Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Araştırma makalesi

Nazal ve Kan Konak Yanıt Modülleri için Solunum Virüsü Transkriptomlarının Kompartman Duyarlı Kıyaslaması: Hesaplamalı Bir Çalışma

85 görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/73334

⸱

18 Eylül 2026

 , 
1Comprehensive Rehabilitation Department, Beidahuang Industry Group General Hospital, 2Department of Pathology, First Affiliated Hospital of Harbin Medical University

Bu makalede

Özet

Bu hesaplamalı çalışma, halka açık solunum yolu virüsü transkriptomlarını karşılaştırmak için kompartman duyarlı bir iş akışı sunmakta; nazal ve kan konak yanıtlarının gen düzeyinde sınırlı bir uyum gösterdiğini, ancak bağımsız veri setleri, klinik karşılaştırmalar, boylamsal iyileşme ve sağlamlık analizleri genelinde tekrarlanabilir, biyolojik olarak yorumlanabilir kompartman spesifik modüller sağladığını kanıtlamaktadır.

Özet

Kamuya açık solunum yolu virüsü transkriptomları, konakçı yanıtlarını incelemek için değerlidir, ancak doku kaynağı, kontrol tanımı ve çalışma tasarımındaki farklılıklar havuzlanmış analizleri karıştırabilir. Nazal ve kan biyolojik bağlamını korurken, tekrarlanabilir konakçı yanıt aktivitesinin belirlenip belirlenemeyeceğini saptamak için kompartman duyarlı bir hesaplamalı iş akışı geliştirdik. Eşleştirilmiş GSE17827 pediatrik kohort; semptomatik picornavirus enfeksiyonu, semptomatik respiratory syncytial virus enfeksiyonu, asemptomatik picornavirus saptaması ve virüs-negatif kontrollerden alınan nazal sürüntü ve tam kan transkriptomlarını içeren çapa veri seti olarak kullanıldı. HUGO Gene Nomenclature Committee (HGNC) filtrelemesinin ardından 27.685 gen analiz edildi. En yüksek pozitif yanıtlardan yola çıkarak, ayrı 50 genli protein kodlayan nazal ve kan modülleri tanımlandı ve harici değerlendirme öncesinde sabitlendi. Gen düzeyindeki nazal ve kan etkileri neredeyse bağımsızdı (Pearson r = 0,015) ve modüller altı keşifsel sıra-çakışma geni paylaştı (Jaccard indeksi = 0,064). Buna rağmen, nazal modül, bağımsız üst solunum yolu kohortlarında enfeksiyonu kontrollerden ayırdı ve alıcı işletim karakteristik eğrisi altındaki alanlar (AUROC) 0,749, 0,693 ve 0,609 olarak belirlendi; kan modülü ise harici kan kohortlarında 0,832, 0,924 ve 0,870 AUROC değerlerine ulaştı. Boylamsal doğal enfeksiyon verilerinde, eşleştirilmiş skorlar akut hastalıktan taburculuğa kadar azaldı ve eşleştirilmiş deltalar nazal örnekler için 0,436, kan için ise 0,30 oldu. 66 harici örneği içeren üç ek kıyaslama veri setinin yanı sıra rastgele gen null değerleri, modül boyutu taramaları, bootstrap stabilitesi, marker-program korelasyonları ve varyans bölümlendirmesi, iş akışının sağlamlığını ve sınırlamalarını tanımladı. Pandya 3-messenger ribonucleic acid (mRNA) seti, viral-bakteriyel ayrım için daha güçlü kalırken, kan modülü bakteriyel pnömonide de artış gösterdi. Bu bulgular, kompartman spesifik modüllerin, evrensel pan-doku biyobelirteçleri veya bağımsız patojen sınıflandırıcılarından ziyade, kohort karşılaştırması ve iyileşme takibi için yeniden kullanılabilir konakçı yanıt aktivite skorları olduğunu desteklemektedir.

Giriş

Konak transkriptomik imzaları, enfeksiyöz sendromları sınıflandırmak ve farklı patojenler arasındaki immün yanıtları karşılaştırmak için yaygın olarak kullanılmaktadır1,2,3,4,5. Solunum yolu virüsleri sıklıkla örtüşen interferon-stimüle genleri (ISG'ler), inflamatuar mediyatörler ve antijen sunum yolaklarını aktive eder6,7,8,9,10. Güncel eşleştirilmiş ve boylamsal çalışmalar ayrıca, lokal hava yolu ve sistemik yanıtların zamanlama, hücresel kompozisyon ve büyüklük açısından farklılık gösterebildiğini kanıtlamaktadır1. Bu durum influenza, respiratuar sinsityal virüs (RSV), rhinovirus ve SARS-CoV-2'nin ötesine geçmektedir. İnsan metapneumovirüsü, solunum yolu hastalıklarının önemli bir nedeni olmaya devam etmektedir; ancak konak yanıtı ve müdahale literatürü hâlâ gelişme aşamasındadır12,13. Solunum yolu virüsü enfeksiyonlarındaki bu gözlemler, lokal hava yolu ve sistemik konak yanıtları arasındaki farkları daha da belirginleştirmektedir14. Hesaplamalı konak-virüs çalışmaları için pratik soru, dolayısıyla yalnızca bir yanıtın mevcut olup olmadığı değildir. Asıl soru, kamuya açık verilerin, doku bağlamını koruyan ve tekrarlanabilir konak yanıt skorları üreten şeffaf bir iş akışı aracılığıyla yeniden kullanılıp kullanılamayacağıdır.

