Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Yonca (Medicago sativa L.) Gövdelerindeki Seçilmiş Hücre Çeperi Bileşenlerinin Rumen Sıvısı ile In vitro İnkübasyonu ve Histolojik Boyanması

122 görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/73286

⸱

18 Eylül 2026

 , 
1Department of Agronomy and Plant Genetics, University of Minnesota - Twin Cities, 2United States Department of Agriculture - Agricultural Research Service

Bu makalede

Özet

Bu protokol, yonca (Medicago sativa L.) gövdelerinin enine kesitlerinde lignin ve pektin hücre duvarı bileşenlerinin birikimini görselleştirmektedir. Amaç, gövdenin istenilen gövde sindirilebilirlik özelliklerine sahip yeni yonca hatları geliştirmek için hedeflenebilecek spesifik dokularını tanımlamaktır.

Özet

Bitkiler büyüdükçe hücre duvarı bileşenlerinin birikmesi, ruminantlar için kaba yem besleyiciliğini sınırlar. Özellikle, bitki dokularındaki lignin birikimi, hücre duvarı karbonhidratları olan selüloz ve hemiselülozun parçalanmasını engeller ve böylece kaba yemden elde edilebilen enerji miktarını azaltır. Buna karşın, hücre duvarının yüksek derecede sindirilebilir pektin bileşeni, yıkıma kolayca erişilebilirdir. Farklı gövde hücre tiplerindeki lignin ve pektin birikimi hakkındaki bilgiler, yonca hatları arasındaki gövde sindirilebilirliğindeki varyasyonun altında yatan faktörlere ilişkin mekanistik içgörüler sağlayabilir. Gövde enine kesitlerinin rumen sıvısı içinde in vitro inkübasyonu, gövde dokularının rumende geçirdiği süreçleri simüle eder. Histolojik boyama ve mikroskopi ile birleştirilen bu yöntem, doku yıkımındaki değişikliklerin zaman içindeki seyri ile gövdedeki lignin ve pektin konumlarının görselleştirilmesini sağlar. Wiesner boyası, ligninin guaiasil (G) aldehit birimleriyle reaksiyona girerek onları fuşya rengine boyar. Benzer şekilde, rutenyum kırmızısı pektinin karboksil gruplarıyla etkileşime girerek, gövdedeki pektini pembeden turuncuya ve kahverengiye kadar değişen tonlarda boyar. Bu protokol, rumen mikroplarına maruz bırakılan yonca gövde enine kesitlerinin sindirilmesini ve ardından hücre duvarlarındaki lignin ve pektin paternlerini görselleştirmek için yapılan boyamayı açıklamaktadır. Yöntem, lignin ve pektinin mevcut olduğu veya olmadığı gövde dokularını tanımlamak için kullanılabilir ve böylece yonca hatları arasındaki karşılaştırmaları kolaylaştırır.

Giriş

Her bitki hücresi bir hücre duvarı ile çevrilidir. Selüloz, hemiselüloz, lignin ve pektin, geviş getiren hayvanların diyetinin gerekli bir parçası olan bitki lifine katkıda bulunan hücre duvarı bileşenleridir. Pektinler yüksek derecede sindirilebilir (çözünür) polisakkaritler iken1, lignin lif yıkımını sınırlayan sindirilemez bir polimerdir2. Bu nedenle lignin, bitki sindirilebilirliğini azaltır ve nihayetinde kaba yemden geviş getiren hayvana sağlanan enerjiyi düşürür. Ancak lignin, trakeid elementlerini güçlendirerek suyun bitki boyunca iletilmesi gibi önemli bitki fizyolojik fonksiyonlarını destekler3. Önceki çalışmalar, gövde lifinde lignini azaltan veya pektini artıran değişikliklerin gövde sindirilebilirliğini ve kaba yemin besin değerini artırabileceğini göstermiştir4. Bu nedenle, bu protokol bu iki hücre duvarı bileşenine odaklanmaktadır. Gövde hücre duvarındaki toplam lignin ve pektin konsantrasyonları, gövde lifi sindirilebilirliğinin altında yatan mekanizmaları açıklamak için yetersiz bilgi sağlar5. Rumen sıvısı ile in vitro inkübasyon ve histolojik boyama, farklı gövde lifi sindirilebilirliğine sahip bitkiler arasındaki hücre duvarı bileşenlerindeki farklılıkları görselleştirerek hücresel düzeyde içgörüler sağlayabilir4,6. Mevcut protokolde, yaygın bir çok yıllık yemleğümsü bitki olan yonca (Medicago sativa L.), yapraklara göre daha fazla lignin ancak daha az pektin içeren gövde dokularındaki lignin ve pektin örüntülerini örneklendirmek için model tür olarak kullanılmıştır.

In vitro rumen sıvısı ile inkübasyon, geviş getiren hayvan midesindeki kaba yem sindirimini simüle ederek, yem anatomisinin sindirilebilirlik üzerindeki etkilerinin gözlemlenmesine olanak tanır. Bir deney tüpünde rumenle benzer koşullar oluşturularak, cam lamlara yapıştırılmış gövde enine kesitleri, rumen sıvısına maruz kalma sonrası doku bozulma derecesini değerlendirmek için çeşitli zaman noktalarında çıkarılabilir6. Bu yöntem, yonca gövdelerinin anatomik yapılarının görselleştirilmesi7 ve gövde sindirilirken farklı hücre duvarı bileşenleri içeren hücre tiplerinin nasıl değiştiğinin incelenmesi için nispeten basit, hızlı ve düşük maliyetli bir yaklaşım sunar.

