Bu protokol, yonca (Medicago sativa L.) gövdelerinin enine kesitlerinde lignin ve pektin hücre duvarı bileşenlerinin birikimini görselleştirmektedir. Amaç, gövdenin istenilen gövde sindirilebilirlik özelliklerine sahip yeni yonca hatları geliştirmek için hedeflenebilecek spesifik dokularını tanımlamaktır.
Yöntem makalesi
Yonca (Medicago sativa L.) Gövdelerindeki Seçilmiş Hücre Çeperi Bileşenlerinin Rumen Sıvısı ile In vitro İnkübasyonu ve Histolojik Boyanması
Bu makalede
Özet
Özet
Bitkiler büyüdükçe hücre duvarı bileşenlerinin birikmesi, ruminantlar için kaba yem besleyiciliğini sınırlar. Özellikle, bitki dokularındaki lignin birikimi, hücre duvarı karbonhidratları olan selüloz ve hemiselülozun parçalanmasını engeller ve böylece kaba yemden elde edilebilen enerji miktarını azaltır. Buna karşın, hücre duvarının yüksek derecede sindirilebilir pektin bileşeni, yıkıma kolayca erişilebilirdir. Farklı gövde hücre tiplerindeki lignin ve pektin birikimi hakkındaki bilgiler, yonca hatları arasındaki gövde sindirilebilirliğindeki varyasyonun altında yatan faktörlere ilişkin mekanistik içgörüler sağlayabilir. Gövde enine kesitlerinin rumen sıvısı içinde in vitro inkübasyonu, gövde dokularının rumende geçirdiği süreçleri simüle eder. Histolojik boyama ve mikroskopi ile birleştirilen bu yöntem, doku yıkımındaki değişikliklerin zaman içindeki seyri ile gövdedeki lignin ve pektin konumlarının görselleştirilmesini sağlar. Wiesner boyası, ligninin guaiasil (G) aldehit birimleriyle reaksiyona girerek onları fuşya rengine boyar. Benzer şekilde, rutenyum kırmızısı pektinin karboksil gruplarıyla etkileşime girerek, gövdedeki pektini pembeden turuncuya ve kahverengiye kadar değişen tonlarda boyar. Bu protokol, rumen mikroplarına maruz bırakılan yonca gövde enine kesitlerinin sindirilmesini ve ardından hücre duvarlarındaki lignin ve pektin paternlerini görselleştirmek için yapılan boyamayı açıklamaktadır. Yöntem, lignin ve pektinin mevcut olduğu veya olmadığı gövde dokularını tanımlamak için kullanılabilir ve böylece yonca hatları arasındaki karşılaştırmaları kolaylaştırır.
Giriş
Her bitki hücresi bir hücre duvarı ile çevrilidir. Selüloz, hemiselüloz, lignin ve pektin, geviş getiren hayvanların diyetinin gerekli bir parçası olan bitki lifine katkıda bulunan hücre duvarı bileşenleridir. Pektinler yüksek derecede sindirilebilir (çözünür) polisakkaritler iken1, lignin lif yıkımını sınırlayan sindirilemez bir polimerdir2. Bu nedenle lignin, bitki sindirilebilirliğini azaltır ve nihayetinde kaba yemden geviş getiren hayvana sağlanan enerjiyi düşürür. Ancak lignin, trakeid elementlerini güçlendirerek suyun bitki boyunca iletilmesi gibi önemli bitki fizyolojik fonksiyonlarını destekler3. Önceki çalışmalar, gövde lifinde lignini azaltan veya pektini artıran değişikliklerin gövde sindirilebilirliğini ve kaba yemin besin değerini artırabileceğini göstermiştir4. Bu nedenle, bu protokol bu iki hücre duvarı bileşenine odaklanmaktadır. Gövde hücre duvarındaki toplam lignin ve pektin konsantrasyonları, gövde lifi sindirilebilirliğinin altında yatan mekanizmaları açıklamak için yetersiz bilgi sağlar5. Rumen sıvısı ile in vitro inkübasyon ve histolojik boyama, farklı gövde lifi sindirilebilirliğine sahip bitkiler arasındaki hücre duvarı bileşenlerindeki farklılıkları görselleştirerek hücresel düzeyde içgörüler sağlayabilir4,6. Mevcut protokolde, yaygın bir çok yıllık yemleğümsü bitki olan yonca (Medicago sativa L.), yapraklara göre daha fazla lignin ancak daha az pektin içeren gövde dokularındaki lignin ve pektin örüntülerini örneklendirmek için model tür olarak kullanılmıştır.
In vitro rumen sıvısı ile inkübasyon, geviş getiren hayvan midesindeki kaba yem sindirimini simüle ederek, yem anatomisinin sindirilebilirlik üzerindeki etkilerinin gözlemlenmesine olanak tanır. Bir deney tüpünde rumenle benzer koşullar oluşturularak, cam lamlara yapıştırılmış gövde enine kesitleri, rumen sıvısına maruz kalma sonrası doku bozulma derecesini değerlendirmek için çeşitli zaman noktalarında çıkarılabilir6. Bu yöntem, yonca gövdelerinin anatomik yapılarının görselleştirilmesi7 ve gövde sindirilirken farklı hücre duvarı bileşenleri içeren hücre tiplerinin nasıl değiştiğinin incelenmesi için nispeten basit, hızlı ve düşük maliyetli bir yaklaşım sunar.
Gövde enine kesitlerinin histolojik boyanması, hücre duvarı bileşenlerinin görselleştirilmesine olanak tanır. Floroglusinol ve hidroklorik asit (HCl), G C6C3 aldehit (koniferaldehit) monomerleri9 ile reaksiyona girerek guaiasil açısından zengin lignin birimleri içeren gövde dokularını belirginleştiren8 Wiesner boyasını oluşturur. Lignin birden fazla monomer alt birimden oluşur; ancak bu makale boyunca "lignin" terimi, yalnızca Wiesner boyası ile reaksiyona giren10 ve dolayısıyla bu protokol kullanılarak görselleştirilen G-birim monomerini ifade eder. Ksilem damarları gibi bazı dokular her zaman lignifiyedir6. Bunun dışında, yonca gövde dokularındaki lignin birikimi, sekonder (kambiyum) büyüme başladığında başlar ve gövde boğum arası uzamasının durmasıyla örtüşür6. Rutenyum kırmızısı, bazen esterleşmiş olan ve bazı yan zincirleri paylaşan karboksil grupları içeren pektik maddelere bağlanır11. Orta lamella ve primer hücre duvarlarında bulunan pektinlerin karboksil grupları rutenyum kırmızısı ile etkileşime girer11. Pektin, hücre uzamasında rol oynar ve bu nedenle primer büyüme sırasında hücrelerde bulunur. Metin boyunca "pektin" terimi, genel olarak mevcut olabilecek pektin grubunu ifade eder. Histolojik boyamanın rumen in vitro inkübasyonu ile birleştirilmesi, gövdedeki hücre duvarı bileşenlerinin konumunun gözlemlenmesini kolaylaştırır ve farklı hücre tiplerinin ruminal sindirim sırasında nasıl değiştiğini vurgular. Nihayetinde bu protokol, lignin ve pektin içeren gövde hücrelerini tanımlamak ve farklı yonca hatları ile inkübasyon süreleri arasındaki örüntüleri karakterize etmek için kullanılabilir.
Protokol
Bu araştırma, hayvan deneklere yönelik kurumsal yönergelere (IACUC 2301-40689B) uygun olarak yürütülmüştür.
1. Numune tüplerinin etiketlenmesi
- İnkübasyon, saklama ve boyama için örnek tüplerinin hazırlanması ve etiketlenmesi
- Her örnek için beş ayrı set tek kullanımlık, vidalı kapaklı, 50 mL konik santrifüj tüpünü önceden etiketleyin. Aşağıda açıklanan kullanımlar için her tüpe örnek tanımlayıcısını ve inkübasyon süresini ekleyin.
- İnkübasyon öncesi tutma tüplerini etiketleyin ve 35 mL ultrapure su ekleyin.
- Bölüm 3 ve 4'te kullanılacak inkübasyon tüplerini etiketleyin. Tüpleri inkübasyon sürelerine göre (0, 4, 8, 24, 48 veya 96 sa) ayrı raklara düzenleyin.
NOT: Etiketlerin su banyosunda silinmesini önlemek için endüstriyel sınıfta kalıcı bir markör kullanın. - İnkübasyon sonrası saklama tüplerini etiketleyin ve %100 gliserol ile ultrapure suyun 50:50 karışımından 35 mL ekleyin. Bu tüpleri, sindirilmiş enine kesitleri boyama işlemine kadar lamlar üzerinde saklamak için kullanın.
- Boyama öncesi tüplerini etiketleyin ve 200-proof etanol ile ultrapure suyun 50:50 karışımından 35 mL ekleyin. Bu tüpleri, boyama öncesinde enine kesitlerdeki gliserolü uzaklaştırmak için kullanın.
