Bu hesaplamalı çalışma, halka açık solunum yolu virüsü transkriptomlarını karşılaştırmak için kompartman duyarlı bir iş akışı sunmakta; nazal ve kan konak yanıtlarının gen düzeyinde sınırlı bir uyum gösterdiğini, ancak bağımsız veri setleri, klinik karşılaştırmalar, boylamsal iyileşme ve sağlamlık analizleri genelinde tekrarlanabilir, biyolojik olarak yorumlanabilir kompartman spesifik modüller sağladığını kanıtlamaktadır.
Araştırma makalesi
Nazal ve Kan Konak Yanıt Modülleri için Solunum Virüsü Transkriptomlarının Kompartman Duyarlı Kıyaslaması: Hesaplamalı Bir Çalışma
Bu makalede
Özet
Özet
Kamuya açık solunum yolu virüsü transkriptomları, konakçı yanıtlarını incelemek için değerlidir, ancak doku kaynağı, kontrol tanımı ve çalışma tasarımındaki farklılıklar havuzlanmış analizleri karıştırabilir. Nazal ve kan biyolojik bağlamını korurken, tekrarlanabilir konakçı yanıt aktivitesinin belirlenip belirlenemeyeceğini saptamak için kompartman duyarlı bir hesaplamalı iş akışı geliştirdik. Eşleştirilmiş GSE17827 pediatrik kohort; semptomatik picornavirus enfeksiyonu, semptomatik respiratory syncytial virus enfeksiyonu, asemptomatik picornavirus saptaması ve virüs-negatif kontrollerden alınan nazal sürüntü ve tam kan transkriptomlarını içeren çapa veri seti olarak kullanıldı. HUGO Gene Nomenclature Committee (HGNC) filtrelemesinin ardından 27.685 gen analiz edildi. En yüksek pozitif yanıtlardan yola çıkarak, ayrı 50 genli protein kodlayan nazal ve kan modülleri tanımlandı ve harici değerlendirme öncesinde sabitlendi. Gen düzeyindeki nazal ve kan etkileri neredeyse bağımsızdı (Pearson r = 0,015) ve modüller altı keşifsel sıra-çakışma geni paylaştı (Jaccard indeksi = 0,064). Buna rağmen, nazal modül, bağımsız üst solunum yolu kohortlarında enfeksiyonu kontrollerden ayırdı ve alıcı işletim karakteristik eğrisi altındaki alanlar (AUROC) 0,749, 0,693 ve 0,609 olarak belirlendi; kan modülü ise harici kan kohortlarında 0,832, 0,924 ve 0,870 AUROC değerlerine ulaştı. Boylamsal doğal enfeksiyon verilerinde, eşleştirilmiş skorlar akut hastalıktan taburculuğa kadar azaldı ve eşleştirilmiş deltalar nazal örnekler için 0,436, kan için ise 0,30 oldu. 66 harici örneği içeren üç ek kıyaslama veri setinin yanı sıra rastgele gen null değerleri, modül boyutu taramaları, bootstrap stabilitesi, marker-program korelasyonları ve varyans bölümlendirmesi, iş akışının sağlamlığını ve sınırlamalarını tanımladı. Pandya 3-messenger ribonucleic acid (mRNA) seti, viral-bakteriyel ayrım için daha güçlü kalırken, kan modülü bakteriyel pnömonide de artış gösterdi. Bu bulgular, kompartman spesifik modüllerin, evrensel pan-doku biyobelirteçleri veya bağımsız patojen sınıflandırıcılarından ziyade, kohort karşılaştırması ve iyileşme takibi için yeniden kullanılabilir konakçı yanıt aktivite skorları olduğunu desteklemektedir.
Giriş
Konak transkriptomik imzaları, enfeksiyöz sendromları sınıflandırmak ve farklı patojenler arasındaki immün yanıtları karşılaştırmak için yaygın olarak kullanılmaktadır1,2,3,4,5. Solunum yolu virüsleri sıklıkla örtüşen interferon-stimüle genleri (ISG'ler), inflamatuar mediyatörler ve antijen sunum yolaklarını aktive eder6,7,8,9,10. Güncel eşleştirilmiş ve boylamsal çalışmalar ayrıca, lokal hava yolu ve sistemik yanıtların zamanlama, hücresel kompozisyon ve büyüklük açısından farklılık gösterebildiğini kanıtlamaktadır1. Bu durum influenza, respiratuar sinsityal virüs (RSV), rhinovirus ve SARS-CoV-2'nin ötesine geçmektedir. İnsan metapneumovirüsü, solunum yolu hastalıklarının önemli bir nedeni olmaya devam etmektedir; ancak konak yanıtı ve müdahale literatürü hâlâ gelişme aşamasındadır12,13. Solunum yolu virüsü enfeksiyonlarındaki bu gözlemler, lokal hava yolu ve sistemik konak yanıtları arasındaki farkları daha da belirginleştirmektedir14. Hesaplamalı konak-virüs çalışmaları için pratik soru, dolayısıyla yalnızca bir yanıtın mevcut olup olmadığı değildir. Asıl soru, kamuya açık verilerin, doku bağlamını koruyan ve tekrarlanabilir konak yanıt skorları üreten şeffaf bir iş akışı aracılığıyla yeniden kullanılıp kullanılamayacağıdır.
Çoğu kamuya açık solunum yolu virüsü transkriptom veri seti, temiz çapraz virüs veya çapraz doku çıkarımları için tasarlanmamıştır. Doku kaynağı, zamanlama, şiddet, yaş, kontrol tanımı ve platform genellikle birlikte değişkenlik gösterir. Yüksek kapasiteli ekspresyon veri setleri ayrıca istenmeyen teknik ve çalışma düzeyindeki varyasyonlara karşı hassastır15,16. Bu nedenle, havuzlanmış bir analiz, kaynağını gizlerken güçlü bir interferon veya inflamatuar imza ortaya çıkarabilir. Nazal örnekler epitelyal ve mukozal immün biyolojiyi yakalarken, tam kan sistemik lökosit yanıtlarını yansıtır. Bu kompartmanların birbirinin yerine geçebilir olarak değerlendirilmesi, skorun hesaplanmasını kolaylaştırır ancak yorumlanmasını zorlaştırır.
Analizi, mevcut en büyük keşif koleksiyonu17 yerine, aynı çalışmaya ait eşleşmiş burun-kan kohortu olan GSE17827 üzerine kurduk. Kohort küçük olsa da, burun ve kan etki boyutları karşılaştırıldığında çalışmalar arası karıştırıcı etkileri azaltmaktadır. Kohort; semptomatik picornavirus enfeksiyonu, semptomatik RSV enfeksiyonu, asemptomatik picornavirus tespiti ve virüs negatif kontrolleri içermektedir. Bu nedenle, bu kohortu yalnızca ayrı kompartıman spesifik modüller için bir çapa olarak kullandık. Modül üyeliği, harici testlerden önce sabitlendi. Küçük kohort seçiminin stabilitesi; tabakalı bootstrap yeniden örnekleme, rastgele gen boş kümeleri ve modül boyutu duyarlılık analizleri ile incelendi.
Bakteriyel ve enfeksiyöz olmayan karşılaştırıcıların yer aldığı bir kıyaslama katmanı ekledik. GSE6390, viral, bakteriyel veya enfeksiyöz olmayan olarak etiketlenmiş tam kan akut solunum yolu hastalığı örneklerini içermektedir18. GSE4012 ise ağır toplum kaynaklı pnömoni, sistemik inflamatuar yanıt sendromu (SIRS) ve sağlıklı kontrolleri içermektedir19. Bu kohortlar, bir modülün genel konak yanıt aktivitesini mi yoksa patojen sınıfı spesifitesini mi yansıttığını test eder. GSE53543, ex vivo periferik kan mononükleer hücresi (PBMC) rinovirüs pertürbasyon kıyaslaması olarak ayrı analiz edilmiştir. Bu veri seti, kontrollü bir stimülasyon altında lökosit yanıt kapasitesini ölçer ancak doğal enfeksiyona eşdeğer değildir.
Yaklaşımımız kasıtlı olarak muhafazakardır. Heterojen kamuya açık verilerden evrensel bir antiviral imza kanıtlamaya çalışmıyoruz. Bunun yerine, kompartman duyarlı bir iş akışının, harici testlerden sonra da kullanışlı kalan modül skorları üretip üretemeyeceğini sorguluyoruz. Amaçlanan kullanım, Pandya 33-mRNA gibi tanısal sınıflayıcıları tamamlayıcı niteliktedir. Bu modüller; kohortlar, iyileşme süreci ve semptom gradyanları boyunca nazal ve kan konak yanıt aktivitesini skorlar. Patojen sınıfı atamak için tasarlanmamışlardır.
Protokol
Bu çalışma, kimliksizleştirilmiş ve halka açık verileri yeniden analiz etmiş olup herhangi bir yeni katılımcı alımı, müdahale veya örnek toplama içermemektedir. Bu nedenle, mevcut ikincil analiz için kurumsal etik onay ve yeni bilgilendirilmiş onam gerekmemiştir. Orijinal çalışmalar için etik onay ve bilgilendirilmiş onam, ilgili veri sağlayıcılar tarafından raporlanmıştır.
Çalışma tasarımı ve iş akışı mantığı
Gene Expression Omnibus20,21 veri tabanına kaydedilmiş veri setlerini kullanarak retrospektif bir kamu verisi biyoinformatik çalışması yürüttük. Yeni hasta örnekleri, hücre kültürü deneyleri, hayvan modelleri veya ıslak laboratuvar doğrulaması yapılmamıştır. İş akışında öncelikle çapa (anchor) odaklı bir tasarım kullanılmıştır. GSE17827; etki büyüklüğü kestirimi, modül oluşturma, bölmeler arası uyum ve semptom gradyanı analizi için kullanılmıştır. Bağımsız veri setleri, ancak modül üyeliği sabitlendikten sonra dahil edilmiştir. İş akışı; eşleşmiş bölme çapalamayı, HGNC eşleştirmeyi ve protein kodlayan filtrelemeyi, ayrı burun ve kan modül oluşturmayı, dokuyla eşleşmiş ve boylamsal doğrulamayı, klinik kıyaslamayı ve sağlamlık analizlerini kapsamıştır. Doğrulayıcı analizler, kilitlenmiş dokuyla eşleşmiş ve boylamsal testlerden oluşmuştur. Örtüşen gen, semptom gradyanı, markör programı ve varyans analizleri ise keşifsel veya tanımlayıcı nitelikteydi.
