumda kimyasal çeker ocak altında yürütülmüştür. Kesici ve delici aletler, uygun atık kutularında toplanmıştır. Kimyasal atıklar ve biyolojik materyaller, kurumsal biyogüvenlik ve tehlikeli atık yönetimi prosedürlerine uygun olarak bertaraf edilmiştir.

İstatistiksel analiz
Sürekli biyokimyasal, böbrek hasarı biyobelirteci, inflamatuar, böbrek fonksiyonu ve redoks ile ilişkili değişkenler, ortalama ± standart sapma (ortalama ± SD) olarak ifade edildi. Veri dağılımının normalliği Shapiro–Wilk testi ile değerlendirildi ve varyansların homojenliği Levene testi ile incelendi. Biyokimyasal sonuçlar için gruplar arası karşılaştırmalar, tek yönlü varyans analizi (ANOVA) kullanılarak gerçekleştirildi. Varsayım kontrolleri, serum kreatinin için bir grupta normallikten sapma ve birçok biyokimyasal sonuç için varyans heterojenliği saptadı. Orijinal ANOVA yaklaşımı korundu; ancak, bu sapmalar sonuçlanan p-değerlerinin güvenilirliğini etkilemiş olabilir ve bu nedenle bulgular ihtiyatla yorumlanmıştır.

ANOVA ile istatistiksel olarak anlamlı bir fark saptandığında, gruplar arasındaki ikili karşılaştırmalar Duncan post hoc çoklu karşılaştırma testi kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Her satırda aynı üst simge harfini paylaşan değerler, Duncan post hoc testine göre anlamlı şekilde farklı değildir. Biyokimyasal sonuçlar genelinde herhangi bir ek çokluluk düzeltmesi uygulanmamıştır. Duncan prosedürü, aile bazlı tip I hata oranı üzerinde güçlü bir kontrol sağlamamıştır ve birden fazla sonucun test edilmesi yalancı pozitif bulguların riskini daha da artırmıştır. Bu nedenle, bireysel anlamlı karşılaştırmalar dikkatle yorumlanmıştır.

Biyokimyasal sonuçlar için genel etki büyüklükleri, df_between = 4 ve df_error = 25 olmak üzere (F × df_between)/(F × df_between + df_error) şeklinde hesaplanan eta-kare (η²) kullanılarak tahmin edilmiştir. İki yönlü %95 güven aralıkları, merkezsiz F dağılımı tersine çevrilerek ve merkezsizlik sınırları (λ), N = 30 olmak üzere λ/(λ + N) kullanılarak dönüştürülmüş hesaplanmıştır. Bu ek hesaplamalar bilimsel bir hesaplama ortamı kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Tahminler, birincil istatistiksel analizden elde edilen yuvarlanmış F istatistiklerinden türetilmiştir ve bu nedenle yaklaşık değerlerdir. Güven aralıkları, ANOVA modelinin normallik ve eşit varyans varsayımlarına dayanmaktadır ve çoklu sonuçlar için düzeltilmemiştir.

Histopatolojik skorlar, ortalama olarak tanımlayıcı şekilde özetlenen, ordinal, yarı nicel gözlemlerdi. ± ortalama grup düzeyindeki lezyon yükünü ve hayvanlar arası değişkenliği göstermek için SD kullanılmıştır. Histopatolojik skorlar için herhangi bir çıkarımsal hipotez testi veya post hoc ikili karşılaştırmalar yapılmamıştır. Bu nedenle, ANOVA, Duncan post hoc testi ve pp-değeri raporlaması yalnızca biyokimyasal, renal hasar biyobelirteçleri, inflamatuar, renal fonksiyon ve redoksla ilişkili sonuçlara uygulanmıştır. A p-değeri < 0,05 istatistiksel olarak anlamlı kabul edildi.

Sonuçlar

Tüm 30 hayvan analizlere dahil edildi ve beş deneysel grubun her birinde altışar hayvan bulundu. Beş gruptaki tüm hayvanlar çalışma gününün 10. gününde (10. study day) sakrifik edilerek örnekleri alındı. Üç metanol maruziyeti grubu için bu zaman noktası, metanol uygulamasından 48 saat sonrasına denk geldi. Bu nedenle, toplam çalışma süresi ve örnek toplama zamanı tüm deneysel gruplarda tutarlıydı. Böbrek hasarı ve inflamatuar biyobelirteçler, böbrek fonksiyonu ve redoks ile ilişkili parametreler ile histopatolojik bulgular aşağıda açıklandığı şekilde değerlendirildi.

Biyo-kimyasal bulgular: böbrek hasarı ve inflamatuar biyobelirteçler
Böbrek doku homojenatlarında ölçülen böbrek hasarı ve inflamatuvar biyobelirteçlere ilişkin bulgular sunulmuştur. Tablo 1Tek yönlü ANOVA, beş grup arasında kistatin C açısından anlamlı genel farklar olduğunu gösterdi [F(4,25) = 5,329, p = 0,003], IL-6 [F(4,25) = 3,907, p = 0,013], KIM-1 [F(4,25) = 3,673, p = 0,017], TNF-α [F(4,25) = 7,660, p < 0,001] ve IL-1β [F(4,25) = 11,584, p < 0,001]. Post-hoc grup karşılaştırmaları Duncan testi kullanılarak yapıldı’s çoklu aralık testi, grup atamaları üst simge harflerle gösterilmiştir Tablo 1. Böbrek doku homojenatında kistatin C, IL-6 ve KIM-1 düzeyleri en yüksek MTX + Metanol grubunda idi, bu değişkenler açısından Kontrol, sadece MTX, MTX + Metanol + Fomepizol ve MTX + Metanol + Etanol grupları arasında anlamlı fark gözlenmedi. Böbrek doku homojenatında TNF-α düzeyleriα ve IL-1β MTX + Metanol grubunda aynı zamanda en yüksek seviyede idi. Sadece MTX grubu, TNF- seviyelerinde daha yüksek değerler gösterdiα ve IL-1β böbrek doku homojenatlarında Kontrol grubuna göre daha yüksek whereas antidot ile tedavi edilen gruplarda ise ara değerler gösterdi (Tablo 1).

Böbrek fonksiyonu ve redoks ile ilişkili parametreler
Serum renal fonksiyon indeksleri ve kandan elde edilen redoks ilişkili parametreler sunuldu Tablo 2Tek yönlü ANOVA, serum üresi açısından beş grup arasında önemli genel farklar olduğunu gösterdi [F(4,25) = 3,694, p = 0,017], serum kreatinin [F(4,25) = 12,988, p < 0,001], serum SOD aktivitesi [F(4,25) = 11,621, p < 0,001], kan GSH düzeyi [F(4,25) = 10,164, p < 0,001], kan CAT aktivitesi [F(4,25) = 10,631, p < 0.001] ve serum MDA konsantrasyonu [F(4,25) = 8,814, p < 0.001]. Post-hoc grup karşılaştırmaları Duncan testi kullanılarak yapıldı’s çoklu aralık testi, grup atamaları üst simge harflerle gösterilmiştir Tablo 2.