- Hidrasyon tüplerini etiketleyin ve 35 mL ultrapure su ekleyin.
2. Gövde enine kesit alma ve lamlara yerleştirme
- Penset kullanarak örnek gövdelerden her seferinde bir gövde segmenti seçin ve segmentin merkezini kesin.
NOT: Her biyolojik tekrar için, her örnek başına teknik tekrar olarak dört gövde kullanın. Her örnekteki tüm olası gövdeler arasından dört gövdeyi rastgele seçin. Tüm inkübasyon çalışmaları boyunca kontrol olarak ek bir standart gövde seti kullanın. - Her biri yaklaşık 2.5 cm uzunluğunda ve 0.6 cm kalınlığında iki adet ekstrüde polistiren sert köpük yalıtım dikdörtgeni kesin. Bir gövde boğum arasının iki köpük parçası arasına sıkıca oturması için her parçanın uzunluğu boyunca küçük bir kama kesin.
- Gövde "sandviçini", 100 μm kalınlığında kesitler üretebilen sürgülü bir mikrotomun tablasına monte edin. Temiz bir kesim sağlamak için ince uçlu bir resim fırçası kullanarak gövdenin ve mikrotom bıçağının üzerine bir damla su damlatın.
- Gövde enine kesitlerini 100 μm kalınlığında kesin. Her bir enine kesiti, geçici depolama için ultrapure su içeren önceden etiketlenmiş bir Petri kabına aktarmak için resim fırçasını kullanın ve kaptaki köpükleri temizleyin.
NOT: Köpük yırtılırsa mikrotom bıçağını değiştirin; yırtılma bıçağın köreldiğini gösterebilir. - Her inkübasyon süresi için her örnek başına iki adet standart 25 mm × 75 mm cam lamı elle etiketleyin (2 boyama × 6 zaman noktası = biyolojik tekrarların her biri için örnek başına 12 lam). Her etikete örnek tanımlayıcısını, inkübasyon süresini ve boyayı ekleyin.
- 2 mm genişliğinde çift taraflı banttan 2.5 cm uzunluğunda bir parça kesin. Bandın kısa kenarını, yapışkan tarafı aşağı bakacak şekilde lamın altından 0.5 cm uzağa yerleştirin ve yapışmayı sağlamak için eldiven takılıyken bandın mumlu kağıt tarafına sıkıca bastırın.
NOT: Cam lamların kırılmasını önlemek için bu işlemi düz bir yüzeyde gerçekleştirin. - Tüm enine kesitleri aynı yöne yönlendirmek için bir disseksiyon mikroskobu kullanın. Çift taraflı banttan mumlu kağıdı çıkarın ve enine kesitlerin yönelimini koruyarak, ıslatılmış ince uçlu bir resim fırçası yardımıyla onları önceden etiketlenmiş cam lam üzerindeki banda aktarın. Enine kesitleri hafifçe nemli tutun.
- Mumlu kağıdı enine kesitlerin üzerine yerleştirin ve enine kesitleri çift taraflı banda sıkıca sabitlemek için resim fırçasını üzerinden hafifçe yuvarlayın. Mumlu kağıdı çıkarın ve dört enine kesit içeren monte edilmiş lamı, ultrapure suyun monte edilmiş enine kesitleri kapladığından emin olarak adım 1.1.2'de açıklanan önceden etiketlenmiş muhafaza tüpüne yerleştirin.
- Hem rutenyum kırmızısı hem de Wiesner boyası ile boyama yapmak için, çift taraflı bantlar dışa bakacak şekilde her muhafaza tüpüne iki lamı sırt sırta yerleştirin.
NOT: Tüm lamlar monte edilip ultrapure su içeren tüplere yerleştirildikten sonra, gerekirse lamları oda sıcaklığında gece boyunca saklayın.
3. Gövde kesitlerinin in vitro inkübasyonu için hazırlık
- İnkübasyon için hazırlanan tek kullanımlık, vidalı kapaklı, 50 mL santrifüj tüplerini kullanın (bkz. 1.1.3). Her bir inkübasyon aralığı için tüm örnek tüplerini tek bir plastik rack üzerinde gruplandırın.
- Dört basamaklı analitik terazi kullanarak, tartım kağıdı üzerine 0,2 g 1 mm öğütülmüş mısır sapı standardı tartın ve malzemeyi, inkübe edilmemiş kontrol olarak hizmet eden 0 h tüpleri hariç, her bir inkübasyon tüpüne dikkatlice aktarın. Tüplerin kapaklarını kapatın ve kullanıma kadar kenara ayırın.
NOT: Sap kesitlerinin biyokütlesi mikrobiyal aktiviteyi sürdürmek için yetersiz olduğundan, mısır sapı standardı inkübasyon sırasında rumen mikroplarını beslemek için enerji sağlar. - Sirkülasyonlu bir su banyosunu yeterli miktarda suyla doldurun ve inkübasyona başlamadan önce 39 °C'ye dengeleyin. Su derinliğini 50 mL'lik tüplerdeki 35 mL işaretini kapatacak şekilde ayarlayın ve gerekirse üniform su sirkülasyonunu ve sıcaklığını korumak için bir hava motoru (aeratör) kullanın.
- İnokülasyon çözeltisi için McDougall tamponunun hazırlanması
- McDougall tamponunu, inkübasyonları başlatmadan en fazla 2 gün önce hazırlayın.
NOT: İnokülasyon çözeltisini hazırlamak için McDougall tamponunu rumen sıvısı ile 4:1 oranında karıştırın. Tampon hacmini örnek sayısına uygun olarak ayarlayın ve tüp başına 30 mL sağlayacak kadar yeterli inokülasyon çözeltisi hazırlayın. - 1.600 mL ultra saf su ölçün. 1 L'sini 3 L'lik düz tabanlı Erlenmeyer flaskına aktarın ve 600 mL'sini reaktiflerin aktarılması ve durulanması için ayırın.
- Erlenmeyer flaskının içine bir manyetik karıştırma çubuğu yerleştirin ve flaskı bir karıştırma plakası üzerine konumlandırın.
- Erlenmeyer flaskına plastik bir huni yerleştirin. 15,7 g sodyum bikarbonat (NaHCO₃), 5,9 g susuz sodyum fosfat dibazik (Na₂HPO₄), 0,91 g potasyum klorür (KCl), 0,75 g sodyum klorür (NaCl), 0,19 g magnezyum sülfat heptahidrat (MgSO₄·7H₂O) ve 0,06 g kalsiyum klorür dihidrat (CaCl₂) ekleyin; her seferinde bir reaktif ekleyin ve bir sonrakini eklemeden önce her bir reaktifin çözünmesini bekleyin. Her eklemeden sonra huniyi durulamak için ayrılmış 600 mL ultra saf suyun bir kısmını kullanın.
- Kalsiyum klorür dihidrat eklendikten sonra, çözünmeyi kolaylaştırmak için bir CO₂ difüzörü yerleştirin ve çözeltiyi havalandırın (sparging). Çözelti berraklaştığında, 10–15 dk daha havalandırmaya devam edin.
- Flaskı sıkıca tıpayın ve tıpaya maskeleme bandı ile sabitleyin, çünkü tamponun ısıtılması kabı basınçlandırabilir.
- Çözeltiyi 20 °C'de 2 güne kadar saklayın. Çözeltiyi kullanımdan bir gün önce 39 °C'lik su banyosuna yerleştirin veya ertesi gün kullanılacaksa doğrudan 39 °C'lik su banyosuna koyun.
- McDougall tamponunu, inkübasyonları başlatmadan en fazla 2 gün önce hazırlayın.
4. Gövde kesitlerinin in vitro inkübasyonu
- İnkübasyon gününde, çeker ocuk içerisinde 100 mL'lik bir behere 47 mL su ve 4 mL 1 N NaOH koyun ve üzerine 0,625 g sistein-HCl ekleyin. İkinci bir 100 mL'lik behere, 47 mL suya 0,625 g sodyum sülfür ekleyin ve inokülasyon çözeltisi hazırlanana kadar iki çözeltiyi ayrı tutun.
- İnekten laboratuvara rumen mikroorganizmalarını taşımak için sıcak bir ortam oluşturmak amacıyla, yalıtımlı bir termosu sıcak suyla doldurun. Sıcak suyu termostan aktarmak için beş galonluk bir kova getirin.
- Ahır yönetimi tarafından deneye tahsis edilen kanüle edilmiş inekten rumen sıvısı toplamak için ahıra gidin.
NOT: Varyasyonu en aza indirmek için, deney boyunca rumen sıvısını günün yaklaşık aynı saatinde ve aynı inekten toplayın. Rumen sıvısı toplamak için ahırda bulunacağınız zamanı önceden bildirmek üzere ahır yönetimiyle koordineli çalışın. - Deney ineğini belirleyin ve laboratuvar önlüğü, göz koruyucu, bot kılıfı ve omuz hizasına kadar uzanan eldivenler dahil olmak üzere uygun kişisel koruyucu ekipmanları giyin.