Gövde enine kesitlerinin histolojik boyanması, hücre duvarı bileşenlerinin görselleştirilmesine olanak tanır. Floroglusinol ve hidroklorik asit (HCl), G C6C3 aldehit (koniferaldehit) monomerleri9 ile reaksiyona girerek guaiasil açısından zengin lignin birimleri içeren gövde dokularını belirginleştiren8 Wiesner boyasını oluşturur. Lignin birden fazla monomer alt birimden oluşur; ancak bu makale boyunca "lignin" terimi, yalnızca Wiesner boyası ile reaksiyona giren10 ve dolayısıyla bu protokol kullanılarak görselleştirilen G-birim monomerini ifade eder. Ksilem damarları gibi bazı dokular her zaman lignifiyedir6. Bunun dışında, yonca gövde dokularındaki lignin birikimi, sekonder (kambiyum) büyüme başladığında başlar ve gövde boğum arası uzamasının durmasıyla örtüşür6. Rutenyum kırmızısı, bazen esterleşmiş olan ve bazı yan zincirleri paylaşan karboksil grupları içeren pektik maddelere bağlanır11. Orta lamella ve primer hücre duvarlarında bulunan pektinlerin karboksil grupları rutenyum kırmızısı ile etkileşime girer11. Pektin, hücre uzamasında rol oynar ve bu nedenle primer büyüme sırasında hücrelerde bulunur. Metin boyunca "pektin" terimi, genel olarak mevcut olabilecek pektin grubunu ifade eder. Histolojik boyamanın rumen in vitro inkübasyonu ile birleştirilmesi, gövdedeki hücre duvarı bileşenlerinin konumunun gözlemlenmesini kolaylaştırır ve farklı hücre tiplerinin ruminal sindirim sırasında nasıl değiştiğini vurgular. Nihayetinde bu protokol, lignin ve pektin içeren gövde hücrelerini tanımlamak ve farklı yonca hatları ile inkübasyon süreleri arasındaki örüntüleri karakterize etmek için kullanılabilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Bu araştırma, hayvan deneklere yönelik kurumsal yönergelere (IACUC 2301-40689B) uygun olarak yürütülmüştür.

1. Numune tüplerinin etiketlenmesi

  1. İnkübasyon, saklama ve boyama için örnek tüplerinin hazırlanması ve etiketlenmesi
    1. Her örnek için beş ayrı set tek kullanımlık, vidalı kapaklı, 50 mL konik santrifüj tüpünü önceden etiketleyin. Aşağıda açıklanan kullanımlar için her tüpe örnek tanımlayıcısını ve inkübasyon süresini ekleyin.
    2. İnkübasyon öncesi tutma tüplerini etiketleyin ve 35 mL ultrapure su ekleyin.
    3. Bölüm 3 ve 4'te kullanılacak inkübasyon tüplerini etiketleyin. Tüpleri inkübasyon sürelerine göre (0, 4, 8, 24, 48 veya 96 sa) ayrı raklara düzenleyin.
      NOT: Etiketlerin su banyosunda silinmesini önlemek için endüstriyel sınıfta kalıcı bir markör kullanın.
    4. İnkübasyon sonrası saklama tüplerini etiketleyin ve %100 gliserol ile ultrapure suyun 50:50 karışımından 35 mL ekleyin. Bu tüpleri, sindirilmiş enine kesitleri boyama işlemine kadar lamlar üzerinde saklamak için kullanın.
    5. Boyama öncesi tüplerini etiketleyin ve 200-proof etanol ile ultrapure suyun 50:50 karışımından 35 mL ekleyin. Bu tüpleri, boyama öncesinde enine kesitlerdeki gliserolü uzaklaştırmak için kullanın.
    6. Hidrasyon tüplerini etiketleyin ve 35 mL ultrapure su ekleyin.

2. Gövde enine kesit alma ve lamlara yerleştirme

  1. Penset kullanarak örnek gövdelerden her seferinde bir gövde segmenti seçin ve segmentin merkezini kesin.
    NOT: Her biyolojik tekrar için, her örnek başına teknik tekrar olarak dört gövde kullanın. Her örnekteki tüm olası gövdeler arasından dört gövdeyi rastgele seçin. Tüm inkübasyon çalışmaları boyunca kontrol olarak ek bir standart gövde seti kullanın.
  2. Her biri yaklaşık 2.5 cm uzunluğunda ve 0.6 cm kalınlığında iki adet ekstrüde polistiren sert köpük yalıtım dikdörtgeni kesin. Bir gövde boğum arasının iki köpük parçası arasına sıkıca oturması için her parçanın uzunluğu boyunca küçük bir kama kesin.
  3. Gövde "sandviçini", 100 μm kalınlığında kesitler üretebilen sürgülü bir mikrotomun tablasına monte edin. Temiz bir kesim sağlamak için ince uçlu bir resim fırçası kullanarak gövdenin ve mikrotom bıçağının üzerine bir damla su damlatın.
  4. Gövde enine kesitlerini 100 μm kalınlığında kesin. Her bir enine kesiti, geçici depolama için ultrapure su içeren önceden etiketlenmiş bir Petri kabına aktarmak için resim fırçasını kullanın ve kaptaki köpükleri temizleyin.
    NOT: Köpük yırtılırsa mikrotom bıçağını değiştirin; yırtılma bıçağın köreldiğini gösterebilir.
  5. Her inkübasyon süresi için her örnek başına iki adet standart 25 mm × 75 mm cam lamı elle etiketleyin (2 boyama × 6 zaman noktası = biyolojik tekrarların her biri için örnek başına 12 lam). Her etikete örnek tanımlayıcısını, inkübasyon süresini ve boyayı ekleyin.
  6. 2 mm genişliğinde çift taraflı banttan 2.5 cm uzunluğunda bir parça kesin. Bandın kısa kenarını, yapışkan tarafı aşağı bakacak şekilde lamın altından 0.5 cm uzağa yerleştirin ve yapışmayı sağlamak için eldiven takılıyken bandın mumlu kağıt tarafına sıkıca bastırın.
    NOT: Cam lamların kırılmasını önlemek için bu işlemi düz bir yüzeyde gerçekleştirin.
  7. Tüm enine kesitleri aynı yöne yönlendirmek için bir disseksiyon mikroskobu kullanın. Çift taraflı banttan mumlu kağıdı çıkarın ve enine kesitlerin yönelimini koruyarak, ıslatılmış ince uçlu bir resim fırçası yardımıyla onları önceden etiketlenmiş cam lam üzerindeki banda aktarın. Enine kesitleri hafifçe nemli tutun.
  8. Mumlu kağıdı enine kesitlerin üzerine yerleştirin ve enine kesitleri çift taraflı banda sıkıca sabitlemek için resim fırçasını üzerinden hafifçe yuvarlayın. Mumlu kağıdı çıkarın ve dört enine kesit içeren monte edilmiş lamı, ultrapure suyun monte edilmiş enine kesitleri kapladığından emin olarak adım 1.1.2'de açıklanan önceden etiketlenmiş muhafaza tüpüne yerleştirin.
  9. Hem rutenyum kırmızısı hem de Wiesner boyası ile boyama yapmak için, çift taraflı bantlar dışa bakacak şekilde her muhafaza tüpüne iki lamı sırt sırta yerleştirin.
    NOT: Tüm lamlar monte edilip ultrapure su içeren tüplere yerleştirildikten sonra, gerekirse lamları oda sıcaklığında gece boyunca saklayın.