Serum üre, serum kreatinin ve serum MDA konsantrasyonları en yüksek düzeyde MTX + Metanol grubunda bulundu. Serum üre ve serum MDA konsantrasyonları Kontrol, sadece MTX, MTX + Metanol + Fomepizol ve MTX + Metanol + Etanol grupları arasında anlamlı farklılık göstermedi, buna karşılık serum kreatinin düzeyi Kontrol grubunda en düşük seviyede oldu.Tablo 2).

MTX + Metanol grubu ayrıca en düşük serum SOD aktivitesini, kan GSH düzeyini ve kan CAT aktivitesini gösterdi. MTX + Metanol grubuna kıyasla, fomepizol ile tedavi edilen grupta serum SOD ve kan CAT aktiviteleri önemli ölçüde daha yüksek iken, etanol ile tedavi edilen gruptaki ilgili artışlar istatistiksel olarak anlamlı değildi. Kan GSH düzeyleri sadece MTX, MTX + Metanol ve iki antidot ile tedavi edilen gruplar arasında önemli ölçüde farklılık göstermedi.Tablo 2).

Kontrol grubuna kıyasla, sadece MTX uygulanan grupta böbrek doku homojenatında TNF düzeyleri daha yüksek bulunduα ve IL-1β ve daha düşük serum SOD aktivitesi, kan GSH düzeyi ve kan CAT aktivitesi gösterdi ancak böbrek doku homojenatında kistatin C, IL-6 veya KIM-1 düzeyleri ile serum üre, serum kreatinin veya serum MDA konsantrasyonu açısından anlamlı bir farklılık göstermedi.

Histopatolojik bulgular ve böbrek hasarı skorları
Böbrek dokularının histopatolojik değerlendirmesinin sonuçları şu şekilde sunuldu: Tablo 3Gruplar arasında tübüler dilatasyon, proteinöz materyal birikimi, tübüler epitel dejenerasyonu, tübüler nekroz, glomerüler dejenerasyon ve Bowman kapsülünün genişlemesi açısından tanımlayıcı varyasyonlar gözlendi.’s boşluğu, vasküler konjesyon, interstisyel inflamasyon ve interstisyel fibrozis.

Kontrol grubunda böbrek dokusu, glomerüler veya tübüler yapılarda belirgin patolojik değişiklikler olmadan normal histolojik yapıyı korudu. MTX grubunda hafif tübüler dejenerasyon, vasküler konjesyon ve interstisyel inflamasyon gözlendi.

MTX + Metanol grubu, değerlendirilen tübüler, glomerüler, vasküler ve interstisyel parametreler boyunca en yüksek gözlenen hasar skorlarını gösterdi. Her iki antidot uygulanan grup da tanımsal olarak MTX + Metanol grubundan daha düşük gözlenen skorlar gösterdi. Tanımsal karşılaştırmalarda, fomepizole ile tedavi edilen grupta, özellikle tübüler dilatasyon, tübüler nekroz, glomerüler dejenerasyon ve Bowman kapsülünün genişlemesi başta olmak üzere, çoğu parametrede etanol ile tedavi edilen gruba göre daha düşük gözlenen skorlar saptandı.’s boşluk, vasküler konjesyon ve interstisyel fibrozis (Tablo 3). Bu karşılaştırmalar tanımlayıcıydı ve histopatolojik skorlar üzerinde herhangi bir çıkarımsal istatistiksel test yapılmadı. Hematoksilen ve eozin ile elde edilen temsili böbrek histopatolojik görüntüleri ve Masson’trikrom boyama ile gösterilmiştir Şekil 2.

Genel olarak, MTX + Metanol grubu en yüksek böbrek hasarı ve inflamatuar biyobelirteç değerlerini, en olumsuz böbrek fonksiyonu ve redoks profillerini ve en yüksek histopatolojik hasar skorlarını gösterdi. Antidot ile tedavi edilen her iki grupta da MTX + Metanol grubuna kıyasla daha olumlu böbrek sonuçları gözlendi ve bu durum fomepizole ile tedavi edilen grupta değerlendirilen alanlarda daha tutarlı bir şekilde ortaya çıktı. Ayrıca MTX-only grubunda kontrol grubuna kıyasla seçili inflamatuar ve redoksla ilişkili parametrelerde değişiklikler görüldü.

VERİ ERİŞİLEBİLİRLİĞİ:
Biyo kimyasal, böbrek hasarı biyobelirteci, inflamatuvar, böbrek fonksiyonu ve redoks ilişkili analizleri destekleyen hayvan düzeyinde ham veriler sağlanmıştır. Ek Dosya 1.

