Bu protokol, torasik ve abdominal bölgelerden primer fare aortik düz kas hücrelerinin izole edilmesi ve kültüre edilmesi için tekrarlanabilir bir yöntemi tanımlamaktadır. Bu yöntem, vasküler yeniden şekillenme ve anevrizma ile ilişkili biyolojinin in vitro çalışmaları için uygun canlı hücreler sağlar.
Yöntem makalesi
Vasküler Remodelleme ve Aort Anevrizması Biyolojisi ile İlgili In vitro Çalışmalar için Primer Murin Aortik Düz Kas Hücrelerinin İzolasyonu ve Kültürü
Bu makalede
Özet
Özet
Primer aortik düz kas hücrelerinin (SMC'ler) izolasyonu ve kültürü, aort anevrizmaları da dahil olmak üzere vasküler hastalıkların altında yatan hücresel mekanizmaların araştırılması için değerli bir yaklaşım sunar. Bu makale, torasik ve abdominal aort segmentlerinden murine aortik SMC'lerin izolasyonu ve kültürü için ayrıntılı ve optimize edilmiş bir protokol açıklamaktadır. Mevcut prosedür; dikkatli aort diseksiyonunu, çevre dokunun uzaklaştırılmasını, kollajenaz, elastaz ve soya fasulyesi tripsin inhibitörü kullanılarak gerçekleştirilen iki aşamalı enzimatik sindirimi, ardından mekanik disosyasyonu ve tanımlanmış kültür koşulları altında hücre genişletmesini içerir. Adventisya temizlenmesi ve kontrollü sindirim süresi dahil olmak üzere, hücre verimini, saflığını ve tekrarlanabilirliğini artıran adımlara özel önem verilmiştir. Bu yaklaşım kullanılarak, karakteristik morfoloji ve büyüme modelleri sergileyen primer SMC'ler başarıyla izole edilebilir ve genişletilebilir. Bu protokol, primer aortik SMC'lerin üretimi için tekrarlanabilir ve uyarlanabilir bir yaklaşım sağlar; vasküler yeniden şekillenme ve aort anevrizması biyolojisi ile ilgili in vitro çalışmalar için bir platform görevi görür.
Giriş
Aort düz kas hücreleri (SMC'ler), aortanın hem yapısal bütünlüğüne hem de fonksiyonel düzenlemesine katkıda bulunan vasküler duvarın temel bileşenleridir. Sağlıklı damarlarda SMC'ler; α-smooth muscle actin (α-SMA) ve smooth muscle myosin heavy chain (MYH11) gibi kontraktil proteinlerin ekspresyonu ile karakterize kontraktil bir fenotipi korurlar1,2,3. Bu fenotip vasküler tonusu destekler ve hücre dışı matris organizasyonunu korur. Ancak, abdominal aort anevrizması (AAA) gibi patolojik durumlarda SMC'ler, sentetik ve pro-inflamatuar bir duruma doğru fenotipik modülasyona uğrarlar1,2,3. Bu geçiş; artmış proliferasyon, sitokin sekresyonu ve matris degrade eden enzimlerin üretimi ile ilişkilidir ve nihayetinde aort duvarının zayıflamasına katkıda bulunur4,5.
Angiotensin II (Ang II) ile indüklenen aortik anevrizma oluşumu dahil olmak üzere hayvan modelleri, AAA patogenezinin anlaşılmasını önemli ölçüde ilerletmiştir1,6,7,8,9,10,11. Bununla birlikte, bu modeller hücresel yolakların hassas manipülasyonuna veya SMC'ye özgü mekanizmaların doğrudan gözlemlenmesine izin vermemektedir. Primer SMC'lerin kullanıldığı In vitro sistemler; sinyal yolaklarının, gen düzenlemesinin ve hücresel yanıtların kontrollü koşullar altında ayrıntılı olarak incelenmesine olanak tanıyarak tamamlayıcı bir yaklaşım sunar12.
Kullanışlı olmalarına rağmen, primer fare aortik SMC'lerin izolasyonu teknik olarak zorlayıcıdır. Fare aortunun küçük boyutu, çevredeki adipoz ve bağ dokusunun varlığı ve adventisiyal fibroblastlar tarafından kontaminasyon potansiyeli, hücre saflığını bozabilir. Ek olarak, doku disosiyasyonu ile hücre canlılığının korunması arasındaki dengeyi sağlamak için enzimatik sindirim dikkatle kontrol edilmelidir. Bu adımlardaki değişkenlik, genellikle deneyler ve laboratuvarlar arasında tutarsız sonuçlara yol açar.
