Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Manyetik Parçacık İşlemcisi Kullanılarak İnsan Dışkı Örneği Toplama ve Otomatik Deoksiribonükleik Asit Ekstraksiyonu için Standartlaştırılmış İş Akışı

252 görüntülenme

⸱

11 Eylül 2026

 ,  ,  ,  , 
1Gut Microbiome Division, SKAN Research Trust, 2Stem Cells Division, SKAN Research Trust

Bu makalede

Özet

Bu protokolün amacı, insan dışkı örneği toplamanın ve manyetik partikül işlemcisi kullanılarak otomatik deoksiribonükleik asit ekstraksiyonunun standartlaştırılmasıdır.

Özet

Bağırsak mikrobiyomu dizileme, sağlıklı ve hastalıklı durumlarda mikrobiyal topluluk dinamiklerini araştırmak için önemli bir yaklaşım haline gelmiştir. Mikrobiyal kompozisyondaki değişiklikler; diyabet, lösemi ve nörodejeneratif hastalıklar dahil olmak üzere yaşam tarzı ve yaşla ilişkili çeşitli bozukluklarla ilişkilendirilmiştir. Farklı mikroorganizmalar farklı fizyolojik özellikler ve çevresel gereksinimler sergilediğinden, numune bütünlüğünü korumak ve teknik değişkenliği minimize etmek için standartlaştırılmış dışkı numunesi toplama, taşıma ve işleme işlemleri esastır. Pre-analitik hazırlama ve deoksiribonükleik asit (DNA) ekstraksiyonu sırasında meydana gelen varyasyonlar, sonraki mikrobiyom analizlerini etkileyebilir ve veri yorumlamasını değiştirebilir. Bu protokolün amacı, MagMAX Microbiome Ultra Nucleic Acid Isolation Kit (nükleik asit ekstraksiyon kiti) ve KingFisher Flex System (otomatik manyetik partikül işlemcisi) kullanılarak insan dışkı numunesi toplama ve otomatik DNA ekstraksiyonu için standartlaştırılmış bir iş akışı sağlamaktır. İş akışı, manuel değişkenliği azaltmak ve prosedürel tutarlılığı artırmak için kontrollü numune yönetimini otomatik nükleik asit ekstraksiyonu ile entegre eder. Protokol; standartlaştırılmış dışkı numunesi toplama, saklama, hazırlama, otomatik ekstraksiyon ve karmaşık dışkı matrislerinden nükleik asit geri kazanımını içerir. Temsili sonuçlar, 16S ribozomal ribonükleik asit (rRNA) gen dizileme ve shotgun metagenomik dizileme dahil olmak üzere sonraki uygulamalar için uygun DNA'nın başarıyla geri kazanıldığını göstermektedir. Standartlaştırılmış iş akışı, tekrarlanabilir numune işlemeyi destekler, mikrobiyom çalışmaları için ölçeklenebilirliği kolaylaştırır ve deneyler arasında daha fazla tutarlılığı teşvik eder. Görsel gösterim, bağırsak mikrobiyomu araştırmaları için standartlaştırılmış dışkı numunesi işleme ve otomatik nükleik asit ekstraksiyonunun uygulanmasına yönelik pratik rehberlik sağlar.

Giriş

Bağırsak mikrobiyomu; konakçı metabolizmasını, bağışıklığını ve nörolojik fonksiyonlarını etkileyen ve metabolik bozukluklar, Parkinson hastalığı, kanser ve nörodejenerasyon dahil olmak üzere çeşitli hastalıklarda giderek daha fazla rol oynadığı görülen karmaşık bir mikrobiyal ekosistemdir1,2. Metabolizma, bağışıklık fonksiyonu, besin emilimi ve patojenik mikroorganizmalara karşı direnci etkileyerek konakçı fizyolojisinin sürdürülmesinde önemli bir rol oynar3,4. Bu ilişkilerin mekanistik içgörülere ve klinik uygulamalara dönüştürülmesi için güvenilir ve tekrarlanabilir mikrobiyom ölçümleri esastır. Yeni nesil dizileme (NGS) teknolojilerindeki ilerlemeler, gastrointestinal kanalda yaşayan karmaşık mikrobiyal topluluklara dair anlayışımızda devrim yaratmıştır. Bununla birlikte; dışkı örneği toplama prosedürleri, saklama koşulları, taşıma, nakliye ve deoksiribonükleik asit (DNA) ekstraksiyon yöntemleri gibi analitik öncesi değişkenler, mikrobiyal topluluk yapısını, DNA verimini ve dizileme sonuçlarını seçici olarak değiştirebilir5,6. Bu tür metodolojik tutarsızlıklar genellikle çalışmalar arasındaki karşılaştırmaları karmaşıklaştırmaktadır.