Şekil 1: Deneysel tasarım ve tedavi zaman çizelgesi. Metanol zehirlenmesinin deneysel sıçan modelinin şematik gösterimi. Yetişkin erkek Wistar albino sıçanlar beş gruba ayrıldı: Kontrol, metotreksat (MTX) sadece, MTX + Metanol, MTX + Metanol + Fomepizol ve MTX + Metanol + Etanol (n = 6/grup). On günlük çalışma boyunca standart pelet yem ve musluk suyu serbestçe temin edildi ve metanol uygulamasından önce veya sonra açlık veya diğer gıda ve su kısıtlamaları uygulanmadı. Kontrol grubuna deneysel bir uygulama yapılmadı. 2. gruptaki hayvanlara–5, 7 ardışık gün boyunca (çalışma günleri 1-7) günde bir kez 0,3 mg/kg dozunda ağız yoluyla gavaj ile MTX aldı–7). 3. Gruptaki Hayvanlar–5, çalışma gününün 8. günü ağız yoluyla 3 g/kg dozunda tek bir metanol dozu aldı. MTX + Metanol + Fomepizol grubunda, metanol uygulamasından 4 saat sonra 15 mg/kg dozunda intraperitoneal yüklenme dozu fomepizol uygulandı ve ardından 12, 24 ve 36. saatlerde 10 mg/kg dozunda destekleyici dozlar verildi. MTX + Metanol + Etanol grubunda, metanol uygulamasından 4 saat sonra etanol, 0.5 g/kg dozunda tek bir doz olarak ağız yoluyla verildi. Tüm hayvanlar çalışma gününün 10. gününde öldürülerek sonlandırıldı. 3. Grup için–5, bu sonuç metanol uygulamasından 48 saat sonra alınan örneklerle karşılandı. Böbrek fonksiyonu, böbrek hasarı biyobelirteçleri, inflamatuar sitokinler, redoks ile ilişkili biyobelirteçler ve böbrek histopatolojisi analizleri için kan ve böbrek örnekleri toplandı. Kısaltmalar: MTX = metotreksat. Lütfen bu şeklin daha büyük halini görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 2: Deneysel gruplardan alınan böbrek dokusunda temsili histopatolojik bulgular. Kontrol, MTX, MTX + Metanol, MTX + Metanol + Fomepizol ve MTX + Metanol + Etanol gruplarına ait temsili böbrek kesitleri gösterilmiştir. Üst satır, hematoxylin ve eosin (H&E) boyama, alt satır ise Masson’s trikrom boyama. Kontrol grubunda normal glomerüler ve tübüler morfoloji ile birlikte korunmuş böbrek yapısı gözlemlendi. Kontrol grubunda glomerüler ve tübüler bazal membranlarda, damar duvarlarında ve interstisyel bağ dokusunda mavi boyanan kollajen, patolojik fibrozis bulgusu değil, fizyolojik kollajen olarak değerlendirildi. MTX grubunda hafif tübüler dejenerasyon, vasküler konjesyon ve inflamatuar değişiklikler görüldü. MTX + Metanol grubunda daha belirgin böbrek hasarı mevcuttu ve bu hasar tübüler dejenerasyon (*) ile karakterizeydi, vasküler konjesyon (+), Bowman boşluğunun genişlemesi’s boşluğu (x), tübüler nekroz (↑), interstisyel inflamasyon (↕) ve histomorfolojik fibrotik değişiklikle uyumlu periglomerüler kollajen birikimi (‡), Masson'da gözlemlendiği gibi’trikrom ile boyanmış kesit. Fomepizol ile tedavi edilen grupta, MTX + Metanol grubuna kıyasla daha düşük histopatolojik hasar skorları gözlendi ve tübüler ve glomerüler yapılar nispeten korunmuş, nekroz, inflamasyon, vasküler konjesyon ve kollajenle ilişkili değişiklikler daha az yaygın oldu. Etil alkol ile tedavi edilen grupta da MTX + Metanol grubuna kıyasla daha düşük histopatolojik hasar skorları saptandı; ancak tübüler, glomerüler ve vasküler değişikliklerin kalıntıları, Fomepizol ile tedavi edilen gruba göre daha belirgin oldu. Fotomikrografik görüntüler 200'de alındı× büyütme ve ölçek çubukları 100'ü temsil eder µm. Masson’s trichrome boyaması destekleyici histomorfolojik kanıt olarak değerlendirildi; fibrozisin gruplar arası karşılaştırmasında nicel bir ölçüt olarak panellerdeki mavi boyamanın yoğunluğundaki farklılıklar kullanılmadı. Semboller: * tübüler dejenerasyon; + vasküler konjesyon; x Bowman boşluğunun genişlemesi’s boşluğu; ↑ tübüler nekroz; ↕ interstisyel inflamasyon ‡ periglomerüler kollajen birikimi, histomorfolojik fibrotik değişiklikle uyumlu. MTX, metotreksat. Lütfen bu şeklin daha büyük halini görüntülemek için buraya tıklayınız.

Değişken	Kontrol (n = 6)	MTX (n = 6)	MTX + Metanol (n = 6)	MTX + Metanol + Fomepizol (n = 6)	MTX + Metanol + Etanol (n = 6)	p	η² %95 GA
Kistatin C (ng/mL)	26.07 ± 12.05a	32.01 ± 1.86a	45.23 ± 10.51b	32.49 ± 1.60a	31.27 ± 4.60a	0.003	0.460 (0.084 – 0.597)
IL-6 (ng/L)	7.66 ± 1.38a	8.72 ± 2.45a	11.02 ± 0.83b	7.96 ± 1.54a	8.12 ± 1.77a	0.013	0.385 (0.023 – 0.535)
KIM-1 (ng/mL)	2.21 ± 1.00a	2.47 ± 0.24a	3.45 ± 0.81b	2.28 ± 0.58a	2.32 ± 0.37a	0.017	0.370 (0.013 – 0.522)
TNF-α (ng/L)	118.66 ± 22.95a	190.51 ± 5.84b	238.29 ± 34.68c	147.10 ± 24.31ab	168.41 ± 75.41ab	<0.001	0.551 (0.181 – 0.668)
IL-1β (ng/mL)	8.43 ± 0.59a	12.53 ± 1.05c	15.26 ± 1.46d	10.05 ± 2.86ab	11.17 ± 2.37bc	<0.001	0.650 (0.316 – 0.743)

Tablo 1: Deneysel gruplarda renal hasar ve inflamatuar biyobelirteçler. Veriler ortalama olarak sunulmuştur ± standart sapma (SS), her grup için altı hayvanla. Tüm biyobelirteçler böbrek doku homojenatlarında ölçüldü. Sistatin C, KIM-1 ve IL-1β konsantrasyonlar ng/mL cinsinden ifade edilir; IL-6 ve TNF-α konsantrasyonlar ng/L cinsinden ifade edilir. Bildirilen p değerler, beş grup arasında yapılan genel tek yönlü varyans analizine (ANOVA) dayanmaktadır. Anlamlı bir genel teste takiben, Duncan'ın çoklu karşılaştırma testi kullanılarak sonrası testleri yapılmıştır’çoklu aralık testi. Her bir satırda, en az bir üst simge harfi ortak olan gruplar arasında anlamlı bir fark yoktur, ortak harfe sahip olmayan gruplar ise 0,05 düzeyinde anlamlı farklılık gösterir. Biomarker'lar arasında ek çoklu karşılaştırma düzeltmesi uygulanmadı. Bazı biomarker'lar arasında varyans heterojenliği tespit edildi; bu nedenle ANOVA ve Duncan sonuçları dikkatli yorumlanmalıdır. Kısaltmalar: MTX = metotreksat; KIM-1 = böbrek hasarı molekülü-1; IL-6 = interleukin-6; TNF-α = tümör nekrozis faktörü-alfa; IL-1β = interleukin-1 beta; SD = standart sapma; ANOVA = varyans analizi; CI = güven aralığı. η² beş grup boyunca genel etki büyüklüğünü temsil eder. İki taraflı %95 güven aralıkları modele dayalıdır, hataların normal dağıldığını ve eşit varyanslara sahip olduğunu varsayar ve çoklu sonuçlar için düzeltilmemiştir. Bu nedenle, bu varsayımlar ihlal edildiğinde güven aralıkları dikkatli yorumlanmalıdır.