3. Gövde kesitlerinin in vitro inkübasyonu için hazırlık

  1. İnkübasyon için hazırlanan tek kullanımlık, vidalı kapaklı, 50 mL santrifüj tüplerini kullanın (bkz. 1.1.3). Her bir inkübasyon aralığı için tüm örnek tüplerini tek bir plastik rack üzerinde gruplandırın.
  2. Dört basamaklı analitik terazi kullanarak, tartım kağıdı üzerine 0,2 g 1 mm öğütülmüş mısır sapı standardı tartın ve malzemeyi, inkübe edilmemiş kontrol olarak hizmet eden 0 h tüpleri hariç, her bir inkübasyon tüpüne dikkatlice aktarın. Tüplerin kapaklarını kapatın ve kullanıma kadar kenara ayırın.
    NOT: Sap kesitlerinin biyokütlesi mikrobiyal aktiviteyi sürdürmek için yetersiz olduğundan, mısır sapı standardı inkübasyon sırasında rumen mikroplarını beslemek için enerji sağlar.
  3. Sirkülasyonlu bir su banyosunu yeterli miktarda suyla doldurun ve inkübasyona başlamadan önce 39 °C'ye dengeleyin. Su derinliğini 50 mL'lik tüplerdeki 35 mL işaretini kapatacak şekilde ayarlayın ve gerekirse üniform su sirkülasyonunu ve sıcaklığını korumak için bir hava motoru (aeratör) kullanın.
  4. İnokülasyon çözeltisi için McDougall tamponunun hazırlanması
    1. McDougall tamponunu, inkübasyonları başlatmadan en fazla 2 gün önce hazırlayın.
      NOT: İnokülasyon çözeltisini hazırlamak için McDougall tamponunu rumen sıvısı ile 4:1 oranında karıştırın. Tampon hacmini örnek sayısına uygun olarak ayarlayın ve tüp başına 30 mL sağlayacak kadar yeterli inokülasyon çözeltisi hazırlayın.
    2. 1.600 mL ultra saf su ölçün. 1 L'sini 3 L'lik düz tabanlı Erlenmeyer flaskına aktarın ve 600 mL'sini reaktiflerin aktarılması ve durulanması için ayırın.
    3. Erlenmeyer flaskının içine bir manyetik karıştırma çubuğu yerleştirin ve flaskı bir karıştırma plakası üzerine konumlandırın.
    4. Erlenmeyer flaskına plastik bir huni yerleştirin. 15,7 g sodyum bikarbonat (NaHCO₃), 5,9 g susuz sodyum fosfat dibazik (Na₂HPO₄), 0,91 g potasyum klorür (KCl), 0,75 g sodyum klorür (NaCl), 0,19 g magnezyum sülfat heptahidrat (MgSO₄·7H₂O) ve 0,06 g kalsiyum klorür dihidrat (CaCl₂) ekleyin; her seferinde bir reaktif ekleyin ve bir sonrakini eklemeden önce her bir reaktifin çözünmesini bekleyin. Her eklemeden sonra huniyi durulamak için ayrılmış 600 mL ultra saf suyun bir kısmını kullanın.
    5. Kalsiyum klorür dihidrat eklendikten sonra, çözünmeyi kolaylaştırmak için bir CO₂ difüzörü yerleştirin ve çözeltiyi havalandırın (sparging). Çözelti berraklaştığında, 10–15 dk daha havalandırmaya devam edin.
    6. Flaskı sıkıca tıpayın ve tıpaya maskeleme bandı ile sabitleyin, çünkü tamponun ısıtılması kabı basınçlandırabilir.
    7. Çözeltiyi 20 °C'de 2 güne kadar saklayın. Çözeltiyi kullanımdan bir gün önce 39 °C'lik su banyosuna yerleştirin veya ertesi gün kullanılacaksa doğrudan 39 °C'lik su banyosuna koyun.