Çapa kohortu ve birincil karşılaştırma
GSE17827, 26 çocuktan alınan burun sürüntüsü ve tam kan ekspresyon profillerini içermektedir: 9 semptomatik pikornavir vakası, 5 asemptomatik pikornavir tespiti, 6 semptomatik RSV vakası ve 6 asemptomatik virüs-negatif kontrol17. İki RSV vakasında kan örneği bulunmamaktaydı. Bu nedenle, eksiksiz çapa tasarımı 50 örnek içermiş ve modül oluşturma aşamasından asemptomatik pikornavir tespitleri hariç tutulduktan sonra birincil enfekte-kontrol karşılaştırması 40 örnek içermiştir. Birincil karşılaştırma için, semptomatik pikornavir ve semptomatik RSV örnekleri enfekte, asemptomatik virüs-negatif örnekler ise kontrol olarak etiketlenmiştir. Asemptomatik pikornavir tespitleri, semptom olmaksızın viral tespitin biyolojik olarak virüs-negatif sağlık durumundan farklı olması nedeniyle kontrol olarak değerlendirilmemiştir. Bu örnekler modül oluşturma sürecinin dışında tutulmuş ve daha sonra bir semptom gradyanı analizi için kullanılmıştır.
Prob eşleştirme ve ön işleme
GSE117827, GPL23126 üzerinde profillendi. Transkript-küme tanımlayıcıları, GEO platformu GPL24539 aracılığıyla dağıtılan Clariom D Human na36, hg38 anotasyon dosyası kullanılarak gen sembolleri ile eşleştirildi. Yalnızca HGNC onaylı semboller tutuldu2. Kontrol probları, ERCC probları, eşleşmeyen transkript kümeleri ve onaylanmamış semboller çıkarıldı. Aynı onaylı sembolle eşleşen birden fazla transkript kümesi, medyan ekspresyon değerine göre birleştirildi. Filtreleme ve birleştirme işlemlerinden sonra, çapa analizi için 27.685 gen kullanıma hazır hale geldi. Ekspresyon matrisinin 95. persentili 50'yi aşarak logaritması alınmamış bir yoğunluk ölçeğine işaret ettiğinde log₂(x + 1) dönüşümü uygulandı. %20'den fazla eksik değeri olan genler çıkarıldı; geri kalan eksik değerler gen içi medyan ile dolduruldu. Ardından her gen, söz konusu veri setindeki tüm örnekler genelinde z = (x − ortalama)/örnek standart sapma (ddof = 1) şeklinde standardize edildi. Sıfır varyanslı genlere 0 standardize değeri atandı. Modül oluşturma, HGNC tam setinde protein kodlayan genler olarak sınıflandırılan girdilerle sınırlandırıldı.
Etki büyüklüğü analizi ve modül oluşturma
Nazal ve kan kompartmanları ayrı analiz edildi. Semptomatik viral örnekler, Hedges g standartlaştırılmış ortalama farklar ve iki yönlü Welch testleri kullanılarak virüs negatif kontrollerle karşılaştırıldı23. Hedges g, enfekte-eksi-kontrol ortalama farkının havuzlanmış standart sapmaya bölünmesi ve df = ninfected + ncontrol − 2 olmak üzere 1 − 3/(4df − 1) küçük örneklem düzeltmesi ile çarpılmasıyla hesaplandı. Welch testleri eşit olmayan varyanslarla uygulandı. Her kompartman içindeki test edilen tüm genler için Benjamini–Hochberg yanlış keşif oranları hesaplandı24. Küçük çapa kohortunda hiçbir protein kodlayan gen, önceden belirlenen FDR < 0.05 ve Hedges g > 0.8 şeklindeki katı kombinasyonu karşılamadığından, pozitif etkili genler önce artan iki yönlü Welch P değerine, ardından azalan Hedges g değerine göre sıralandı ve son belirleyici olarak gen sembolü kullanıldı. En üstteki 50 gen her bir birincil modülü oluşturdu. Elli gen, platformlar arası eksik gen kaybını sınırlarken biyolojik genişliği koruyan orta düzeyde bir modül boyutu olarak a priori seçildi. Bu modül boyutu dışsal AUROC'a göre ayarlanmadı. 10, 25, 50, 10 ve 200 gen kullanılarak yapılan sensitivite analizleri aynı kalitatif çapa ayrımı sonucunu verdi. Amaç, tek gen keşfi değil, modül düzeyinde tekrarlanabilirliktir.
Kompartmanlar arası uyum
Nazal ve kan Hedges g tahminleri gen bazında hizalandı ve Pearson ile Spearman korelasyonları kullanılarak karşılaştırıldı. İlk 50 nazal ve ilk 50 kan modülü arasındaki örtüşme, örtüşme sayısı ve Jaccard indeksi ile özetlendi. Örtüşen genler, doğrulanmış korunmuş biyobelirteçlerden ziyade keşifsel kompartmanlar arası sıra-örtüşme adayları olarak yorumlandı.
Harici doku-eşleşmeli doğrulama
Modül puanı doğrulaması, yorumlanabilir kaynak gruplarına sahip bağımsız halka açık veri setleri kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Üst solunum yolu doğrulaması, GSE41374 RSV nazal yıkama örneklerini ve SARS-CoV-2 veri setleri olan GSE152075 ile GSE156063'ü kapsamıştır. Kan doğrulaması ise GSE1710 ile ayrı normalize edilmiş iki GSE3890 birimini içermiştir: GPL1058 (36 örnek; 28 RSV ve 8 kontrol) ve GPL684 (138 örnek; 107 RSV ve 31 kontrol). Her harici veri seti için problar HGNC sembollerine eşlenmiş ve yinelenen semboller medyan ekspresyon ile birleştirilmiştir. Çapa veri seti için kullanılan dönüşüm, eksik değer filtreleme, medyan imputasyonu ve gen başına z-standardizasyon kuralları her veri setine ayrı uygulanmıştır. Modül puanı, temsil edilen modül genlerinin standardize edilmiş ekspresyon değerlerinin ağırlıklandırılmamış ortalaması olarak hesaplanmıştır. AUROC, ortalama hassasiyet ve Welch testi FDR'si, klinik tanısal performans tahminleri olarak değil, taşınabilirlik metrikleri olarak raporlanmıştır.
Geniş klinik kıyaslama ve ex vivo perturbasyon veri setleri
İki tam kan veri seti, keşif kohortları yerine klinik kıyaslamalar olarak kullanılmıştır. GSE6390'da örnekler, kaydedilen enfeksiyon durumu meta verilerine göre viral solunum yolu enfeksiyonu (n = 17), bakteriyel solunum yolu enfeksiyonu (n = 73) veya enfeksiyöz olmayan hastalık (n = 90) olarak atanmıştır; bu net etiketlerden herhangi birine sahip olmayan örnekler hariç tutulmuştur18. GSE4012'de ise kaydedilen tanı alanları influenza A pnömonisi (n = 39), influenza olmaksızın bakteriyel pnömoni (n = 61), pnömoni olmaksızın SIRS (n = 40), sağlıklı kontroller (n = 36) veya karışık bakteriyel/influenza pnömonisi (n = 14) olarak eşleştirilmiştir19. Karışık bakteriyel/influenza örnekleri tanımlanmış ancak ikili kıyaslama karşılaştırmalarından hariç tutulmuştur.
GSE53543, 98 bireyden alınan 196 ex vivo PBMC profili içermektedir. Her bireyden bir adet sadece besiyeri içeren örnek ve bir adet 24 sa boyunca rhinovirus 16'ya maruz bırakılmış örnek alınmıştır; denek tanımlayıcıları 98 eksiksiz çifti doğrulamıştır. AUROC bir sıra-ayırma metriği olduğundan, temel kıyaslama 98 stimüle edilmiş ve 98 stimüle edilmemiş örnek üzerinden raporlanan AUROC değerlerini içermektedir. Denek eşleşmeleri meta verilerde korunmuş ve skor farklarının eşleştirilmiş duyarlılık analizinde kullanılmıştır. Bu deney, doğal klinik enfeksiyondan ayrı olarak analiz edilmiş olup klinik tanı iddialarını desteklemek için kullanılmamıştır.
GSE6390, GSE4012 ve GSE53543 için ham GEO seri matrisleri indirildi. GSE6390 için GPL571, GSE4012 için GPL6947 ve GSE53543 için GPL1058 kullanıldı. Problar HGNC onaylı sembollerle eşleştirildi ve mükerrer eşleştirmeler medyan ekspresyon kullanılarak birleştirildi. Depolanmış normalize matrisler kullanıldı. Genel 95. persentil kuralı, log₂(x + 1) dönüşümünü yalnızca logaritmik olmayan ölçekteki matrisler için tetikledi. GSE53543, orijinal araştırmacılar tarafından halihazırda log₂-dönüştürülmüş, sıra-değişmez (rank-invariant) normalize edilmiş ve işlem gününe göre ayarlanmıştı, bu nedenle ek bir log dönüşümü uygulanmadı. Değerlerin %20'den fazlası eksik olan genler çıkarıldıktan ve geri kalan eksik değerler medyan ile doldurulduktan sonra, her bir gen kendi veri setindeki tüm örnekler arasında z-standardize edildi. Kıyaslama katmanı 470 klinik tam kan örneği ve 196 ex vivo PBMC örneği içeriyordu.