Kritik pre-analitik adımlar arasında DNA ekstraksiyonu, mikrobiyom veri kalitesini belirleyen en etkili faktörlerden birini teşkil eder7,8. İdeal bir ekstraksiyon protokolü, çok sayıda örnek genelinde minimal kontaminasyon ile tutarlı bir şekilde yüksek kaliteli, yüksek moleküler ağırlıklı DNA üretmelidir. Otomatik nükleik asit ekstraksiyon platformları tekrarlanabilirliği artırabilir, manuel işlem hatalarını azaltabilir, kontaminasyon riskini düşürebilir ve işlem kapasitesini artırabilir. Bu otomatik ekstraksiyon platformlarının performansı; örnek homojenizasyonu, boncukla parçalama (bead-beating) koşulları, lizis kimyası, inkübasyon koşulları ve manyetik boncuk yönetimi dahil olmak üzere protokol parametrelerine önemli ölçüde bağlıdır9,10. Bu nedenle, standart dışkı örneği toplama ile otomatik DNA ekstraksiyonunu entegre eden standardize edilmiş bir iş akışı oluşturmak, güvenilir ve tekrarlanabilir mikrobiyom veri setleri üretmek için esastır.

Burada, yukarıda açıklanan nükleik asit ekstraksiyon kiti ve otomatik manyetik partikül işlemcisi kullanılarak insan dışkı örneği toplama, işleme ve otomatik DNA ekstraksiyonu için standartlaştırılmış bir iş akışı sunuyoruz. Protokol; kontrollü örnek işleme, etkili mekanik ve kimyasal lizis, inhibitörlerin uzaklaştırılması ve 16S ribozomal ribonükleik asit (rRNA) geni amplikon sekanslama, tüm genom sekanslama, kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) ve shotgun metagenomik sekanslama dahil olmak üzere alt uygulamalar için uygun kalite kontrol önlemlerini vurgulamaktadır. Görsel gösterim, tekrarlanabilir ve ölçeklenebilir bağırsak mikrobiyom araştırmalarını desteklemek amacıyla, standartlaştırılmış dışkı örneği işleme ve otomatik nükleik asit ekstraksiyonu için pratik rehberlik sağlamaktadır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Çalışma, SKAN Araştırma Vakfı Kurumsal Etik Kurulu yönergelerine uygun olarak yürütülmüş ve kurul tarafından onaylanmıştır (Onay No. SKAN/IEC/2025/04). Örnek toplama işleminden önce tüm katılımcılardan yazılı bilgilendirilmiş onam alınmıştır.

NOT: Tüm reaktifler, sarf malzemeleri ve ekipmanlar Malzeme Tablosu'nda listelenmiştir.

1. Dışkı örneği toplama kitini hazırlayın

  1. Steril bir dışkı yakalayıcı, spatulalı steril vidalı kapaklı bir toplama tüpü (30–50 mL kapasiteli), stabilizasyon tamponu ile önceden doldurulmuş bir toplama tüpü, tek kullanımlık eldivenler, emici malzeme, biyotehlike etiketli kapatılabilir bir taşıma çantası ve bir talimat formu içeren bir dışkı örneği toplama kiti hazırlayın (Şekil 1).
  2. Her bir toplama tüpünü, kalıcı bir kalem veya önceden basılmış bir etiket kullanarak benzersiz bir örnek tanımlayıcı, tarih ve toplama saati ile etiketleyin.
  3. Örnek toplama prosedürünü, uygulama önlemlerini, saklama koşullarını ve taşıma gerekliliklerini açıklayan bir talimat formu ekleyin.
    ​NOT: Stabilizasyon tamponu, dışkı toplama kitinin bir parçası olarak dışkı toplama tüpünün içinde önceden doldurulmuş olarak sağlanır. Üretici, stabilizasyon tamponunun bileşimini veya hacmini açıklamamaktadır. Üretici talimatlarına uygun olarak, yaklaşık 2–5 g dışkı materyalini doğrudan önceden doldurulmuş toplama tüpüne toplayın.

Eldivenler, tüp, biyotehlike torbası, yakalayıcı ve analiz için broşür içeren dışkı örneği toplama kiti.
Şekil 1. Dışkı örneği toplama kitinin bileşenleri. 
Dışkı örneği toplama kiti; tek kullanımlık eldivenler, steril bir dışkı yakalayıcı, spatulası bulunan vidalı kapaklı steril bir dışkı toplama tüpü, biyotehlike etiketli sızdırmaz bir taşıma torbası ve katılımcılara dışkı örneğinin toplanması, işlenmesi, saklanması ve taşınması için verilen bir talimat broşüründen oluşmaktadır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

2. Katılımcıyı örnek toplamaya hazırlayın

  1. Katılımcıya, örnek toplama işleminden önce ellerini yıkaması gerektiğini söyleyin.
  2. Dışkı örneğinin idrarla kontamine olmasını önlemek için, katılımcıya dışkılama öncesinde mesanesini boşaltması gerektiğini söyleyin.