Primer fare aortik düz kas hücrelerinin izolasyonu ve kültürünü açıklayan birçok protokol yayınlanmıştır; bunların çoğu, enzimatik sindirim öncesinde adventisyanın tamamen mekanik olarak uzaklaştırılmasına dayanmakta ve öncelikle tüm aortlara veya torasik aort segmentlerine odaklanmaktadır13,14. Mevcut protokol, tam doku disosiasyonundan önce adventisya ve medya tabakalarının ayrılmasını kolaylaştırmak için kısa bir enzimatik ön-sindirim adımı, aralıklı hafif mekanik disosiasyon ile standartlaştırılmış sindirim koşulları ve torasik (THX) ile abdominal (ABD) aortik düz kas hücrelerinin ayrı izolasyonu ve kültürü için bir iş akışı dahil olmak üzere çeşitli teknik iyileştirmeleri entegre ederek bu yöntemlerin üzerine inşa edilmiştir. Bu iyileştirmeler hep birlikte, vasküler yeniden şekillenme ve anevrizma biyolojisinin bölgeye özgü çalışmalarını kolaylaştırırken, doku işlemenin tutarlılığını ve tekrarlanabilirliğini artırmayı amaçlamaktadır. Elde edilen SMC kültürleri, gen susturma, farmakolojik çalışmalar ve vasküler yeniden şekillenme ile anevrizma biyolojisi ile ilgili mekanistik incelemeler dahil olmak üzere geniş bir yelpazedeki alt uygulamalar için uygundur. Hastalıksız aortlardan izole edilen primer SMC'ler doğuştan anevrizmal fenotipleri taklit etmeseler de, hedeflenmiş deneysel manipülasyonun ardından anevrizma gelişiminde rol oynayan hücresel yolakların araştırılması için kontrollü bir in vitro sistem sağlarlar.
Protokol
Aşağıda açıklanan prosedür için 18–20 g ağırlığında, 8-10 haftalık yetişkin dişi C57BL/6J fareler kullanılmıştır. Her izolasyon için iki fare kullanılmıştır. Tüm hayvan prosedürleri, Kentucky Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi'nin (IACUC) kılavuzlarına uygun olarak gerçekleştirilmiş ve 2022-4153 numaralı protokol kapsamında onaylanmıştır. Kullanılan tüm reaktiflerin ve ekipmanların ayrıntıları şurada listelenmiştir: Materyal TablosuTam izolasyon ve kültür iş akışının şematik bir genel görünümü şurada gösterilmiştir: Şekil 1.
DİKKAT: Ketamin ve ksilazin kontrollü maddelerdir; kurumsal politikalar ve geçerli düzenlemeler uyarınca taşınmalı, saklanmalı ve imha edilmelidir. Kollajenaz tip II ve elastaz, cilt, göz ve solunum yolu iritasyonuna neden olabilen proteolitik enzimlerdir. Trypan blue tehlikeli bir boyadır; cilt ve göz temasından kaçınarak uygun kişisel koruyucu ekipmanla kullanılmalıdır. Tüm tehlikeli reaktifler, kurumsal güvenlik kılavuzlarına ve üretici talimatlarına uygun olarak taşınmalı ve imha edilmelidir.
1. Reaktiflerin ve kültür ortamlarının hazırlanması
- İzolasyon gününde, steril bir 15 mL konik tüp içerisinde 10 mL taze enzim sindirim çözeltisi hazırlayın:
- 10 mg kolajenaz tip II (nihai konsantrasyon 1 mg/mL) ekleyin (Materyaller Tablosuna bakınız).
- 10 mg soya tripsin inhibitörü (nihai konsantrasyon 1 mg/mL) ekleyin (Materyaller Tablosuna bakınız).
- 71 µL elastaz süspansiyonu (nihai konsantrasyon 0.744 U/mL) ekleyin (Materyaller Tablosuna bakınız).
- Çözeltiyi, fenol kırmızısı içermeyen, kalsiyum ve magnezyum içeren HBSS içerisinde hazırlayın (Materyaller Tablosuna bakınız).
- 100 µL penisilin/streptomisin (nihai hacmin %1'i) ekleyin (Materyaller Tablosuna bakınız).
- Çözeltiyi iyice karıştırın ve 0.2 µm naylon şırınga filtresi kullanarak steril filtreleme yapın (Materyaller Tablosuna bakınız).
- Tam SMC kültür medyumu (500 mL) hazırlayın
- Baz medyum olarak 385 mL fenol kırmızısı içermeyen Dulbecco’s Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12) ekleyin (Materyaller Tablosuna bakınız).
- 100 mL kömür/dekstran ile işlem görmüş fetal bovine serum (%20 nihai hacim) ile takviye edin (Materyaller Tablosuna bakınız).
- 10 mL penisilin/streptomisin (%2 nihai hacim) ekleyin (Materyaller Tablosuna bakınız).
- 5 mL amfoterisin B (%1 nihai hacim) ekleyin (Materyaller Tablosuna bakınız)
- Medyumu steril filtreleyin ve 4 °C'de saklayın.
- Kullanımdan önce tüm reaktifleri 37 °C'ye ön ısıtmaya tabi tutun.
2. Doku işleme hazırlığı
- Enzim sindirim solüsyonunu, doku işlemleri öncesinde 6 kuyucuklu bir kültür plağının 4 kuyucuğuna eşit miktarda (her birine 2.5 mL) paylaştırın ve 37 °C sıcaklıkta, %5 CO₂ içeren inkübatörde önceden ısıtın. Aort segmentleri için 2 kuyucuk 'THX' ve 2 kuyucuk 'ABD' olarak belirlenmelidir. Aynı anatomik bölgeden alınan birden fazla segment tek bir kuyucukta işlenebilir.
- Tam SMC kültür medyumu içeren 2 ayrı kültür kabı hazırlayın (Materyal Tablosuna bakınız) ve bunları THX ve ABD olarak etiketleyin.
- Medyum içeren kültür kaplarını nemlendirilmiş bir inkübatörde önceden ısıtın.