Çoğu kamuya açık solunum yolu virüsü transkriptom veri seti, temiz çapraz virüs veya çapraz doku çıkarımları için tasarlanmamıştır. Doku kaynağı, zamanlama, şiddet, yaş, kontrol tanımı ve platform genellikle birlikte değişkenlik gösterir. Yüksek kapasiteli ekspresyon veri setleri ayrıca istenmeyen teknik ve çalışma düzeyindeki varyasyonlara karşı hassastır15,16. Bu nedenle, havuzlanmış bir analiz, kaynağını gizlerken güçlü bir interferon veya inflamatuar imza ortaya çıkarabilir. Nazal örnekler epitelyal ve mukozal immün biyolojiyi yakalarken, tam kan sistemik lökosit yanıtlarını yansıtır. Bu kompartmanların birbirinin yerine geçebilir olarak değerlendirilmesi, skorun hesaplanmasını kolaylaştırır ancak yorumlanmasını zorlaştırır.

Analizi, mevcut en büyük keşif koleksiyonu17 yerine, aynı çalışmaya ait eşleşmiş burun-kan kohortu olan GSE17827 üzerine kurduk. Kohort küçük olsa da, burun ve kan etki boyutları karşılaştırıldığında çalışmalar arası karıştırıcı etkileri azaltmaktadır. Kohort; semptomatik picornavirus enfeksiyonu, semptomatik RSV enfeksiyonu, asemptomatik picornavirus tespiti ve virüs negatif kontrolleri içermektedir. Bu nedenle, bu kohortu yalnızca ayrı kompartıman spesifik modüller için bir çapa olarak kullandık. Modül üyeliği, harici testlerden önce sabitlendi. Küçük kohort seçiminin stabilitesi; tabakalı bootstrap yeniden örnekleme, rastgele gen boş kümeleri ve modül boyutu duyarlılık analizleri ile incelendi.

Bakteriyel ve enfeksiyöz olmayan karşılaştırıcıların yer aldığı bir kıyaslama katmanı ekledik. GSE6390, viral, bakteriyel veya enfeksiyöz olmayan olarak etiketlenmiş tam kan akut solunum yolu hastalığı örneklerini içermektedir18. GSE4012 ise ağır toplum kaynaklı pnömoni, sistemik inflamatuar yanıt sendromu (SIRS) ve sağlıklı kontrolleri içermektedir19. Bu kohortlar, bir modülün genel konak yanıt aktivitesini mi yoksa patojen sınıfı spesifitesini mi yansıttığını test eder. GSE53543, ex vivo periferik kan mononükleer hücresi (PBMC) rinovirüs pertürbasyon kıyaslaması olarak ayrı analiz edilmiştir. Bu veri seti, kontrollü bir stimülasyon altında lökosit yanıt kapasitesini ölçer ancak doğal enfeksiyona eşdeğer değildir.

Yaklaşımımız kasıtlı olarak muhafazakardır. Heterojen kamuya açık verilerden evrensel bir antiviral imza kanıtlamaya çalışmıyoruz. Bunun yerine, kompartman duyarlı bir iş akışının, harici testlerden sonra da kullanışlı kalan modül skorları üretip üretemeyeceğini sorguluyoruz. Amaçlanan kullanım, Pandya 33-mRNA gibi tanısal sınıflayıcıları tamamlayıcı niteliktedir. Bu modüller; kohortlar, iyileşme süreci ve semptom gradyanları boyunca nazal ve kan konak yanıt aktivitesini skorlar. Patojen sınıfı atamak için tasarlanmamışlardır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Bu çalışma, kimliksizleştirilmiş ve halka açık verileri yeniden analiz etmiş olup herhangi bir yeni katılımcı alımı, müdahale veya örnek toplama içermemektedir. Bu nedenle, mevcut ikincil analiz için kurumsal etik onay ve yeni bilgilendirilmiş onam gerekmemiştir. Orijinal çalışmalar için etik onay ve bilgilendirilmiş onam, ilgili veri sağlayıcılar tarafından raporlanmıştır.

Çalışma tasarımı ve iş akışı mantığı
Gene Expression Omnibus20,21 veri tabanına kaydedilmiş veri setlerini kullanarak retrospektif bir kamu verisi biyoinformatik çalışması yürüttük. Yeni hasta örnekleri, hücre kültürü deneyleri, hayvan modelleri veya ıslak laboratuvar doğrulaması yapılmamıştır. İş akışında öncelikle çapa (anchor) odaklı bir tasarım kullanılmıştır. GSE17827; etki büyüklüğü kestirimi, modül oluşturma, bölmeler arası uyum ve semptom gradyanı analizi için kullanılmıştır. Bağımsız veri setleri, ancak modül üyeliği sabitlendikten sonra dahil edilmiştir. İş akışı; eşleşmiş bölme çapalamayı, HGNC eşleştirmeyi ve protein kodlayan filtrelemeyi, ayrı burun ve kan modül oluşturmayı, dokuyla eşleşmiş ve boylamsal doğrulamayı, klinik kıyaslamayı ve sağlamlık analizlerini kapsamıştır. Doğrulayıcı analizler, kilitlenmiş dokuyla eşleşmiş ve boylamsal testlerden oluşmuştur. Örtüşen gen, semptom gradyanı, markör programı ve varyans analizleri ise keşifsel veya tanımlayıcı nitelikteydi.