3. Dışkı toplayıcı kullanarak dışkı örneğini toplayın

  1. Dışkı örneğinin tuvalet suyuyla temasını önlemek için klozet kapağına steril bir dışkı toplama aparatı yerleştirin.
  2. Yapışkanlı dışkı toplama aparatları için, cihazı yırtmadan belirtilen kenarlar boyunca dikkatlice açın. Dışkı toplama aparatı ile birlikte verilen üretici talimatlarını izleyin ve sabit bir toplama yüzeyi oluşturmak için cihazı klozet kapağının arka kısmına güvenli bir şekilde sabitleyin.
  3. Yapışkansız dışkı toplama aparatları için, stabil bir destek sağlamak amacıyla cihazı üretici talimatlarına göre klozet kasesinin üzerine yerleştirin.
  4. Örnek toplama sırasında dışkı toplama aparatının tuvalet suyuyla temas etmediğinden emin olun.
  5. Katılımcıya, dışkılama işlemini doğrudan dışkı toplama aparatının üzerine yapması talimatını verin.
  6. Örnekle çalışmaya başlamadan önce toplama kitinde bulunan tek kullanımlık eldivenleri giyin.
  7. Steril toplama tüpünü açın ve ekli spatulayı kullanarak dışkının dış yüzeyi ve iç çekirdeği dahil olmak üzere en az dört ila beş farklı bölgesinden dışkı materyali toplayın. Bu yaklaşım genellikle DNA ekstraksiyonu için yeterli olan yaklaşık 2–5 g dışkı materyali sağlar.
  8. Dışkı toplama aparatının kenarlarıyla veya herhangi bir dış yüzeyle temas etmiş dışkı materyallerini toplamaktan kaçının.
  9. Örnek toplama işleminin hemen ardından toplama tüpünü güvenli bir şekilde kapatın.
  10. Kapalı toplama tüpünü, örnek homojen bir şekilde süspande olana ve büyük topaklar kalmayana kadar manuel olarak şiddetle sallayarak, dışkı örneğini stabilizasyon tamponu ile iyice karıştırın.
  11. Mühürlenmiş toplama tüpünü, emici malzeme içeren, sızdırmaz ve biyotehlike etiketli taşıma çantasına yerleştirin.
  12. İçeriğin dökülmediğinden emin olarak, dışkı toplama aparatını dışkı ile birlikte dikkatlice tuvalete bırakın. Dışkı toplama aparatını ve dışkıyı birlikte bertaraf etmek için sifonu çekin.

4. Fekal örneklerin saklanması ve taşınması

  1. Numuneleri, kullanılan stabilizasyon tamponunun özelliklerine göre saklayın.
  2. Stabilizasyon tamponu ortam sıcaklığında korumayı destekliyorsa, numuneleri oda sıcaklığında saklayın. Alternatif olarak, kısa süreli saklama (≤24–48 h) için numuneleri 4°C'de veya uzun süreli saklama için −20°C ila −80°C'de saklayın.
  3. Numuneleri üreticinin önerilerine uygun olarak saklayın. Bu çalışmada kullanılan stabilizasyon tamponu ile toplanan numuneler, oda sıcaklığında 2 yıla kadar stabildir.
  4. Sızıntı ve kontaminasyonu önlemek için numuneleri, emici materyal içeren sızdırmaz biyotehlike torbalarında taşıyın.
  5. Taşıma sırasında numuneleri önerilen sıcaklık koşullarında tutun. Gerektiğinde yalıtımlı kaplar ve soğutucu elementler kullanın.
  6. Biyolojik örneklerin taşınmasıyla ilgili kurumsal biyogüvenlik kılavuzlarına ve geçerli yerel düzenlemelere uyulduğundan emin olun.

5. Numunelerin teslim alınması ve kaydedilmesi

  1. Laboratuvara ulaştığında her bir numuneyi uygun etiketleme, tüp bütünlüğü ve sızıntı kanıtı açısından inceleyin.
  2. Gerekliyse laboratuvara özgü bir tanımlayıcı atayın ve toplama tarihini, saatini, saklama koşullarını ve taşıma süresini kaydedin.
  3. Sızıntı gösteren, hatalı etiketlenmiş veya bütünlüğü bozulmuş numuneleri kapsam dışı bırakın.

6. Plakaları hazırlayın

NOT: Ekstraksiyon iş akışını başlatmadan önce tüm plakaları hazırlayın. Reaktifler ve biyolojik örneklerle ilgili tüm adımları; laboratuvar önlüğü, eldiven ve göz koruması dahil olmak üzere uygun kişisel koruyucu ekipmanlar kullanarak temiz bir ortamda gerçekleştirin. Şekil 2 otomatik manyetik partikül işlemcisini gösterir (Şekil 2A), plaka yükleme konumları (Şekil 2B), derin kuyucuklu plaka adaptörü (Şekil 2C), plaka uyumlu santrifüj (Şekil 2D), boncuklu homogenizatör (Şekil 2E), yastıklama desteği (Şekil 2F), plaka tutucu (Şekil 2G), 96 kuyucuklu boncuk plakası (Şekil 2H), derin kuyucuklu plaka (Şekil 2I), ve Elüsyon Plakası (Şekil 2J).

Santrifüj ve doku parçalayıcı dahil olmak üzere, numune hazırlama ve analiz için laboratuvar ekipman kurulumu.
Şekil 2Otomatik fekal deoksiribonükleik asit (DNA) ekstraksiyonu için kullanılan ekipman ve sarf malzemeleri. 
(A) Otomatik manyetik partikül işlemcisi. (B) Otomatik manyetik partikül işlemcisi içindeki plaka yükleme konumu. (C) Santrifüj için derin kuyucuklu plaka adaptörü. (D) Plaka uyumlu santrifüj. (E) Boncuklu değirmen homogenizatörü. (F) Boncukla parçalama sırasında kullanılan sönümleme desteği. (G) Boncukla parçalama için derin kuyucuklu plaka tutucu (adaptör). (H) Nükleik asit ekstraksiyon kiti ile birlikte supplied edilen doksan altı kuyucuklu boncuk plakası. (I) Doksan altı kuyucuklu derin kuyucuklu plaka. (J) Doksan altı kuyucuklu elüsyon plakası. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