Referans imza kıyaslaması
Çapa nasal ve kan modülleri, ağırlıklandırılmamış üç referans setine göre kıyaslanmıştır. Resmi Pandya 3-mRNA seti, orijinal sınıflandırıcı raporunun Ek Tablo 1'inden aktarılmıştır5. Andres-Terre karşılaştırıcısı, rapor edilen çoklu-virüs imzasından derlenen 33 interferon odaklı genden oluşmaktadır3. Hallmark karşılaştırıcısı, MSigDB HALLMARK_INTERFERON_ALPHA_RESPONSE seti ile bağlantılı 3 genlik bir interferon-alfa çekirdek alt kümesini içermektedir25,26. Her üç referans seti için tam gen listeleri Ek Veri 1'de sunulmuştur. Bu referans skorları, orijinal ağırlıklı sınıflandırıcıları yeniden oluşturmamaktadır. Her veri seti için skor, mevcut gen başına z skorlarının ağırlıklandırılmamış ortalaması olarak hesaplanmıştır; en az üç temsil edilen genin bulunması şart koşulmuş ve temsil edilen gen sayısı rapor edilmiştir. Gerekli grupların mevcut olduğu durumlarda, kıyaslama karşıtlıkları viral ile bakteriyel, viral ile enfeksiyöz olmayan, viral ile bakteriyel veya enfeksiyöz olmayan, viral ile sağlıklı/kontrol ve bakteriyel ile sağlıklı/kontrol şeklinde belirlenmiştir. AUROC ve ortalama kesinlik, kıyaslama metrikleri olarak yorumlanmıştır. Welch-testi P değerleri, kıyaslama tablosundaki tüm geçerli veri seti-karşıtlık-modül kombinasyonları genelinde Benjamini–Hochberg prosedürü kullanılarak düzeltilmiştir.
Bağımsız boylamsal doğrulama
Eşleştirilmiş akut-taburculuk veri setleri GSE9741 ve GSE9742 yalnızca boylamsal doğrulama için kullanılmıştır27. Kaydedilen meta verilerde RSV tek enfeksiyon (RSVsi) veya rinovirüs (hRV) olarak etiketlenen örnekler birincil analizi oluşturmuştur; RSV ko-enfeksiyonları (RSVco) ise yalnızca ek çıktılarda tutulmuştur. Akut ve taburculuk etiketleri örnek başlıklarından ayrıştırılmıştır. Örnekler; veri seti, kompartıman, virüs grubu ve denek tanımlayıcısına göre eşleştirilmiş ve yalnızca her iki zaman noktasına sahip olan denekler tutulmuştur. Birincil birleştirilmiş grup, 38 RSVsi ve 30 hRV çiftinden (kompartıman başına 68 çift) oluşmuştur.
GSE9741 veya GSE97742 veri setleri; gen seçimi, modül iyileştirme veya eşik ayarı için kullanılmamıştır. Bu veri setleri harici doğrulama için ayrılmıştır. Prob tanımlayıcıları onaylı HGNC sembolleri ile eşleştirilmiş ve yinelenen semboller medyan ekspresyon kullanılarak birleştirilmiştir. Sabit GSE117827 modül skorları hesaplanmadan önce; aynı 95. persentil log-transformasyon kuralı, eksik değer filtresi, medyan imputasyonu ve veri seti içi gen başına z-standardizasyonu prosedürleri uygulanmıştır.
Her doku ve modül için, akut ve taburculuk skorları denek ve virüs grubuna göre eşleştirilmiştir. Her çift için akut eksi taburculuk farkı hesaplanmıştır. Cohen dz, ortalama eşleştirilmiş farkın örneklem standart sapmasına bölünmesiyle hesaplanmıştır. İki yönlü eşleştirilmiş t testleri ve iki yönlü Wilcoxon işaretli sıra testleri, akut ve taburculuk skorlarının ayrımı için AUROC değerleri ile birlikte raporlanmıştır. Benjamini–Hochberg FDR değerleri, tam boylamsal çıktıda yer alan 20 geçerli eşleştirilmiş t testinin tamamı üzerinden (iki veri seti, iki modül kaynağı ve önceden belirlenmiş beş virüs grubu özeti) hesaplanmıştır.
Semptom gradyanı ve post-hoc analizi
Modül üyeliği belirlendikten sonra, GSE17827'deki ayrılmış asemptomatik picornavirus tespitleri yalnızca semptom gradyan analizi için kullanılmıştır. Sıralı klinik skor; virüs negatif kontroller için 0, asemptomatik picornavirus tespitleri için 1 ve semptomatik enfeksiyonlar için 2 olarak belirlenmiştir. Sıralı trend Spearman korelasyonu ile, üç grup arasındaki genel farklar ise Kruskal–Wallis testi ile değerlendirilmiştir. Üç grup çiftini karşılaştırmak için iki yönlü Mann–Whitney U post-hoc testleri uygulanmıştır. Her bir kompartman içerisinde, üçlü ikili karşılaştırma ailesine ayrı Benjamini–Hochberg düzeltmesi uygulanmıştır.
Fonksiyonel zenginleştirme
Nazal ve kan modül genleri, MSigDB Hallmark 2020, Reactome 202 ve GO Biological Process 2023 kütüphaneleri kullanılarak gseapy aracılığıyla Enrichr ile analiz edildi25,26,28,29,30,31. Enrichr, Fisher'ın kesin testi tabanlı standart aşırı temsil çerçevesini kullandı. Kütüphane tarafından raporlanan Benjamini–Hochberg düzeltmeli P değerleri < 0.05 olanlar anlamlı kabul edildi. Sorgulanan üç kütüphane genelinde modül başına en anlamlı sekiz terim, düzeltilmiş P değerine göre sıralandı. Zenginleştirme sonuçları sadece yorumlama amacıyla kullanıldı.
Dayanıklılık, marker programı ve varyans analizleri
Dayanıklılık analizleri, sonuçların modül boyutuna veya şans eseri seçime bağlı olup olmadığını test etmiştir. 10, 25, 50, 100 ve 20 genlik modül boyutları değerlendirilmiştir. Rastgele gen nul analizi için uygun evren, işlenmiş GSE17827 matrisinde temsil edilen HGNC protein kodlayan genlerden oluşmuştur. NumPy 20260622 rastgele tohumu kullanılarak, yerine koymadan beş yüz adet 50 genlik set örneklenmiştir. Bootstrap yeniden seçimi, her kompartıman için orijinal çapa analizinde en yüksek sırada yer alan 1.00 pozitif etkili protein kodlayan genle sınırlandırılmıştır. Her yeniden örneklemede, pozitif protein kodlayan genler artan iki yönlü Welch P değerine ve ardından azalan ortalama farka göre sıralanmıştır. En üstteki 50 gen seçilmiştir. Gen stabilitesi, seçim sayısının 10'e bölünmesiyle hesaplanmıştır. Her kompartımanda en yüksek seçim frekansına sahip 20 gen gösterilmiştir.
Marker-program skorları, hücre fraksiyonu tahminlerinden ziyade tanımlayıcı yardımcılar olarak kullanılmıştır. Altı küratörlü program değerlendirilmiştir: epitel (EPCAM, KRT8, KRT18, KRT19, MUC1, KRT5, KRT14, SCGB1A1, FOXJ1), monosit/makrofaj (LYZ, LST1, S100A8, S10A9, FCGR3A, FCGR1A, CD14, MS4A7, CTSS), nötrofil (S10A8, S10A9, MPO, ELANE, CEACAM8, FCGR3B, OLFM4, MMP8), T/NK (CD3D, CD3E, TRAC, NKG7, GNLY, PRF1, GZMB, KLRD1, IL7R), B/plazma (MS4A1, CD79A, CD79B, MZB1, JCHAIN, IGHG1, SDC1) ve myeloid interferon (SIGLEC1, IFI27, IFI4L, ISG15, MX1, OAS1, RSAD2, IFIT3). Her bir program skoru, mevcut gen başına z skorlarının ortalaması olarak hesaplanmış ve en az üç temsilci genin bulunması şartı aranmıştır. Spearman P değerleri, veri seti-modül-program korelasyonlarının tüm ailesi genelinde Benjamini–Hochberg prosedürü kullanılarak düzeltilmiştir. Tek yönlü eta-kare, her bir modül-faktör çifti için gruplar arası kareler toplamının toplam kareler toplamına bölünmesiyle hesaplanmıştır. İlgili faktörün eksik olduğu satırlar bu hesaplamadan hariç tutulmuştur. Bu analiz tanımlayıcı nitelikte olup, karşılıklı korele faktörler için düzeltme yapılmamıştır.
Tekrarlanabilirlik
Tüm analizler, Materyal Tablosu'nda belirtilen yazılım paketleri ve versiyonları kullanılarak Python 3.12.13'te betik tabanlı iş akışları ile yürütülmüştür. Rastgeleleştirilmiş prosedürlerde 20260622 sabit tohum değeri kullanılmıştır. Genel GEO ekspresyon matrisleri; ham girişlerin, işlenmiş verilerin, istatistiksel çıktıların, tabloların ve şekillerin ayrıştırıldığı tutarlı bir proje yapısı kullanılarak işlenmiştir. Bağımsız doğrulamayı desteklemek amacıyla modül tanımlamaları, örnek kürasyon kayıtları, etki büyüklüğü tahminleri, doğrulama istatistikleri, zenginleştirme sonuçları, sağlamlık analizleri ve şekil kaynak verileri saklanmıştır. Analiz kodu, bağımlılık spesifikasyonları ve destekleyici türetilmiş veriler, Veri Erişilebilirliği beyanında açıklandığı şekilde mevcuttur.