Çapa kohortu ve birincil karşılaştırma
GSE17827, 26 çocuktan alınan burun sürüntüsü ve tam kan ekspresyon profillerini içermektedir: 9 semptomatik pikornavir vakası, 5 asemptomatik pikornavir tespiti, 6 semptomatik RSV vakası ve 6 asemptomatik virüs-negatif kontrol17. İki RSV vakasında kan örneği bulunmamaktaydı. Bu nedenle, eksiksiz çapa tasarımı 50 örnek içermiş ve modül oluşturma aşamasından asemptomatik pikornavir tespitleri hariç tutulduktan sonra birincil enfekte-kontrol karşılaştırması 40 örnek içermiştir. Birincil karşılaştırma için, semptomatik pikornavir ve semptomatik RSV örnekleri enfekte, asemptomatik virüs-negatif örnekler ise kontrol olarak etiketlenmiştir. Asemptomatik pikornavir tespitleri, semptom olmaksızın viral tespitin biyolojik olarak virüs-negatif sağlık durumundan farklı olması nedeniyle kontrol olarak değerlendirilmemiştir. Bu örnekler modül oluşturma sürecinin dışında tutulmuş ve daha sonra bir semptom gradyanı analizi için kullanılmıştır.

Prob eşleştirme ve ön işleme
GSE117827, GPL23126 üzerinde profillendi. Transkript-küme tanımlayıcıları, GEO platformu GPL24539 aracılığıyla dağıtılan Clariom D Human na36, hg38 anotasyon dosyası kullanılarak gen sembolleri ile eşleştirildi. Yalnızca HGNC onaylı semboller tutuldu2. Kontrol probları, ERCC probları, eşleşmeyen transkript kümeleri ve onaylanmamış semboller çıkarıldı. Aynı onaylı sembolle eşleşen birden fazla transkript kümesi, medyan ekspresyon değerine göre birleştirildi. Filtreleme ve birleştirme işlemlerinden sonra, çapa analizi için 27.685 gen kullanıma hazır hale geldi. Ekspresyon matrisinin 95. persentili 50'yi aşarak logaritması alınmamış bir yoğunluk ölçeğine işaret ettiğinde log₂(x + 1) dönüşümü uygulandı. %20'den fazla eksik değeri olan genler çıkarıldı; geri kalan eksik değerler gen içi medyan ile dolduruldu. Ardından her gen, söz konusu veri setindeki tüm örnekler genelinde z = (x − ortalama)/örnek standart sapma (ddof = 1) şeklinde standardize edildi. Sıfır varyanslı genlere 0 standardize değeri atandı. Modül oluşturma, HGNC tam setinde protein kodlayan genler olarak sınıflandırılan girdilerle sınırlandırıldı.

Etki büyüklüğü analizi ve modül oluşturma
Nazal ve kan kompartmanları ayrı analiz edildi. Semptomatik viral örnekler, Hedges g standartlaştırılmış ortalama farklar ve iki yönlü Welch testleri kullanılarak virüs negatif kontrollerle karşılaştırıldı23. Hedges g, enfekte-eksi-kontrol ortalama farkının havuzlanmış standart sapmaya bölünmesi ve df = ninfected + ncontrol − 2 olmak üzere 1 − 3/(4df − 1) küçük örneklem düzeltmesi ile çarpılmasıyla hesaplandı. Welch testleri eşit olmayan varyanslarla uygulandı. Her kompartman içindeki test edilen tüm genler için Benjamini–Hochberg yanlış keşif oranları hesaplandı24. Küçük çapa kohortunda hiçbir protein kodlayan gen, önceden belirlenen FDR < 0.05 ve Hedges g > 0.8 şeklindeki katı kombinasyonu karşılamadığından, pozitif etkili genler önce artan iki yönlü Welch P değerine, ardından azalan Hedges g değerine göre sıralandı ve son belirleyici olarak gen sembolü kullanıldı. En üstteki 50 gen her bir birincil modülü oluşturdu. Elli gen, platformlar arası eksik gen kaybını sınırlarken biyolojik genişliği koruyan orta düzeyde bir modül boyutu olarak a priori seçildi. Bu modül boyutu dışsal AUROC'a göre ayarlanmadı. 10, 25, 50, 10 ve 200 gen kullanılarak yapılan sensitivite analizleri aynı kalitatif çapa ayrımı sonucunu verdi. Amaç, tek gen keşfi değil, modül düzeyinde tekrarlanabilirliktir.

Kompartmanlar arası uyum
Nazal ve kan Hedges g tahminleri gen bazında hizalandı ve Pearson ile Spearman korelasyonları kullanılarak karşılaştırıldı. İlk 50 nazal ve ilk 50 kan modülü arasındaki örtüşme, örtüşme sayısı ve Jaccard indeksi ile özetlendi. Örtüşen genler, doğrulanmış korunmuş biyobelirteçlerden ziyade keşifsel kompartmanlar arası sıra-örtüşme adayları olarak yorumlandı.

Harici doku-eşleşmeli doğrulama
Modül puanı doğrulaması, yorumlanabilir kaynak gruplarına sahip bağımsız halka açık veri setleri kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Üst solunum yolu doğrulaması, GSE41374 RSV nazal yıkama örneklerini ve SARS-CoV-2 veri setleri olan GSE152075 ile GSE156063'ü kapsamıştır. Kan doğrulaması ise GSE1710 ile ayrı normalize edilmiş iki GSE3890 birimini içermiştir: GPL1058 (36 örnek; 28 RSV ve 8 kontrol) ve GPL684 (138 örnek; 107 RSV ve 31 kontrol). Her harici veri seti için problar HGNC sembollerine eşlenmiş ve yinelenen semboller medyan ekspresyon ile birleştirilmiştir. Çapa veri seti için kullanılan dönüşüm, eksik değer filtreleme, medyan imputasyonu ve gen başına z-standardizasyon kuralları her veri setine ayrı uygulanmıştır. Modül puanı, temsil edilen modül genlerinin standardize edilmiş ekspresyon değerlerinin ağırlıklandırılmamış ortalaması olarak hesaplanmıştır. AUROC, ortalama hassasiyet ve Welch testi FDR'si, klinik tanısal performans tahminleri olarak değil, taşınabilirlik metrikleri olarak raporlanmıştır.