  1. Uç tarak plakasını paketinden çıkarın ve cihaz yüklemesi için hazır bulundurun.
  2. Nükleik asit ekstraksiyon kitiyle birlikte verilen elüsyon tamponundan 200 µL miktarını 96 kuyucuklu bir plakanın her bir kuyucuğuna ekleyerek Elüsyon Plakasını (Şekil 2J) hazırlayın. Kontaminasyonu önlemek için plakayı şeffaf yapışkan filmle kapatın. Plaka, otomatik manyetik partikül işlemcisine yüklenene kadar kapalı tutun. Plakayı Elüsyon Plakası olarak etiketleyin.
  3. Derin kuyucuklu bir plakanın her bir kuyucuğuna 1 mL %80 etanol ekleyerek 4 Numaralı Yıkama Plakasını hazırlayın. Buharlaşmayı ve kontaminasyonu önlemek için plakayı yapışkan filmle kapatın.
  4. Ayrı bir derin kuyucuklu plakanın her bir kuyucuğuna 1 mL taze hazırlanmış %80 etanol ekleyerek 3 Numaralı Yıkama Plakasını hazırlayın. Plakayı yapışkan filmle kapatın.
  5. Derin kuyucuklu bir plakanın her bir kuyucuğuna 1 mL yıkama tamponu ekleyerek 2 Numaralı Yıkama Plakasını hazırlayın. Plakayı yapışkan filmle kapatın.
  6. Derin kuyucuklu bir plakanın her bir kuyucuğuna 1 mL yıkama tamponu ekleyerek 1 Numaralı Yıkama Plakasını hazırlayın. Plakayı yapışkan filmle kapatın.

7. Otomatik manyetik partikül işlemcisini kurun

  1. Otomatik manyetik partikül işlemcisini açın. Doğru 96'lı derin kuyucuklu manyetik başlığın ve 96 kuyucuklu derin kuyucuk ısıtma bloğunun kurulu olduğunu doğrulayın.
  2. Numuneleri işlemeye başlamadan önce, temiz bir uç tarağı ve boş uyumlu bir kuyucuk plakası kullanarak uygun cihaz kontrol protokolünü (örneğin, Check_96dw_tip protokolünü) çalıştırın.
  3. Gerekli ekstraksiyon programının otomatik manyetik partikül işlemcisinde mevcut olduğunu onaylayın.
    NOT: Yanlış manyetik başlık veya ısıtma bloğunun kullanımı, nükleik asit verimini azaltabilir ve cihaza zarar verebilir.

8. Örnek lizini gerçekleştirin

  1. 96 kuyucuklu plaka içindeki her bir örneğin konumunu kaydetmek için bir plaka haritası hazırlayın.
  2. Boncukları her kuyucuğun dibinde toplamak için 96 kuyucuklu boncuk plakasını (Şekil 2H), plaka uyumlu bir santrifüj (Şekil 2D) ve adaptör (Şekil 2C) kullanarak 2.750 × g hızda 10 s boyunca santrifüjleyin.
    NOT: Bu adım, plaka sızdırmazlık bandı çıkarılırken boncuk kaybını önler.
  3. Plaka sızdırmazlık bandını, boncukları yerinden oynatmadan dikkatlice çıkarın.
  4. Boncuk plakasının her kuyucuğuna 800 µL liziz tamponu ekleyin.
  5. Pipetleme sırasında boncukları aspire etmemeye dikkat edin.
  6. Dondurulmuş dışkı örneklerini oda sıcaklığında tamamen çözülene kadar bekletin. Örnekleri homojen hale getirmek için nazikçe karıştırın ve hemen DNA ekstraksiyonuna geçin. DNA kalitesini ve verimini düşürebileceği için tekrarlanan dondurma-çözme döngülerinden kaçının.
    NOT: Taze örnekler için, örnek homojenizasyonunu sağlamak amacıyla stabilizasyon çözeltisi içeren her bir dışkı örneği tüpünü 5–10 s boyunca vorteksleyin.
  7. Homojenize edilmiş her bir örnekten 200 µL'yi boncuk plakasının ilgili kuyucuğuna aktarın.
  8. Örnekleri aktarmak için steril filtreli, geniş ağızlı (kesilmiş) pipet uçları takılmış tek kanallı bir pipet kullanın. Boncuk kaybını ve buna bağlı olarak DNA verimindeki azalmayı minimize etmek için tekrarlanan pipetlemeden kaçının.
  9. Tüm kuyucukların ve plaka kenarlarının tamamen kapatıldığından emin olarak plakayı yapışkanlı film ile güvenli bir şekilde mühürleyin.

9. Mekanik lizis gerçekleştirin (boncukla parçalama)

  1. Uygun plaka tutucu (Şekil 2G) ve yastıklama desteği (Şekil 2F) kullanarak, mühürlenmiş plakayı boncuklu homojenizatöre (Şekil 2E) sabitleyin.
  2. Örnek plakasının karşısına eşit ağırlıkta bir plaka yerleştirerek cihazı dengeleyin.
  3. Cihazı 30 Hz hızında 2 dk için ayarlayın ve çalışmayı başlatın.
  4. Çalışmanın kesintisiz olarak tamamlanmasını bekleyin.
  5. Çalışma sona erdiğinde, mühürlemedeki sızdırmazlığı bozmadan plakayı dikkatlice çıkarın.
    NOT: Boncukla parçalama işlemi sırasında plakanın zarar görmesini önlemek için yastıklama desteği kullanın.