NOT: 4.4–4.8 arasındaki adımlarda yer alan prosedürleri, yalnızca ilgili IACUC protokolü kapsamında yetkilendirilmiş personelle sınırlandırın. - Ilık suyu termostan beş galonluk kovaya aktarın. Rumen materyalini süzmek için 50 numara gazlı bezden (tülbent) iki katman hazırlayın.
- Kanüllü inekten rumen sıvısı toplama
- Kanülü dikkatlice açın ve tıpacığın kontamine olmasını önlemek için tıpacığı ılık suyla dolu beş galonluk kovaya yerleştirin. Eldivenli bir elle, rumenin katı-sıvı ara yüzeyine erişmek için rumen içerisinden yeterli miktarda materyal çıkarın.
- Katı-sıvı arayüzeyine ulaşıldığında, materyali birkaç avuç dolusu toplayın ve her biri yaklaşık 45 cm kare olan iki kat 50 derece gazlı bezden sıkarak önceden ısıtılmış, vidalı kapaklı bir termosa aktarın. Rumen sıvısını gazlı bezden sıktıktan sonra kalan materyali atın.
- İnkübe edilecek numune sayısına göre hacmi gerekirse ayarlayarak, her 60'lı inokülasyon tüpü seti için termosta 1 L rumen sıvısı olana kadar 4.6.2. adımı tekrarlayın.
NOT: Kanüle edilmiş ineklerde, belirli bir hafta boyunca çekilebilecek rumen sıvısı miktarı için özel sınırlamalar vardır. Çekilen rumen sıvısı miktarının inek için belirlenen sınırı aşmadığından emin olmak için ahır sorumlusuyla iletişim kurun.
- Yeterli miktarda rumen sıvısı toplandıktan sonra, sıcaklığı korumak için termosu sıkıca kapatın. Kanülü yerine takın ve temizlik için beş galonluk kovadaki ılık suyu kullanın.
- Ağıldan ayrılırken kirlenmiş bot kılıflarını, eldivenleri ve gazlı bezleri uygun atık kutusuna atın. Rumen sıvısının sıcaklığını ve anoksik koşullarını korumak için mümkün olan en kısa sürede laboratuvara dönün.
- Laboratuvara dönüldüğünde, iki indirgeyici ajan çözeltisini (bkz. 4.1) çeker ocak içerisinde birleştirin ve indirgeme çözeltisini hazırlamak için karıştırın.
- Büyük bir manyetik karıştırma çubuğu içeren, en az 2 L kapasiteli bir cam beheri, şu değere ayarlanmış ısıtmalı bir manyetik karıştırıcı üzerine yerleştirin: <30 °Cve bir CO yerleştirin₂ sıvının üzerinde bir difüzör. 1.600 mL McDougall tamponu ekleyin ve CO2'nin kaçmasına izin vermeden yavaşça karıştırın₂ difüzörün sıvı ile temas etmesi.
NOT: Bu düşük sıcaklıkta istenirse polipropilen bir beher kullanın. CO kullanın₂ O'yu yerinden etmek için₂ ve anoksik koşulların korunmasına yardımcı olur. - Büyük bir huniyi iki kat 50 numara tülbent ile kaplayın ve 2 L'lik dereceli silindirin üzerine yerleştirin. 400 mL rumen sıvısını filtreleyin ve inokülasyon çözeltisini hazırlamak için McDougall tamponuna (bkz. 3.4.7) ekleyin.
- İnokülasyon çözeltisine 80 mL redüksiyon çözeltisi (bkz. 4.9) ekleyin ve yavaşça karıştırın. CO'yu koruyun₂ difüzörün sıvı ile temas etmesini önlemek için.
- Çeker ocakta, inkübasyon tüplerinin kapaklarını çıkarın ve tüpleri inkübasyon sürelerine göre ayrı raflara düzenleyin. Slaytların aktarımına hazırlık amacıyla ön inkübasyon bekleme tüplerinin kapaklarını açın (bkz. 1.1.2).
- Her seferinde rastgele bir ön inkübasyon bekleme tüpü seçin ve montajlı cam lamları bir pens yardımıyla ilgili inkübasyon tüpüne aktarın (bkz. 1.1.3). Montajlı lamları içeren her bir inkübasyon tüpünü küçük bir örnek rafına yerleştirin ve ön inkübasyon bekleme tüpünü kenara ayırın.
NOT: 4.14–4.15 arasındaki adımları gerçekleştirmek için iki kişi görevlendirin. Mümkün olduğunca, rumen sıvısı-tampon karışımının soğumasını en aza indirin. - Küt uçlu, geniş lümenli bir iğne takılı 60 mL'lik bir şırınga ile 30 mL inokülasyon çözeltisi çekin. Çözeltiyi inkübasyon tüpünün kenarından yavaşça boşaltın, tüpü CO2 ile temizleyin₂ yaklaşık 20 saniye boyunca bekleyin, tüpün kapağını kapatın ve tüpü tekrar rafa yerleştirin.
- İnoküle edilmiş tüpleri içeren rafları bir 39 °C su banyosu. Düzensiz ısınmayı en aza indirmek için tüpleri günde en az bir kez hafifçe çalkalayın ve raf konumlarını günlük olarak değiştirin.
NOT: Tüplerde gaz kabarcıklarının oluşması, aktif fermantasyonu gösterir. - Her inkübasyon süresinin sonunda, ilgili rafı su banyosundan çıkarın. Tüpleri tek tek açın, her bir lamı çıkarın ve katı maddeler ile kalıntı inokülasyon çözeltisini ultrapure su ile nazikçe durulayarak uzaklaştırın.
- Durulanan lamları, adım 1.1.4'te açıklanan gliserol-su karışımını içeren inkübasyon sonrası saklama tüplerine yerleştirin.
5. Lignin için enine kesit boyama
- Slaytlar %50:50 gliserol-su karışımında saklanmışsa, monte edilmiş enine kesitleri içeren her iki slaytı da etanol-ultrasafi su çözeltisi içeren boyama öncesi durulama tüplerine aktarın (bkz. 1.1.5). Boyama öncesinde gliserolü uzaklaştırmak için tüpleri bir gece boyunca buzdolabında saklayın.
- Işığa duyarlı reaktifi ışıktan korumak için alüminyum folyoya sarılmış 25 mL'lik bir Erlenmeyer flask içinde 0,3 g PG'yi 10 mL absolut etanolde çözerek %3'lük florglusinol (PG) çözeltisi hazırlayın. Flaskı tıpayın, çözelti adı, hazırlama tarihi ve hazırlayanın adıyla etiketleyin ve 20 °C'de saklayın.
- Slaytları soğutmalı tüplerden çıkarın ve geçici olarak adım 1.1.6'da açıklanan, %100 ultrasafi su içeren hidratasyon tüplerine aktarın.
NOT: Kesitlere zarar verebilen ve sonraki görüntülemeyi etkileyebilen oksidasyonu minimize etmek için işlem sırasında enine kesitlerin hidrate kalmasını sağlayın. - Çeker ocuk altında, bir pipetleyici kullanarak 50 mL'lik bir beherde 50 μL %3'lük etanolde PG'yi (bkz. 5.2) 25 μL hidroklorik asit (HCl) ile karıştırarak Wiesner boyasını hazırlayın.
NOT: 2:1 PG-HCl oranını koruyarak miktarları slayt sayısına göre ayarlayın.
UYARI: Hidroklorik asit metaller için korozif olduğundan, ciddi cilt yanıklarına ve göz hasarına yol açabileceğinden ve solunum sistemi irritasyonuna neden olabileceğinden, asidi çeker ocuk altında kullanın. Buhar veya aerosolleri solumaktan kaçının, uygun koruyucu eldiven, kıyafet, göz koruması ve yüz koruması kullanın ve işlem sonrası temas eden cildi iyice yıkayın. - Tüpten bir slayt çıkarın ve boyanın banttan akmasını önlemek için çift taraflı bandın etrafındaki camı düşük tüylü bir peçete ile nazikçe kurulayın. Slaytı küçük bir plastik tepsiye yerleştirin ve bir pipet kullanarak enine kesitlerin üzerine birkaç damla Wiesner boyası uygulayın.
- Bir zamanlayıcıyı 12 dk'ya ayarlayın ve slaytları ışıktan korumak için alüminyum folyo ile örtün. Boyama sırasında enine kesitleri kontrol edin ve kurumayı önlemek için gerekirse boyayı yeniden uygulayın.
NOT: Oksidasyon dokuya zarar verebileceği ve sonraki görüntülemeyi etkileyebileceği için enine kesitlerin kurumasını önleyin. - 12 dk sonra, fazla Wiesner boyasını düşük tüylü bir peçete ile nazikçe temizleyin. Mikroskop objektif lensinin korozif HCl buharlarına maruz kalmasını minimize etmek için montajdan önce dokuyu yıkayın.