Değişken	Kontrol	MTX	MTX + Metanol	MTX + Metanol + Fomepizol	MTX + Metanol + Etanol	p	η² %95 GA
Serum üre (mg/dL)	39.64 ± 13.69a	46.88 ± 9.49a	98.75 ± 59.24b	48.03 ± 19.64a	60.44 ± 18.53a	0.017	0.371 (0.014–0.523)
Serum kreatinin (mg/dL)	0.50 ± 0.10a	0.54 ± 0.05ab	0.72 ± 0.03c	0.54 ± 0.03ab	0.60 ± 0.05b	<0.001	0.675 (0.356–0.762)
Sera SOD aktivitesi (U/mL)	470.40 ± 40.49d	371.16 ± 17.64c	219.29 ± 85.06a	319.38 ± 107.20bc	256.22 ± 67.89ab	<0.001	0.650 (0.317–0.743)
Kan GSH (mmol/L)	58.74 ± 31.90b	26.36 ± 5.92a	11.10 ± 3.73a	19.56 ± 1.66a	13.66 ± 5.32a	<0.001	0.619 (0.272–0.720)
Kan CAT aktivitesi (U/mL)	220.82 ± 74.08c	160.88 ± 55.18b	68.90 ± 13.41a	129.45 ± 7.49b	110.14 ± 20.18ab	<0.001	0.630 (0.287–0.728)
Serum MDA (nmol/mL)	13.17 ± 2.03a	17.29 ± 6.36a	31.83 ± 9.94b	17.93 ± 2.04a	19.34 ± 4.65a	<0.001	0.585 (0.225–0.694)

Tablo 2: Deneysel gruplarda böbrek fonksiyonu ve redoks ile ilişkili parametreler. Veriler ortalama olarak sunulmuştur ± standart sapma (SD) ile, her grupta altışar hayvan olacak şekilde. Serum üresi, serum kreatinini, süperoksit dismutaz (SOD) aktivitesi ve malondialdehit (MDA) konsantrasyonu serumda; indirgenmiş glutatyon (GSH) düzeyi ve katalaz (CAT) aktivitesi etilen diamin tetraasetik asit (EDTA) ile antikoagüle edilmiş kanda ölçüldü. Serum üre ve kreatinin konsantrasyonları mg/dL cinsinden, SOD ve CAT aktiviteleri U/mL cinsinden, GSH düzeyleri mmol/L cinsinden ve MDA konsantrasyonları nmol/mL cinsinden ifade edildi. Bildirilen p değerler, beş grup arasında yapılan genel tek yönlü varyans analizine (ANOVA) dayanmaktadır. Anlamlı bir genel teste takiben, Duncan'ın çoklu karşılaştırma testi kullanılarak ikincil karşılaştırmalar yapılmıştır’çoklu aralık testi. Her satırda, en az bir üst simge harfi ortak olan gruplar arasında anlamlı bir fark yoktur, ortak harfe sahip olmayan gruplar ise 0,05 düzeyinde anlamlı farklılık gösterir. Biomarker'lar arasında ek çoklu karşılaştırma düzeltmesi uygulanmadı. Bazı sonuçlarda varyans heterojenliği tespit edildi; bu nedenle ANOVA ve Duncan sonuçları dikkatli yorumlanmalıdır. Redoks ile ilişkili biomarker'lar dolaylı göstergelerdir ve mitokondriyal fonksiyonun doğrudan ölçümlerini ya da yaralanmanın moleküler mekanizmalarını oluşturmaz. η² beş grup boyunca genel etki büyüklüğünü temsil eder. İki taraflı %95 güven aralıkları modele dayalıdır, hataların normal dağıldığını ve varyansların eşit olduğunu varsayar ve çoklu sonuçlar için düzeltilmemiştir. Bu nedenle, bu varsayımlar ihlal edildiğinde güven aralıkları dikkatli yorumlanmalıdır. Kısaltmalar: MTX = metotreksat; SOD = süperoksit dismutaz; GSH = indirgenmiş glutatyon; CAT = katalaz; MDA = malondialdehit; EDTA = etilen diamin tetraasetik asit; SD = standart sapma; ANOVA = varyans analizi; CI = güven aralığı.

Değişken	Kontrol	MTX	MTX + Metanol	MTX + Metanol  + Fomepizol	MTX + Metanol + Etanol
Tübüler dilatasyon	0.16 ± 0.40	1.50 ± 0.54	3.50 ± 0.54	0.83 ± 0.40	1.66 ± 0.51
Protein içeriğinin birikimi	0.00 ± 0.00	1.33 ± 0.51	3.16 ± 0.40	0.66 ± 0.51	1.33 ± 0.51
Tübüler epitel dejenerasyonu	0.16 ± 0.40	1.83 ± 0.40	3.83 ± 0.40	1.00 ± 0.00	2.00 ± 0.00
Tübüler nekroz	0.00 ± 0.00	1.00 ± 0.00	3.33 ± 0.51	0.83 ± 0.40	1.33 ± 0.51
Glomerüler dejenerasyon	0.16 ± 0.40	1.33 ± 0.51	3.33 ± 0.51	1.00 ± 0.00	1.66 ± 0.51
Bowman's boşluğunun genişlemesi	0.00 ± 0.00	1.16 ± 0.40	3.00 ± 0.00	0.83 ± 0.40	1.66 ± 0.51
Vasküler tıkanıklık	0.00 ± 0.00	1.33 ± 0.51	3.16 ± 0.40	0.83 ± 0.40	1.66 ± 0.51
İnterstisyel inflamasyon	0.00 ± 0.00	1.00 ± 0.00	3.00 ± 0.63	0.83 ± 0.40	1.16 ± 0.40
İnterstisyel fibrozis	0.00 ± 0.00	1.00 ± 0.00	2.83 ± 0.40	0.66 ± 0.51	1.16 ± 0.40

Tablo 3: Deneysel gruplardaki tanımlayıcı histopatolojik skorlar. Veriler, ortalama olarak tanımlayıcı biçimde sunulmuştur ± standart sapma (SS), her grup için altı hayvanla. Histopatolojik skorlar, hematoksilen ve eozin (HE) ile boyanmış böbrek kesitlerinden elde edildi.&E) ve Masson’s trichrom; puanlar boyutsuzdur. Her hayvana her histopatolojik parametre için 0 ila 4 arasında bir tam sayı puanı verildi–4, burada 0 = yok, 1 = minimal, 2 = hafif, 3 = orta, 4 = şiddetli anlamındadır. Tabloda sunulan ondalık değerler, her deneysel gruptaki altışar hayvandan elde edilen bireysel tam sayı puanlarının aritmetik ortalamalarını temsil eder ve bireysel hayvanlara atanan puanları ya da sürekli bir puanlama sistemini yansıtmaz. Standart sapmalar, her gruptaki hayvanlar arasındaki değişkenliği gösterir. Histopatolojik puanlar üzerinde herhangi bir çıkarımsal istatistiksel test ya da post-hoc ikili karşılaştırmalar yapılmadı; bu nedenle gruplar arası gözlemlenen desenler, istatistiksel olarak anlamlı farklılıklar olarak değil, tanımlayıcı olarak yorumlanmalıdır. Histopatolojik değerlendirme, tübüler dilatasyon, proteinöz materyal birikimi, tübüler epitel dejenerasyonu, tübüler nekroz, glomerüler dejenerasyon, Bowman boşluğunun genişlemesi içermiştir’s boşluğu, vasküler konjesyon, interstisyel inflamasyon ve interstisyel fibrozis.