10. Liz sonrası işlemleri gerçekleştirin

  1. Plakayı, dengeli bir konfigürasyon kullanarak oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 2,750 × g hızda santrifüjleyin.
  2. Her kuyucuktan 400 µL süpernatantı, Numune Plakası olarak adlandırılan yeni bir derin kuyucuklu plakaya dikkatlice aktarın.
  3. Bu adım sırasında herhangi bir boncuğun aktarılmamasına dikkat edin.
    NOT: Numune Plakası boncuk içermez ve ön santrifüjleme gerektirmez.
  4. İşleme hemen devam edilmeyecekse Numune Plakasını mühürleyin.
    NOT: Gerekirse, mühürlenmiş lizat plakasını gece boyunca 4°C'de saklayın. Alternatif olarak, mühürlenmiş Numune Plakasını 3 aya kadar −20°C'de saklayın. Daha ileri işlemlerden önce numuneleri oda sıcaklığında çözdürün.

11. Bağlama boncuğu karışımını hazırlayın

  1. Kullanımdan hemen önce, her örnek için 500 µL nükleik asit bağlama tamponu ile 20 µL manyetik boncuğu birleştirerek bağlama boncuğu karışımını hazırlayın. Homojen bir süspansiyon elde etmek için iyice karıştırın.
  2. Örnek sayısına göre gerekli toplam bağlama boncuğu karışımı hacmini hesaplayın.
  3. Tam bir 96 kuyucuklu plaka için, steril bir konik tüpe 48,00 mL nükleik asit bağlama tamponu ve 1,92 mL manyetik boncuk ekleyerek bağlama boncuğu karışımını hazırlayın. Toplam 49,92 mL (kuyucuk başına 520 µL) nihai hacim elde edecek şekilde iyice karıştırın.
    NOT: Pipetleme değişkenliklerini telafi etmek için bir veya iki ek kuyucuk için yeterli hacim hazırlayın.
  4. Bağlama boncuğu süspansiyonunu homojen hale gelene kadar ters çevirerek nazikçe karıştırın.
  5. Bağlama boncuğu karışımını temiz bir reaktif rezervuarına aktarın.
  6. Boncukların çökmesini önlemek için, dağıtmadan hemen önce süspansiyonu üç ila dört kez yukarı-aşağı pipetleyerek manyetik boncukları yeniden süspanse edin.
  7. Çok kanallı bir pipet kullanarak, hazırlanan Örnek Plakasının her bir kuyucuğuna 520 µL bağlama boncuğu karışımı dağıtın.
  8. Çözeltinin viskozitesi nedeniyle yavaşça pipetleyin ve kabarcık oluşumundan kaçının. Tüm kuyucuklarda tekdüze boncuk dağılımını korumak için her dağıtım adımından önce reaktif rezervuarındaki bağlama boncuğu karışımını nazikçe yeniden süspanse edin.

12. MagMAX_Microbiome_Stool_Flex cihaz programını değiştirin (modifiye edilmiş ekstraksiyon programı)

  1. Üretici talimatlarına göre BindIt yazılımını (protokol düzenleme yazılımı) indirin ve kurun.
  2. Cihaz programını üreticinin web sitesinden indirin.
  3. Protokol düzenleme yazılımını başlatın ve başlatılmasını bekleyin.
  4. Aç'a tıklayın ve indirilen cihaz programını seçin.
  5. Protokol parametrelerini şuracda açıklandığı şekilde değiştirin Tablo 1.
  6. Düzenlenmiş protokolü kaydedin ve yazılımı kapatın.
  7. Bilgisayarı, bir USB veya RS-232C seri kablo kullanarak otomatik manyetik partikül işlemciye bağlayın.
    NOT: Bilgisayar bağlantısını kurmadan önce otomatik manyetik partikül işlemcisinin kapalı olduğundan emin olun.
  8. Otomatik manyetik partikül işlemcisini açın ve başlatma işleminin tamamlanmasını bekleyin.
  9. Protokol düzenleme yazılımını başlatın ve otomatik manyetik partikül işlemcisini algıladığını onaylayın.
  10. Modifiye edilmiş ekstraksiyon programını otomatik manyetik partikül işlemcisine aktarın.
  11. Modifiye edilmiş ekstraksiyon programının başarıyla aktarıldığını doğrulayın, ardından otomatik manyetik partikül işlemcisini kapatın.
AdımİşlemParametreler
1BağlanmaKarıştırın; 5 toplama döngüsü; 37°C
2Boncukları toplayın5 manyetik toplama döngüsü
3Yıkama 13 döngü boyunca 20 saniye boyunca karıştırın; 37°C
4Yıkama 220 saniye boyunca 3 döngü şeklinde karıştırın; 37°C
5Yıkama 320 saniye boyunca 2 döngü şeklinde karıştırın; 37°C
6Yıkama 4Karıştırın; 1 döngü; 37°C
7Kuru2 dakika boyunca havada kurutun
8Elüsyon75°C; 6 karıştırma döngüsü; ön ısıtma etkinleştirildi
9Boncukları toplayın3 manyetik toplama döngüsü
10Elüatı aktarınSaflaştırılmış nükleik asidi Elüsyon Plakasına aktarın

Tablo 1: Manyetik partikül işlemcisi için otomatik ekstraksiyon programı.
Deoksiribonükleik asit (DNA) ekstraksiyonu sırasında otomatik manyetik partikül işlemcisi tarafından yürütülen otomatik ekstraksiyon programının özeti. Program; nükleik asit bağlanması, manyetik boncuk toplanması, ardışık yıkama adımları, hava ile kurutma, elüsyon ve saflaştırılmış DNA'nın Elüsyon Plakasına aktarılmasını içerir. Her bir otomatik adım için çalışma parametreleri listelenmiştir.