- Vasküler perfüzyon ve doku işlemleri için önceden 20 mL steril HBSS hazırlayın.
- İzole edilen aortların sırayla temizlenmesi için her biri 3 mL HBSS içeren 2 ek kültür kabı hazırlayın.
- THX ve ABD aort segmentlerinin geçici olarak saklanması ve ayrılması için her biri 5 mL HBSS içeren etiketli 15 mL konik tüpler hazırlayın (Materyal Tablosuna bakınız).
- Cerrahi aletleri, hayvanlar arasında deterjan uygulayarak, distile su ile durulayarak, %70 etanol ile dezenfekte ederek ve bir boncuk sterilizatör kullanarak (Materyal Tablosuna bakınız) sterilize edin.
3. Hayvan hazırlığı ve aort diseksiyonu
- Terminal prosedürler için University of Kentucky IACUC protokol 2022-4153 uyarınca onaylandığı şekilde, ketamin (300 mg/kg) ve ksilazin (30 mg/kg) (Materyal Tablosuna bakınız) intraperitonyal (IP) enjeksiyon ile fareleri anesteziye alın.
- Parmak sıkıştırma yöntemine karşı refleks yanıtın yokluğu ile anestezinin yeterli derinlikte olduğunu doğrulayın.
- Cerrahi alanı %70 etanol kullanarak sterilize edin.
- Kurumsal ve AVMA kılavuzları uyarınca, derin cerrahi anestezi altındaki fareleri, önce kardiyak ponksiyon yoluyla kan kaybı ile ötanize edin ve ardından HBSS ile transkardiyal perfüzyon uygulayın.
- Toraks boşluğunu açın ve kan toplamak için kardiyak ponksiyon gerçekleştirin.
- 10 mL steril HBSS'yi yavaşça enjekte etmek için 25-gauge iğne takılmış bir 10 mL şırınga kullanarak sol ventrikül üzerinden vasküler sistemi perfüze edin. Kalan kanın etkili bir şekilde uzaklaştırılmasını sağlamak için yaklaşık 0,5 mL/s'lik bir perfüzyon hızı önerilir.
- Çevredeki organları (karaciğer, akciğerler, dalak, gastrointestinal sistem, böbrekler) dikkatlice çıkarın. Diyaframın bir kısmını aortaya bağlı olarak bırakın.
- Aortayı, intakt diyaframla birlikte aort kökünden iliak bifurkasyona kadar izole edin. Diyafram, THX ve ABD bölgeleri arasındaki anatomik sınır görevi görür (Şekil 2B).
- Aortayı hemen steril HBSS içine aktarın (Şekil 2A).
4. Aort temizliği ve segmentasyonu
- Aortayı içeren steril kültür kabını bir diseksiyon mikroskobunun altına yerleştirin (Materyal Tablosuna bakınız).
- Hassas pensler kullanarak yağ dokusunu ve bağ dokusunu dikkatlice temizleyin (Materyal Tablosuna bakınız).
- Aortayı THX ve ABD segmentlerine ayırın.
NOT: THX segmenti aortanın diyaframın hemen üzerindeki bölgesinden aort köküne kadar uzanırken, ABD segmenti aortanın diyaframın hemen altındaki bölgesinden iliak bifurkasyona kadar uzanır (Şekil 2B). - Temizlenen segmentleri, daha ileri işlemler için taze HBSS içeren ayrı 15 mL konik tüplere aktarın.
5. Enzimatik sindirim ve hücre izolasyonu
- Aort segmentlerini 37 °C'de 8–10 dk boyunca enzim çözeltisinde inkübe edin.
- Aort segmentlerini enzim çözeltisinden çıkarın.
- Segmentleri, THX ve ABD örnekleri için ayrılmış, tamamlanmış SMC medyası içeren ayrı kültür kaplarına aktarın .
- Kaba ve ince pensler kullanarak aorttaki adventisya tabakasını çıkarın. Aortun dış yüzeyinin pürüzsüz ve şeffaf görünmesi, görünür kalıntı bağ dokusu veya adipoz doku kalmaması durumunda adventisyanın tamamen çıkarıldığı doğrulanmış olur (Şekil 2C).
- Aort segmentlerini taze enzim çözeltisine aktarın ve medya tabakasını doğrudan çözelti içinde küçük parçalar halinde inceleyin (Şekil 3A).
- Doku fragmanlarını %5 CO₂ içeren nemlendirilmiş bir inkübatörde 37 °C'de 1 saat boyunca inkübe edin.
- Hücre salınımını kolaylaştırmak için pipetle yaklaşık 10–15 kez yukarı-aşağı çekerek nazik bir mekanik disosiyasyon gerçekleştirin (Şekil 3B).
- İnkübasyon devam ederken, toplam 2–3 saatlik bir sindirme süresine ulaşana veya homojen bir hücre süspansiyonu elde edilene kadar 30–60 dk aralıklarla mekanik disosiyasyon adımını tekrarlayın.
6. Hücre toplama, yıkama, ekim ve başlangıç kültürü
- Ayrıştırılmış hücreleri içeren enzim sindirim çözeltisini, THX ve ABD örnekleri için belirlenmiş ayrı 15 mL'lik konik tüplere (Materyal Tablosuna bakınız) aktarın.
- Her bir sindirim kuyucuğunu 5 mL kültür medyası ile durulayın ve ilgili tüplerle birleştirin.