Sonuçlar
Çapa-adım kıyaslaması, dokuya özgü gen etkilerini pan-doku gen etkilerinden ayırdı
Küratörlüğü yapılmış GSE117827 çapa matrisi 27.685 HGNC onaylı gen içeriyordu. Birincil nazal karşılaştırma 15 semptomatik enfekte ve 6 virüs negatif kontrol örneğini içerirken; kan karşılaştırması 13 semptomatik enfekte ve 6 kontrolü içeriyordu (Tablo 1). Bu küçük kohort stabil tek gen keşfini destekleyemeyeceği için, eşli kompartıman çapası olarak kullanıldı. Stabilite; bootstrap yeniden örnekleme, rastgele gen boş hipotez testi, harici doğrulama ve modül boyutu hassasiyet analizleri ile modül düzeyinde değerlendirildi.
| Lütfen çevrilecek kaynak metni sağlayın. Kaynak metni gönderdiğinizde, belirtilen akademik standartlara ve teknik gereksinimlere uygun olarak profesyonel Türkçe çevirisini gerçekleştireceğim. | Grup | Koşul | Birincil kontrast | n |
| Kan | RSV | Enfekte | Evet | 4 |
| Kan | Asemptomatik pikornavirüs | İkincil | Hayır | 5 |
| Kan | Semptomatik pikornavirüs | Enfekte | Evet | 9 |
| Kan | Virüs negatif kontrolü | Kontrol | Evet | 6 |
| Nazal | RSV | Enfekte | Evet | 6 |
| Nazal | Semptom göstermeyen pikornavirüs | İkincil | Hayır | 5 |
| Nazal | Semptomatik pikornavirüs | Enfekte | Evet | 9 |
| Nazal | Virüs negatif kontrolü | Kontrol | Evet | 6 |
Tablo 1: Birincil karşılaştırma kürasyonundan sonra GSE117827 çapa tasarımı. Birincil karşılaştırma kürasyonundan sonra eşleştirilmiş çapa veri setindeki kan ve burun bölmeleri genelindeki örnek dağılımı. Semptomatik respiratuar sinsityal virüs (RSV) ve semptomatik pikornavirüs örnekleri enfekte olarak sınıflandırılmış ve birincil karşılaştırmaya dahil edilmiştir; virüs negatif kontroller ise kontrol olarak sınıflandırılmış ve birincil karşılaştırmaya dahil edilmiştir. Asemptomatik pikornavirüs örnekleri ikincil olarak belirlenmiş ve modül oluşturma sürecinden hariç tutulmuştur; bunlar yalnızca keşifsel semptom-gradyan analizinde kullanılmıştır. İki RSV vakasında kan örnekleri bulunmadığı için dört kan ve altı burun RSV örneği elde edilmiştir.
Paylaşılan 27.685 gen genelinde, nazal ve kan Hedges g tahminleri neredeysele ilişkisizdi (Pearson r = 0,015; Şekil 1). Bu sonuç tek bir çalışma kapsamında ortaya çıkmış olup, havuzlanmış kohortlar arası bir karşılaştırmaya göre çalışmalar arası farklara daha az maruz kalmıştır. Yoğun merkezi bulut, çoğu genin her iki kompartmanda benzer şekilde hareket etmediğini göstermektedir. Vurgulanan örtüşen genler, her iki sıralama listesinin en üstündeki istisnalardır. Bu örüntü, nazal ve kan modüllerinin ayrı ayrı oluşturulmasını desteklemektedir.
Şekil 1. Eşleştirilmiş GSE117827 çapa kohortundaki nazal ve kan gen düzeyi etki büyüklükleri. Hedges g değerleri, 27.685 gen için semptomatik enfeksiyonu virüs-negatif kontrollerle karşılaştırmaktadır. Nazal tahminler (15 enfekte, 6 kontrol) x-ekseninde, kan tahminleri (13 enfekte, 6 kontrol) ise y-ekseninde gösterilmiştir. Heksagonal-bin gölgelendirmesi, bin başına düşen gen sayısını belirtir. Kırmızı noktalar, ilk-50 nazal ve kan modülleri arasında ortak olan altı geni göstermektedir. Pearson r = 0.015. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Modül inşası, interferon merkezli küçük bir örtüşme oluşturdu
En üstteki 50 nazal ve kan modülü altı geni paylaştı: ISG15, ACRBP, IFIT1, RSAD2, CCRL2 ve XAF1 (Jaccard indeksi = 0.064; Tablo 2; Şekil 2). ISG15, IFIT1, RSAD2 ve XAF1, interferon bağlantılı antiviral biyoloji ile uyumludur32,33,34. CCRL2, inflamatuar lökosit göçü bağlamında daha iyi yorumlanmaktadır35. ACRBP'nin belirlenmiş bir antiviral rolü yoktur. Şeffaflık adına altı genin tamamı raporlanmıştır, ancak hiçbiri valide edilmiş bir dokular arası biyobelirteç olarak iddia edilmemiştir. Bu genlerin tek gen FDR değerleri, küçük çapa kohortunda anlamlı değildir. Bu nedenle temel çıkarım, örtüşme listesine değil, kilitli modül düzeyindeki doğrulamaya dayanmaktadır.
| Gen | Nazal Hedgeler g | Nazal FDR | Kan Bariyerleri g | Kan FDR | Yorumlama |
| ISG15 | 2.215 | 0.213 | 1.369 | 0.442 | İnterferonla uyarılmış antiviral gen; keşifsel örtüşme |
| ACRBP | 1.69 | 0.205 | 1.748 | 0.429 | Saptanmış bir antiviral rolü yoktur; şeffaflık adına tutulmuştur |
| IFIT1 | 1.875 | 0.213 | 1.35 | 0.442 | İnterferonla uyarılmış antiviral gen; keşifsel örtüşme |
| RSAD2 | 1.663 | 0.213 | 1.532 | 0.442 | İnterferonla uyarılmış antiviral gen; keşifsel örtüşme |
| CCRL2 | 1.396 | 0.217 | 1.782 | 0.442 | İnflamatuar lökosit göçü bağlamı; virüse özgü değildir |
| XAF1 | 1.603 | 0.226 | 1.47 | 0.442 | İnterferon bağlantılı apoptoz faktörü; keşifsel örtüşme |
Tablo 2: En üst sırada yer alan nazal ve kan modülleri arasındaki tam keşifsel örtüşme. Paylaşılan altı genin tamamı, nazal ve kan Hedges g değerleri ve gene özgü FDR değerleri ile birlikte raporlanmıştır. Gene özgü FDR değerleri küçük çapa kohortunda anlamlı olmadığı için altı genin tamamı keşifsel sıra-örtüşme adayları olarak değerlendirilmiştir. ACRBP, yerleşik bir antiviral rolü olmamasına rağmen şeffaflık adına tutulmuştur. Altı genin hiçbiri doğrulanmış evrensel bir biyobelirteç olarak sunulmamıştır; temel kanıt modül düzeyindeki harici doğrulamaya dayanmaktadır.
Şekil 2. Altı keşifsel burun-kan örtüşme geninin etki büyüklükleri. GSE117827'deki ACRBP, CCRL2, IFIT1, ISG15, RSAD2 ve XAF1 için burun ve kan Hedges g tahminleri gösterilmiştir. Pozitif değerler, semptomatik enfeksiyondaki ekspresyonun virüs negatif kontrollere göre daha yüksek olduğunu belirtir. Tam örtüşme şeffaflık adına gösterilmiştir; tek gen FDR değerleri anlamlı değildi ve bu genler doğrulanmış evrensel biyobelirteçler olarak sunulmamaktadır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Fonksiyonel zenginleştirme, modül içeriği üzerinde biyolojik bir kontrol sağladı
Gen kompozisyonu ve zenginleştirme gücü farklılık gösterse de, her iki modül de interferon ve antiviral yollar açısından zenginleşmişti (Şekil 3). Modül başına en anlamlı sekiz terim gösterilmiştir. Nazal modül için, Hallmark interferon-gamma response (düzeltilmiş P = 2.23 × 10⁻24), Hallmark interferon-alpha response (düzeltilmiş P = 1.40 × 10⁻22), Reactome interferon-alpha/beta signalling (düzeltilmiş P = 3.64 × 10⁻19) ve GO defense response to virus (düzeltilmiş P = 5.47 × 10⁻15) önde gelen terimler arasında yer aldı. Kan modülü, daha düşük zenginleştirme gücünde aynı genel biyolojiyi gösterdi: interferon-alpha response (düzeltilmiş P = 3.87 × 10⁻6), Reactome interferon-alpha/beta signaling (düzeltilmiş P = 5.70 × 10⁻6), interferon-gamma response (düzeltilmiş P = 8.89 × 10⁻6) ve defense response to virus (düzeltilmiş P = 1.07 × 10⁻4). Bu sonuçlar, bölmelere özgü gen sıralamalarının aynı olduğunu ima etmeksizin biyolojik tutarlılığı desteklemektedir.
Şekil 3Nazal ve kan modülleri için seçilen zenginleştirme terimleri. Aşırı temsil analizi, Hallmark 2020, Reactome 2022 ve GO Biyolojik Süreç 2023 veri setleri kullanılarak Enrichr ile gerçekleştirilmiştir. Benjamini–Hochberg düzeltmeli en küçük değere sahip sekiz terim... P her bir modül için değerler gösterilmiştir. Çubuk uzunluğu −log değerini temsil etmektedir10(ayarlanmış) P değer). Sol ve sağ paneller sırasıyla nazal ve kan modüllerini göstermektedir. Terimler cümle düzeninde görüntülenmiştir. Zenginleştirme analizi modül üyeliğini değiştirmemiştir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Kilitli modüller, doku ile eşleştirilmiş harici doğrulamada test edilmiştir
Kilitli nazal modül, GSE41374'te 0,749, GSE152075'te 0,693 ve GSE156063'te 0,609 AUROC değerlerine ulaşmıştır (Tablo 3; Şekil 4). Kilitli kan modülü, GSE171110'da 0,832, GSE38900 GPL10558 ünitesinde 0,924 ve GPL6884 ünitesinde 0,870 AUROC değerlerine ulaşmıştır. Dahili çapa performansı, yapısı gereği iyimser bir yanlılık gösterdiği için hariç tutulmuştur. Harici AUROC değerleri, taşınabilirlik özetleri olarak değerlendirilmektedir. Bu değerler klinik duyarlılığı, özgüllüğü veya tanıya hazır olup olmadıklarını belirlemez.