Ek Dosya 1: Biyokimyasal analizleri destekleyen ham verilerBu elektronik tablo, makalede bildirilen biyokimyasal, böbrek hasarı biyobelirteci, inflamatuar ve redoks ilişkili analizler için kullanılan birey hayvan düzeyindeki ham değerleri içermektedir. Lütfen bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.

Tartışma

Bu çalışmanın temel bulgusu, MTX + Metanol grubunun fonksiyonel, inflamatuar, redoksla ilişkili ve histopatolojik sonuçlar genelinde en olumsuz böbrek hasarı profilini göstermesidir. Bu grup; en yüksek serum üre, serum kreatinin, renal sistatin C, KIM-1, TNF-α, IL-6, IL-1β ve MDA değerleri ile en düşük SOD aktivitesi, GSH seviyeleri ve CAT aktivitesine ve beraberinde gözlemlenen en yüksek histopatolojik hasar skorlarına sahipti. Her iki antidotla tedavi edilen grup, MTX + Metanol grubuna göre daha olumlu böbrek sonucu modelleri göstermiş olup, fomepizole ile tedavi edilen grup değerlendirilen alanlar genelinde daha tutarlı ve olumlu bir model sergilemiştir. Ancak bu bulgular, eşit olmayan antidot rejimleri kullanılarak akut MTX ön tedavili bir sıçan modelinde elde edilmiştir: tekrarlayan intraperitoneal fomepizol uygulamasına karşı tek doz oral etanol. Uygulama yolu ve dozlama sıklığındaki bu farklılıklar, nefroprotektif etkinliğin doğrudan karşılaştırılmasını sınırlamakta ve gözlemlenen sonuç modelleri fomepizolün etanole karşı üstünlüğünü kanıtlamamaktadır. Yalnızca MTX verilen grup, Kontrol grubuna göre daha yüksek TNF-α ve IL-1β seviyeleri ile daha düşük SOD aktivitesi, GSH seviyeleri ve CAT aktivitesi göstermiş; buna karşın renal sistatin C, IL-6, KIM-1, serum üre, serum kreatinin ve MDA seviyeleri gruplar arasında istatistiksel olarak benzer kalmıştır. Bu durum, MTX ön tedavisinin arka plandaki inflamatuar ve redoksla ilişkili profile katkıda bulunduğunu göstermiştir. Buna göre, MTX + Metanol grubunda gözlemlenen ek değişiklikler, MTX ön tedavili bir zemin üzerinde meydana gelmiş olup yalnızca metanole atfedilemez. Yalnızca metanol verilen bir grup çalışmaya dahil edilmediği için, metanolün bağımsız katkısı ve potansiyel MTX–metanol etkileşimleri tam olarak ayırt edilememiştir.

Yerleşik metanol toksikolojisine dayanarak, toksik metabolit birikimi renal hasarın olası bir nedeni olarak görülmüştür. Metanol, ağırlıklı olarak karaciğerde ADH tarafından önce formaldehit ve ardından formik aside metabolize edilir^1,3,18,19,20. Dolayısıyla böbrek, yaygın yerel metanol metabolizmasından ziyade, öncelikle dolaşımdaki format ve bunun sonucunda ortaya çıkan sistemik metabolik bozulmalardan etkilenmiş olabilir. Bununla birlikte, metanol, formaldehit ve format konsantrasyonları ile renal ADH aktivitesi ölçülmediği için, renal dokudaki alkol veya aldehit metabolizmasının katkısı dışlanamaz. Formik asit, mitokondriyal sitokrom c oksidazı inhibe ederek oksidatif fosforilasyonu bozar, ATP üretimini azaltır ve histotoksik hipoksiye neden olur; bu süreç laktik asidoz, artmış reaktif oksijen türleri üretimi ve membran hasarı ile sonuçlanabilir^1,2,3,19,20. Metanol metabolizmasının ana merkezi olan karaciğerle karşılaştırıldığında böbrek, formatın aşağı akış etkilerine ve sistemik metabolik bozulmalara karşı özellikle hassas olabilir. Proksimal tübüler epitel hücreleri yüksek enerji gereksinimine sahiptir ve mitokondriyal disfonksiyona, oksidatif strese ve mikrosirkülasyon bozukluğuna karşı özellikle savunmasızdırlar. Sonuç olarak, format aracılı hipoksi, metabolik asidoz ve inflamasyon renal hasara katkıda bulunabilir^{2,8,9,21,22,23}. Akut böbrek hasarının metabolik asidoz, solunum yetmezliği, rabdomiyoliz, sepsis ve çoklu organ disfonksiyonu ile ilişkili olduğunu gösteren klinik çalışmalar, renal hasarın sistemik toksik yükü yansıtabileceğini göstermiştir^8,9,10,21. Sıçanlarda formatın insanlara göre daha hızlı folat bağımlı oksidasyonu, deneysel modellerin önemli bir sınırlamasını temsil etmektedir^1,11,12. Buna göre, metotreksat ön tedavisi, insanlardaki metanol zehirlenmesinin tüm klinik ve metabolik özelliklerini yeniden üretmekten ziyade, format klirensini azaltmak ve metanol toksisitesine karşı duyarlılığı artırmak için kullanılmıştır.