4. Gövde kesitlerinin in vitro inkübasyonu

  1. İnkübasyon gününde, çeker ocuk içerisinde 100 mL'lik bir behere 47 mL su ve 4 mL 1 N NaOH koyun ve üzerine 0,625 g sistein-HCl ekleyin. İkinci bir 100 mL'lik behere, 47 mL suya 0,625 g sodyum sülfür ekleyin ve inokülasyon çözeltisi hazırlanana kadar iki çözeltiyi ayrı tutun.
  2. İnekten laboratuvara rumen mikroorganizmalarını taşımak için sıcak bir ortam oluşturmak amacıyla, yalıtımlı bir termosu sıcak suyla doldurun. Sıcak suyu termostan aktarmak için beş galonluk bir kova getirin.
  3. Ahır yönetimi tarafından deneye tahsis edilen kanüle edilmiş inekten rumen sıvısı toplamak için ahıra gidin.
    NOT: Varyasyonu en aza indirmek için, deney boyunca rumen sıvısını günün yaklaşık aynı saatinde ve aynı inekten toplayın. Rumen sıvısı toplamak için ahırda bulunacağınız zamanı önceden bildirmek üzere ahır yönetimiyle koordineli çalışın.
  4. Deney ineğini belirleyin ve laboratuvar önlüğü, göz koruyucu, bot kılıfı ve omuz hizasına kadar uzanan eldivenler dahil olmak üzere uygun kişisel koruyucu ekipmanları giyin.
    NOT: 4.4–4.8 arasındaki adımlarda yer alan prosedürleri, yalnızca ilgili IACUC protokolü kapsamında yetkilendirilmiş personelle sınırlandırın.
  5. Ilık suyu termostan beş galonluk kovaya aktarın. Rumen materyalini süzmek için 50 numara gazlı bezden (tülbent) iki katman hazırlayın.
  6. Kanüllü inekten rumen sıvısı toplama
    1. Kanülü dikkatlice açın ve tıpacığın kontamine olmasını önlemek için tıpacığı ılık suyla dolu beş galonluk kovaya yerleştirin. Eldivenli bir elle, rumenin katı-sıvı ara yüzeyine erişmek için rumen içerisinden yeterli miktarda materyal çıkarın.
    2. Katı-sıvı arayüzeyine ulaşıldığında, materyali birkaç avuç dolusu toplayın ve her biri yaklaşık 45 cm kare olan iki kat 50 derece gazlı bezden sıkarak önceden ısıtılmış, vidalı kapaklı bir termosa aktarın. Rumen sıvısını gazlı bezden sıktıktan sonra kalan materyali atın.
    3. İnkübe edilecek numune sayısına göre hacmi gerekirse ayarlayarak, her 60'lı inokülasyon tüpü seti için termosta 1 L rumen sıvısı olana kadar 4.6.2. adımı tekrarlayın.
      NOT: Kanüle edilmiş ineklerde, belirli bir hafta boyunca çekilebilecek rumen sıvısı miktarı için özel sınırlamalar vardır. Çekilen rumen sıvısı miktarının inek için belirlenen sınırı aşmadığından emin olmak için ahır sorumlusuyla iletişim kurun.
  7. Yeterli miktarda rumen sıvısı toplandıktan sonra, sıcaklığı korumak için termosu sıkıca kapatın. Kanülü yerine takın ve temizlik için beş galonluk kovadaki ılık suyu kullanın.
  8. Ağıldan ayrılırken kirlenmiş bot kılıflarını, eldivenleri ve gazlı bezleri uygun atık kutusuna atın. Rumen sıvısının sıcaklığını ve anoksik koşullarını korumak için mümkün olan en kısa sürede laboratuvara dönün.
  9. Laboratuvara dönüldüğünde, iki indirgeyici ajan çözeltisini (bkz. 4.1) çeker ocak içerisinde birleştirin ve indirgeme çözeltisini hazırlamak için karıştırın.
  10. Büyük bir manyetik karıştırma çubuğu içeren, en az 2 L kapasiteli bir cam beheri, şu değere ayarlanmış ısıtmalı bir manyetik karıştırıcı üzerine yerleştirin: <30 °Cve bir CO yerleştirin₂ sıvının üzerinde bir difüzör. 1.600 mL McDougall tamponu ekleyin ve CO2'nin kaçmasına izin vermeden yavaşça karıştırın₂ difüzörün sıvı ile temas etmesi.
    NOT: Bu düşük sıcaklıkta istenirse polipropilen bir beher kullanın. CO kullanın₂ O'yu yerinden etmek için₂ ve anoksik koşulların korunmasına yardımcı olur.
  11. Büyük bir huniyi iki kat 50 numara tülbent ile kaplayın ve 2 L'lik dereceli silindirin üzerine yerleştirin. 400 mL rumen sıvısını filtreleyin ve inokülasyon çözeltisini hazırlamak için McDougall tamponuna (bkz. 3.4.7) ekleyin.
  12. İnokülasyon çözeltisine 80 mL redüksiyon çözeltisi (bkz. 4.9) ekleyin ve yavaşça karıştırın. CO'yu koruyun₂ difüzörün sıvı ile temas etmesini önlemek için.
  13. Çeker ocakta, inkübasyon tüplerinin kapaklarını çıkarın ve tüpleri inkübasyon sürelerine göre ayrı raflara düzenleyin. Slaytların aktarımına hazırlık amacıyla ön inkübasyon bekleme tüplerinin kapaklarını açın (bkz. 1.1.2).
  14. Her seferinde rastgele bir ön inkübasyon bekleme tüpü seçin ve montajlı cam lamları bir pens yardımıyla ilgili inkübasyon tüpüne aktarın (bkz. 1.1.3). Montajlı lamları içeren her bir inkübasyon tüpünü küçük bir örnek rafına yerleştirin ve ön inkübasyon bekleme tüpünü kenara ayırın.
    NOT: 4.14–4.15 arasındaki adımları gerçekleştirmek için iki kişi görevlendirin. Mümkün olduğunca, rumen sıvısı-tampon karışımının soğumasını en aza indirin.
  15. Küt uçlu, geniş lümenli bir iğne takılı 60 mL'lik bir şırınga ile 30 mL inokülasyon çözeltisi çekin. Çözeltiyi inkübasyon tüpünün kenarından yavaşça boşaltın, tüpü CO2 ile temizleyin₂ yaklaşık 20 saniye boyunca bekleyin, tüpün kapağını kapatın ve tüpü tekrar rafa yerleştirin.
  16. İnoküle edilmiş tüpleri içeren rafları bir 39 °C su banyosu. Düzensiz ısınmayı en aza indirmek için tüpleri günde en az bir kez hafifçe çalkalayın ve raf konumlarını günlük olarak değiştirin.
    NOT: Tüplerde gaz kabarcıklarının oluşması, aktif fermantasyonu gösterir.
  17. Her inkübasyon süresinin sonunda, ilgili rafı su banyosundan çıkarın. Tüpleri tek tek açın, her bir lamı çıkarın ve katı maddeler ile kalıntı inokülasyon çözeltisini ultrapure su ile nazikçe durulayarak uzaklaştırın.
  18. Durulanan lamları, adım 1.1.4'te açıklanan gliserol-su karışımını içeren inkübasyon sonrası saklama tüplerine yerleştirin.