Geniş klinik kıyaslama ve ex vivo perturbasyon veri setleri
İki tam kan veri seti, keşif kohortları yerine klinik kıyaslamalar olarak kullanılmıştır. GSE6390'da örnekler, kaydedilen enfeksiyon durumu meta verilerine göre viral solunum yolu enfeksiyonu (n = 17), bakteriyel solunum yolu enfeksiyonu (n = 73) veya enfeksiyöz olmayan hastalık (n = 90) olarak atanmıştır; bu net etiketlerden herhangi birine sahip olmayan örnekler hariç tutulmuştur18. GSE4012'de ise kaydedilen tanı alanları influenza A pnömonisi (n = 39), influenza olmaksızın bakteriyel pnömoni (n = 61), pnömoni olmaksızın SIRS (n = 40), sağlıklı kontroller (n = 36) veya karışık bakteriyel/influenza pnömonisi (n = 14) olarak eşleştirilmiştir19. Karışık bakteriyel/influenza örnekleri tanımlanmış ancak ikili kıyaslama karşılaştırmalarından hariç tutulmuştur.

GSE53543, 98 bireyden alınan 196 ex vivo PBMC profili içermektedir. Her bireyden bir adet sadece besiyeri içeren örnek ve bir adet 24 sa boyunca rhinovirus 16'ya maruz bırakılmış örnek alınmıştır; denek tanımlayıcıları 98 eksiksiz çifti doğrulamıştır. AUROC bir sıra-ayırma metriği olduğundan, temel kıyaslama 98 stimüle edilmiş ve 98 stimüle edilmemiş örnek üzerinden raporlanan AUROC değerlerini içermektedir. Denek eşleşmeleri meta verilerde korunmuş ve skor farklarının eşleştirilmiş duyarlılık analizinde kullanılmıştır. Bu deney, doğal klinik enfeksiyondan ayrı olarak analiz edilmiş olup klinik tanı iddialarını desteklemek için kullanılmamıştır.

GSE6390, GSE4012 ve GSE53543 için ham GEO seri matrisleri indirildi. GSE6390 için GPL571, GSE4012 için GPL6947 ve GSE53543 için GPL1058 kullanıldı. Problar HGNC onaylı sembollerle eşleştirildi ve mükerrer eşleştirmeler medyan ekspresyon kullanılarak birleştirildi. Depolanmış normalize matrisler kullanıldı. Genel 95. persentil kuralı, log₂(x + 1) dönüşümünü yalnızca logaritmik olmayan ölçekteki matrisler için tetikledi. GSE53543, orijinal araştırmacılar tarafından halihazırda log₂-dönüştürülmüş, sıra-değişmez (rank-invariant) normalize edilmiş ve işlem gününe göre ayarlanmıştı, bu nedenle ek bir log dönüşümü uygulanmadı. Değerlerin %20'den fazlası eksik olan genler çıkarıldıktan ve geri kalan eksik değerler medyan ile doldurulduktan sonra, her bir gen kendi veri setindeki tüm örnekler arasında z-standardize edildi. Kıyaslama katmanı 470 klinik tam kan örneği ve 196 ex vivo PBMC örneği içeriyordu.

Referans imza kıyaslaması
Çapa nasal ve kan modülleri, ağırlıklandırılmamış üç referans setine göre kıyaslanmıştır. Resmi Pandya 3-mRNA seti, orijinal sınıflandırıcı raporunun Ek Tablo 1'inden aktarılmıştır5. Andres-Terre karşılaştırıcısı, rapor edilen çoklu-virüs imzasından derlenen 33 interferon odaklı genden oluşmaktadır3. Hallmark karşılaştırıcısı, MSigDB HALLMARK_INTERFERON_ALPHA_RESPONSE seti ile bağlantılı 3 genlik bir interferon-alfa çekirdek alt kümesini içermektedir25,26. Her üç referans seti için tam gen listeleri Ek Veri 1'de sunulmuştur. Bu referans skorları, orijinal ağırlıklı sınıflandırıcıları yeniden oluşturmamaktadır. Her veri seti için skor, mevcut gen başına z skorlarının ağırlıklandırılmamış ortalaması olarak hesaplanmıştır; en az üç temsil edilen genin bulunması şart koşulmuş ve temsil edilen gen sayısı rapor edilmiştir. Gerekli grupların mevcut olduğu durumlarda, kıyaslama karşıtlıkları viral ile bakteriyel, viral ile enfeksiyöz olmayan, viral ile bakteriyel veya enfeksiyöz olmayan, viral ile sağlıklı/kontrol ve bakteriyel ile sağlıklı/kontrol şeklinde belirlenmiştir. AUROC ve ortalama kesinlik, kıyaslama metrikleri olarak yorumlanmıştır. Welch-testi P değerleri, kıyaslama tablosundaki tüm geçerli veri seti-karşıtlık-modül kombinasyonları genelinde Benjamini–Hochberg prosedürü kullanılarak düzeltilmiştir.