| Kohort | Numune/virüs | Modül | pozitif n | n negatif | Temsil edilen genler | AUROC | Ortalama kesinlik | Welch testi FDR |
| GSE152075 | SARS-CoV-2 üst solunum yolu | Nazal | 430 | 54 | 50 | 0.693 | 0.935 | 2,20 × 10⁻⁴ |
| GSE156063 | SARS-CoV-2 üst solunum yolu | Nazal | 93 | 100 | 49 | 0.609 | 0.551 | 1,38 × 10⁻² |
| GSE171110 | SARS-CoV-2 tam kan | Kan | 44 | 10 | 50 | 0.832 | 0.959 | 7,94 × 10⁻⁴ |
| GSE38900-GPL10558 | RSV tam kan | Kan | 28 | 8 | 50 | 0.924 | 0.979 | 7,94 × 10⁻⁴ |
| GSE38900-GPL6884 | RSV tam kan | Kan | 107 | 31 | 49 | 0.87 | 0.962 | 3,47 × 10⁻¹⁵ |
| GSE41374 | RSV nazal yıkama | Nazal | 76 | 10 | 50 | 0.749 | 0.951 | 2,63 × 10⁻² |
Tablo 3: Harici dokuyla eşleştirilmiş modül skor doğrulama. Kilitli nazal modül GSE41374, GSE152075 ve GSE156063'te; kilitli kan modülü ise GSE171110 ile GSE38900 platform birimleri GPL10558 ve GPL6884'te test edilmiştir. Tablo; pozitif ve negatif örnek sayılarını, temsil edilen modül genlerini, AUROC, ortalama hassasiyeti ve Welch-testi FDR değerlerini raporlamaktadır. Dahili çapa performansı hariç tutulmuştur. AUROC ve ortalama hassasiyet, klinik tanı performansı tahminleri olarak değil, taşınabilirlik özetleri olarak raporlanmıştır.
Şekil 4. Harici dokuyla eşleşmiş modül skoru taşınabilirliği. GSE41374 (76 RSV, 10 kontrol), GSE152075 (430 SARS-CoV-2, 54 kontrol) ve GSE156063 (93 SARS-CoV-2, 100 kontrol) için nazal modüle; GSE171110 (44 SARS-CoV-2, 10 kontrol), GSE38900-GPL10558 (28 RSV, 8 kontrol) ve GSE38900-GPL6884 (107 RSV, 31 kontrol) için kan modülüne ait AUROC değerleri gösterilmiştir. Skorlar, temsil edilen gen başına z değerlerinin ağırlıklandırılmamış ortalamalarıdır. Kesikli çizgi AUROC = 0.5 değerini belirtmektedir. Değerler taşınabilirlik özetleridir, klinik tanı tahminleri değildir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Boylamsal doğrulama, iyileşme sırasında skorların düşüp düşmediğini test etti
GSE97741/GSE97742 yardımcı veri setleri, hastaneye yatırılan çocuklardan alınan akut ve taburculuk örnekleriyle bağımsız bir doğal enfeksiyon doğrulama ortamı sağlamıştır27. Bu örnekler, sağlıklı kontrol keşif verileri olarak kullanılmamıştır. Bu örnekler, çapa türevli modül skorlarının akut hastalıktan taburculuğa kadar azalıp azalmadığını değerlendirmek için kullanılmıştır.
Önceden belirlenmiş kombine RSV tekil enfeksiyonu ve rhinovirus grubu için, her bir dokuda 68 eşleştirilmiş denek analiz edilmiştir (Tablo 4; Şekil 5). Kan modülü, kanda akut hastalıktan taburculuğa kadar azalmıştır (ortalama delta = 0.330; Cohen dz = 0.740; eşleştirilmiş test FDR = 1.98 × 10⁻7; AUROC = 0.765). Nazal modül de nazofaringeal örneklerde azalmıştır (ortalama delta = 0.436; Cohen dz = 0.477; eşleştirilmiş test FDR = 3.06 × 10⁻4; AUROC = 0.679). Eşleştirilmiş yörüngeler ve bunların standart hataları, grup düzeyindeki düşüşün birkaç eşleşmemiş uç değerden kaynaklanmadığını göstermektedir.
| Veri Seti | Örnek kaynak | Modül | Doku eşleşmeli | n çift | Ortalama akut taburculuk deltası | Cohen dz | AUROC | Eşleştirilmiş test FDR |
| GSE97741 | Kan | Kan | Evet | 68 | 0.330 | 0.740 | 0.765 | 1,98 × 10⁻⁷ |
| GSE97741 | Kan | Nazal | Hayır | 68 | 0.479 | 0.721 | 0.755 | 3,19 × 10⁻⁷ |
| GSE97742 | Nazofaringeal | Kan | Hayır | 68 | 0.361 | 0.914 | 0.845 | 9,42 × 10⁻¹⁰ |
| GSE97742 | Nazofaringeal | Nazal | Evet | 68 | 0.436 | 0.477 | 0.679 | 3,06 × 10⁻⁴ |
Tablo 4: Bağımsız boylamsal akut-taburculuk karşılaştırmalı doğrulama. Tablo; GSE97741 ve GSE97742'deki sabit modüller için tamamlanmış çift sayısını, ortalama akut-eksi-taburculuk skor farkını, Cohen dz değerini, AUROC değerini ve eşleştirilmiş test FDR değerini bildirmektedir. Pozitif delta, akut hastalık sırasında daha yüksek bir modül skoruna işaret eder. Eşleştirilmiş test FDR değerleri, tam boylamsal çıktıda yer alan toplam 20 geçerli eşleştirilmiş t testi üzerinden hesaplanmış, Benjamini–Hochberg düzeltmeli iki taraflı eşleştirilmiş t-testi P değerleridir.
Şekil 5. Akut hastalıktan taburculuğa kadar eşleştirilmiş modül skoru değişiklikleri. (A) Tam kanda kan-modülü skorları (GSE97741). (B) Nazofaringeal örneklerde nazal-modül skorları (GSE97742). Her panel 68 tam denek çifti içermektedir: 38 RSV tekil enfeksiyonu ve 30 rinovirüs enfeksiyonu. İnce çizgiler, eşleştirilmiş denek ölçümlerini birbirine bağlar. Turuncu noktalar grup ortalamalarını ve turuncu hata çubukları ortalamanın standart hatasını göstermektedir. Çift taraflı eşleştirilmiş t testleri ve Wilcoxon işaretli sıra testleri gerçekleştirilmiştir; 20 geçerli boylamsal eşleştirilmiş t testi üzerinden Benjamini–Hochberg FDR düzeltmesi uygulanmıştır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Kompartmanlar arası testler faydalı bir nüansı ortaya çıkardı. Sabitleyicideki bireysel nazal ve kan etki boyutları zayıf düzeyde uyumlu olmasına rağmen, nazofaringeal örneklere uygulanan kan modülü 0,845'lik bir AUROC değeri verdi. Eşleşmiş yörüngelerin incelenmesi, tersine dönmüş bir etiket dağılımından ziyade tutarlı bir skor düşüşü olduğunu gösterdi. Bu nedenle sonuç, aynı bireysel genlerin her iki dokuya da hakim olduğunun bir kanıtı değildir. Bu durum, koordine bir interferon/inflamatuar programın, farklı ancak kısmen yedekli gen setleri ile özetlenebileceğini göstermektedir. Kompartman özgüllüğü, gen sıralama düzeyinde en güçlüdür ve yolak veya skor düzeyinde mutlak değildir.
Semptom gradyan davranışını test etmek için ayrılan asemptomatik tespitler
GSE117827'deki asemptomatik picornavirus tespitleri, birincil kontrol grubuna dahil edilmelerini önlemek için modül oluşturma sürecinin dışında tutulmuştur. Bu ayrılan grup, daha sonra biyolojik bir kontrol sağlamıştır. Her iki kompartıman da, virüs-negatif kontroller, asemptomatik picornavirus tespiti ve semptomatik enfeksiyondan oluşan sıralı gruplar boyunca modül skorlarının arttığını göstermiştir (Şekil 6A,B).
Şekil 6. Ayrılmış semptom gradyanı boyunca modül skorları. (A) Burun modülü: 6 virüs-negatif kontrol, 5 asemptomatik picornavirus tespiti ve 15 semptomatik enfeksiyon. (B) Kan modülü: 6 virüs-negatif kontrol, 5 asemptomatik picornavirus tespiti ve 13 semptomatik enfeksiyon. Noktalar bireysel örnekleri temsil etmektedir. Orta çizgiler medyanları göstermektedir; kutular 25. ve 75. persentilleri kapsamakta; bıyıklar ise interkuartil aralığın 1,5 katı içindeki en uç değerlere kadar uzanmaktadır. Etiketler, her kompartman başına üç karşılaştırma için Benjamini–Hochberg düzeltmeli çift yönlü Mann–Whitney U post-hoc karşılaştırmalarını bildirmektedir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Nazal modül, sıralı semptom skoru ile korelasyon gösterdi (Spearman rho = 0.818, P = 3.28 × 10⁻7; Kruskal-Wallis P = 1.57 × 10⁻4). Kan modülü de benzer bir gradyan sergiledi (rho = 0.861, P = 6.89 × 10⁻8; Kruskal-Wallis P = 1.92 × 10⁻4). Her üçlü karşılaştırma ailesi içindeki düzeltme sonrasında, semptomatik enfeksiyon, her iki kompartımanda da kontrollerden ve asemptomatik tespitlerden farklılık gösterdi. Asemptomatik tespitler, virüs negatif kontrollerden farklılık göstermedi (nazal FDR = 0.792; kan FDR = 0.082). Bu nedenle modüller, semptomatik konak yanıt aktivitesini yalnızca viral tespit yöntemine göre daha net bir şekilde takip etti.