- Hücre süspansiyonunu oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 400 × g hızında santrifüjleyin.
- Pellet oluşumu yetersizse santrifüj işlemini tekrarlayın.
- Hücre pelletini bozmadan süpernatantı uzaklaştırın (Şekil 3C).
- Hücreleri 5 mL taze kültür medyası ile yeniden süspande edin ve aynı koşullar altında santrifüjle takip edilen ek bir yıkama adımı gerçekleştirin.
- Süpernatantı uzaklaştırın ve final hücre pelletini uygun hacimdeki (genellikle 6 mL) komple SMC kültür medyumunda yeniden süspande edin.
- Torasik veya abdominal aort segmentinden elde edilen tüm hücre süspansiyonunu, 6 kuyucuklu bir kültür plağının iki kuyucuğuna (kuyucuk başına 3 mL süspande medyum) ekleyin ve 37 °C'de %5,0 CO₂ ile inkübe edin. Hücreler, izolasyonun hemen ardından önceden hücre sayımı yapılmadan ekilir; bu nedenle, bu aşamada herhangi bir hedef ekim yoğunluğu kullanılmaz.
- Hücrelerin tutunması ve başlangıç ekspansiyonu için kültürleri 5–7 gün boyunca rahatsız edilmeden muhafaza edin.
DURAKLAMA NOKTASI: Ekimden sonra, kültürler Bölüm 7'deki hücre bakımı ve ekspansiyon adımlarına geçmeden önce 5–7 gün boyunca inkübatörde tutulabilir.
7. Hücrelerin korunması ve genişletilmesi
- Kültür ortamını her 3–4 günde bir değiştirin.
- Hücre morfolojisini ve konfluensini düzenli olarak izleyin.
- Hücreler yaklaşık %80–90 konfluense ulaştığında pasajlayın.
- Kültür ortamını aspire edin ve hücreleri önceden ısıtılmış fosfat tamponlu salin (PBS) ile yıkayın (Materyaller Tablosuna bakınız).
- %0,05 trypsin-EDTA ekleyin ve 37 °C'de 5–10 dk inkübe edin.
- Hücrelerin %80–%90'ı ayrıldığında işleme devam edin.
- Ayrılmayı kolaylaştırmak için kültür plağına hafifçe vurun.
- Trypsin'i nötralize etmek için eşit hacimde komple kültür ortamı ekleyin.
- Kalan hücreleri ayırmak için nazikçe pipetleyin.
- Hücre süspansiyonunu konik tüplere aktarın ve 400 × g hızında 5 dk santrifüjleyin.
- Süpernatantı uzaklaştırın ve hücre peletini taze kültür ortamında yeniden süspande edin.
- Hücreleri 1:2 ayırma oranıyla (veya istenen deneysel yoğunlukta) ekimleyin ve %5 CO₂ içeren 37 °C'de inkübe edin. Hücrelerin rahatsız edilmeden yapışması için 24–48 sa boyunca bekleyin.
NOT: Sonraki deneyler için, kültür kaynaklı fenotipik kaymayı minimize etmek amacıyla 3. ve 7. pasajlar (P3–P7) arasındaki hücreleri kullanın. 7. pasajın ötesindeki hücreler fenotipik kaymaya daha eğilimlidir ve değişmiş morfoloji ve fonksiyon sergileyebilirler.
8. α-SMA immünofloresan boyama ile doğrulama
- Hücreleri floresan mikroskopiye uygun materyal üzerinde büyütün.
- Hücreleri, kuyu başına 15.000 hücre olacak şekilde 96 kuyucuklu optik tabanlı plakaya ekleyin. Hücrelerin istenen konfluense ulaşmasını bekleyin.
- Hücreleri fiksasyona hazırlayın
- Adherent hücrelerdeki kültür ortamını aspire edin. Kuyu başına 200 µL %0,1 Tween 20 içeren Tris tamponlu salin (TBS-T) ile her yıkama için 5 dk boyunca 3 kez yıkayın, ardından biyolojik çeker ocak vakumu ile aspire edin.
- Hücreleri fikse edin
- Kuyu başına 200 µL 1x PBS içinde %4 paraformaldehit (PFA) ekleyin. Oda sıcaklığında 10–20 dk inkübe edin, ardından aspire edin.
- Permeabilizasyon
- Kuyu başına 200 µL 1x PBS içinde %0,1 Triton X-100 ekleyin. Oda sıcaklığında 10–15 dk inkübe edin, ardından aspire edin.
- Özgül olmayan bağlanmanın bloklanması
- Hücreleri kuyu başına 200 µL TBS-T ile her yıkama için 5 dk boyunca 3 kez yıkayın. Kuyu başına 200 µL TBS-T içinde %5 sığır serum albümini (BSA) ekleyin.
- Plakayı orbital çalkalayıcıya yerleştirin ve oda sıcaklığında 1 sa boyunca yaklaşık 200 rpm'de çalkalayın.
- Primer antikor boyama
- Primer α-SMA antikorunu, %5 BSA içeren TBS-T içinde 1:1.000 dilüsyonla hazırlayın.
- Plakayı orbital çalkalayıcıdan çıkarın ve α-SMA boyama için belirlenen kuyucuklardaki bloklama solüsyonunu aspire edin. Sadece sekonder antikor kontrolü için primer antikoru eklemeyin ve kontrol kuyucuğunu %5 BSA içeren TBS-T içinde tutun.