Bağımsız boylamsal doğrulama
Eşleştirilmiş akut-taburculuk veri setleri GSE9741 ve GSE9742 yalnızca boylamsal doğrulama için kullanılmıştır27. Kaydedilen meta verilerde RSV tek enfeksiyon (RSVsi) veya rinovirüs (hRV) olarak etiketlenen örnekler birincil analizi oluşturmuştur; RSV ko-enfeksiyonları (RSVco) ise yalnızca ek çıktılarda tutulmuştur. Akut ve taburculuk etiketleri örnek başlıklarından ayrıştırılmıştır. Örnekler; veri seti, kompartıman, virüs grubu ve denek tanımlayıcısına göre eşleştirilmiş ve yalnızca her iki zaman noktasına sahip olan denekler tutulmuştur. Birincil birleştirilmiş grup, 38 RSVsi ve 30 hRV çiftinden (kompartıman başına 68 çift) oluşmuştur.

GSE9741 veya GSE97742 veri setleri; gen seçimi, modül iyileştirme veya eşik ayarı için kullanılmamıştır. Bu veri setleri harici doğrulama için ayrılmıştır. Prob tanımlayıcıları onaylı HGNC sembolleri ile eşleştirilmiş ve yinelenen semboller medyan ekspresyon kullanılarak birleştirilmiştir. Sabit GSE117827 modül skorları hesaplanmadan önce; aynı 95. persentil log-transformasyon kuralı, eksik değer filtresi, medyan imputasyonu ve veri seti içi gen başına z-standardizasyonu prosedürleri uygulanmıştır.

Her doku ve modül için, akut ve taburculuk skorları denek ve virüs grubuna göre eşleştirilmiştir. Her çift için akut eksi taburculuk farkı hesaplanmıştır. Cohen dz, ortalama eşleştirilmiş farkın örneklem standart sapmasına bölünmesiyle hesaplanmıştır. İki yönlü eşleştirilmiş t testleri ve iki yönlü Wilcoxon işaretli sıra testleri, akut ve taburculuk skorlarının ayrımı için AUROC değerleri ile birlikte raporlanmıştır. Benjamini–Hochberg FDR değerleri, tam boylamsal çıktıda yer alan 20 geçerli eşleştirilmiş t testinin tamamı üzerinden (iki veri seti, iki modül kaynağı ve önceden belirlenmiş beş virüs grubu özeti) hesaplanmıştır.

Semptom gradyanı ve post-hoc analizi
Modül üyeliği belirlendikten sonra, GSE17827'deki ayrılmış asemptomatik picornavirus tespitleri yalnızca semptom gradyan analizi için kullanılmıştır. Sıralı klinik skor; virüs negatif kontroller için 0, asemptomatik picornavirus tespitleri için 1 ve semptomatik enfeksiyonlar için 2 olarak belirlenmiştir. Sıralı trend Spearman korelasyonu ile, üç grup arasındaki genel farklar ise Kruskal–Wallis testi ile değerlendirilmiştir. Üç grup çiftini karşılaştırmak için iki yönlü Mann–Whitney U post-hoc testleri uygulanmıştır. Her bir kompartman içerisinde, üçlü ikili karşılaştırma ailesine ayrı Benjamini–Hochberg düzeltmesi uygulanmıştır.

Fonksiyonel zenginleştirme
Nazal ve kan modül genleri, MSigDB Hallmark 2020, Reactome 202 ve GO Biological Process 2023 kütüphaneleri kullanılarak gseapy aracılığıyla Enrichr ile analiz edildi25,26,28,29,30,31. Enrichr, Fisher'ın kesin testi tabanlı standart aşırı temsil çerçevesini kullandı. Kütüphane tarafından raporlanan Benjamini–Hochberg düzeltmeli P değerleri < 0.05 olanlar anlamlı kabul edildi. Sorgulanan üç kütüphane genelinde modül başına en anlamlı sekiz terim, düzeltilmiş P değerine göre sıralandı. Zenginleştirme sonuçları sadece yorumlama amacıyla kullanıldı.

Dayanıklılık, marker programı ve varyans analizleri
Dayanıklılık analizleri, sonuçların modül boyutuna veya şans eseri seçime bağlı olup olmadığını test etmiştir. 10, 25, 50, 100 ve 20 genlik modül boyutları değerlendirilmiştir. Rastgele gen nul analizi için uygun evren, işlenmiş GSE17827 matrisinde temsil edilen HGNC protein kodlayan genlerden oluşmuştur. NumPy 20260622 rastgele tohumu kullanılarak, yerine koymadan beş yüz adet 50 genlik set örneklenmiştir. Bootstrap yeniden seçimi, her kompartıman için orijinal çapa analizinde en yüksek sırada yer alan 1.00 pozitif etkili protein kodlayan genle sınırlandırılmıştır. Her yeniden örneklemede, pozitif protein kodlayan genler artan iki yönlü Welch P değerine ve ardından azalan ortalama farka göre sıralanmıştır. En üstteki 50 gen seçilmiştir. Gen stabilitesi, seçim sayısının 10'e bölünmesiyle hesaplanmıştır. Her kompartımanda en yüksek seçim frekansına sahip 20 gen gösterilmiştir.