5. Lignin için enine kesit boyama

  1. Slaytlar %50:50 gliserol-su karışımında saklanmışsa, monte edilmiş enine kesitleri içeren her iki slaytı da etanol-ultrasafi su çözeltisi içeren boyama öncesi durulama tüplerine aktarın (bkz. 1.1.5). Boyama öncesinde gliserolü uzaklaştırmak için tüpleri bir gece boyunca buzdolabında saklayın.
  2. Işığa duyarlı reaktifi ışıktan korumak için alüminyum folyoya sarılmış 25 mL'lik bir Erlenmeyer flask içinde 0,3 g PG'yi 10 mL absolut etanolde çözerek %3'lük florglusinol (PG) çözeltisi hazırlayın. Flaskı tıpayın, çözelti adı, hazırlama tarihi ve hazırlayanın adıyla etiketleyin ve 20 °C'de saklayın.
  3. Slaytları soğutmalı tüplerden çıkarın ve geçici olarak adım 1.1.6'da açıklanan, %100 ultrasafi su içeren hidratasyon tüplerine aktarın.
    NOT: Kesitlere zarar verebilen ve sonraki görüntülemeyi etkileyebilen oksidasyonu minimize etmek için işlem sırasında enine kesitlerin hidrate kalmasını sağlayın.
  4. Çeker ocuk altında, bir pipetleyici kullanarak 50 mL'lik bir beherde 50 μL %3'lük etanolde PG'yi (bkz. 5.2) 25 μL hidroklorik asit (HCl) ile karıştırarak Wiesner boyasını hazırlayın.
    NOT: 2:1 PG-HCl oranını koruyarak miktarları slayt sayısına göre ayarlayın.
    UYARI: Hidroklorik asit metaller için korozif olduğundan, ciddi cilt yanıklarına ve göz hasarına yol açabileceğinden ve solunum sistemi irritasyonuna neden olabileceğinden, asidi çeker ocuk altında kullanın. Buhar veya aerosolleri solumaktan kaçının, uygun koruyucu eldiven, kıyafet, göz koruması ve yüz koruması kullanın ve işlem sonrası temas eden cildi iyice yıkayın.
  5. Tüpten bir slayt çıkarın ve boyanın banttan akmasını önlemek için çift taraflı bandın etrafındaki camı düşük tüylü bir peçete ile nazikçe kurulayın. Slaytı küçük bir plastik tepsiye yerleştirin ve bir pipet kullanarak enine kesitlerin üzerine birkaç damla Wiesner boyası uygulayın. 
  6. Bir zamanlayıcıyı 12 dk'ya ayarlayın ve slaytları ışıktan korumak için alüminyum folyo ile örtün. Boyama sırasında enine kesitleri kontrol edin ve kurumayı önlemek için gerekirse boyayı yeniden uygulayın.
    NOT: Oksidasyon dokuya zarar verebileceği ve sonraki görüntülemeyi etkileyebileceği için enine kesitlerin kurumasını önleyin.
  7. 12 dk sonra, fazla Wiesner boyasını düşük tüylü bir peçete ile nazikçe temizleyin. Mikroskop objektif lensinin korozif HCl buharlarına maruz kalmasını minimize etmek için montajdan önce dokuyu yıkayın.
  8. Her enine kesit üzerine 1–2 damla %50 gliserol-ultrasafi su uygulayın ve 24 mm × 30 mm'lik bir lamelle (No. 1.5 kalınlık) örtün. Hemen mikroskobik analiz ve görüntülemeye geçin.
    NOT: Wiesner boyaması zamana duyarlı olduğundan ve zamanla sarararak enine kesitten yayılabileceğinden görüntüleri 6–8 saat içinde alın.

6. Pektin için enine kesit boyaması

  1. Boyama öncesinde, saklanan lamlar üzerindeki gliserol-ultra saf su karışımını uzaklaştırmak için adım 5.1'i takip edin.
  2. Işığa duyarlı reaktifi ışıktan korumak için alüminyum folyoya sarılmış 125 mL'lik bir Erlenmeyer balonunda, 0,02 g rutenyum kırmızısını 100 mL ultra saf suda çözerek %0,02'lik rutenyum kırmızısı çözeltisi hazırlayın. Balonu tıpayın; çözelti adı, hazırlama tarihi ve hazırlayan kişinin adını içeren bir etiket yapıştırın ve 20 °C'de saklayın.
  3. Lamları soğutmalı etanol-ultra saf su tüplerinden çıkarın ve montajlı kesitler içeren doğru şekilde etiketlenmiş lamları geçici olarak bekletmek üzere %100 ultra saf su (bakınız 1.1.6) içeren tüplere aktarın.
    NOT: Adım 5.3'te açıklanan hidratasyon önlemlerini uygulayın.
  4. Pens yardımıyla ultra saf sudan bir lam çıkarın ve boyanın cama akmasını önlemek için bandın etrafındaki suyu hav bırakmayan bir peçete ile kurulayın. Lamı küçük bir plastik tepsiye yerleştirin.
  5. Enine kesitleri eşit şekilde kaplayacak şekilde birkaç damla rutenyum kırmızısı çözeltisi (bakınız 6.2) uygulayın. Lamları ışıktan korumak için 10 dk boyunca alüminyum folyo ile örtün, ardından lamdaki boyayı 2 dk boyunca ultra saf su ile nazikçe durulayın.
  6. Lamdaki fazla suyu kurulayın ve her bir enine kesit üzerine 1–2 damla %50 gliserol-ultra saf su uygulayın. Enine kesitleri 24 mm × 30 mm'lik bir lamel (No. 1.5 kalınlık) ile kapatın ve mikroskobik analiz ve görüntüleme aşamasına geçin.
    NOT: Optimal sonuçlar için mikroskobik analizi aynı gün içinde gerçekleştirin.