- Experimental kuyucuklara kuyu başına 200 µL dilüe edilmiş primer α-SMA antikoru ekleyin. Experimental ve sadece sekonder kontrol kuyucuklarını 4 °C'de, hafif bir orbital çalkalayıcı üzerinde gece boyunca inkübe edin.
- Sekonder antikor boyama
- Floresan sekonder antikoru, %0,1 Tween 20 içeren TBS-T içinde 1:2.500 dilüsyonla hazırlayın.
- Plakayı orbital çalkalayıcıdan çıkarın ve tüm kuyucukları aspire edin.
- Tüm kuyucukları kuyu başına 200 µL TBS-T ile her yıkama için 5 dk boyunca 3 kez yıkayın, ardından aspire edin.
- Sadece sekonder antikor kontrolü dahil tüm kuyucuklara kuyu başına 200 µL dilüe edilmiş floresan sekonder antikor ekleyin.
- Plakayı ışıktan koruyun ve oda sıcaklığında 1 sa boyunca yaklaşık 200 rpm'de orbital çalkalayıcıda inkübe edin.
- Nükleer boyama ve floresan görüntüleme
- 2 µg/mL'lik Hoechst 33342 solüsyonu hazırlayın.
- Hücreleri kuyu başına 200 µL TBS-T ile her yıkama için 5 dk boyunca 3 kez yıkayın. Hücreleri örtecek miktarda yeterli Hoechst 33342 boyama solüsyonu ekleyin ve oda sıcaklığında, ışıktan koruyarak 10 dk inkübe edin.
- α-SMA boyalı THX ve ABD kültürleri için 20x büyütmede ve sadece sekonder antikor kontrolleri için 10x büyütmede, Hoechst 33342 için 385 nm eksitasyon ve florofora konjuge sekonder antikor için 475 nm eksitasyon kullanarak ters floresan mikroskobu ile floresan görüntüleri elde edin. Sadece sekonder antikor kontrolleri, görüş alanına yeterli sayıda çekirdek dahil etmek amacıyla 10x büyütmede görüntülenmiştir.
- α-SMA-pozitif hücrelerin kantifikasyonu.
- Belirgin α-SMA-pozitif iğ şeklinde sitoplazmik boyama sergileyen hücrelerle ilişkili Hoechst-pozitif çekirdekleri sayarak α-SMA pozitifliğini değerlendirin. Belirsiz veya tanımlanmamış floresan sinyale sahip hücreleri ihtiyatlı bir şekilde α-SMA negatif olarak skorlayın.
- α-SMA pozitifliğini, değerlendirilen mikroskobik alanlarda sayılan α-SMA-pozitif hücre sayısının, toplam Hoechst-pozitif çekirdek sayısına bölünmesi ve 100 ile çarpılması şeklinde hesaplayın.
Sonuçlar
İzolasyonu takiben 24–48 saat içinde, hücrelerin bir kısmı kültür yüzeyine tutunmaya ve yayılmaya başlar; başlangıçta yuvarlak bir morfoloji sergilerler. Erken zaman noktalarında hücre tutunması değişkenlik gösterebilir ve başlangıç izolasyonu sırasında geri kazanılan canlı hücre sayısının sınırlı olması nedeniyle kültürler seyrek görünebilir. 3–5. günlere gelindiğinde, yapışkan hücreler kademeli olarak vasküler düz kas hücreleri (SMC'ler) için tipik olan karakteristik iğ şeklinde, uzamış bir morfoloji kazanır ve küçük kümeler oluşturarak çoğalmaya başlar. Aort izolasyonu, segmentasyon, enzimatik sindirim, mekanik disosyasyon ve hücre ekimini içeren deneysel iş akışının şematik bir genel görünümü Şekil 1'de gösterilmiştir.
Aort izolasyonunun, THX ve ABD bölgelerine göre anatomik segmentasyonun ve adventisya tabakasının uzaklaştırılmasının temsili görüntüleri Şekil 2'de gösterilmiştir. THX ve ABD aort bölgeleri, Şekil 2B'de belirtildiği üzere diyaframa göre anatomik konumlarına dayanarak ayırt edilmiştir. Enzimatik sindirimin, mekanik ayrıştırmanın ve santrifüj sonrası görünür bir hücre peletinin oluşumunun temsili görüntüleri Şekil 3'te gösterilmiştir.
Hücre sayısı ve canlılığı, 3. pasajda Trypan mavi dışlama yöntemi (1:1) ve bir Countess Otomatik Hücre Sayıcı kullanılarak değerlendirildi. Veriler, toplam 6 fare kullanılarak (izolasyon başına 2 fare) 3 bağımsız izolasyondan elde edildi. THX kültürleri, ortalama 5.10 × 105 ± 7.81 × 104 hücre sayısına (aralık, 4.20 × 105–5.60 × 105) ve %66.33 ± 18.18 canlılığa (aralık, %46–81) sahipti. ABD kültürleri, ortalama 4.63 × 105 ± 2.31 × 104 hücre sayısına (aralık, 4.50 × 105–4.90 × 105) ve %61.66 ± 12.01% canlılığa (aralık, %50–74) sahipti (Tablo 1).