Marker-program skorları, hücre fraksiyonu tahminlerinden ziyade tanımlayıcı yardımcılar olarak kullanılmıştır. Altı küratörlü program değerlendirilmiştir: epitel (EPCAM, KRT8, KRT18, KRT19, MUC1, KRT5, KRT14, SCGB1A1, FOXJ1), monosit/makrofaj (LYZ, LST1, S100A8, S10A9, FCGR3A, FCGR1A, CD14, MS4A7, CTSS), nötrofil (S10A8, S10A9, MPO, ELANE, CEACAM8, FCGR3B, OLFM4, MMP8), T/NK (CD3D, CD3E, TRAC, NKG7, GNLY, PRF1, GZMB, KLRD1, IL7R), B/plazma (MS4A1, CD79A, CD79B, MZB1, JCHAIN, IGHG1, SDC1) ve myeloid interferon (SIGLEC1, IFI27, IFI4L, ISG15, MX1, OAS1, RSAD2, IFIT3). Her bir program skoru, mevcut gen başına z skorlarının ortalaması olarak hesaplanmış ve en az üç temsilci genin bulunması şartı aranmıştır. Spearman P değerleri, veri seti-modül-program korelasyonlarının tüm ailesi genelinde Benjamini–Hochberg prosedürü kullanılarak düzeltilmiştir. Tek yönlü eta-kare, her bir modül-faktör çifti için gruplar arası kareler toplamının toplam kareler toplamına bölünmesiyle hesaplanmıştır. İlgili faktörün eksik olduğu satırlar bu hesaplamadan hariç tutulmuştur. Bu analiz tanımlayıcı nitelikte olup, karşılıklı korele faktörler için düzeltme yapılmamıştır.

Tekrarlanabilirlik
Tüm analizler, Materyal Tablosu'nda belirtilen yazılım paketleri ve versiyonları kullanılarak Python 3.12.13'te betik tabanlı iş akışları ile yürütülmüştür. Rastgeleleştirilmiş prosedürlerde 20260622 sabit tohum değeri kullanılmıştır. Genel GEO ekspresyon matrisleri; ham girişlerin, işlenmiş verilerin, istatistiksel çıktıların, tabloların ve şekillerin ayrıştırıldığı tutarlı bir proje yapısı kullanılarak işlenmiştir. Bağımsız doğrulamayı desteklemek amacıyla modül tanımlamaları, örnek kürasyon kayıtları, etki büyüklüğü tahminleri, doğrulama istatistikleri, zenginleştirme sonuçları, sağlamlık analizleri ve şekil kaynak verileri saklanmıştır. Analiz kodu, bağımlılık spesifikasyonları ve destekleyici türetilmiş veriler, Veri Erişilebilirliği beyanında açıklandığı şekilde mevcuttur.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Çapa-adım kıyaslaması, dokuya özgü gen etkilerini pan-doku gen etkilerinden ayırdı
Küratörlüğü yapılmış GSE117827 çapa matrisi 27.685 HGNC onaylı gen içeriyordu. Birincil nazal karşılaştırma 15 semptomatik enfekte ve 6 virüs negatif kontrol örneğini içerirken; kan karşılaştırması 13 semptomatik enfekte ve 6 kontrolü içeriyordu (Tablo 1). Bu küçük kohort stabil tek gen keşfini destekleyemeyeceği için, eşli kompartıman çapası olarak kullanıldı. Stabilite; bootstrap yeniden örnekleme, r...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Temel ders operasyoneldir: işlemlere en büyük havuzlanmış matrisle değil, örneklenen kompartmanla başlayın. GSE17827 küçüktür, ancak eşleştirilmiş tasarımı tek bir çalışma dahilinde doğrudan burun-kan karşılaştırmasına izin verir. Gen düzeyindeki etki korelasyonunun sıfıra yakın olması, havuzlanmış pan-doku sıralama listesinin önemli kompartman yapılarını gizleyeceğini göstermektedir. Bu nedenle, ayrı modüller daha savunulabilir bir tasarımdı. Modüllerin harici ve boylamsal performansı, evrensel bir gen listesini değil, ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar, bu çalışma ile ilgili herhangi bir finansal veya finansal olmayan çıkar çatışması beyan etmemektedirler.