13. Otomatik nükleik asit ekstraksiyonunu gerçekleştirin

  1. Ana güç kaynağını ve ardından cihazın güç düğmesini açarak otomatik manyetik partikül işlemcisini (Şekil 2A) çalıştırın. Sistemin başlatma işlemini tamamlamasını bekleyin.
  2. Cihaz kontrol panelini kullanarak modifiye edilmiş ekstraksiyon programını seçin ve çalışmayı başlatın.
  3. İstendiğinde, uç tarak plakasını 7. pozisyona yerleştirin ve devam etmek için Start düğmesine basın. Plaka yükleme pozisyonları için Şekil 2B'ye ve Tablo 2'ye bakın.
  4. Elüsyon Plakasının sızdırmazlık filmini çıkarın ve doğru yönlendirmeye dikkat ederek (A1 kuyucuğu belirlenen pozisyonla hizalı olacak şekilde) plakayı 6. pozisyona yerleştirin. Devam etmek için Start düğmesine basın.
  5. %80 etanol içeren Yıkama Plakası 4'ün sızdırmazlık filmini çıkarın, plakayı doğru yönlendirmeyle 5. pozisyona yerleştirin ve Start düğmesine basın.
  6. %80 etanol içeren Yıkama Plakası 3'ün sızdırmazlık filmini çıkarın, plakayı 4. pozisyona yerleştirin ve Start düğmesine basın.
  7. Yıkama Plakası 2'nin sızdırmazlık filmini çıkarın, plakayı 3. pozisyona yerleştirin ve Start düğmesine basın.
  8. Yıkama Plakası 1'in sızdırmazlık filmini çıkarın, plakayı 2. pozisyona yerleştirin ve Start düğmesine basın.
  9. İstendiğinde, doğru yönlendirmeye dikkat ederek Numune Plakasını 1. pozisyona yerleştirin.
  10. Cihaz kapağını kapatın ve otomatik ekstraksiyon işlemini başlatmak için Start düğmesine basın.
  11. Programın kesintisiz olarak tamamlanmasını bekleyin (yaklaşık 35–40 dk).
    NOT: Tablo 1, cihaz tarafından yürütülen otomatik ekstraksiyon programını özetlemektedir.
PlakaKonumPlaka tipiReaktifKuyu başına hacim
Numune Plakası196'lı derin kuyulu plakaNumune lizatı + bağlayıcı boncuk karışımı920 µL
Yıkama Plakası 1296'lı derin kuyulu plakaYıkama tamponu1,000 µL
Yıkama Plakası 2396'lı derin kuyulu plakaYıkama tamponu1,000 µL
Yıkama Plakası 3496'lı derin kuyulu plaka%80 etanol1,000 µL
Yıkama Plakası 4596'lı derin kuyulu plaka%80 etanol1,000 µL
Elüsyon Plakası696'lı plakaElüsyon tamponu200 µL
Uç Tarağı Plakası7Standart derin kuyulu plaka96'lı derin kuyulu uç tarağıN/A

Tablo 2: Otomatik nükleik asit ekstraksiyonu için plaka yükleme konfigürasyonu.
Manyetik partikül işlemcisi ile gerçekleştirilen otomatik DNA ekstraksiyonunda kullanılan plaka yükleme konumları, plaka türleri, reaktifler ve reaktif hacimleri. Örnek Plakası, örnek lizat ve bağlayıcı boncuk karışımını içerir. N/A, Pipet Ucu Tarağı Plakasına herhangi bir sıvı reaktif eklenmediğini belirtir.

​14. Nükleik asitleri elüe edin ve saklayın

  1. Çalışma tamamlandıktan sonra cihazı açın ve elüatların dökülmesini önlemek için Elüsyon Plakasını dikkatlice çıkarın.
    NOT: Elüsyon Plakasında gözle görülür manyetik boncuk taşınımı varsa, elüatları standart bir 96 kuyucuklu plakaya aktarın ve plakayı 5–10 dk boyunca manyetik bir standa yerleştirin. Berraklaşmış süpernatanı, çok kanallı bir pipet kullanarak yeni bir 96 kuyucuklu plakaya veya uygun şekilde etiketlenmiş tüplere aktarın.
  2. Elüye edilen DNA'yı uygun şekilde etiketlenmiş tüplere veya saklama plakalarına aktarın.
  3. Elüye edilen DNA'yı kısa süreli kullanım için 4°C'de, 6 aya kadar saklama için −20°C'de veya uzun süreli saklama için −80°C'de muhafaza edin.