5. ile 7. günler arasında kültürler tipik olarak yaklaşık %70–%90 konfluense ulaşarak yoğun ve nispeten homojen bir monokatman oluşturur. Hücreler, kontraktil soy hatlarını yansıtacak şekilde genellikle paralel yönelimlerde dizilirler. Aortun bilinen bölgesel heterojenliğiyle tutarlı olarak, THX ve ABD SMC'leri arasında proliferasyon hızı ve hücre yoğunluğu açısından farklılıklar gözlemlenebilir. THX ve ABD aort segmentlerinden alınan primer SMC'lerin morfolojisine ait düşük (10x) ve yüksek (20x) büyütmedeki temsilci faz-kontrast görüntüleri Şekil 4'te gösterilmiştir.
SMC'ler; karakteristik uzamış, iğ şeklinde morfoloji, konfluens durumunda organize paralel dizilim ve tekdüze büyüme paterni sergilerken, fibroblast benzeri hücreler tipik olarak daha yassı, düzensiz bir morfoloji, daha az organize bir yönelim ve heterojen yayılım gösterir. Bu morfolojik ve büyüme özellikleri, moleküler doğrulamanın olmadığı durumlarda primer kültürdeki SMC popülasyonlarını tanımlamak için pratik ve tekrarlanabilir bir yaklaşım sunar. Başarılı izolasyon; 24–48 h içinde erken hücre yapışması, iğ şeklindeki morfolojinin kademeli olarak kazanılması ve 5–7. günlerde konfluent bir tek tabaka oluşumu ile belirtilir. Hücreler, düz kas fenotipiyle uyumlu olarak, yüksek konfluens seviyelerinde tipik olarak paralel diziler halinde hizalanır. Optimal olmayan sonuçlar arasında; yetersiz hücre yapışması, düşük hücre verimi veya eksik sindirimi, aşırı enzimatik maruziyeti veya düz kas olmayan hücre popülasyonlarıyla kontaminasyonu gösterebilen yassı, düzensiz şekilli hücrelerin varlığı yer alabilir.
Tutarlı hücre canlılığı ve minimum fibroblast benzeri kontaminasyon, başarılı izolasyonu daha da desteklemektedir. SMC kimliğini daha fazla doğrulamak için, Bölüm 8'de açıklanan prosedür kullanılarak temsili primer kültürlerde α-SMA için immün boyama yapılmıştır (Şekil 5). Hem THX hem de ABD kültürleri, vasküler SMC'lerden beklenen karakteristik filamentöz α-SMA boyama paternini göstermiştir. Dört mikroskobik alan genelindeki kantifikasyon, değerlendirilen 72 Hoechst-pozitif hücre arasında 69 α-SMA-pozitif hücre belirlemiş olup, bu durum %95,8'lik (%95 GA, %88,5–%98,9) bir genel α-SMA pozitifliğine karşılık gelmektedir. Spesifik olarak, 20/20 THX hücresi ve 49/52 ABD hücresi α-SMA pozitiftir. Şekil 5, değerlendirilen alanlardan temsili örnekleri göstermektedir.
Erken pasajlarda hücreler stabil bir morfoloji ve proliferatif kapasite korurlar. Ancak, uzun süreli kültürle birlikte hücreler; artan yayılma, azalmış hizalanma ve değişmiş büyüme paternleri dahil olmak üzere, kademeli olarak fenotipik modülasyon özellikler sergileyebilirler.
Bu koşullar altında, primer SMC kültürleri; gen susturma, farmakolojik tedaviler ve vasküler yeniden şekillenme ile aort anevrizması gelişiminde yer alan yolakların mekanistik çalışmaları dahil olmak üzere sonraki uygulamalar için uygundur.
Şekil 1: Şematik iş akışı genel bakış. Birincil fare aortik düz kas hücresi izolasyon iş akışının şematik gösterimi. Panel 1 ötanazi ve aorta izolasyonunu göstermektedir. Panel 2 THX ve ABD aortik segmentlerinin enzim sindirim çözeltisine ayrılmasını göstermektedir. Panel 3 adventisya temizliğini ve medya tabakasının izolasyonunu göstermektedir. Panel 4 doku segmentlerinin taze enzim çözeltisine geri döndürülmesini ve parçalanmasını göstermektedir. Panel 5 2–3 saat boyunca her 30 dakikada bir pipetleme ile yapılan mekanik dissosiasyonu göstermektedir. Panel 6 6a santrifüjleme, 6b süpernatan uzaklaştırma ve 6c pelet resüspansiyonu ve ekimini içeren hücre geri kazanımını ve ekimini göstermektedir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 2: Fare aorta segmentlerinin izolasyonu ve hazırlanması. (A) İzole edilen ve bir kültür kabına yerleştirilen tüm aorta. (B) Diyafram ve iliak bifurkasyon dahil olmak üzere, THX ve ABD bölgelerini belirten anatomik işaretlerle birlikte temizlenmiş aorta. (C) İnce ve kalın pensler kullanılarak THX (üst) ve ABD (alt) segmentlerinden adventisya çıkarımının temsili görüntüleri; düz kas hücresi izolasyonu için kritik olan alttaki medya tabakası ortaya çıkarılmıştır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3Aort dokusunun enzimatik sindirimi ve mekanik disosyasyonu. (A) Adventisya tabakasının çıkarılmasının ardından, medya tabakası taze enzim solüsyonuna aktarılır ve küçük makaslar kullanılarak ince parçalara ayrılır. (B) Aort fragmanlarının nazik pipetleme yoluyla mekanik olarak ayrıştırılmasına örnek. (CEnzimle sindirim ve santrifüjasyon sonrası, görünür bir hücre peleti gözlemlenir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Primer fare aortik düz kas hücrelerinin (SMC'ler) temsili morfolojisi. Torasik ve