- Her enine kesit üzerine 1–2 damla %50 gliserol-ultrasafi su uygulayın ve 24 mm × 30 mm'lik bir lamelle (No. 1.5 kalınlık) örtün. Hemen mikroskobik analiz ve görüntülemeye geçin.
NOT: Wiesner boyaması zamana duyarlı olduğundan ve zamanla sarararak enine kesitten yayılabileceğinden görüntüleri 6–8 saat içinde alın.
6. Pektin için enine kesit boyaması
- Boyama öncesinde, saklanan lamlar üzerindeki gliserol-ultra saf su karışımını uzaklaştırmak için adım 5.1'i takip edin.
- Işığa duyarlı reaktifi ışıktan korumak için alüminyum folyoya sarılmış 125 mL'lik bir Erlenmeyer balonunda, 0,02 g rutenyum kırmızısını 100 mL ultra saf suda çözerek %0,02'lik rutenyum kırmızısı çözeltisi hazırlayın. Balonu tıpayın; çözelti adı, hazırlama tarihi ve hazırlayan kişinin adını içeren bir etiket yapıştırın ve 20 °C'de saklayın.
- Lamları soğutmalı etanol-ultra saf su tüplerinden çıkarın ve montajlı kesitler içeren doğru şekilde etiketlenmiş lamları geçici olarak bekletmek üzere %100 ultra saf su (bakınız 1.1.6) içeren tüplere aktarın.
NOT: Adım 5.3'te açıklanan hidratasyon önlemlerini uygulayın. - Pens yardımıyla ultra saf sudan bir lam çıkarın ve boyanın cama akmasını önlemek için bandın etrafındaki suyu hav bırakmayan bir peçete ile kurulayın. Lamı küçük bir plastik tepsiye yerleştirin.
- Enine kesitleri eşit şekilde kaplayacak şekilde birkaç damla rutenyum kırmızısı çözeltisi (bakınız 6.2) uygulayın. Lamları ışıktan korumak için 10 dk boyunca alüminyum folyo ile örtün, ardından lamdaki boyayı 2 dk boyunca ultra saf su ile nazikçe durulayın.
- Lamdaki fazla suyu kurulayın ve her bir enine kesit üzerine 1–2 damla %50 gliserol-ultra saf su uygulayın. Enine kesitleri 24 mm × 30 mm'lik bir lamel (No. 1.5 kalınlık) ile kapatın ve mikroskobik analiz ve görüntüleme aşamasına geçin.
NOT: Optimal sonuçlar için mikroskobik analizi aynı gün içinde gerçekleştirin.
7. Brightfield görüntüleme
- Çapraz kesitleri, bir mikroskop kullanarak 10×, 20× ve 40× büyütmelerde parlak alan aydınlatması altında gözlemleyin. Görüntüleme parametreleri ve ayarları için Tablo 1'e bakınız.
Sonuçlar
Santrifüj tüplerinin rumen koşullarını simüle etmek amacıyla kullanılması, Medicago sativa gövde enine kesitlerinin nispeten hızlı ve düşük maliyetli in vitro sindirimini mümkün kılmıştır. Kayar mikrotom kullanılarak, 10 μm kalınlığında M. sativa gövde enine kesitleri hazırlanmıştır (Şekil 1A). Gövde enine kesitleri, çift taraflı bant ile cam lamlara yapıştırılmış (Şekil 1B) ve 4 h ile 96 h arasında değişen inkübasyon süreleri boyunca rumen sıvısı inokülasyon çözeltisine daldırılmıştır (Şekil 1C). in vitro inkübasyon için, kapaklı tek kullanımlık 50 mL santrifüj tüpleri inkübasyon kapları olarak kullanılmış ve inkübasyon boyunca rumen mikroorganizmalarını desteklemek için 0,2 g 1-mm öğütülmüş mısır sapı substratı ile takviye edilmiştir. Tüpler, 39 °C'de tutulan bir su banyosunda inkübe edilmiştir (Şekil 1D). Rumen mikroorganizmalarının aktif fermentasyonu, inokülasyon çözeltisinde oluşan gaz kabarcıkları ile görsel olarak doğrulanmıştır. Bu protokol için gerekli malzemeler, ıslak kimya laboratuvarlarında yaygın olarak bulunmaktadır. Çift taraflı bant, rumen sıvısına maruz kalma sırasında doku dejenerasyonunu engellememiş, ancak sindirim sonrası gövdeden geri kalan kısımları tutarak sonraki boyama ve mikroskobik görüntüleme işlemlerine olanak sağlamıştır.
in vitro inkübasyona tabi tutulmayan (0 h) gövde enine kesitleri, farklı gövde dokularındaki başlangıç hücre duvarı bileşenlerinin görselleştirilmesine olanak sağlamıştır. Wiesner boyası ile boyanan enine kesitler, ligninle ilişkili boyanma gösteren dokuları belirlemiş (Şekil 2A–E), rutenyum kırmızısı ile boyanan enine kesitler ise pektinle ilişkili boyanma gösteren dokuları vurgulamıştır (Şekil 3A–E). Wiesner ile boyanmış kesitlerde, olgun primer floem lifleri fuşya renginde boyanma göstermiştir (Şekil 2B–E). Ksilem damarları ve interfasiküler ksilem de fuşya renginde boyanma sergilemiştir (Şekil 2B–D). Rutenyum kırmızısı boyanması epidermis, kollenkima, klorenkima, sekonder floem (Şekil 3B–E) ve pith (Şekil 3B–D) bölgelerinde gözlemlenmiştir. Bazı interfasiküler ksilem ve primer floem lifleri de rutenyum kırmızısı ile boyanmıştır (Şekil 3B–E). Tüm gövde enine kesitleri, 10× büyütmede elde edilen 5 × 5'lik bir görüntü ızgarasının birleştirilmesiyle görselleştirilmiştir (Şekil 2A ve Şekil 3A). Gövde enine kesitinin tek bir bölgesine ait ek görüntüler; vasküler kambiyumun üzerinde (Şekil 2D ve Şekil 3D) ve altında (Şekil 2E ve Şekil 3E) 10× (Şekil 2B ve Şekil 3B), 20× (Şekil 2C ve Şekil 3C) ve 40× büyütmelerde elde edilmiştir.
Wiesner ile boyanmış ... dokuları M. sativa tüm örneklerde gövde enine kesitleri belirgindi in vitro 0 saatten 96 saate kadar inkübasyonlar (Şekil 4A–F). 0. saatte, tüm hücreler net kenarlara sahiptir (Şekil 4A). Sonrasında 8. saatte, ince ve ligninleşmemiş (yani boyanmamış) hücre duvarlarına sahip hücrelerin (örneğin kolenkim) kenarlarındaki bulanıklaşma ve bazı hücrelerin (örneğin sekonder floem) kaybolmasıyla doku dejenerasyonunun kanıtları belirginleşmiştir. 24 saat sonra, çevre dokuların dejenerasyonuyla birlikte ksilem damarlarının spiral üç boyutlu yapısı daha belirgin hale gelmiştir (Şekil 4D). 24 saatin ötesinde, boyanmamış hücreler kademeli olarak degrade oldu ve yok oldu (Şekil 4D–F). Bu dokular yıkıldıkça, anatomik desteğin kaybı boyanmamış epidermisin yanlara doğru çökmesine neden olmuş ve 24, 48 ve 96. saatlerde ince, şeffaf hücrelerden oluşan bir şerit görünümü ortaya çıkarmıştır (Şekil 4D–F).
M. sativa gövde enine kesitlerinin in vitro inkübasyonunu takiben yapılan rutenyum kırmızı boyama, rumen sıvısına 0–96 h boyunca maruz kalma sonrası gövde dokularındaki pektinle ilişkili boyamanın görselleştirilmesini sağlamıştır (Şekil 5A–F). 0 ila 4 saat arasında, tüm hücrelerin etrafındaki net kenarlar, hücrelerin bozulmadan kaldığını göstermektedir (Şekil 5A,B). İnkübasyon süresi 8 saate ulaştığında; kolenkim, klorenkim ve sekonder floem dahil olmak üzere kortekste bulunan ince, lignine edilmemiş hücre duvarlı dokular kademeli olarak yapısal bütünlüklerini kaybetmiş ve bu durum hücre kenarlarının bulanıklaşmasıyla sonuçlanmıştır (Şekil 5C). 24, 48 ve 96. saatlerde, çevreleyen kortikal dokunun büyük kısmı kaybolurken; epidermisin, interfasiküler ksilemin, iliğin ve vasküler dokuların bölümleri görünür kalmaya devam etmiştir (Şekil 5D–F). Çevredeki anatomik yapının kaybına, epidermal bölgenin lateral kollapsı eşlik etmiştir. 96. saate gelindiğinde, önceki inkübasyon sürelerine kıyasla rutenyum kırmızı ile boyanmış doku miktarı önemli ölçüde azalmıştır (Şekil 5F). Genel olarak, inkübasyon sırasında gövde dokusunun kademeli kaybına, rutenyum kırmızıya pozitif boyanan hücrelerdeki azalma eşlik etmiştir. Pektinin zamanla kolayca degrade olması nedeniyle, ince, lignine edilmemiş ve pektinle ilişkili hücrelerin dejenerasyonu ve yok olması beklenen bir durumdur.