Teşekkürler

Yazarlar, bu çalışmada yeniden analiz edilen halka açık GEO çalışmalarının araştırmacılarına ve katılımcılarına teşekkür eder. Yazarlık kriterlerini karşılayan başka kişi bulunmamaktadır. Bu araştırma; kamu, ticari veya kâr amacı gütmeyen sektörlerdeki herhangi bir finansman kuruluşundan özel bir hibe almamıştır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Andres-Terre çoklu virüs interferon uyarılı gen setiAndres-Terre ve ark.3 genli karşılaştırıcı; Ek Veri 1Bildirilen çoklu virüs imzasından derlenen, ağırlıklandırılmamış interferon odaklı karşılaştırıcı; gen listesinin tamamı Ek Veri 1'de sunulmuştur.
EnrichrMa'ayan LaboratuvarıErişim tarihi 18 Ağustos 2026; RRID:SCR_01575gseapy aracılığıyla erişilen gen seti aşırı temsil kaynağı.
Gen Ekspresyonu Omnibus'uUlusal Biyoteknoloji Bilgi MerkeziGEO; RRID:SCR_005012Analiz edilen veri setlerine erişmek için kullanılan halka açık transkriptom deposu.
Gen OntolojisiGen Ontolojisi KonsorsiyumuGO Biyolojik Süreç 2023; RRID:SCR_0281Enrichr aracılığıyla kullanılan fonksiyonel anotasyon kütüphanesi.
GPL1058NCBI GEOGPL1058GSE53543 için platform ve 36 örneklik GSE3890 doğrulama birimi.
GPL23126NCBI GEOGPL23126GSE17827 için ekspresyon platformu.
GPL24539NCBI GEOClariom_D_Human.na36.hg38.
probeset.csv		GSE17827 transkript-küme eşlemesi için Clariom D Human na36, hg38 anotasyonu kullanılmıştır.
GPL571NCBI GEOGPL571GSE6390'a platform anotasyonu uygulanmıştır.
GPL6884NCBI GEOGPL6884138 örnekli GSE3890 RSV tüm kan doğrulama birimi için platform.
GPL6947NCBI GEOGPL6947GSE40012'ye platform anotasyonu uygulanmıştır.
GSE17827NCBI GEOGSE17827Birincil eşleştirilmiş nazal sürüntü ve tam kan çapa veri seti.
GSE152075NCBI GEOGSE152075Harici SARS-CoV-2 üst solunum yolu doğrulama veri seti.
GSE156063NCBI GEOGSE156063Harici SARS-CoV-2 üst solunum yolu doğrulama veri seti.
GSE1710NCBI GEOGSE1710Harici SARS-CoV-2 tam kan doğrulama veri seti.
GSE3890NCBI GEOGSE3890; GPL10558 ve GPL684Ayrı ayrı normalize edilmiş 36 ve 138 örnekli platform birimleri olarak analiz edilen harici RSV tam kan doğrulaması.
GSE40012NCBI GEOGSE4012Klinik influenza A pnömonisi, bakteriyel pnömoni, SIRS ve sağlıklı kontrol referansı.
GSE41374NCBI GEOGSE41374Harici RSV nazal yıkama doğrulama veri seti.
GSE53543NCBI GEOGSE5354398 denek ve 196 örnek içeren, eşleştirilmiş ex vivo PBMC rhinovirus perturbasyon kıyaslaması.
GSE6390NCBI GEOGSE6390Klinik viral, bakteriyel ve enfeksiyöz olmayan tam kan referans örneği.
GSE97741NCBI GEOGSE97741Boylamsal tam kan akut durum ve taburculuk karşılaştırmalı doğrulama veri seti.
GSE9742NCBI GEOGSE97742Boylamsal nazofaringeal akut-veya-taburculuk doğrulama veri seti.
gseapygseapy geliştiricileriSürüm 1.3.1Enrichr'ı sorgulamak için kullanılan Python arayüzü.
HGNC gen sembolü kaynağıHUGO Gen Nomenklatür KomitesiErişim tarihi 18 Ağustos 2026; RRID:SCR_02827Onaylanmış gen sembolü normalleştirme ve protein kodlayan sınıflandırma kaynağı.
MatplotlibMatplotlib geliştirme ekibiSürüm 3.1.1Şekil oluşturma.
MSigDB Hallmark gen setleriBroad InstituteHallmark 2020; RRID:SCR_016863Enrichr üzerinden erişilen Hallmark zenginleştirme kütüphanesi.
MSigDB Hallmark interferon-alfa yanıt gen setiBroad InstituteBELİRGİN_İNTERFERON_ALFA_
YANIT; Ek Veri 1'deki 3 genlik çekirdek alt küme		Ağırlıklandırılmamış interferon-alfa karşılaştırıcısı; kesin alt küme Ek Veri 1'de verilmiştir.
NumPyNumPy geliştiricileriVersiyon 2.5.2Sayısal hesaplama ve tohumlanmış rastgele örnekleme.
pandaspandas geliştirme ekibiSürüm 3.0.5Tablo verilerinin işlenmesi.
Pandya 33-mRNA konak yanıt gen setiPandya ve ark.Ek Tablo 1; Ek Veri 1Ağırlıklandırılmamış bir karşılaştırıcı olarak puanlanan resmi 3 gen seti.
PythonPython Software FoundationSürüm 3.12.13Hesaplamalı analiz ortamı.
ReactomeReactomeReactome 202; RRID:SCR_03485Enrichr aracılığıyla erişilen yol zenginleştirme kütüphanesi.
scikit-learnscikit-learn geliştiricileriVersiyon 1.9.0AUROC ve ortalama hassasiyet hesaplamaları.
SciPySciPy geliştiricileriVersiyon 1.18.0Welch, eşli t, Wilcoxon, Mann–Whitney ve korelasyon testleri.
SeabornSeaborn geliştirme ekibiSürüm 0.13.2İstatistiksel grafikler.
statsmodelsstatsmodels geliştiricileriSürüm 0.14.6İstatistiksel araçlar.