abdominal aort segmentlerinden izole edilen primer SMC'ler standart koşullar altında kültüre edilmiş ve 4. pasajda görüntülenmiştir. Temsili faz-kontrast görüntüler düşük (10x) ve yüksek (20x) büyütmede gösterilmiştir. Hücreler, kontraktil SMC fenotipi ile uyumlu olan karakteristik iğ şeklinde, uzamış bir morfoloji ve dizilim sergilemektedir. Bölgesel heterojenliği yansıtacak şekilde, THX ve ABD kaynaklı SMC'ler arasında hücre yoğunluğu ve organizasyonunda farklılıklar gözlemlenebilir. Ölçek çubukları = 100 µm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Primer fare aortik SMC'lerinin immünofloresan doğrulaması. (A) THX (sol) ve ABD (sağ) aortundan izole edilen ve α-SMA (yeşil) için boyanan primer SMC'lerin temsili immünofloresan görüntüleri. Çekirdekler Hoechst 33342 (mavi) ile karşıt boyanmıştır. Görüntüler 20x büyütmede elde edilmiştir. (B) α-SMA primer antikoru olmadan işlenen ve Hoechst 33342 (mavi) ile karşıt boyanan THX (sol) ve ABD (sağ) primer SMC'lerinin temsili sadece sekonder antikor kontrol görüntüleri. Görüntüler 10x büyütmede elde edilmiştir. Dört mikroskobik alan üzerinden yapılan kantifikasyon sonucunda hücrelerin 69/72'si α-SMA pozitif (%95,8) olarak belirlenmiştir. Ölçek çubukları = 100 µm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Primer Murin Aortik Düz Kas Hücre Kültürlerinin Hücre Sayısı ve Canlılığı | |||
| Aort segmenti | Bağımsız izolasyonlar, n | Hücre Sayısı (Ortalama ± SD)* | Hücre canlılığı (Ortalama ± SD)† |
| THX | 3 | 5.10 x 105 ± 7.81 x 104 hücre | 66.33 ± 18.18 % |
| ABD | 3 | 4.63 x 105 ± 2.31 x 104 hücre | 61.66 ± 12.01 % |
| *Hücre sayıları, 3 bağımsız izolasyondan pasaj 3'te elde edilmiştir. | |||
| †Hücre sayısı ve canlılığı, bir Countess Otomatik Hücre Sayıcı kullanılarak 1:1 Trypan mavisi dışlama yöntemiyle belirlenmiştir. | |||
Tablo 1: Primer fare aortik düz kas hücresi kültürlerinin hücre sayısı ve canlılığı
| Adım | Problem | Olası Neden | Önerilen Çözüm |
| Aort dissectionu | Düşük hücre verimi | Diseksiyon sırasında aortun eksik geri kazanılması veya doku hasarı | Aort kökünden iliak bifurkasyona kadar tam izolasyon sağladığınızdan emin olun; dokuya zarar vermemek için nazikçe işlem yapın |
| Aort temizliği | Fibroblast kontaminasyonu | Adventisya dokusunun eksik temizlenmesi | İlk sindirim işleminden sonra adventisya dikkatle soyulmalıdır; bu, SMC saflığı açısından kritiktir |
| İlk sindirim | Adventisyanın çıkarılmasındaki güçlük | Yetersiz enzimatik gevşeme | Mekanik sıyırma işlemine geçmeden önce inkübasyonun (8-10 dk) uygun şekilde tamamlandığından emin olun |
| Enzimatik sindirim | Düşük hücre verimi | Dokunun yetersiz sindirilmesi | Sindirimi süresini hafifçe uzatın veya mekanik ayrıştırma sıklığını artırın |
| Enzimatik sindirim | Düşük hücre canlılığı | Aşırı sindirim veya aşırı enzim maruziyeti | Sindirimi süresini azaltın ve uzun süreli inkübasyondan kaçının |
| Mekanik disosiasyon | Yetersiz hücre salınımı | Yetersiz pipetleme | Her 30-60 dakikada bir nazik ama tekrarlayan pipetleme işlemi gerçekleştirin |
| Hücre tutunması | Plakaya yetersiz tutunma | Hücre hasarı veya soğuk besiyeri | Önceden ısıtılmış besiyeri kullanın ve manipülasyon stresini en aza indirin |
| Erken kültürleme | Hücre büyümesi yok | Düşük canlılık veya kontaminasyon | Sindirim koşullarını ve steriliteyi doğrulayın; gerekirse izolasyonu tekrarlayın |
| Hücre morfolojisi | İğ şeklinde olmayan şekil (yuvarlak/yassı hücreler kalmaya devam eder) | Kontaminasyon veya fenotipik kayma | Adventisyanın uzaklaştırıldığını doğrulayın; aşırı büyümeyi ve uzun süreli kültürlemeden kaçının |
| Hücre büyümesi | Yavaş proliferasyon | Suboptimal serum konsantrasyonu | Erken genişletme aşamasında %20 FBS kullanın |
| Konfluens | Aşırı konfluens durumundaki hücrelerin pasajlanmasındaki zorluklar | Gecikmeli ayırma | Hücreleri %80-90 konflüense ulaştıklarında pasajlayın |
| Pasajlama | Yetersiz ayrılma | Hücrelerin aşırı konfluens olması veya yetersiz tripsinizasyon | Trypsin maruziyetini hafifçe artırın ve ayrılmaya mekanik olarak destek olun |
| Uzun süreli kültür | SMC fenotip kaybı | Yüksek pasaj sayısı veya uzun süreli kültür | 3-7. pasajlar arasındaki hücreleri kullanın |
| Tekrarlanabilirlik | İzolasyonlar arası değişkenlik | Teknik farklılıklar veya biyolojik değişkenlik | Deneyler boyunca enzim hazırlama, zamanlama ve uygulama süreçlerini standardize edin |
Tablo 2: Primer fare aortik düz kas hücrelerinin izolasyonu ve kültürü için sorun giderme kılavuzu. Primer fare aortik düz kas hücrelerinin izolasyonu, sindirimi ve kültürü sırasında karşılaşılan yaygın teknik sorunların, olası nedenlerin ve tekrarlanabilirliği artırmak için önerilen çözümlerin özeti.