Klinik referans değerleri konak yanıtı ile patojen özgüllüğü arasındaki sınırı belirlemiştir
Klinik referans değerleri, konak yanıt aktivitesi ile patojen sınıflandırması arasındaki ayrımı tanımlamıştır (Tablo 5; Şekil 7). GSE63990'da, nazal modül viral hastalık ile bakteriyel hastalık için 0,782 ve viral hastalık ile enfeksiyöz olmayan hastalık için 0,791 AUROC değerleri vermiştir. Kan modülü ise sırasıyla 0,678 ve 0,753 AUROC değerleri vermiştir. Pandya 33-mRNA karşılaştırıcısı, sırasıyla 0,867 ve 0,852 AUROC değerleri ile daha iyi performans göstermiştir. Viral/viral olmayan ayrımı için tasarlanmış bir set için bu sonuç beklenmektedir ve çapa modüllerinin yerini alan tanısal sınıflandırıcılar olarak sunulmaması gerektiğini göstermektedir.
| Veri Seti | Kontrast | Nazal ankraj | Ankraj kanı | Pandya 33 mRNA | Andres-Terre ISG | Belirleyici interferon-alfa |
| GSE63990 | Viral ve bakteriyel | 0.782 | 0.678 | 0.867 | 0.833 | 0.831 |
| GSE63990 | Viral ve enfeksiyöz olmayan | 0.791 | 0.753 | 0.852 | 0.851 | 0.848 |
| GSE40012 | Viral ve bakteriyel pnömoni | 0.755 | 0.789 | 0.893 | 0.867 | 0.872 |
| GSE40012 | Viral pnömoni ve SIRS karşılaştırması | 0.897 | 0.907 | 0.985 | 0.965 | 0.956 |
| GSE40012 | Viral pnömoni ile sağlıklı kontrol karşılaştırması | 0.804 | 0.986 | 0.923 | 0.906 | 0.891 |
| GSE40012 | Bakteriyel pnömoni ve sağlıklı karşılaştırması | 0.476 | 0.917 | 0.465 | 0.391 | 0.378 |
| GSE53543 | Ex vivo rhinovirus ile stimüle edilmiş ve edilmemiş PBKlar | 1 | 0.957 | 1 | 1 | 1 |
Tablo 5: Çapa modülleri ve referans konak-yanıt setleri için AUROC kıyaslaması. GSE63990 ve GSE40012 klinik tüm kan kohortlarıdır. GSE53543, 98 eşleşmiş denek içeren ex vivo PBMC pertürbasyon deneyidir ve doğal klinik kohortlardan ayrı olarak rapor edilmiştir. Referans setler, orijinal ağırlıklı sınıflandırıcıları yerine ağırlıklandırılmamış gen ortalamaları olarak skorlanmıştır. AUROC değerleri, klinik diyagnostik performans tahminleri olarak değil, kıyaslama metrikleri olarak rapor edilmiştir.
Şekil 7. Çapa modüllerinin ve referans konak yanıt setlerinin AUROC kıyaslaması. Satırlar GSE63990, GSE40012 ve GSE53543'teki önceden belirlenmiş karşılaştırmaları; sütunlar ise iki çapa modülünü ve ağırlıklandırılmamış üç referans seti temsil etmektedir. GSE53543, ex vivo rhinovirus-stimüle edilmiş ve edilmemiş PBK'lar olarak etiketlenmiş olup doğal klinik kohortlardan ayrı olarak sunulmuştur. Hallmark karşılaştırıcı Hallmark interferon-alfa olarak etiketlenmiştir. Hücre değerleri, yöntem kıyaslaması için kullanılan AUROC'ları belirtir ve klinik tanı performansı tahminleri olarak yorumlanmamalıdır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
GSE40012 bu sınırı netleştirmiştir. Pandya karşılaştırıcısı, viral pneumonia ile bakteriyel pneumonia arasında 0,893 ve viral pneumonia ile SIRS arasında 0,985 AUROC değerlerine ulaşmıştır. Kan modülü, influenza A pneumonia'yı sağlıklı kontrollerden (AUROC = 0,986) ve SIRS'den (AUROC = 0,907) ayırmış, ancak aynı zamanda bakteriyel pneumonia'yı da sağlıklı kontrollerden ayırmıştır (AUROC = 0,917). Bu nedenle kan modülü, geniş sistemik inflamatuar ve interferon ilişkili aktiviteyi ölçmektedir. Virüse özgü değildir ve yüksek bir skor, patojen sınıfı ataması yapamaz.
Ayrı bir GSE53543 ex vivo PBMC kıyaslamasında, nazal modül ve interferon karşılaştırıcıları, rhinovirus ile stimüle edilmiş PBMC'lere karşı yalnızca medyum içeren PBMC'ler için 1,000 AUROC değerine ulaşmıştır; kan modülü ise 0,957 AUROC değerine ulaşmıştır. 98 deneğin tamamı eşleştirilmiş koşullara katkıda bulunmuştur. Bu kontrollü sonuç, skorlanan programların rhinovirus stimülasyonuna karşı yanıt verme yeteneğini desteklemektedir. Bu çalışma, klinik tanı performansını tahmin etmemektedir.
Sağlamlık kontrolleri modül boyutunu, rastgele alternatifleri ve seçim stabilitesini test etti
En üst sırada yer alan 10, 25, 50, 100 ve 200 gen genelinde çıpa ayrımı değişmedi (Şekil 8A). Bu dahili AUROC değerleri dış doğrulama teşkil etmemekle birlikte, kalitatif sonucun tam olarak 50 gen seçilmesine bağlı olmadığını göstermektedir. 500 rastgele 50'li gen setinde, null AUROC medyanları nazal için 0,489 ve kan için 0,705 olarak belirlendi; buna karşılık 99. persentiller 0,722 ve 0,872 idi (Şekil 8B). Gözlemlenen modüller bu null dağılımları aşmıştır. Bootstrap seçim frekansları, tek bir değişmez liste üzerinde yoğunlaşmak yerine dağılım göstermiştir (Şekil 8C). Bu bulgu, doğrudan küçük çıpa örneğini yansıtmaktadır. Bu durum, seçilen her genin sabit kabul edilmemesi konusunda uyarıda bulunurken, stabil bir toplam sinyali desteklemektedir.
Şekil 8. Modül boyutu, rastgele gen ve bootstrap sağlamlık analizleri. (A) 10, 25, 50, 100 ve 200 genlik modül boyutlarındaki çapa AUROC değerleri; bu değerler dahili duyarlılık kontrollerini temsil etmektedir. (B) GSE117827'de temsil edilen genler arasından yerine koymadan örneklenen 500 rastgele protein kodlayan 50 genlik setten elde edilen AUROC dağılımları (seed = 20260622). Turuncu noktalar gözlemlenen modül AUROC değerlerini göstermektedir. Her bir keman grafiğindeki yatay çizgiler %25'lik dilimi, medyanı ve %75'lik dilimi belirtmektedir. (C) Bootstrap yeniden seçimi, her bir kompartman için orijinal çapa analizinde en yüksek sırada yer alan pozitif etkili 1.000 protein kodlayan genle sınırlandırılmıştır. Çubuklar, kompartman başına en yüksek seçim frekansına sahip 20 geni göstermektedir; seçim frekansı, seçim sayısının 100'e bölünmesiyle hesaplanmıştır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Markör-program ve varyans analizleri skorların neyi ölçtüğünü netleştirmiştir
GSE40012, GSE53543 ve GSE63990 genelinde, her iki modül de myeloid interferon programı ile en tutarlı korelasyonu göstermiştir (Şekil 9A). Nazal modül korelasyonları 0,812, 0,878 ve 0,882; kan modülü korelasyonları ise 0,517, 0,843 ve 0,774 olarak belirlenmiştir. Varyans bölümlendirmesi tanımlayıcı niteliktedir (Tablo 6; Şekil 9B). Kan modülü için durum ve detaylı grup, veri setinden (0,066), örnek tipinden (0,026) veya kaynak gruptan (0,025) daha fazla varyansı açıklamıştır (sırasıyla eta-kare = 0,282 ve 0,250). Nazal modül için de detaylı grup ve durum, veri seti, örnek tipi veya kaynak gruptan daha fazla varyansı açıklamıştır. Bu nedenle, biyolojik durum ve detaylı grup, modül skor varyansının daha büyük kısımlarını açıklamıştır; ancak sıfır olmayan veri seti ve kompozisyon etkileri, dökme (bulk) kamu verilerinin yeniden kullanımının bir sınırlaması olmaya devam etmektedir.
Şekil 9. Markör-program korelasyonları ve tanımlayıcı varyans bölüştürme. (A) GSE40012, GSE53543 ve GSE63990'da modül skorları ile altı markör-program skoru arasındaki Spearman korelasyonları. Programlar için en az üç temsil edilen gen gereklidir. P değerleri tüm veri seti-modül-program korelasyonları genelinde düzeltilmiştir. Boş hücreler, gen ve örnek gereksinimlerinden sonra mevcut olmayan veya tahmin edilemeyen kombinasyonları belirtir. (B) Durum, detaylı grup, veri seti, örnek tipi ve kaynak grup için tek yönlü eta-kare (η2; gruplar arası kareler toplamı/toplam kareler toplamı). Analiz 934 kan-modül ve 1.469 nazal-modül skorunu içermektedir ve nedensel değil, tanımlayıcıdır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Modül | Faktör | Eta-kare | n örnek |
| Ankraj kanı | Koşul | 0.282 | 934 |
| Çapa kanı | Detaylı grup | 0.25 | 934 |
| Kan sabitleme | Veri Seti | 0.066 | 934 |
| Ankraj kanı | Numune tipi | 0.026 | 934 |
| Ankraj kanı | Kaynak grup | 0.025 | 934 |
| Nazal anker | Detaylı grup | 0.17 | 1469 |
| Nazal ankraj | Koşul | 0.13 | 1469 |
| Nazal ankraj | Veri Seti | 0.021 | 1469 |
| Nazal ankraj | Örnek türü | 0.006 | 1469 |
| Nazal ankraj | Kaynak grup | 0.002 | 1469 |
Tablo 6: Modül skorlarının tanımlayıcı varyans bölümlemesi. Her bir modül-faktör çifti için, karşılık gelen eta-kare ve örneklem boyutu ile birlikte bir satır sağlanmıştır. Eta-kare, ilgili modül skoru veya faktörü eksik olan satırlar hariç tutulduktan sonra, gruplar arası kareler toplamının toplam kareler toplamına bölünmesiyle hesaplanmıştır. Faktörler bireysel olarak değerlendirilmiştir; bu nedenle analiz tanımlayıcıdır, karşılıklı ilişkili faktörler için düzeltme yapmamıştır ve nedensel olarak yorumlanmamalıdır.