Renal disfonksiyon, geleneksel biyokimyasal parametrelerin ve renal hasar biyobelirteçlerinin kombine değerlendirmesi yoluyla gösterilmiştir. MTX + Metanol grubundaki yüksek serum üre ve kreatinin konsantrasyonları, bozulmuş renal filtrasyon ve ekskresyon kapasitesini desteklemiştir. Artmış renal cystatin C ve KIM-1 seviyeleri, fonksiyonel bozulmaya tübüler hasarın eşlik ettiğini göstermiştir. KIM-1'in proksimal tübüler hasar ile olan ilişkisi göz önüne alındığında, bu artış tübüler epitel dejenerasyonu, dilatasyonu ve nekrozu ile uyumludur^24,25. Artmış cystatin C seviyeleri de bozulmuş renal fonksiyonun varlığını desteklemiştir^26,27. Fomepizol ve etanol ile tedavi edilen gruplarda bu biyobelirteçlerin daha düşük seviyelerde olması, renal hasarın hafiflediğini düşündürmüştür ve fomepizol ile tedavi edilen grupta daha tutarlı bir örüntü gözlemlenmiştir. Redoks ile ilişkili biyobelirteç örüntüsü, onaylanmış bir mekanizmanın kanıtından ziyade, renal hasara olası bir katkı sağlayıcı olarak oksidatif stres ile uyumluydu. MDA yaygın olarak lipid peroksidasyonunun bir indeksi olarak kullanılırken, GSH hücresel redoks homeostazının sürdürülmesine katkıda bulunur^28,29. Metanol zehirlenmesi ve metanol ile ilişkili optik nöropati deneysel modellerinde; oksidatif stres, lipid peroksidasyonu ve azalmış antioksidan kapasite de doku hasarı ile ilişkilendirilmiştir^10,15,20. MTX + Metanol grubundaki daha düşük serum SOD aktivitesi, daha yüksek serum MDA konsantrasyonları ile daha düşük kan GSH seviyeleri ve CAT aktivitesi, azalmış antioksidan kapasitesi ve artmış lipid peroksidasyonu ile uyumluydu; ancak bu ölçümler temel bir mitokondriyal veya moleküler mekanizma belirlememiştir. Antidot ile tedavi edilen gruplarda daha düşük serum MDA konsantrasyonları ile serum SOD ve kan CAT aktivitelerinin kısmi recovery'si, daha olumlu bir redoks ile ilişkili biyobelirteç profili ile uyumlu bulunmuş ve fomepizol ile tedavi edilen grupta daha tutarlı şekilde olumlu bir örüntü gözlemlenmiştir.

MTX + Metanol grubundaki daha yüksek TNF-α, IL-6 ve IL-1β değerleri, proinflamatuar bir renal profil ile uyumluydu. Bu sitokinler yolak-spesifik olmadığından ve MTX'in kendisi seçilmiş inflamatuar belirteçlerdeki değişikliklerle ilişkili olduğundan, bulgular inflamasyonun renal hasarın kesinleşmiş bir mekanizmasından ziyade olası bir katkı sağlayıcısı olduğunu desteklemiştir. Formik asit aracılı mitokondriyal disfonksiyon, hücresel hipoksi ve oksidatif stres, inflamatuar yolakların aktivasyonu için bir temel oluşturabilir; bu nedenle, metanol toksisitesinde oksidatif stres ve inflamasyon birbirini karşılıklı olarak destekleyen süreçler olarak ilerleyebilir^1,2,3,15. Metanol zehirlenmesinin deneysel modellerinde, metanol maruziyetinin inflamatuar hücre infiltrasyonu, histopatolojik hasar ve IL-1β ile TNF-α gibi proinflamatuar belirteçlerin artmış düzeyleri ile ilişkili olduğu bildirilmiştir^13,15. Bu bulgular, MTX + Metanol grubunda gözlemlenen artmış proinflamatuar sitokin düzeyleri ve interstisyel inflamasyon, tübüler dejenerasyon ile tübüler nekroz için yükselmiş skorlarla uyumluydu. Toplu olarak bulgular; toksik metabolit etkileri, oksidatif stres, inflamasyon, mikrosirkülasyon bozukluğu ve sistemik toksik yükü içeren multifaktöriyel bir süreçle uyumluydu; ancak bu yolaklar doğrudan değerlendirilmemiştir. Antidotla tedavi edilen gruplarda daha düşük TNF-α, IL-6 ve IL-1β seviyeleri, toksik metabolit oluşumunun inhibisyonunun inflamatuar yanıtı da sınırlamış olabileceğini düşündürmüştür. Histopatolojik bulgular, renal hasarın doku düzeyindeki korelasyonlarını sağlamış ve MTX + Metanol grubu tübüler, glomerüler, vasküler ve interstisyel parametreler genelinde gözlemlenen en yüksek hasar skorlarını göstermiştir. Antidotla tedavi edilen her iki grup da tanımlayıcı olarak daha düşük histopatolojik hasar skorları göstermiş ve fomepizol ile tedavi edilen grup, çoğu parametre için etanol ile tedavi edilen gruptan tanımlayıcı olarak daha düşük skorlar sergilemiştir. Bununla birlikte, histopatolojik skorlar üzerinde herhangi bir çıkarımsal istatistiksel test yapılmadığı için, bu gözlemler her iki antidot için de istatistiksel olarak anlamlı bir histopatolojik koruma veya üstünlük kanıtlamamıştır^16,17.

Metanol zehirlenmesinde etanol ve fomepizolün antidotal etkileri, alkol dehidrogenaz aracılı metabolizmanın baskılanmasına ve böylece formaldehit ile formik asit oluşumunun azaltılmasına dayanmaktadır. Etanol kompetitif bir substrat olarak görev yaparken, fomepizol alkol dehidrogenazın doğrudan ve güçlü bir inhibitörü olarak işlev görür^{1,3,4,6,7,30,31,32}. Her iki antidot ile tedavi edilen gruplarda gözlemlenen daha olumlu renal sonuç örüntüleri, alkol dehidrogenaz inhibisyonunun beklenen etkileriyle uyumludur. Buna rağmen, mevcut literatür fomepizolün etanole göre kesin bir klinik üstünlüğü olduğunu kanıtlamamaktadır. Fomepizol; daha kolay dozajlanması, öngörülebilir farmakokinetiği ve daha düşük yan etki profili nedeniyle sıklıkla tercih edilse de etanol etkili bir alternatif olmaya devam etmektedir^{1,3,4,6,7,30,32}. Zakharov ve ark. tarafından rapor edilen kitlesel metanol zehirlenmesi verilerinde, iki antidot arasında mortalite, yoğun bakım süresi veya diyaliz gereksinimi açısından belirgin bir fark gözlemlenmemiştir; bu nedenle, klinik üstünlüğe ilişkin yorumlar ihtiyatla yapılmalıdır⁵. Duncan post hoc testi kullanılarak biyokimyasal sonuçlar açısından fomepizol ve etanol ile tedavi edilen gruplar arasında istatistiksel olarak anlamlı doğrudan bir fark saptanmamıştır. Dahası, fomepizol tekrarlayan dozlar halinde uygulanırken, etanol tek doz olarak uygulanmıştır. Rejimler; uygulama yolu, dozaj sıklığı veya sistemik maruziyet açısından eşleştirilmemiştir. Sonuç olarak, fomepizol ile ilişkili tanımlayıcı olarak daha olumlu olan örüntü, antidotal ajanlar arasındaki farkların yanı sıra dozaj takvimindeki, uygulama yolundaki veya ilaç maruziyetindeki farklılıkları yansıtmış olabilir ve daha yüksek bir biyokimyasal etkinlik, klinik üstünlük veya klinik bir tedavi tercihi oluşturmamıştır^5,6,30,32. Çalışmanın temel güçlü yönü; serum üre ve kreatinin, sistatin C, KIM-1, proinflamatuar sitokinler, redoksla ilişkili biyobelirteçler ve histopatolojik skorların tamamlayıcı fonksiyonel, tübüler, inflamatuar, redoksla ilişkili ve yapısal alanlar genelinde entegre bir şekilde değerlendirilmiş olmasıdır. Bu renal hasar odaklı model, folat bağımlı format klirensinin azaldığı koşullar altında antidotal rejimlerin, yardımcı renoprotektif müdahalelerin ve renal hasar biyobelirteçlerinin değerlendirilmesi için yararlı bir preklinik çerçeve sağlayabilir^8,9,10,21.