7. Brightfield görüntüleme

  1. Çapraz kesitleri, bir mikroskop kullanarak 10×, 20× ve 40× büyütmelerde parlak alan aydınlatması altında gözlemleyin. Görüntüleme parametreleri ve ayarları için Tablo 1'e bakınız.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Santrifüj tüplerinin rumen koşullarını simüle etmek amacıyla kullanılması, Medicago sativa gövde enine kesitlerinin nispeten hızlı ve düşük maliyetli in vitro sindirimini mümkün kılmıştır. Kayar mikrotom kullanılarak, 10 μm kalınlığında M. sativa gövde enine kesitleri hazırlanmıştır (Şekil 1A). Gövde enine kesitleri, çift taraflı bant ile cam lamlara yapıştırılmış (Şekil 1B) ve 4 h ile 96 h arasında değişen inkübasyon süreleri boyunca ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Bu çalışmada kullanılan yonca materyali, beş farklı yonca hattından alınan klonlardan oluşmaktadır. İki deneysel hat, düşük 16 h IVNDFD ve düşük 96 h IVNDFD veya yüksek 16 h IVNDFD ve yüksek 96 h IVNDFD değerlerine sahip ana bitkilerden, in vitro nötr deterjan lif sindirilebilirliği (IVNDFD) için iki döngülük farklılaştırıcı seçilim sonrası seçilmiştir12. Çalışmaya genetik geçmişleri bilinmeyen üç ticari hat da dahil edilmiş ve ana bitkiler, yakın kızılötesi spektroskopi analizi teme...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar, araştırmanın potansiyel bir çıkar çatışması olarak yorumlanabilecek herhangi bir ticari veya finansal ilişki olmaksızın yürütüldüğünü beyan ederler. Bu yayında ticari isimlere veya ticari ürünlere yer verilmesi, yalnızca spesifik bilgi sağlama amaçlıdır ve ABD Tarım Bakanlığı (U.S. Department of Agriculture) tarafından bir tavsiye veya onay anlamına gelmez. USDA, fırsat eşitliği sağlayan bir kurum ve işverendir. Tüm deneyler, gerçekleştirildikleri ülke olan Amerika Birleşik Devletleri'nin yürürlükteki yasalarına uygun olarak yapılmıştır.