Veri Erişilebilirliği:
Bu çalışmada analiz edilen tüm transkriptomik veri setleri, GSE117827, GSE41374, GSE152075, GSE156063, GSE171110, GSE38900, GSE97741, GSE97742, GSE63990, GSE40012 ve GSE53543 erişim numaraları altında Gene Expression Omnibus üzerinden kamuya açıktır. Ana şekillerin ve tabloların temelini oluşturan analiz kaynaklı veriler ile analiz kodları, makul talep üzerine sorumlu yazardan temin edilebilir. Bu çalışmada kısıtlanmış veya yeni oluşturulmuş katılımcı düzeyinde veri kullanılmamıştır.
Tartışma
Temel ders operasyoneldir: işlemlere en büyük havuzlanmış matrisle değil, örneklenen kompartmanla başlayın. GSE17827 küçüktür, ancak eşleştirilmiş tasarımı tek bir çalışma dahilinde doğrudan burun-kan karşılaştırmasına izin verir. Gen düzeyindeki etki korelasyonunun sıfıra yakın olması, havuzlanmış pan-doku sıralama listesinin önemli kompartman yapılarını gizleyeceğini göstermektedir. Bu nedenle, ayrı modüller daha savunulabilir bir tasarımdı. Modüllerin harici ve boylamsal performansı, evrensel bir gen listesini değil, modül düzeyinde tekrarlanabilir konak yanıt aktivitesini desteklemektedir.
Gen düzeyindeki ve modül düzeyindeki taşınabilirlik birbirinden farklıdır. Bireysel nazal ve kan etki büyüklükleri arasında zayıf bir uyum olmasına rağmen, kan modülü nazofaringeal boylamsal örneklerde iyi performans göstermiştir (AUROC 0.845). Eşleştirilmiş yörüngeler etiket tersinmesi göstermemiştir. Daha olası bir açıklama yol yedekliliğidir: koordineli interferon ve inflamatuar aktivite, farklı kompartmanlardaki farklı gen alt kümeleri ile özetlenebilir6,7,8,9,10,1,32,3,34. Modülleri kompartman-özel değil, kompartman-duyarlı olarak tanımlamamızın nedeni budur. Kesin sıralamalar farklılık gösterse de, ortak bir yol-düzeyindeki bileşen tespit edilebilir durumda kalmaktadır. Toplu profiller ayrıca ekspresyon değişikliklerini hücre kompozisyonundaki değişikliklerle karıştırır. Markör-program korelasyonları bu sorunu işaret edebilir, ancak hücre çözünürlüğünde mekanizmalar sağlayamazlar36,37.
Klinik kıyaslama noktaları ikinci bir sınır belirler. Pandya 3-mRNA ve interferon karşılaştırıcıları, viral-bakteriyel ayrımı için daha güçlüydü. Çapa modülleri ise farklı bir soruyu yanıtlar: bir örnek, akut konak yanıt programını ne kadar güçlü eksprese eder? Kan modülü bakteriyel pnömonide de artış göstermiştir. Bu nedenle, virüse özgü bir sınıflandırıcı olarak değil, geniş bir sistemik inflamatuar/interferon aktivite skoru olarak yorumlanmalıdır. Yüksek bir skor, kohort karşılaştırmasını, yanıt takibini veya inflamatuar durum tanımlamasını destekleyebilir ancak patojeni tanımlayamaz. İnsan metapnömovirüsü gibi virüslerin artan klinik önemi, dar bir virüs setinden ekstrapolasyon yapmak yerine, patojen açısından çeşitli ve dokuyla eşleştirilmiş bir validasyonun gerekliliğini daha da desteklemektedir12,13.
Örtüşen altı gen araştırma amaçlıdır. ISG15, IFIT1, RSAD2 ve XAF1'in interferon ile bağlantılı makul rolleri vardır32,3,34; CCRL2 enflamatuar lökosit migrasyonu ile ilişkilidir35; ACRBP'nin ise belirlenmiş bir antiviral yorumu yoktur. Küçük kohort ve gen bazındaki anlamlı olmayan FDR değerleri, daha güçlü iddialarda bulunulmasını engellemektedir. Metodolojik yenilik başka noktalarda yatmaktadır: aynı çalışma eşleşmiş çapası, kilitli kompartman spesifik modülleri, dokuyla eşleşmiş harici testler, eşleşmiş geri kazanım analizi, klinik karşılaştırıcı kıyaslaması ve açık rastgelelik, boyut, bootstrap, belirteç ve varyans kontrolleri. Bu kanıt hiyerarşisi, sonuçların yorumlanması için muhafazakâr bir çerçeve sunmaktadır.
Bazı kısıtlamalar devam etmektedir. Çapa kohortu yalnızca 15 enfekte ve 6 kontrol burun örneği ile 13 enfekte ve 6 kontrol kan örneği içermektedir. Bootstrap sonuçları, bireysel gen üyeliğinin tamamen stabil olmadığını doğrulamaktadır. Semptomatik RSV ve pikornavirüs birleştirildiği için çapa etkileri virüse özgü değildir. Harici kohortlar yaş, platform, şiddet, zamanlama ve kontrol tanımı açısından farklılık göstermektedir. GSE53543, ex vivo eşleştirilmiş bir perturbasyon çalışmasıdır. GSE6390 ve GSE4012 faydalı klinik karşılaştırıcılar sunmakta ancak eşleştirilmiş burun-kan örneklemesi sağlamamaktadır. Viral yük, semptom süresi, oksijen ihtiyacı ve şiddet verileri tutarlı bir şekilde mevcut değildi. Daha güçlü bir prospektif tasarım; viral yük ve semptom ölçümleriyle birlikte, aynı katılımcılardan eşleşmiş zaman noktalarında burun sürüntüleri ve kan örnekleri, bakteriyel ve semptomatik virüs-negatif karşılaştırıcılar ve hücre çözünürlüklü doğrulama toplayacaktır1,14,36,37.
Sonuç olarak, mevcut halka açık transkriptomlar, doku bağlamı korunduğunda tekrarlanabilir nazal ve kan konak yanıt aktivite modüllerini desteklemektedir. Bunlar, dokular arası değişim yapılabilir genel bir gen imzasını desteklememektedir. Eşleştirilmiş çapa, gen düzeyinde çok az uyum göstermişken, kilitli modül skorları eşleşmiş dokular arasında aktarılmış ve iyileşme sürecinde azalmıştır. Bakteriyel pnömonide kan modülünün yanıtı ve yerleşik bir sınıflandırıcının viral-bakteriyel karşılaştırmasındaki üstün performansı, hedeflenen kullanım amacını belirlemektedir: bu modüller konak yanıt aktivitesini tanımlamakta ve şeffaf kohort kıyaslamasını desteklemektedir; bunlar tek başına patojen sınıflandırıcıları değildir. Analiz kodu ve türetilen veriler, iş akışının bağımsız doğrulanmasını ve yeniden kullanımını desteklemek amacıyla Veri Kullanılabilirliği beyanında açıklandığı şekilde erişime açıktır.
Açıklamalar
Yazarlar, bu çalışma ile ilgili herhangi bir finansal veya finansal olmayan çıkar çatışması beyan etmemektedirler.