Çeşitli kısıtlamalar yorumlamayı etkilemiştir. Klinik metanol zehirlenmesine doğrudan genellenebilirlik, deneysel hayvan modeli ve türler arası metabolik farklılıklar nedeniyle sınırlıydı. Metotreksat, renal, inflamatuar ve oksidatif sonuçları bağımsız olarak etkileyebilir³³ ve yalnızca metanol içeren bir grubun yokluğu, metanol etkilerinin potansiyel MTX-metanol etkileşimlerinden tamamen ayrılmasını engellemiştir. Metanol, formaldehit, format, etanol ve fomepizolün serum veya doku konsantrasyonları ölçülmemiş ve ham renalle sitozolik fraksiyondaki ADH aktivitesi değerlendirilmemiştir; bu nedenle metabolik duyarlılaşma, toksik metabolit oluşumu, antidot maruziyeti ve metanol metabolizmasının inhibisyonu doğrudan doğrulanamamış ve renal biyokimyasal sonuçlarla korelasyon analizleri yapılamamıştır. pH, bikarbonat, baz eksikliği ve anyon açığı dahil olmak üzere asit-baz değişkenleri ölçülmemiştir. 48 saatlik takip, yalnızca akut renal sonuçların değerlendirilmesine izin vermiş; renal iyileşmeyi, hasarın kalıcılığını veya geri döndürülebilirliğini ya da kronik yapısal değişiklikleri belirlememiştir. Masson trikrom boyaması, kolajen-pozitif alanın kantitatif ölçümü yapılmadan histomorfolojik olarak değerlendirilmiş; α-smooth muscle actin ekspresyonu, kolajen içeriği ve 4-hidroksiprolin konsantrasyonu dahil olmak üzere moleküler veya biyokimyasal fibrozis belirteçleri değerlendirilmemiştir. Tek bir kör patolog tarafından yapılan histopatolojik değerlendirme, gözlemciler arası uyumun değerlendirilmesini engellemiş ve semikantitatif lezyon derecelendirmesi potansiyel olarak gözlemciye bağlı sınıflamaya tabi kalmıştır. Antidot rejimleri farmakolojik olarak eşit değildi; renal doku ELISA konsantrasyonları toplam protein konsantrasyonuna normalize edilmedi; mitokondriyal fonksiyon ve hücre ölümü yolaklarının moleküler analizleri yapılmadı; örneklem boyutu sınırlıydı ve yalnızca erkek sıçanlar dahil edildi. Gelecekteki çalışmalar; yalnızca metanol ve yalnızca MTX gruplarını, karşılaştırılabilir antidot rejimlerini, metanol, format ve antidot konsantrasyonlarının seri ölçümlerini, renal ADH aktivitesini, asit-baz ölçümlerini, kantitatif fibrozis değerlendirmesini, daha uzun takibi ve uygun şekilde tasarlanmış klinik doğrulamaları içermelidir. Sonuç olarak, bu metotreksat ile ön işlem görmüş sıçan modelinde metanol maruziyeti; bozulmuş renal fonksiyon, artmış renal hasar ve inflamatuar biyobelirteçler, elverişsiz bir redoksla ilişkili profil ve histopatolojik hasar ile ilişkilendirilmiştir. Antidot tedavisi gören her iki grup, MTX + Metanol grubuna göre daha elverişli renal sonuç modelleri göstermiştir. Fomepizol, değerlendirilen alanlar genelinde daha tutarlı ve elverişli bir tanımlayıcı model göstermiştir; ancak antidot grupları arasında anlamlı doğrudan biyokimyasal farklılıkların olmaması, histopatolojik karşılaştırmaların tanımlayıcı doğası, eşit olmayan antidot rejimleri ve toksikokinetik ölçümlerin yokluğu, etanol üzerindeki üstünlüğe ilişkin sonuçlar çıkarılmasını engellemiştir. Bu bulgular, metotreksat ile ön işlem görmüş sıçan modeli ile sınırlıdır ve metotreksat ön işlemi olmadan metanol maruziyeti sonrası veya insanlarda metanol zehirlenmesinde her iki antidotun renal etkilerini belirlemez. Bu bulguların tekrarlanabilirliğini ve daha geniş uygulanabilirliğini değerlendirmek için doğrudan toksikokinetik ölçümleri, mekanistik değerlendirmeleri, karşılaştırılabilir antidot dozaj rejimlerini ve daha uzun takibi içeren ileri çalışmalara ihtiyaç vardır.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
%10 Nötr Tamponlu Formalin	Merck	Kaydedilmedi	Histopatolojik işlem için doku fiksasyonu.
Absolüt Etanol (≥99.8%)	Sigma-Aldrich, USA	Kaydedilmedi	Nihai %20 (v/v) çözelti elde etmek için steril distile su ile seyreltildi; metanol uygulamasından 4 sa sonra 0.5 g/kg tek doz oral gavage olarak uygulandı.
Masaüstü Santrifüj	Nüve	NF048	Numune hazırlama ve santrifügasyon.
Biyotin-Konjuge Antikor	BT Lab ELISA Kit Bileşenleri	Kite dahil	Saptama antikoru
CAT (Katalaz) Kiti	Otto Scientific	Otto3051	EDTA-antikoagülanlı kanda katalaz (CAT) aktivitesinin kolorimetrik ölçümü.
cOmplete Mini EDTA-free Proteaz İnhibitör Kokteyli	Roche / Sigma-Aldrich	11836170001	ELISA analizleri için böbrek dokusu homojenatlarının hazırlanması sırasında homojenizasyon tamponuna eklendi.
Kreatinin Kiti	Otto Scientific	OttoBC139	Serum kreatinin seviyelerinin değerlendirilmesi.