Teşekkürler

Yazarlar, önceki ilgili çalışmalara dair görüşleri için R. Ted Jeo'ya teşekkür ederler. Görüntülerin yayın için hazırlanmasında mikroskop görüntüleme ve analiz yazılımlarına erişim sağladığı için University of Minnesota - Twin Cities bünyesindeki University Imaging Center'a teşekkür ederiz. Bu çalışma, Amerika Birleşik Devletleri Tarım Bakanlığı – Tarımsal Araştırma Servisi [062-21500-001-000D] ve yardım dışı iş birliği anlaşması (No. 58-5062-2-016) tarafından desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Alüminyum folyoYürüyüş yolu7106BW18 inç × 1.000 ft; ışığa duyarlı boyama çözeltilerini ışıktan korumak için kullanılır
Kalsiyum klorür dihidrat, min. %99Sigma Life ScienceC7902-500GCAS No. 10035-04-8; McDougall için reaktif’s tamponu
Kamera yazılımıNikonNIS-Elements AR 5.42.04görüntüleme ve analiz için kullanılan 64-bit görüntüleme yazılımı
Karbondioksit gazıMathesonUN1013Kullanım sınıfı; hazırlama ve inkübasyon sırasında anoksik koşulların korunması için kullanılır
Sirkülasyonlu su banyosuHassasiyet—Numuneleri şu sıcaklıkta tutmak için kullanılan sıcaklık kontrollü sirkülasyonlu su banyosu 39 °C
Mısır sapı standardıMinnesota ÜniversitesiSisteme giriş yapılamadı.ABD'nin Minnesota eyaletinin St. Paul şehrinde 2023 sonbaharında hasat edilmiştir; 1 mm boyutunda öğütülmüş ve mikrobiyal substrat olarak kullanılmıştır
Lamelli camThermo Scientific341924 mm × 30 mm, No. 1.5 kalınlık, 1 oz
FX geniş formatlı CMOS görüntü sensörlü Digital Sight 10 renkli mikroskop kamerasıNikonMQA20000Aydınlık alan mikroskobik görüntüleri elde etmek için kullanılan dijital renkli kamera
Diseksiyon mikroskobuNikonSMZ18Kök enine kesitlerini yönlendirmek ve konumlandırmak için kullanılan stereo mikroskop
Çift taraflı bantSelloTape Office Vinil Çift Taraflı Bant42702 mm × 53 m; gövde enine kesitlerini lamlara sabitlemek için kullanılır
Elektronik teraziVEGH-202Dört ondalık basamak okunabilirliğe sahip analitik terazi
Erlenmeyer flask (125 mL)Kimax25600125 mL balon joje; 5 numara tıpa ile uyumlu
Erlenmeyer flask (25 mL)Pyrex498025 mL balon joje; 0 numara tıpa ile uyumlu
Etanol (%100)Fisher Scientific04-355-720Boyama çözeltilerinin hazırlanmasında ve boyama öncesi durulama işlemlerinde kullanılan absolut etanol
Ekstrüde polistiren sert köpük yalıtımOwens Corning14077881 inç × 2 ft × 2 ft, R-5, 15 PSI köpük levha; kesit alma işlemi sırasında gövde boğumaralarını desteklemek için kullanılır
PenslerFisher Scientific10-316AKök segmentlerinin, lamların ve monte edilmiş kesitlerin taşınmasında kullanılan laboratuvar pensleri
Lam camlarıFisherBrand12550325 mm × 75 mm × 1 mm; gövde enine kesitlerinin montajı için kullanılır
Balon joje (6 L)PyrexCLS43205L-4EADaha büyük çözelti hacimlerinin hazırlanmasında veya taşınmasında kullanılan 6 L'lik cam balon
Gliserin, laboratuvar tipi sıvıFisher Bilim Eğitimi525342CCAS No. 56-81-5; kapatma ve saklama çözeltilerinde kullanılan gliserol
50 numara çift katlı tülbentJINIOHEE MağazasıB0FL27KXRN%100 pamuk, beyazlatılmış; rumen materyali ve rumen sıvısını filtrelemek için kullanılır
Mezur (10 mL)Pyrex700024Sıvı hacimlerini ölçmek için kullanılan 10 mL'lik dereceli silindir
Hidroklorik asitFisherA1445-500CAS No. 7647-01-0; Wiesner boyası hazırlamak için floroglusinol ile birlikte kullanılır
Endüstriyel süper kalıcı markörSharpie13601İnce uç; inkübasyon tüplerini suya dayanıklı işaretlerle etiketlemek için kullanılır
L-sistein hidroklorür hidratSigma-AldrichC121800-10GCAS No. 345909-32-2; inkübasyon solüsyonunun hazırlanmasında kullanılan indirgeyici ajan
Düşük havlı mendilKimberly-Clark341554,5 inç × 8,5 inç; lif bırakmadan lamların üzerindeki fazla sıvıyı emmek için kullanılır
Düşük profilli mikrotom bıçağıLeica 81963065-LPUniform gövde kesitlerinin hazırlanmasında kullanılan düşük profilli yedek bıçak
Magnezyum sülfat heptahidratFisher ChemicalM80-500CAS No. 10034-99-8; McDougall için reaktif’S tamponu
Manyetik karıştırma çubuğuFisher Scientific03-411-78376 mm × 12 mm; tampon çözeltinin ve inokülasyon çözeltilerinin karıştırılmasında kullanılır
Posta adresi etiketleriAvery51671/2 inç × 1 3/4 in; numune ve lam tanımlaması için kullanılır
Boya fırçasıLoew-Cornell—7000 Serisi, No. 3 yuvarlak; gövde enine kesitlerini aktarmak ve manipüle etmek için kullanılan ince fırça
Kapaklı Petri kaplarıBecton Dickinson Laboratuvar Gereçleri8173111960 mm × 15 mm; gövde enine kesitlerinin ultrapure su içerisinde geçici olarak saklanmasında kullanılır
Floroglusinol, 1,3,5-trihidroksibenzenSigma-AldrichP3502-25GCAS No. 108-73-6; Wiesner boyasını hazırlamak için kullanılan reaktif
Pipet (100 μL)GilsonP 1000; 767547MBoyama solüsyonlarını dağıtmak için kullanılan ayarlanabilir hacimli pipet
Plastik kullanım amaçlı huniNalgene10-437-23E150 mm; reaktif transferinde ve filtrasyonda kullanılır
Polipropilen beher (4 L)Nalgene1201-4000İnokülasyon çözeltilerinin hazırlanması ve karıştırılması için kullanılan 4 L kimyasallara dayanıklı beher
Potasyum klorürFisher ChemicalP217-500CAS No. 7447-40-7; McDougall için reaktif’s tamponu
JiletlerPersona66-00890,009 kalınlığında; gövde materyalinin manuel olarak kırpılması için kullanılır
Rutenyum kırmızısı, amonyaklı rutenyum oksiklorürSigmaR-2751CAS No. 11103-72-3; pektik maddelerin görüntülenmesi için kullanılan histolojik boya
MakaslarFiskars1063071Bant, köpük ve diğer sarf malzemelerini kesmek için kullanılan genel amaçlı makaslar
Vidalı kapaklı konik santrifüj tüpleri (50 mL)Corning430828Polipropilen, pirojenik olmayan; numune tutma, inkübasyon, durulama ve saklama için kullanılır
Sledge mikrotomLeica2000RHazırlamak için kullanılan kaydırmalı/kızaklı mikrotom 100 μm-kalın gövde kesitleri
Sodyum bikarbonat, ACS kaliteFisher ChemicalS233-3CAS No. 144-55-8; McDougall için reaktif’s tamponu
Sodyum klorürFisher Chemical—CAS No. 7647-14-5; McDougall için reaktif’s tamponu
Sodyum hidroksitFisher ChemicalS318-500CAS No. 1310-73-2; indirgeyici çözeltinin hazırlanmasında kullanılır
susuz dibazik sodyum fosfat (Na2HPO4)Sigma AldrichS-9763CAS 7558-79-4
Sodyum sülfit anhidrat, ACS, min. %98,0Oakwood Chemicals245960CAS No. 1313-84-4; inkübasyon solüsyonunun hazırlanmasında kullanılan indirgeyici ajan
Spoonula laboratuvar kaşığıFisher Scientific14-375-10Toz reaktiflerin aktarımı için kullanılan laboratuvar spatülü
Manyetik karıştırıcıSybron tarafından üretilen Thermolyne7200Tampon ve inokülasyon çözeltilerini karıştırmak için kullanılan manyetik karıştırıcı
Geniş uçlu iğneye sahip şırınga (60 mL)Monoject935401028İnokülasyon solüsyonunu dağıtmak için kullanılan geniş lümenli iğneye sahip 60 mL'lik şırınga
Deney tüpü raflarıThermo Scientific14-809-4450 mL'lik inkübasyon tüplerini organize etmek ve desteklemek için kullanılan raflar
TermometreFisherBrand13201663Çözelti ve su banyosu sıcaklığını doğrulamak için kullanılan laboratuvar termometresi
Dik mikroskopNikonEclipse NiBoyanmış gövde enine kesitlerinin görselleştirilmesi ve görüntülenmesi için kullanılan dik parlak alan mikroskobu
Yardımcı pompaLittle Giant Pump Co.502203Model 2E-38N; 115 VAC, 60 Hz, 1,7 A; suyu sirküle etmek ve banyo sıcaklığını sabit tutmak için kullanılır
Tartım kağıdıVWR Bilimsel Ürünleri12578-165Katı reaktiflerin ve mısır sapı substratının tartılması ve aktarılmasında kullanılan tek kullanımlık tartım kağıdı