Şekil 1: In vitro yonca gövde enine kesitlerinin inkübasyonu. (AAlfalfa gövde segmentleri, iki ekstrüde polistiren sert köpük yalıtım parçası arasına sıkıştırılmış ve enine kesit alma işlemi için kayar bir mikrotom tablasına yerleştirilmiştir.B) her biri... olan dört kesit 100 μm kalın, çift taraflı bant ile bir lam üzerine sabitlendi in vitro inkübasyon ve histolojik boyama. (C) İki cam lam, çift taraflı bantları dışa bakacak şekilde sırt sırta getirilerek, 30 mL rumen sıvısı-tampon inokülasyon çözeltisi ve 0,2 g 1 mm öğütülmüş mısır sapı içeren 50 mL'lik bir tüpe yerleştirildi. Tüp CO₂ ile temizlendi ve inkübasyon için kapatıldı. İnkübasyon sırasında tüpün kenarları boyunca oluşan gaz kabarcıkları, rumen mikroorganizmaları tarafından gerçekleştirilen aktif fermentasyonu gösterdi. (D50 mL'lik tüpleri içeren raflar, bir 39 °C inkübasyon boyunca su banyosu kullanıldı. Su seviyesi, inokülasyon solüsyonunu kaplayacak ancak tüp ağızlarının altında kalacak şekilde ayarlanarak tüplerin içine su girmesi engellendi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2Yonca gövde dokularının Wiesner boyaması, ligninleşmiş hücre duvarı bileşenlerinin dağılımını göstermektedir. (A–E) Sindirilmemiş yonca gövde enine kesitleri (inkübasyon süresi = 0 sa), Wiesner boyanması gösteren gövde dokularının tanımlanması için başlangıç referansı olarak kullanılmıştır. Ksilem damarları (XV), fasiküller arası ksilem (ifX) ve olgun primer floem lifleri (PP) fuşya renginde boyanmıştır. Büyütmeler ve ölçek çubukları: (A) 10× büyütmede elde edilen, birleştirilmiş görüntülerden oluşan 5 × 5 ızgara, ölçek çubuğu = 500 μm; (B) 10×, ölçek çubuğu = 500 μm; (C) 20×, ölçek çubuğu = 250 μm; (D, E) 40×, ölçek çubukları = 150 μmKısaltmalar: Xy = ksilem; Ct = korteks; Pi = pith (öz); Ep = epidermis; Co = kolenkim; Ch = klorenkim; SP = sekonder floem; XV = ksilem damarları; ifX = interfasiküler ksilem; PP = olgun primer floem lifleri. Lütfen bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayın.
Şekil 3Yonca gövde dokularının rutenyum kırmızısı ile boyanması, hücre duvarlarındaki pektik polisakkaritlerin dağılımını göstermektedir. (A–ESindirilmemiş yonca gövde kesitleri (inkübasyon süresi = 0 sa), rutenyum kırmızı boyanması gösteren gövde dokularının belirlenmesi için başlangıç referansı olarak kullanılmıştır. Epidermis (Ep), kollenkim (Co), klorenkim (Ch), sekonder floem (SP) ve pito (Pi) kırmızı boyanma göstermiştir. Sekonder ksilem (SX) ve olgun primer floem (PP) de boyanma göstermişken, ksilem damarları (XV) nispeten boyanmamış kalmıştır. Büyütmeler ve ölçek çubukları: (A) 10× büyütmede elde edilen, birleştirilmiş görüntülerden oluşan 5 × 5 ızgara, ölçek çubuğu = 500 μm; (B) 10×, ölçek çubuğu = 500 μm; (C) 20×, ölçek çubuğu = 250 μm; (D, E) 40×, ölçek çubukları = 150 μmKısaltmalar: Xy = ksilem; Ct = korteks; Pi = pith (öz); Ep = epidermis; Co = kollenkima; Ch = klorenkima; SP = sekonder floem; XV = ksilem damarları; SX = sekonder ksilem; PP = olgun primer floem. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 4yonca gövde dokularında meydana gelen değişiklikler in vitro inkübasyon ve Wiesner boyama. Aynı boğum aralarından alınan yonca gövde enine kesitleri şunlara tabi tutulmuştur: in vitro rumen sıvısı ile inkübasyon (A) 0 sa, (B) 4 sa, (C) 8 sa, (D) 24 sa, (E) 48 sa, ve (F) 96 sa. Ksilem damarları (XV), fasiküller arası ksilem (ifX) ve olgun primer floem lifleri (PP), inkübasyon süreleri boyunca Wiesner boyamasını korudu. Olgunlaşmamış gövde dokusunda ifX'in sönük boyandığı gözlemlendi. İnkübasyon süresi arttıkça, çevre dokular yapısal bütünlüklerini kademeli olarak kaybetti ve bu durum, geriye kalan boyanmış vasküler yapıların giderek daha belirgin hale gelmesini sağladı. Ölçek çubukları = 250 μm. Lütfen bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayın.
Şekil 5yonca gövde dokularındaki değişimler şu durumlar sonrası in vitro inkübasyon ve rutenyum kırmızı boyama. Aynı boğumlar arası bölgelerden alınan yonca gövde enine kesitleri şunlara tabi tutulmuştur: in vitro rumen sıvısı ile inkübasyon (A) 0 sa, (B) 4 sa, (C) 8 sa, (D) 24 sa, (E) 48 sa, ve (F) 96 sa. Birden fazla gövde dokusunda rutenyum kırmızısı boyanması gözlemlenirken, ksilem damarları (XV) karşılaştırmalı olarak boyanmamış kaldı. İnkübasyon süresi arttıkça, doku yapısında ve rutenyum kırmızısı boyanmasında aşamalı bir kayıp gözlemlendi. Daha geç inkübasyon sürelerinde ksilem damarlarının bölümleri, interfasiküler ksilem (ifX) ve epidermal bölge (Ep) görünür kalmaya devam etti. Ölçek çubukları = 250 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Parametre | Kurulum |
| Hızlı (Odak) | 2000 × 1328 |
| Kalite (Yakalama) | 2000 × 1328 |
| Renk Modu | RGB Renk |
| Bit Derinliği | kanal başına 8-bit |
| Etkin Renk Derinliği | 24-bit RGB (8-bit R + 8-bit G + 8-bit B) |
| Kazanç | 2 |
| 10x büyütme pozlama süresi (ms) | 30 |
| 20x büyütme pozlama süresi (ms) | 50 |
| 150x büyütme pozlama süresi (ms) | 150 |
Tablo 1: Görüntüleme için mikroskop ve kamera ayarları. Dijital renkli kamera ve görüntüleme yazılımı ile donatılmış dik bir mikroskopla yapılan parlak alan görüntüleme için kullanılan mikroskop, kamera ve görüntüleme ayarları.
Tartışma
Bu çalışmada kullanılan yonca materyali, beş farklı yonca hattından alınan klonlardan oluşmaktadır. İki deneysel hat, düşük 16 h IVNDFD ve düşük 96 h IVNDFD veya yüksek 16 h IVNDFD ve yüksek 96 h IVNDFD değerlerine sahip ana bitkilerden, in vitro nötr deterjan lif sindirilebilirliği (IVNDFD) için iki döngülük farklılaştırıcı seçilim sonrası seçilmiştir12. Çalışmaya genetik geçmişleri bilinmeyen üç ticari hat da dahil edilmiş ve ana bitkiler, yakın kızılötesi spektroskopi analizi temel alınarak (a) en yüksek lignin, (b) en düşük lignin ve (c) en düşük nötr deterjan lif ve asit deterjan lif değerlerine sahip bireyleri belirlemek üzere seçilmiştir. Beş yonca hattı, Mayıs 2021'de bir seradan Minnesota, ABD'deki iki konumda tekrarlanan saha denemelerine nakledilmiştir. Her yetiştirme sezonunun hem birinci hem de ikinci biçim hasatları için, her yonca hattından 10 gövde; bitki olgunluğunun vejetatif, erken tomurcuk, erken çiçeklenme, çiçeklenme ve yeşil pod aşamalarında hasat edilmiştir. Her gövdenin tabanından itibaren yedinci boğum arası kesilmiş ve enine kesit inkübasyonuna kadar saklanmak üzere 200-proof etanol ve ultrapure suyun 50:50 karışımını içeren 50 mL'lik bir tüpe yerleştirilmiştir. Bu yöntem, laboratuvar grubunun 1990'larda yürüttüğü ve yedinci boğum arasının çalışma birimi olarak seçildiği önceki çalışmalara dayanarak geliştirilmiştir4,6.