Kaynaklar

  1. Zaas AK, et al. Gene expression signatures diagnose influenza and other symptomatic respiratory viral infections in humans. Cell Host Microbe. 2009;6(3):207-17.
  2. Woods CW, et al. A host transcriptional signature for presymptomatic detection of infection in humans exposed to influenza H1N1 or H3N2. PLoS One. 2013;8(1):e52198.
  3. Andres-Terre M, et al. Integrated, multi-cohort analysis identifies conserved transcriptional signatures across multiple respiratory viruses. Immunity. 2015;43(6):1199-211.
  4. Herberg JA, et al. Diagnostic test accuracy of a 2-transcript host RNA signature for discriminating bacterial vs viral infection in febrile children. JAMA. 2016;316(8):835-45.
  5. Pandya R, et al. A machine learning classifier using 33 host immune response mRNAs accurately distinguishes viral and non-viral acute respiratory illnesses in nasal swab samples. Genome Med. 2023;15(1):64.
  6. Ioannidis I, et al. Plasticity and virus specificity of the airway epithelial cell immune response during respiratory virus infection. J Virol. 2012;86(10):5422-36.
  7. Mejias A, et al. Whole blood gene expression profiles to assess pathogenesis and disease severity in infants with respiratory syncytial virus infection. PLoS Med. 2013;10(11):e1001549.
  8. Blanco-Melo D, et al. Imbalanced host response to SARS-CoV-2 drives development of COVID-19. Cell. 2020;181(5):1036-45.e9.
  9. Hadjadj J, et al. Impaired type I interferon activity and inflammatory responses in severe COVID-19 patients. Science. 2020;369(6504):718-24.
  10. Mick E, et al. Upper airway gene expression reveals suppressed immune responses to SARS-CoV-2 compared with other respiratory viruses. Nat Commun. 2020;11(1):5854.
  11. Yoshida M, et al. Local and systemic responses to SARS-CoV-2 infection in children and adults. Nature. 2022;602(7896):321-7.
  12. Jamali MC, et al. Respiratory infections by human metapneumovirus: epidemiological evidence and treatment prospects. Res J Pharm Technol. 2026;19(8):3905-12. doi:10.52711/0974-360X.2026.00549.
  13. Gao G, Lin R, Ma D. Human metapneumovirus: pathogenesis, epidemiology, diagnostic technologies, and potential intervention strategies. Virol J. 2025;22(1):376.
  14. Lim FY, et al. homeRNA self-blood collection enables high-frequency temporal profiling of presymptomatic host immune kinetics to respiratory viral infection: a prospective cohort study. EBioMedicine. 2025;112:105531.
  15. Johnson WE, Li C, Rabinovic A. Adjusting batch effects in microarray expression data using empirical Bayes methods. Biostatistics. 2007;8(1):118-27.
  16. Leek JT, et al. The sva package for removing batch effects and other unwanted variation in high-throughput experiments. Bioinformatics. 2012;28(6):882-3.
  17. Yu J, et al. Host gene expression in nose and blood for the diagnosis of viral respiratory infection. J Infect Dis. 2019;219(7):1151-61.
  18. Tsalik EL, et al. Host gene expression classifiers diagnose acute respiratory illness etiology. Sci Transl Med. 2016;8(322):322ra11.
  19. Parnell GP, et al. A distinct influenza infection signature in the blood transcriptome of patients with severe community-acquired pneumonia. Crit Care. 2012;16(4):R157.
  20. Edgar R, Domrachev M, Lash AE. Gene Expression Omnibus: NCBI gene expression and hybridization array data repository. Nucleic Acids Res. 2002;30(1):207-10.
  21. Barrett T, et al. NCBI GEO: archive for functional genomics data sets-update. Nucleic Acids Res. 2013;41(D1):D991-5.
  22. Tweedie S, et al. Genenames.org: the HGNC and VGNC resources in 2021. Nucleic Acids Res. 2021;49(D1):D939-46.
  23. Welch BL. The generalization of Student's problem when several different population variances are involved. Biometrika. 1947;34(1-2):28-35.
  24. Benjamini Y, Hochberg Y. Controlling the false discovery rate: a practical and powerful approach to multiple testing. J R Stat Soc Series B Stat Methodol. 1995;57(1):289-300.
  25. Subramanian A, et al. Gene set enrichment analysis: a knowledge-based approach for interpreting genome-wide expression profiles. Proc Natl Acad Sci U S A. 2005;102(43):15545-50.
  26. Liberzon A, et al. The Molecular Signatures Database Hallmark Gene Set Collection. Cell Syst. 2015;1(6):417-25.
  27. Do LAH, et al. Host transcription profile in nasal epithelium and whole blood of hospitalized children under 2 years of age with respiratory syncytial virus infection. J Infect Dis. 2018;217(1):134-46.
  28. Ashburner M, et al. Gene Ontology: tool for the unification of biology. Nat Genet. 2000;25(1):25-9.
  29. The Gene Ontology Consortium. The Gene Ontology resource: enriching a GOld mine. Nucleic Acids Res. 2021;49(D1):D325-34.
  30. Gillespie M, et al. The Reactome pathway knowledgebase 2022. Nucleic Acids Res. 2022;50(D1):D687-92.
  31. Kuleshov MV, et al. Enrichr: a comprehensive gene set enrichment analysis web server 2016 update. Nucleic Acids Res. 2016;44(W1):W90-7.
  32. Schoggins JW, et al. A diverse range of gene products are effectors of the type I interferon antiviral response. Nature. 2011;472(7344):481-5.
  33. Schneider WM, Chevillotte MD, Rice CM. Interferon-stimulated genes: a complex web of host defenses. Annu Rev Immunol. 2014;32:513-45.
  34. Perng YC, Lenschow DJ. ISG15 in antiviral immunity and beyond. Nat Rev Microbiol. 2018;16(7):423-39.
  35. Schioppa T, et al. Molecular basis for CCRL2 regulation of leukocyte migration. Front Cell Dev Biol. 2020;8:615031.
  36. Avila Cobos F, et al. Benchmarking of cell type deconvolution pipelines for transcriptomics data. Nat Commun. 2020;11(1):5650.
  37. Maden SK, et al. Challenges and opportunities to computationally deconvolve heterogeneous tissue with varying cell sizes using single-cell RNA-sequencing datasets. Genome Biol. 2023;24(1):288.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Daha fazla makale keşfet

Nazal TranskriptomlarKan TranskriptomlarıHesaplamalı İş AkışıGen İfade AnaliziViral Enfeksiyon KohortlarıBiyobelirteç DoğrulamaModül Robustluğu
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.