Dijital Homojenizatör	Daihan Scientific	HG-15D	Doku homojenizasyonu
ELx50 Auto Strip Yıkayıcı	Bio-Tek Instruments, USA	ELx50	ELISA yıkama
ELx800 Mikroplaka Okuyucu	Bio-Tek Instruments, USA	ELx800	ELISA ve kolorimetrik analizler için absorbans ölçümü; ELISA absorbansı 450 nm'de okundu.
Eozin Y (Sarımsı)	Merck	1.15935.0025	Histopatolojik boyama
Fomepizol (4-Metilpirazol)	Hüsnü Arsan A.., Ankara, Türkiye	Kaydedilmedi	Steril %0.9 sodyum klorür çözeltisinde 10 mg/mL nihai konsantrasyonda hazırlandı; metanol uygulamasından 4 sa sonra 15 mg/kg yükleme dozu olarak intraperitonyal uygulandı ve ardından metanol uygulamasından sonraki 12, 24 ve 36. saatlerde 10 mg/kg idame dozları verildi.
GSH (Glutatyon) Kiti	Otto Scientific	Otto3053	EDTA-antikoagülanlı kanda indirgenmiş glutatyon (GSH) seviyelerinin kolorimetrik ölçümü.
Harris Hematoksilen Çözeltisi	BSLAB	BS-002	Histopatolojik boyama
Hidroklorik asit (HCl)	Merck	7647-01-0	pH ayarı
IBM SPSS Statistics	IBM Corp.	IBM SPSS Statistics Versiyon 29.0	İstatistiksel analiz; RRID:SCR_016479.
Ketamin Hidroklorür (Ketalar)	Pfizer,USA	Kaydedilmedi	Kan ve böbrek dokusu toplama öncesi genel anestezi.
Işık Mikroskobu	Nikon Eclipse	Ni-U	Histopatolojik inceleme
Masson's Trichrome Boyama Kiti	MOSLAB (Medical Olympus Sanayi Tic. Ltd. ti., Türkiye)	BKMTO001	Histopatolojik boyama
MDA (Malondialdehit) Kiti	Otto Scientific	Otto1001	Lipid peroksidasyonunun bir göstergesi olarak serumdaki malondialdehit (MDA) seviyelerinin kolorimetrik ölçümü.
Metanol (≥99.8%)	Sigma-Aldrich, USA	322415	Deneysel metanol zehirlenmesini indüklemek için oral olarak (3 g/kg) uygulandı.
Metotreksat (Emthexate 500 mg/5 mL)	Teva Pharma Belgium	Kaydedilmedi	Ticari 100 mg/mL formülasyon, 0.06 mg/mL nihai çalışma konsantrasyonu elde etmek için steril %0.9 sodyum klorür çözeltisi ile seyreltildi; 7 ardışık gün boyunca günde bir kez, 0.3 mg/kg'ya tekabül eden 5 mL/kg dozunda oral gavage ile uygulandı.
Mindray Kimya Analizörü	Mindray	BS-400	Serum üre ve kreatinin ölçümü.
Parafin Mum, histolojik derece	Kaydedilmedi	Kaydedilmedi	Doku gömme.
Fosfat tamponlu salin (PBS)	Merck	P4417	doku durulama/yıkama
Sıçan Cystatin-C ELISA Kiti	BT Lab, China	E0145Ra	Böbrek dokusu homojenatlarındaki cystatin C seviyelerinin kantifikasyonu; analitik hassasiyet, 0.25 ng/mL; saptama aralığı, 0.5–100 ng/mL.
Sıçan IL-1β ELISA Kiti	BT Lab, China	E0119Ra	Böbrek dokusu homojenatlarındaki IL-1β seviyelerinin kantifikasyonu; analitik hassasiyet, 0.08 ng/mL; saptama aralığı, 0.2–60 ng/mL.
Sıçan IL-6 ELISA Kiti	BT Lab, China	E0135Ra	Böbrek dokusu homojenatlarındaki IL-6 seviyelerinin kantifikasyonu; analitik hassasiyet, 0.052 ng/L; saptama aralığı, 0.1–40 ng/L.
Sıçan KIM-1 ELISA Kiti	BT Lab, China	E0549Ra	Böbrek dokusu homojenatlarındaki KIM-1 seviyelerinin kantifikasyonu; analitik hassasiyet, 0.01 ng/mL; saptama aralığı, 0.05–10 ng/mL.
Sıçan TNF-α ELISA Kiti	BT Lab, China	E0764Ra	Böbrek dokusu homojenatlarındaki TNF-α seviyelerinin kantifikasyonu; analitik hassasiyet, 2.51 ng/L; saptama aralığı, 5–1,000 ng/L.
RIPA Lizis ve Ekstraksiyon Tamponu	Thermo Scientific	89900	ELISA analizleri için böbrek dokusu homojenizasyonu ve lizis.
SOD (Süperoksit Dismutaz) Kiti	Otto Scientific	Otto3047	Serumda süperoksit dismutaz (SOD) aktivitesinin kolorimetrik ölçümü.
Sodyum sitrat	Merck	03-04-6132	Tampon hazırlama
Sodyum hidroksit (NaOH)	Merck	1310-73-2	pH ayarı
Paslanmaz Çelik Besleme İğnesi (22 G Oral Gavage Kanülü)	Instech Laboratories, USA	Kaydedilmedi	Sıçanlarda oral gavage uygulaması için kullanılan yeniden kullanılabilir paslanmaz çelik kanül.
Durdurma Çözeltisi	BT Lab ELISA Kit Bileşenleri	Kite dahil	ELISA reaksiyon sonlandırma
Streptavidin Peroksidaz	Thermo Scientific	SHRP248-B	ELISA saptama sistemi
TMB Substrat Çözeltisi	BT Lab ELISA Kit Bileşenleri	Kite dahil	Kromojenik substrat
Tris-HCl	Thermo Scientific	1185-53-1	Tampon hazırlama
Üre Kiti	Otto Scientific	OttoBC157	Serum üre seviyelerinin ölçümü.
Yıkama Tamponu Konsantresi	BT Lab ELISA Kit Bileşenleri	Kite dahil	Plaka yıkama
Wistar albino sıçanlar	Ahi Evran Üniversitesi Deneysel Hayvan Araştırma Laboratuvarı, , Türkiye	Üretim/damızlık lisans no. 184	Erkek; 8–12 haftalık; vücut ağırlığı, 220 ± 20 g
Ksilazin hidroklorür (Rompun)	Bayer,Germany	Kaydedilmedi	Kan ve böbrek dokusu toplama öncesi genel anestezi.
Ksilen, histolojik derece	Kaydedilmedi	Kaydedilmedi	Histolojik doku işlemi ve berraklaştırma.