In vitro rumen sıvısı ile inkübasyon ve yonca gövdelerinin histolojik boyaması, degrade olmuş gövde dokuları boyunca hücre duvarı bileşenlerinin çökelme modelleri hakkında bilgi edinmek için kullanılmıştır. in vitro inkübasyonlar, bir yonca gövdesinin rumende uğradığı degradasyon derecesini simüle etmiş ve ardından yapılan histolojik boyama, zamanlanmış mikrobiyal sindirim sonrası bu hücre duvarı bileşenlerinin tespit edilebilir kaldığı hücrelerdeki lignin ve pektini vurgulamıştır. Kaydırmalı mikrotom kullanımı, sonuçları etkileyebilecek kesit artefaktlarını minimize etmek için standartlaştırılmış bir kesit kalınlığı sağlamıştır13. Mevcut protokolde yalnızca lignin ve pektin incelenmiş olsa da, bu ve diğer hücre duvarı bileşenlerinin histolojik boyaması için toluidin mavisi, Astra mavisi ve Direct Red 23 gibi alternatif boyalar da kullanılabilir14,15,16. Ayrıca, hücre duvarlarındaki selülozu tespit etmek için polarize ışık kullanılabilir ve safranin O gibi floresan reaktifler lignini17 ve hücre duvarı polisakkaritlerini görselleştirebilir. Dahası, spesifik pektinleri etiketlemek için antikorlar kullanılabilir18. Yoncanın ötesinde, bu protokol diğer türlere de uygulanabilir. Ancak, boyama yanıtları türler, genotipler, gelişim aşamaları ve çevresel koşullar arasında farklılık gösterebilir19.
Gövde enine kesitlerini lamlara yapıştırmak için düşük maliyetli çift taraflı bant kullanımı daha önce tanımlanmıştır6,20. Bu in vitro inkübasyon protokolüne başlamadan önce, birkaç gün boyunca sıvıya batırılmaya dayanıklı ve kolayca temin edilebilen bir çift taraflı bant belirlemek gerekiyordu. Farklı endüstriyel kullanım amaçlarına ve kalınlıklara sahip çeşitli bant türleri değerlendirildi. Özetle, 1 inç uzunluğundaki çift taraflı bant parçaları ve gövde enine kesitleri lamlara sabitlendi ve lamlara yapışık kalıp kalmadıklarını belirlemek için 1 hafta boyunca değişen sürelerde suya daldırıldı. Bazı çift taraflı bantlar lamlardan ayrılırken, diğerleri uzun süre sıvıya maruz kaldığında opak hale geldi. Bant şeffaflığının kaybolması mikroskopi çalışmalarını engelledi ve gövde enine kesitlerinin yüksek kaliteli görüntülerinin elde edilmesini zorlaştırdı. Test edilen yapıştırıcılar arasında vinil çift taraflı bant en iyi performansı gösterdi. Orijinal deneylerde kullanılan bant 1990'larda satın alınmıştı ve etkili kalmaya devam etmişti; ancak aynı ürün sonraki deneyler için temin edilemedi. Bu nedenle, hem bandın hem de enine kesitlerin inkübasyon süresi boyunca yapışık kaldığından emin olmak için seçilen bant kullanım öncesinde test edilmelidir. Yüksek kaliteli görüntüler elde edilmesine olanak sağlamak için bandın ayrıca şeffaf kalması gerekir.
Protokolün in vitro inkübasyon bölümü, dikkatli bir planlama ve koordinasyon gerektiren zamana duyarlı birçok adımı içermekteydi. in vitro inkübasyon prosedürü için gereken toplam süre, deneyin büyüklüğüne bağlı olarak değişiklik gösterebilir. Örneğin, gövde enine kesitlerinden oluşan güçlü bir veri seti oluşturmak için, her örnek × in vitro inkübasyon aralığı × boyama kombinasyonu için her lama dört adet farklı yonca gövdesi yerleştirilmiştir. 16 örnek, altı inkübasyon aralığı ve iki boyama ile, her bir in vitro inkübasyon çalışması için toplam 768 gövde enine kesiti gerekmiştir. 768 enine kesitin hazırlanması yaklaşık 8 saat sürmüştür; hazırlanan bu kesitler daha sonra ultrapure su içeren Petri kaplarında gece boyunca saklanmış ve ertesi gün lamlara yerleştirilmiştir. Yerleştirme işleminden önce, 192 cam lam ve 96 santrifüj tüpünün (50 mL) etiketlenmesi gerekmiştir. Enine kesitlerin yerleştirilmesi ek olarak 8 saat sürmüştür; çünkü gövde dokuları arasındaki karşılaştırmaları kolaylaştırmak amacıyla kesitler, inkübasyon aralıkları ve boyamalar boyunca tutarlı bir şekilde yönlendirilmiştir. Bu yaklaşım, enine kesitlerin rastgele yerleştirilmesine göre daha fazla zaman gerektirmiştir. Yerleştirilen lamlar, ertesi gün in vitro inkübasyon başlatılmadan önce gece boyunca ultrapure su içerisinde saklanmıştır. Yonca gövde enine kesitleri hazırlanıp yerleştirilirken, aynı zamanda McDougall tamponu da hazırlanmıştır. Tampon, in vitro inkübasyon başlatılmadan en fazla 2 gün önce hazırlanabilmiş ve yerleştirilen enine kesitlerin inokülasyonundan önce 39 °C'ye ısıtılması gerekmiştir. Bu nedenle, protokolün başarıyla tamamlanması için dikkatli bir planlama ve hazırlık gerekli olmuştur.
Wiesner boyası, bitki dokularındaki lignin ilişkili yapıları görüntülemek için yaygın olarak kullanılır. Bu boyama yöntemi nispeten basit21 ve makul düzeyde spesifik22 olsa da, guaiacyl (G) lignin birimleri ile ilişkili sinnamaldehit uç gruplarını boyar13. Yonca gibi dikotiledon angiospermlerde, H-halkalı alt birimler de mevcut olsa da, G ve syringyl (S) birimleri lignin polimerinin temel bileşenleridir. Bu nedenle Wiesner boyaması, S lignini ile reaksiyona girmediği için gövdedeki toplam lignini olduğundan düşük tahmin edebilir. Hem G hem de S birimleri interfasiküler ksilem ve primer floem liflerinde (yani sklerenkim dokularda) bulunabilir; bu nedenle, S birimleri Wiesner boyası ile reaksiyona girmese bile, G birimlerinin boyanması bu dokulardaki lignin ilişkili yapıların varlığını gösterebilir. S birimlerini görüntülemek ve gövdedeki lignin birimlerinin daha eksiksiz bir temsilini sunmak için Mäule boyası kullanılabilir13. Pektinin rutenyum kırmızı ile boyanma yoğunluğundaki varyasyonlar, pektik asidin esterleşme veya de-esterleşme durumuna bağlı olarak ortaya çıkabilir23. Boyama, sarı-turuncu bir tondan parlak kırmızı bir renge kadar değişebilir. Rutenyum kırmızı birkaç karbonhidratla etkileşime girebildiği için, bu boyanın kullanımı dokulardaki pektinin olduğundan fazla tahmin edilmesine yol açabilir11. Yonca gövdesi olgunlaştıkça lignin oranı arttığından, lignin daha yaşlı gövdelerde pektin boyamasını da etkileyebilir. Belirli bir boyanın tonları arasındaki farkları görsel olarak ayırt etmek zor olabilir; ancak görüntü analiz teknolojileri bu sınırlamanın aşılmasına yardımcı olabilir.
Rumen sıvısı ile in vitro inkübasyon ve histolojik boyama işlemleri sonrası, gövde enine kesitleri mikroskop altında görüntülenebilir ve sonraki analizler için görüntüler elde edilebilir. Wiesner boyaması 24 saat içinde solduğu için9, görüntüler arasında tutarlı renklenmeyi sağlamak amacıyla lignin için boyanan gövdelerin parlak alan mikroskobik analizi, boyama ile aynı gün, ideal olarak 6–8 saat içinde tamamlanmalıdır. Rutenyum kırmızı boyaması yoğunluğunu zamanla korur; bu nedenle, aynı gün görüntüleme yapılması daha az kritiktir. Yine de, tutarlılık sağlamak için rutenyum kırmızı ile boyanan görüntüler de 6–8 saat içinde elde edilmiştir. Görüntüler, geniş formatlı bir CMOS görüntü sensörü ile donatılmış yüksek tanımlı, yüksek çözünürlüklü bir dijital renkli mikroskop kamerası kullanılarak alınmıştır. Görüntüler arasında karşılaştırılabilirliği sağlamak ve çekim ayarlarındaki farklılıkların neden olduğu varyasyonu minimize etmek için aynı pozlama, analog kazanç, bit derinliği, görüntü kalitesi ve odak ayarları kullanılmıştır. Aşırı pozlamayı veya düşük pozlamayı önlemek ve yüksek kaliteli görüntüler üretmek için pozlama süresi büyütme oranına (10×, 20× ve 40×) göre ayarlanmıştır. Bu nedenle, farklı pozlama ayarlarıyla ilişkili varyasyonu minimize etmek için karşılaştırmalar aynı büyütme oranında elde edilen görüntüler arasında yapılmalıdır. Görüntüleme ayarları, kullanılan mikroskop ve kameraya bağlı olarak ayarlama gerektirebilir (Tablo 1). Mevcut protokolde parlak alan mikroskobisi kullanılmış olsa da, hücre duvarı bileşenlerini görüntülemek için taramalı elektron mikroskobisi 6,20 ve floresan mikroskobisi14,15,17 dahil diğer mikroskopi teknikleri de kullanılmıştır.