15. Çalışma sonrası temizliği gerçekleştirin

  1. Kullanılmış tüm plakaları ve uç taraklarını otomatik manyetik partikül işlemcisinden çıkarın.
  2. Tüm sarf malzemelerini, kurumun biyogüvenlik ve kimyasal atık bertaraf kılavuzlarına uygun olarak imha edin.
  3. Olası dökülmeleri uygun bir laboratuvar dezenfektanı kullanarak temizleyin.
  4. Önce otomatik manyetik partikül işlemcisini, ardından ana güç kaynağını kapatın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Tanımlanan toplama iş akışı kullanılarak yedi katılımcıdan dışkı örnekleri başarıyla toplanmış; sonraki işlemler için yeterli kütleye ve uygun kıvama sahip numuneler elde edilmiştir. Örnekler, toplama işleminin ardından oda sıcaklığında saklanmıştır. Örneklerin çoğunluğu, uygun toplama ve saklama koşullarıyla uyumlu olarak homojen bir doku ve renk sergilerken, küçük bir alt grup, katılımcılar arasındaki biyolojik varyasyonu yansıtabilecek düşük düzeyde kıvam değişkenliği göstermiştir. Taşıma sırasında herhangi bir görünü...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Burada açıklanan protokol, mikrobiyom çalışmaları için insan dışkı örneği toplama ve otomatik DNA ekstraksiyonuna yönelik standartlaştırılmış bir iş akışı sunmaktadır. Kritik adımlar arasında, dışkının birden fazla bölgesinden temsili dışkı örneklemesi, stabilizasyon tamponu ile kapsamlı homojenizasyon, önerilen koşullar altında uygun saklama ve taşıma, etkili mekanik liz ve otomatik ekstraksiyon sırasında dikkatli işlem yapılması yer almaktadır. Bu adımlara tutarlı şekilde uyulması, teknik değişkenliği minimize eder ve ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar, herhangi bir finansal veya finansal olmayan çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.

Teşekkürler

Bu çalışmayı mümkün kılan kaynakları ve iş birlikçi ortamı sağladıkları için SKAN Research Trust (Hindistan) kuruluşuna şükranlarımızı sunarız. Ayrıca, olgu kontrolü ve editöryal destek konusundaki yardımları için Dr. Anushree Kogje'ye teşekkür ederiz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
%80 Etanol (absolüt etanolden hazırlanmış)MerckBu videoda, farklı ortam koşullarında hücrelerin canlılığını ve proliferasyonunu (çoğalmasını) değerlendirmek için kullanılan standart bir MTT deneyi protokolü sunulmaktadır. MTT deneyi, metabolik olarak aktif hücrelerin mitokondriyal dehydrogenaz enzimi aracılığıyla sarı renkli MTT tuzunu mor renkli formazan kristallerine indirgediği prensibine dayanan kolorimetrik bir yöntemdir. Bu yöntem, özellikle ilaç tarama çalışmalarında ve sitotoksisite testlerinde yaygın olarak kullanılmaktadır.Protokolde açıklandığı gibi, absolut etanol kullanılarak taze olarak hazırlayın.
Emici malzemeKimtech34256Taşıma çantasına dahildir.
Yapışkanlı plaka sızdırmazlık filmiApplied Biosystems4306311MicroAmp Şeffaf Yapışkan Film.
Otomatik manyetik partikül işlemcisi (96 derin kuyucuklu başlığa sahip KingFisher Flex Purification System)Thermo Fisher Scientific5400630Otomatik nükleik asit ekstraksiyon sistemi.
Biyotehlike etiketli, kapatılabilir taşıma torbasıZymo ResearchR1180Numune taşımacılığı için sızdırmaz taşıma çantası.
BindIt yazılımıThermo Fisher Scientific5189009Otomatik ekstraksiyon protokolünü değiştirmek ve aktarmak için kullanılan yazılım.
Spatulalı toplama tüpü (30–50 mL)Zymo ResearchR1180Steril vidalı kapaklı toplama tüpü.
Yastıklama desteğiQIAGEN69984TissueLyser Adaptör Seti (boncukla parçalama sırasında yastıklama desteği olarak kullanılır).
Derin kuyucuklu plaka (96 kuyucuklu)Thermo Fisher Scientific95040460KingFisher Derin Kuyucuklu 96'lı Plaka.
Tek kullanımlık eldivenlerZymo ResearchR1180Tozsuz olanı önerilir.
Elüsyon tamponuApplied BiosystemsA42357MagMAX Microbiome Ultra Nükleik Asit İzolasyon Kiti ile birlikte sağlanmıştır.
Dışkı yakalayıcıZymo ResearchR1180Steril toplama düzeneği.
Isıtma bloğu (96 kuyucuklu derin kuyucuklu)Thermo Fisher ScientificEnstrümanla birlikte sağlanmıştırKingFisher Flex Purifikasyon Sisteminin bileşeni.
Laboratuvar önlüğüYerel tedarikçiGiriş bulunmamaktadır.Kişisel koruyucu donanım.
Lizis tamponuApplied BiosystemsA42357MagMAX Microbiome Ultra Nucleic Acid Isolation Kiti ile birlikte tedarik edilmiştir.
Manyetik boncuklarApplied BiosystemsA42357MagMAX Microbiome Ultra Nukleik Asit İzolasyon Kiti ile birlikte sağlanmıştır.
Manyetik başlık (96 derin kuyucuklu)Thermo Fisher Scientific5400630 ile birlikte verilmiştirKingFisher Flex sistemi ile birlikte tedarik edilen doksan altı derin kuyucuklu manyetik başlık.
Manyetik stand (96 kuyucuklu)Thermo Fisher Scientific12332DYalnızca manyetik boncuk taşınması gözlemlenirse gereklidir.
Çok kanallı pipetEppendorf312500005296 kuyucuklu plakalarla uyumludur.
NanoDrop spektrofotometreThermo Fisher ScientificND-ONE-WA260/280 ve A260/230 oranlarının belirlenmesinde kullanılır.
Nükleik asit bağlama tamponuApplied BiosystemsA42357MagMAX Microbiome Ultra Nükleik Asit İzolasyon Kiti ile birlikte sağlanmıştır.
Kalıcı markörSharpie3002Alternatif olarak, önceden basılmış etiketler kullanın.
Pipet uçları, steril filtreli (10 µL)Tarsons528100Steril dereceli filtreli uçlar.
Pipet uçları, steril filtrelenmiş (200 µL)Tarsons528104Steril dereceli filtreli pipet uçları.
Pipet uçları, steril filtrelenmiş (1,000 µL)Tarsons529106Steril filtre uçları; protokolde belirtilen yerlerde geniş ağızlı uçlar hazırlamak için kesin.
Santrifüj için plaka adaptörüEppendorf5820710004Rotor A-2-DWP-AT derin kuyucuklu plaka adaptörü.
Plaka uyumlu santrifüjEppendorf5810Rotor A-2-DWP-AT adaptörü ile uyumludur.
Boncuklu parçalama işlemi için plaka tutucuQIAGEN69984TissueLyser Adaptör Seti 2 × 96.
Önceden basılmış etiketler (isteğe bağlı)BradyBBP12Kalıcı markör alternatifi.
Qubit dsDNA HS AnaliziThermo Fisher ScientificQ33231DNA kantifikasyonu için kullanılan florometrik analiz.
Qubit florometreThermo Fisher ScientificQ33327Florometrik DNA nicelendirmesi için kullanılan cihaz.
Reaktif haznesiThermo Fisher Scientific8093Matris Reaktif Rezervuarı.
Numune stabilizasyon tamponuZymo ResearchR1180DNA/RNA Shield Dışkı Toplama Kiti.
Steril konik tüpHiMediaTCP106HBağlama boncuğu karışımının hazırlanmasında kullanılır.
TissueLyser III boncuklu değirmen homojenizatörüQIAGEN9003240Mekanik lizis cihazı.
Tip tarak plakasıThermo Fisher Scientific97002534Derin kuyucuklu mıknatıslar için KingFisher 96 Uç Tarağı.
Yıkama tamponuApplied BiosystemsA42357MagMAX Microbiome Ultra Nucleic Asit İzolasyon Kiti ile birlikte sağlanmıştır.