Teşekkürler
Yazarlar, bu çalışmada yeniden analiz edilen halka açık GEO çalışmalarının araştırmacılarına ve katılımcılarına teşekkür eder. Yazarlık kriterlerini karşılayan başka kişi bulunmamaktadır. Bu araştırma; kamu, ticari veya kâr amacı gütmeyen sektörlerdeki herhangi bir finansman kuruluşundan özel bir hibe almamıştır.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Andres-Terre çoklu virüs interferon uyarılı gen seti | Andres-Terre ve ark. | 3 genli karşılaştırıcı; Ek Veri 1 | Bildirilen çoklu virüs imzasından derlenen, ağırlıklandırılmamış interferon odaklı karşılaştırıcı; gen listesinin tamamı Ek Veri 1'de sunulmuştur. |
| Enrichr | Ma'ayan Laboratuvarı | Erişim tarihi 18 Ağustos 2026; RRID:SCR_01575 | gseapy aracılığıyla erişilen gen seti aşırı temsil kaynağı. |
| Gen Ekspresyonu Omnibus'u | Ulusal Biyoteknoloji Bilgi Merkezi | GEO; RRID:SCR_005012 | Analiz edilen veri setlerine erişmek için kullanılan halka açık transkriptom deposu. |
| Gen Ontolojisi | Gen Ontolojisi Konsorsiyumu | GO Biyolojik Süreç 2023; RRID:SCR_0281 | Enrichr aracılığıyla kullanılan fonksiyonel anotasyon kütüphanesi. |
| GPL1058 | NCBI GEO | GPL1058 | GSE53543 için platform ve 36 örneklik GSE3890 doğrulama birimi. |
| GPL23126 | NCBI GEO | GPL23126 | GSE17827 için ekspresyon platformu. |
| GPL24539 | NCBI GEO | Clariom_D_Human.na36.hg38. probeset.csv | GSE17827 transkript-küme eşlemesi için Clariom D Human na36, hg38 anotasyonu kullanılmıştır. |
| GPL571 | NCBI GEO | GPL571 | GSE6390'a platform anotasyonu uygulanmıştır. |
| GPL6884 | NCBI GEO | GPL6884 | 138 örnekli GSE3890 RSV tüm kan doğrulama birimi için platform. |
| GPL6947 | NCBI GEO | GPL6947 | GSE40012'ye platform anotasyonu uygulanmıştır. |
| GSE17827 | NCBI GEO | GSE17827 | Birincil eşleştirilmiş nazal sürüntü ve tam kan çapa veri seti. |
| GSE152075 | NCBI GEO | GSE152075 | Harici SARS-CoV-2 üst solunum yolu doğrulama veri seti. |
| GSE156063 | NCBI GEO | GSE156063 | Harici SARS-CoV-2 üst solunum yolu doğrulama veri seti. |
| GSE1710 | NCBI GEO | GSE1710 | Harici SARS-CoV-2 tam kan doğrulama veri seti. |
| GSE3890 | NCBI GEO | GSE3890; GPL10558 ve GPL684 | Ayrı ayrı normalize edilmiş 36 ve 138 örnekli platform birimleri olarak analiz edilen harici RSV tam kan doğrulaması. |
| GSE40012 | NCBI GEO | GSE4012 | Klinik influenza A pnömonisi, bakteriyel pnömoni, SIRS ve sağlıklı kontrol referansı. |
| GSE41374 | NCBI GEO | GSE41374 | Harici RSV nazal yıkama doğrulama veri seti. |
| GSE53543 | NCBI GEO | GSE53543 | 98 denek ve 196 örnek içeren, eşleştirilmiş ex vivo PBMC rhinovirus perturbasyon kıyaslaması. |
| GSE6390 | NCBI GEO | GSE6390 | Klinik viral, bakteriyel ve enfeksiyöz olmayan tam kan referans örneği. |
| GSE97741 | NCBI GEO | GSE97741 | Boylamsal tam kan akut durum ve taburculuk karşılaştırmalı doğrulama veri seti. |
| GSE9742 | NCBI GEO | GSE97742 | Boylamsal nazofaringeal akut-veya-taburculuk doğrulama veri seti. |
| gseapy | gseapy geliştiricileri | Sürüm 1.3.1 | Enrichr'ı sorgulamak için kullanılan Python arayüzü. |
| HGNC gen sembolü kaynağı | HUGO Gen Nomenklatür Komitesi | Erişim tarihi 18 Ağustos 2026; RRID:SCR_02827 | Onaylanmış gen sembolü normalleştirme ve protein kodlayan sınıflandırma kaynağı. |
| Matplotlib | Matplotlib geliştirme ekibi | Sürüm 3.1.1 | Şekil oluşturma. |
| MSigDB Hallmark gen setleri | Broad Institute | Hallmark 2020; RRID:SCR_016863 | Enrichr üzerinden erişilen Hallmark zenginleştirme kütüphanesi. |
| MSigDB Hallmark interferon-alfa yanıt gen seti | Broad Institute | BELİRGİN_İNTERFERON_ALFA_ YANIT; Ek Veri 1'deki 3 genlik çekirdek alt küme | Ağırlıklandırılmamış interferon-alfa karşılaştırıcısı; kesin alt küme Ek Veri 1'de verilmiştir. |
| NumPy | NumPy geliştiricileri | Versiyon 2.5.2 | Sayısal hesaplama ve tohumlanmış rastgele örnekleme. |
| pandas | pandas geliştirme ekibi | Sürüm 3.0.5 | Tablo verilerinin işlenmesi. |
| Pandya 33-mRNA konak yanıt gen seti | Pandya ve ark. | Ek Tablo 1; Ek Veri 1 | Ağırlıklandırılmamış bir karşılaştırıcı olarak puanlanan resmi 3 gen seti. |
| Python | Python Software Foundation | Sürüm 3.12.13 | Hesaplamalı analiz ortamı. |
| Reactome | Reactome | Reactome 202; RRID:SCR_03485 | Enrichr aracılığıyla erişilen yol zenginleştirme kütüphanesi. |
| scikit-learn | scikit-learn geliştiricileri | Versiyon 1.9.0 | AUROC ve ortalama hassasiyet hesaplamaları. |
| SciPy | SciPy geliştiricileri | Versiyon 1.18.0 | Welch, eşli t, Wilcoxon, Mann–Whitney ve korelasyon testleri. |
| Seaborn | Seaborn geliştirme ekibi | Sürüm 0.13.2 | İstatistiksel grafikler. |
| statsmodels | statsmodels geliştiricileri | Sürüm 0.14.6 | İstatistiksel araçlar. |
Kaynaklar
- Zaas AK, et al. Gene expression signatures diagnose influenza and other symptomatic respiratory viral infections in humans. Cell Host Microbe. 2009;6(3):207-17.
- Woods CW, et al. A host transcriptional signature for presymptomatic detection of infection in humans exposed to influenza H1N1 or H3N2. PLoS One. 2013;8(1):e52198.
- Andres-Terre M, et al. Integrated, multi-cohort analysis identifies conserved transcriptional signatures across multiple respiratory viruses. Immunity. 2015;43(6):1199-211.
- Herberg JA, et al. Diagnostic test accuracy of a 2-transcript host RNA signature for discriminating bacterial vs viral infection in febrile children. JAMA. 2016;316(8):835-45.
- Pandya R, et al. A machine learning classifier using 33 host immune response mRNAs accurately distinguishes viral and non-viral acute respiratory illnesses in nasal swab samples. Genome Med. 2023;15(1):64.
- Ioannidis I, et al. Plasticity and virus specificity of the airway epithelial cell immune response during respiratory virus infection. J Virol. 2012;86(10):5422-36.
- Mejias A, et al. Whole blood gene expression profiles to assess pathogenesis and disease severity in infants with respiratory syncytial virus infection. PLoS Med. 2013;10(11):e1001549.
- Blanco-Melo D, et al. Imbalanced host response to SARS-CoV-2 drives development of COVID-19. Cell. 2020;181(5):1036-45.e9.
- Hadjadj J, et al. Impaired type I interferon activity and inflammatory responses in severe COVID-19 patients. Science. 2020;369(6504):718-24.
- Mick E, et al. Upper airway gene expression reveals suppressed immune responses to SARS-CoV-2 compared with other respiratory viruses. Nat Commun. 2020;11(1):5854.
- Yoshida M, et al. Local and systemic responses to SARS-CoV-2 infection in children and adults. Nature. 2022;602(7896):321-7.
- Jamali MC, et al. Respiratory infections by human metapneumovirus: epidemiological evidence and treatment prospects. Res J Pharm Technol. 2026;19(8):3905-12. doi:10.52711/0974-360X.2026.00549.
- Gao G, Lin R, Ma D. Human metapneumovirus: pathogenesis, epidemiology, diagnostic technologies, and potential intervention strategies. Virol J. 2025;22(1):376.
- Lim FY, et al. homeRNA self-blood collection enables high-frequency temporal profiling of presymptomatic host immune kinetics to respiratory viral infection: a prospective cohort study. EBioMedicine. 2025;112:105531.
- Johnson WE, Li C, Rabinovic A. Adjusting batch effects in microarray expression data using empirical Bayes methods. Biostatistics. 2007;8(1):118-27.
- Leek JT, et al. The sva package for removing batch effects and other unwanted variation in high-throughput experiments. Bioinformatics. 2012;28(6):882-3.
- Yu J, et al. Host gene expression in nose and blood for the diagnosis of viral respiratory infection. J Infect Dis. 2019;219(7):1151-61.
- Tsalik EL, et al. Host gene expression classifiers diagnose acute respiratory illness etiology. Sci Transl Med. 2016;8(322):322ra11.
- Parnell GP, et al. A distinct influenza infection signature in the blood transcriptome of patients with severe community-acquired pneumonia. Crit Care. 2012;16(4):R157.
- Edgar R, Domrachev M, Lash AE. Gene Expression Omnibus: NCBI gene expression and hybridization array data repository. Nucleic Acids Res. 2002;30(1):207-10.
- Barrett T, et al. NCBI GEO: archive for functional genomics data sets-update. Nucleic Acids Res. 2013;41(D1):D991-5.
- Tweedie S, et al. Genenames.org: the HGNC and VGNC resources in 2021. Nucleic Acids Res. 2021;49(D1):D939-46.
- Welch BL. The generalization of Student's problem when several different population variances are involved. Biometrika. 1947;34(1-2):28-35.
- Benjamini Y, Hochberg Y. Controlling the false discovery rate: a practical and powerful approach to multiple testing. J R Stat Soc Series B Stat Methodol. 1995;57(1):289-300.
- Subramanian A, et al. Gene set enrichment analysis: a knowledge-based approach for interpreting genome-wide expression profiles. Proc Natl Acad Sci U S A. 2005;102(43):15545-50.
- Liberzon A, et al. The Molecular Signatures Database Hallmark Gene Set Collection. Cell Syst. 2015;1(6):417-25.
- Do LAH, et al. Host transcription profile in nasal epithelium and whole blood of hospitalized children under 2 years of age with respiratory syncytial virus infection. J Infect Dis. 2018;217(1):134-46.
- Ashburner M, et al. Gene Ontology: tool for the unification of biology. Nat Genet. 2000;25(1):25-9.
- The Gene Ontology Consortium. The Gene Ontology resource: enriching a GOld mine. Nucleic Acids Res. 2021;49(D1):D325-34.
- Gillespie M, et al. The Reactome pathway knowledgebase 2022. Nucleic Acids Res. 2022;50(D1):D687-92.
- Kuleshov MV, et al. Enrichr: a comprehensive gene set enrichment analysis web server 2016 update. Nucleic Acids Res. 2016;44(W1):W90-7.
- Schoggins JW, et al. A diverse range of gene products are effectors of the type I interferon antiviral response. Nature. 2011;472(7344):481-5.
- Schneider WM, Chevillotte MD, Rice CM. Interferon-stimulated genes: a complex web of host defenses. Annu Rev Immunol. 2014;32:513-45.
- Perng YC, Lenschow DJ. ISG15 in antiviral immunity and beyond. Nat Rev Microbiol. 2018;16(7):423-39.
- Schioppa T, et al. Molecular basis for CCRL2 regulation of leukocyte migration. Front Cell Dev Biol. 2020;8:615031.
- Avila Cobos F, et al. Benchmarking of cell type deconvolution pipelines for transcriptomics data. Nat Commun. 2020;11(1):5650.
- Maden SK, et al. Challenges and opportunities to computationally deconvolve heterogeneous tissue with varying cell sizes using single-cell RNA-sequencing datasets. Genome Biol. 2023;24(1):288.