Bu protokol, histolojik boyama ile elde edilen kalitatif bilgilerin, makine öğrenimi teknolojileri kullanılarak kantitatif analizlere dönüştürülmesini sağlamak için kullanılabilecek geniş bir gövde kesit görüntü veri seti (>15.000) oluşturmuştur. Verimli görüntü analiz boru hatları, görüntülerden kantitatif verilerin çıkarılmasını otomatize edebilir ve hızlandırabilir. Bilgisayar bilimcileriyle yapılacak iş birlikleri; görüntülerin ön işlemesi, yabancı gürültülerin temizlenmesi ve birden fazla hipotezi değerlendirmek için ilgili özelliklerin çıkarılmasına yönelik araçların geliştirilmesini kolaylaştırabilir. Makine öğrenimi yaklaşımları, sağlam bir model performansı sağlamak için yeterli büyüklükte uygun eğitim ve test veri setlerine ihtiyaç duyar. Daha küçük veri setleri, ImageJ24 gibi görüntü analiz yazılımları veya mikroskopla ilişkili görüntü analiz yazılımları25 kullanılarak ilgili özelliklerin manuel ölçümü gibi daha basit görüntü analiz yaklaşımlarıyla analiz edilebilir. Bu nedenle, görüntülerin hedeflenen sonraki kullanımının değerlendirilmesi, elde edilecek görüntülerin türünün ve sayısının belirlenmesinde olduğu kadar, sonraki analiz yaklaşımında da verimliliği artırabilir.
Açıklamalar
Yazarlar, araştırmanın potansiyel bir çıkar çatışması olarak yorumlanabilecek herhangi bir ticari veya finansal ilişki olmaksızın yürütüldüğünü beyan ederler. Bu yayında ticari isimlere veya ticari ürünlere yer verilmesi, yalnızca spesifik bilgi sağlama amaçlıdır ve ABD Tarım Bakanlığı (U.S. Department of Agriculture) tarafından bir tavsiye veya onay anlamına gelmez. USDA, fırsat eşitliği sağlayan bir kurum ve işverendir. Tüm deneyler, gerçekleştirildikleri ülke olan Amerika Birleşik Devletleri'nin yürürlükteki yasalarına uygun olarak yapılmıştır.
Teşekkürler
Yazarlar, önceki ilgili çalışmalara dair görüşleri için R. Ted Jeo'ya teşekkür ederler. Görüntülerin yayın için hazırlanmasında mikroskop görüntüleme ve analiz yazılımlarına erişim sağladığı için University of Minnesota - Twin Cities bünyesindeki University Imaging Center'a teşekkür ederiz. Bu çalışma, Amerika Birleşik Devletleri Tarım Bakanlığı – Tarımsal Araştırma Servisi [062-21500-001-000D] ve yardım dışı iş birliği anlaşması (No. 58-5062-2-016) tarafından desteklenmiştir.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Alüminyum folyo | Yürüyüş yolu | 7106BW | 18 inç × 1.000 ft; ışığa duyarlı boyama çözeltilerini ışıktan korumak için kullanılır |
| Kalsiyum klorür dihidrat, min. %99 | Sigma Life Science | C7902-500G | CAS No. 10035-04-8; McDougall için reaktif’s tamponu |
| Kamera yazılımı | Nikon | NIS-Elements AR 5.42.04 | görüntüleme ve analiz için kullanılan 64-bit görüntüleme yazılımı |
| Karbondioksit gazı | Matheson | UN1013 | Kullanım sınıfı; hazırlama ve inkübasyon sırasında anoksik koşulların korunması için kullanılır |
| Sirkülasyonlu su banyosu | Hassasiyet | — | Numuneleri şu sıcaklıkta tutmak için kullanılan sıcaklık kontrollü sirkülasyonlu su banyosu 39 °C |
| Mısır sapı standardı | Minnesota Üniversitesi | Sisteme giriş yapılamadı. | ABD'nin Minnesota eyaletinin St. Paul şehrinde 2023 sonbaharında hasat edilmiştir; 1 mm boyutunda öğütülmüş ve mikrobiyal substrat olarak kullanılmıştır |
| Lamelli cam | Thermo Scientific | 3419 | 24 mm × 30 mm, No. 1.5 kalınlık, 1 oz |
| FX geniş formatlı CMOS görüntü sensörlü Digital Sight 10 renkli mikroskop kamerası | Nikon | MQA20000 | Aydınlık alan mikroskobik görüntüleri elde etmek için kullanılan dijital renkli kamera |
| Diseksiyon mikroskobu | Nikon | SMZ18 | Kök enine kesitlerini yönlendirmek ve konumlandırmak için kullanılan stereo mikroskop |
| Çift taraflı bant | SelloTape Office Vinil Çift Taraflı Bant | 4270 | 2 mm × 53 m; gövde enine kesitlerini lamlara sabitlemek için kullanılır |
| Elektronik terazi | VE | GH-202 | Dört ondalık basamak okunabilirliğe sahip analitik terazi |
| Erlenmeyer flask (125 mL) | Kimax | 25600 | 125 mL balon joje; 5 numara tıpa ile uyumlu |
| Erlenmeyer flask (25 mL) | Pyrex | 4980 | 25 mL balon joje; 0 numara tıpa ile uyumlu |
| Etanol (%100) | Fisher Scientific | 04-355-720 | Boyama çözeltilerinin hazırlanmasında ve boyama öncesi durulama işlemlerinde kullanılan absolut etanol |
| Ekstrüde polistiren sert köpük yalıtım | Owens Corning | 1407788 | 1 inç × 2 ft × 2 ft, R-5, 15 PSI köpük levha; kesit alma işlemi sırasında gövde boğumaralarını desteklemek için kullanılır |
| Pensler | Fisher Scientific | 10-316A | Kök segmentlerinin, lamların ve monte edilmiş kesitlerin taşınmasında kullanılan laboratuvar pensleri |
| Lam camları | FisherBrand | 125503 | 25 mm × 75 mm × 1 mm; gövde enine kesitlerinin montajı için kullanılır |
| Balon joje (6 L) | Pyrex | CLS43205L-4EA | Daha büyük çözelti hacimlerinin hazırlanmasında veya taşınmasında kullanılan 6 L'lik cam balon |
| Gliserin, laboratuvar tipi sıvı | Fisher Bilim Eğitimi | 525342C | CAS No. 56-81-5; kapatma ve saklama çözeltilerinde kullanılan gliserol |
| 50 numara çift katlı tülbent | JINIOHEE Mağazası | B0FL27KXRN | %100 pamuk, beyazlatılmış; rumen materyali ve rumen sıvısını filtrelemek için kullanılır |
| Mezur (10 mL) | Pyrex | 700024 | Sıvı hacimlerini ölçmek için kullanılan 10 mL'lik dereceli silindir |
| Hidroklorik asit | Fisher | A1445-500 | CAS No. 7647-01-0; Wiesner boyası hazırlamak için floroglusinol ile birlikte kullanılır |
| Endüstriyel süper kalıcı markör | Sharpie | 13601 | İnce uç; inkübasyon tüplerini suya dayanıklı işaretlerle etiketlemek için kullanılır |
| L-sistein hidroklorür hidrat | Sigma-Aldrich | C121800-10G | CAS No. 345909-32-2; inkübasyon solüsyonunun hazırlanmasında kullanılan indirgeyici ajan |
| Düşük havlı mendil | Kimberly-Clark | 34155 | 4,5 inç × 8,5 inç; lif bırakmadan lamların üzerindeki fazla sıvıyı emmek için kullanılır |
| Düşük profilli mikrotom bıçağı | Leica 819 | 63065-LP | Uniform gövde kesitlerinin hazırlanmasında kullanılan düşük profilli yedek bıçak |
| Magnezyum sülfat heptahidrat | Fisher Chemical | M80-500 | CAS No. 10034-99-8; McDougall için reaktif’S tamponu |
| Manyetik karıştırma çubuğu | Fisher Scientific | 03-411-783 | 76 mm × 12 mm; tampon çözeltinin ve inokülasyon çözeltilerinin karıştırılmasında kullanılır |
| Posta adresi etiketleri | Avery | 5167 | 1/2 inç × 1 3/4 in; numune ve lam tanımlaması için kullanılır |
| Boya fırçası | Loew-Cornell | — | 7000 Serisi, No. 3 yuvarlak; gövde enine kesitlerini aktarmak ve manipüle etmek için kullanılan ince fırça |
| Kapaklı Petri kapları | Becton Dickinson Laboratuvar Gereçleri | 81731119 | 60 mm × 15 mm; gövde enine kesitlerinin ultrapure su içerisinde geçici olarak saklanmasında kullanılır |
| Floroglusinol, 1,3,5-trihidroksibenzen | Sigma-Aldrich | P3502-25G | CAS No. 108-73-6; Wiesner boyasını hazırlamak için kullanılan reaktif |
| Pipet (100 μL) | Gilson | P 1000; 767547M | Boyama solüsyonlarını dağıtmak için kullanılan ayarlanabilir hacimli pipet |
| Plastik kullanım amaçlı huni | Nalgene | 10-437-23E | 150 mm; reaktif transferinde ve filtrasyonda kullanılır |