Kaynaklar

  1. Joshi D, et al. Roles of human gut microbiota in metabolic, neurodegenerative, cardiovascular and gastrointestinal diseases. Discov Biotechnol. 2026;3(1):8. doi:10.1007/s44340-026-00053-2.
  2. Jin X, et al. Gut microbiota and Parkinson’s disease: exploring pathogenesis and potential therapeutic strategies from a gut-brain axis perspective. iScience. 2026;29(2):114185. doi:10.1016/j.isci.2025.114185.
  3. Hou K, et al. Microbiota in health and diseases. Signal Transduct Target Ther. 2022;7(1):135. doi:10.1038/s41392-022-00974-4.
  4. Valencia S, et al. Human gut microbiome: a connecting organ between nutrition, metabolism, and health. Int J Mol Sci. 2025;26(9):4112. doi:10.3390/ijms26094112.
  5. Panek M, et al. Methodology challenges in studying human gut microbiota: effects of collection, storage, DNA extraction and next-generation sequencing technologies. Sci Rep. 2018;8(1):5143. doi:10.1038/s41598-018-23296-4.
  6. Ece G, et al. Basic microbiome analysis: analytical steps from sampling to sequencing. Microorganisms. 2026;14(2):387. doi:10.3390/microorganisms14020387.
  7. Bharti R, Grimm DG. Current challenges and best-practice protocols for microbiome analysis. Brief Bioinform. 2021;22(1):178-193. doi:10.1093/bib/bbz155.
  8. Zoruk P, et al. Impact of DNA extraction techniques and sequencing approaches on microbial community profiling accuracy. Front Microbiomes. 2025;4:1688681. doi:10.3389/frmbi.2025.1688681.
  9. Wallinger C, et al. Evaluation of an automated protocol for efficient and reliable DNA extraction of dietary samples. Ecol Evol. 2017;7(16):6382-6389. doi:10.1002/ece3.3197.
  10. Kwa WT, Sim CK, Low A, Lee JWJ. A comparison of three automated nucleic acid extraction systems for human stool samples. Microorganisms. 2024;12(12):2417. doi:10.3390/microorganisms12122417.
  11. Demkina A, et al. Benchmarking DNA isolation methods for marine metagenomics. Sci Rep. 2023;13(1):22138. doi:10.1038/s41598-023-48804-z.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Daha fazla makale keşfet

DNA EkstraksiyonuBağırsak MikrobiyomuMikrobiyom SekanslamaNumune HazırlamaNükleik Asit Kazanımı16S rRNA SekanslamaShotgun MetagenomikNumune Saklama

Bu makale yayımlandı

Video yakında

Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.