Kaynaklar

  1. Cosgrove DJ. Growth of the plant cell wall. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 2005;6(11):850-861.
  2. Moore KJ, Jung H-JG. Lignin and fiber digestion. Journal of Range Management. 2001;54(4):420-430.
  3. Barros J, Serk H, Granlund I, Pesquet E. The cell biology of lignification in higher plants. Annals of Botany. 2015;115(7):1053-1074.
  4. Jung HG, Engels FM. Alfalfa stem tissues: cell wall deposition, composition, and degradability. Crop Science. 2002;42(2):524-534.
  5. Jung HG, Lamb JFS. Stem morphological and cell wall traits associated with divergent in vitro neutral detergent fiber digestibility in alfalfa clones. Crop Science. 2006;46(5):2054-2061.
  6. Engels FM, Jung HG. Alfalfa stem tissues: cell-wall development and lignification. Annals of Botany. 1998;82(5):561-568.
  7. Akin DE. Section to slide technique for study of forage anatomy and digestion. Crop Science. 1982;22(2):444-446.
  8. Jung HG, Deetz DA. Cell wall lignification and degradability. In: Jung HG, Buxton DR, Hatfield RD, Ralph J, eds. Forage Cell Wall Structure and Digestibility. American Society of Agronomy, Crop Science Society of America, Soil Science Society of America; Madison, WI; 1993:315-346.
  9. Blaschek L, et al. Cellular and genetic regulation of coniferaldehyde incorporation in lignin of herbaceous and woody plants by quantitative Wiesner staining. Frontiers in Plant Science. 2020;11:109.
  10. Blaschek L, et al. Different combinations of laccase paralogs nonredundantly control the amount and composition of lignin in specific cell types and cell wall layers in Arabidopsis. The Plant Cell. 2023;35(2):889-909.
  11. Nevins DJ. Analysis of forage cell wall polysaccharides. In: Jung HG, Buxton DR, Hatfield RD, Ralph J, eds. Forage Cell Wall Structure and Digestibility. American Society of Agronomy, Crop Science Society of America, Soil Science Society of America; Madison, WI; 1993:105-132.
  12. Xu Z, Heuschele DJ, Lamb JFS, Jung H-JG, Samac DA. Improved forage quality in alfalfa (Medicago sativa L.) via selection for increased stem fiber digestibility. Agronomy. 2023;13(3):770.
  13. Pradhan Mitra P, Loqué D. Histochemical staining of Arabidopsis thaliana secondary cell wall elements. Journal of Visualized Experiments. 2014;(87):51381.
  14. De Micco V, Aronne G. Combined histochemistry and autofluorescence for identifying lignin distribution in cell walls. Biotechnic & Histochemistry. 2007;82(4–5):209-216.
  15. Kraus JE, et al. Astra Blue and Basic Fuchsin double staining of plant materials. Biotechnic & Histochemistry. 1998;73(5):235-243.
  16. Ursache R, Andersen TG, Marhavý P, Geldner N. A protocol for combining fluorescent proteins with histological stains for diverse cell wall components. The Plant Journal. 2018;93(2):399-412.
  17. Baldacci-Cresp F, et al. A rapid and quantitative safranin-based fluorescent microscopy method to evaluate cell wall lignification. The Plant Journal. 2020;102(5):1074-1089.
  18. Casero PJ, Knox JP. The monoclonal antibody JIM5 indicates patterns of pectin deposition in relation to pit fields at the plasma-membrane-face of tomato pericarp cell walls. Protoplasma. 1995;188(1-2):133-137.
  19. Pesquet E, Cesarino I, Kajita S, Pawlowski K. Physiological roles of lignins – tuning cell wall hygroscopy and biomechanics. New Phytologist. 2025;248(6):2674-2706.
  20. Jung HG, Engels FM. Alfalfa stem tissues: rate and extent of cell-wall thinning during ruminal degradation. NJAS: Wageningen Journal of Life Sciences. 2001;49(1):3-13.
  21. Yeung EC. A beginner’s guide to the study of plant structure. Tested Studies for Laboratory Teaching. 1998;19:125-142.
  22. Jensen, W.A. Botanical Histochemistry: Principles and Practice. Freeman W.H. & Co. San Francisco, CA. (1962).
  23. Ruzin, SE. Plant Microtechnique and Microscopy. Oxford University Press; New York, NY; 1999.
  24. Gronwald JW, Bucciarelli B. Comparison of stem morphology and anatomy of two alfalfa clonal lines exhibiting divergent cell wall composition. Journal of the Science of Food and Agriculture. 2013;93(11):2858-2863.
  25. Dai R, et al. Overexpression MsJAR1 gene increased lateral branches and plant height in alfalfa (Medicago sativa L.). Scientific Reports. 2025;15(1):16956.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Daha fazla makale keşfet

Rumen Sıvısı İnkübasyonuYonca GövdeleriLignin BirikimiPektin BirikimiGövde SindirilebilirliğiWiesner BoyasıRutenyum KırmızısıYem Besleme

Bu makale yayımlandı

Video yakında

Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.