| Polipropilen beher (4 L) | Nalgene | 1201-4000 | İnokülasyon çözeltilerinin hazırlanması ve karıştırılması için kullanılan 4 L kimyasallara dayanıklı beher |
| Potasyum klorür | Fisher Chemical | P217-500 | CAS No. 7447-40-7; McDougall için reaktif’s tamponu |
| Jiletler | Persona | 66-0089 | 0,009 kalınlığında; gövde materyalinin manuel olarak kırpılması için kullanılır |
| Rutenyum kırmızısı, amonyaklı rutenyum oksiklorür | Sigma | R-2751 | CAS No. 11103-72-3; pektik maddelerin görüntülenmesi için kullanılan histolojik boya |
| Makaslar | Fiskars | 1063071 | Bant, köpük ve diğer sarf malzemelerini kesmek için kullanılan genel amaçlı makaslar |
| Vidalı kapaklı konik santrifüj tüpleri (50 mL) | Corning | 430828 | Polipropilen, pirojenik olmayan; numune tutma, inkübasyon, durulama ve saklama için kullanılır |
| Sledge mikrotom | Leica | 2000R | Hazırlamak için kullanılan kaydırmalı/kızaklı mikrotom 100 μm-kalın gövde kesitleri |
| Sodyum bikarbonat, ACS kalite | Fisher Chemical | S233-3 | CAS No. 144-55-8; McDougall için reaktif’s tamponu |
| Sodyum klorür | Fisher Chemical | — | CAS No. 7647-14-5; McDougall için reaktif’s tamponu |
| Sodyum hidroksit | Fisher Chemical | S318-500 | CAS No. 1310-73-2; indirgeyici çözeltinin hazırlanmasında kullanılır |
| susuz dibazik sodyum fosfat (Na2HPO4) | Sigma Aldrich | S-9763 | CAS 7558-79-4 |
| Sodyum sülfit anhidrat, ACS, min. %98,0 | Oakwood Chemicals | 245960 | CAS No. 1313-84-4; inkübasyon solüsyonunun hazırlanmasında kullanılan indirgeyici ajan |
| Spoonula laboratuvar kaşığı | Fisher Scientific | 14-375-10 | Toz reaktiflerin aktarımı için kullanılan laboratuvar spatülü |
| Manyetik karıştırıcı | Sybron tarafından üretilen Thermolyne | 7200 | Tampon ve inokülasyon çözeltilerini karıştırmak için kullanılan manyetik karıştırıcı |
| Geniş uçlu iğneye sahip şırınga (60 mL) | Monoject | 935401028 | İnokülasyon solüsyonunu dağıtmak için kullanılan geniş lümenli iğneye sahip 60 mL'lik şırınga |
| Deney tüpü rafları | Thermo Scientific | 14-809-44 | 50 mL'lik inkübasyon tüplerini organize etmek ve desteklemek için kullanılan raflar |
| Termometre | FisherBrand | 13201663 | Çözelti ve su banyosu sıcaklığını doğrulamak için kullanılan laboratuvar termometresi |
| Dik mikroskop | Nikon | Eclipse Ni | Boyanmış gövde enine kesitlerinin görselleştirilmesi ve görüntülenmesi için kullanılan dik parlak alan mikroskobu |
| Yardımcı pompa | Little Giant Pump Co. | 502203 | Model 2E-38N; 115 VAC, 60 Hz, 1,7 A; suyu sirküle etmek ve banyo sıcaklığını sabit tutmak için kullanılır |
| Tartım kağıdı | VWR Bilimsel Ürünleri | 12578-165 | Katı reaktiflerin ve mısır sapı substratının tartılması ve aktarılmasında kullanılan tek kullanımlık tartım kağıdı |
Kaynaklar
- Cosgrove DJ. Growth of the plant cell wall. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 2005;6(11):850-861.
- Moore KJ, Jung H-JG. Lignin and fiber digestion. Journal of Range Management. 2001;54(4):420-430.
- Barros J, Serk H, Granlund I, Pesquet E. The cell biology of lignification in higher plants. Annals of Botany. 2015;115(7):1053-1074.
- Jung HG, Engels FM. Alfalfa stem tissues: cell wall deposition, composition, and degradability. Crop Science. 2002;42(2):524-534.
- Jung HG, Lamb JFS. Stem morphological and cell wall traits associated with divergent in vitro neutral detergent fiber digestibility in alfalfa clones. Crop Science. 2006;46(5):2054-2061.
- Engels FM, Jung HG. Alfalfa stem tissues: cell-wall development and lignification. Annals of Botany. 1998;82(5):561-568.
- Akin DE. Section to slide technique for study of forage anatomy and digestion. Crop Science. 1982;22(2):444-446.
- Jung HG, Deetz DA. Cell wall lignification and degradability. In: Jung HG, Buxton DR, Hatfield RD, Ralph J, eds. Forage Cell Wall Structure and Digestibility. American Society of Agronomy, Crop Science Society of America, Soil Science Society of America; Madison, WI; 1993:315-346.
- Blaschek L, et al. Cellular and genetic regulation of coniferaldehyde incorporation in lignin of herbaceous and woody plants by quantitative Wiesner staining. Frontiers in Plant Science. 2020;11:109.
- Blaschek L, et al. Different combinations of laccase paralogs nonredundantly control the amount and composition of lignin in specific cell types and cell wall layers in Arabidopsis. The Plant Cell. 2023;35(2):889-909.
- Nevins DJ. Analysis of forage cell wall polysaccharides. In: Jung HG, Buxton DR, Hatfield RD, Ralph J, eds. Forage Cell Wall Structure and Digestibility. American Society of Agronomy, Crop Science Society of America, Soil Science Society of America; Madison, WI; 1993:105-132.
- Xu Z, Heuschele DJ, Lamb JFS, Jung H-JG, Samac DA. Improved forage quality in alfalfa (Medicago sativa L.) via selection for increased stem fiber digestibility. Agronomy. 2023;13(3):770.
- Pradhan Mitra P, Loqué D. Histochemical staining of Arabidopsis thaliana secondary cell wall elements. Journal of Visualized Experiments. 2014;(87):51381.
- De Micco V, Aronne G. Combined histochemistry and autofluorescence for identifying lignin distribution in cell walls. Biotechnic & Histochemistry. 2007;82(4–5):209-216.
- Kraus JE, et al. Astra Blue and Basic Fuchsin double staining of plant materials. Biotechnic & Histochemistry. 1998;73(5):235-243.
- Ursache R, Andersen TG, Marhavý P, Geldner N. A protocol for combining fluorescent proteins with histological stains for diverse cell wall components. The Plant Journal. 2018;93(2):399-412.
- Baldacci-Cresp F, et al. A rapid and quantitative safranin-based fluorescent microscopy method to evaluate cell wall lignification. The Plant Journal. 2020;102(5):1074-1089.
- Casero PJ, Knox JP. The monoclonal antibody JIM5 indicates patterns of pectin deposition in relation to pit fields at the plasma-membrane-face of tomato pericarp cell walls. Protoplasma. 1995;188(1-2):133-137.
- Pesquet E, Cesarino I, Kajita S, Pawlowski K. Physiological roles of lignins – tuning cell wall hygroscopy and biomechanics. New Phytologist. 2025;248(6):2674-2706.
- Jung HG, Engels FM. Alfalfa stem tissues: rate and extent of cell-wall thinning during ruminal degradation. NJAS: Wageningen Journal of Life Sciences. 2001;49(1):3-13.
- Yeung EC. A beginner’s guide to the study of plant structure. Tested Studies for Laboratory Teaching. 1998;19:125-142.
- Jensen, W.A. Botanical Histochemistry: Principles and Practice. Freeman W.H. & Co. San Francisco, CA. (1962).
- Ruzin, SE. Plant Microtechnique and Microscopy. Oxford University Press; New York, NY; 1999.
- Gronwald JW, Bucciarelli B. Comparison of stem morphology and anatomy of two alfalfa clonal lines exhibiting divergent cell wall composition. Journal of the Science of Food and Agriculture. 2013;93(11):2858-2863.
- Dai R, et al. Overexpression MsJAR1 gene increased lateral branches and plant height in alfalfa (Medicago sativa L.). Scientific Reports. 2025;15(1):16956.
Yeniden basım ve izinler
Bu makale yayımlandı
Video yakında