Tartışma
Bu protokol, in vitro çalışmalar için primer murin aortik düz kas hücrelerinin (SMC'ler) izolasyonu ve kültürü için sağlam ve tekrarlanabilir bir yöntem sunmaktadır. Teknik faydasının yanı sıra bu yaklaşım, vasküler yeniden şekillenme ve aort anevrizması gelişiminin temelindeki mekanizmaların araştırılması açısından oldukça önemlidir. Renin-anjiyotensin sisteminin (RAS) ve Ang II'nin vasküler inflamasyon ve anevrizma oluşumundaki yerleşik rolü göz önüne alındığında15,16, primer aortik SMC'lerin izolasyonu, bu yolakların hücresel düzeyde sorgulanması için değerli bir yaklaşım sağlar.
Başarının temel belirleyicilerinden biri, adventisya dokusunun tamamen uzaklaştırılmasıdır. Adventisya, yeterince uzaklaştırılmadığı takdirde kültür ortamında SMC'lerden daha hızlı büyüyebilen fibroblastlar ve diğer SMC dışı popülasyonları içerir. Kısa süreli başlangıç enzimatik sindirim adımı, adventisyanın medial tabakadan mekanik olarak ayrılmasını kolaylaştırarak daha hassas bir diseksiyona olanak tanır. Bu adımın etkili bir şekilde gerçekleştirilememesi, SMC izolasyon protokollerindeki kontaminasyon ve değişkenliğin en yaygın nedenlerinden biridir.
Enzimatik sindirim koşulları da dikkatle optimize edilmelidir. Kollajenaz tip II, elastaz ve soya fasulyesi tripsin inhibitörü kombinasyonu, hücre canlılığını korurken hücre dışı matris bileşenlerinin verimli bir şekilde parçalanmasını sağlar. Ancak, sindirim süreci yakından izlenmelidir. Yetersiz sindirim, dokunun tam olarak ayrışmamasına ve hücre veriminin azalmasına neden olurken, aşırı sindirim hücrelere zarar verebilir, tutunmayı bozabilir ve canlılığı düşürebilir. Bu nedenle, nazik ve tekrarlayan pipetleme yoluyla gerçekleştirilen mekanik ayrıştırma, enzimatik aşırı maruziyeti en aza indirirken hücre salınımını teşvik eden temel bir tamamlayıcı adımdır. Bu adımlar birlikte, hem hücre verimini hem de canlılığını optimize etmek için enzimatik ve mekanik işlemlerin dengelenmesinin önemini vurgulamaktadır. İzolasayonlar arasındaki tekrarlanabilirliği artırmak için prosedür boyunca tutarlı sindirim sürelerinin, doku işleme yöntemlerinin ve mekanik ayrıştırmanın sürdürülmesi de aynı derecede önemlidir.
Kültür koşulları, SMC fenotipinin ve fonksiyonunun korunmasında merkezi bir rol oynar. Yüksek serumlu besiyeri (%20 fetal bovin serum), izolasyon sonrası primer hücrelerin başlangıç yapışmasını ve ekspansiyonunu destekler. Standart serum preparatlarında bulunan hormonların ve lipid bileşenlerin neden olduğu değişkenliği azaltmak için kömür/dekstran ile işlem görmüş serum kullanılmıştır. Ancak, yüksek seruma uzun süreli maruziyet veya uzatılmış kültür süresi, sentetik veya fibroblast benzeri bir duruma doğru fenotipik kaymayı teşvik edebilir. Bu etkileri en aza indirmek için, hücrelerin erken ila orta pasajlarda (P3–P7) kullanılması ve morfolojiyi değiştirip proliferasyon kapasitesini azaltabilen aşırı konfluens durumlarından kaçınılması önerilir.
İzole edilen hücrelerin morfolojisi, kültür kalitesi hakkında önemli bir ilk gösterge sağlar. Sağlıklı SMC'ler, karakteristik iğ şeklinde, uzamış bir morfoloji sergiler ve yüksek konfluens seviyelerinde paralel diziler halinde hizalanırlar. Yassılaşmış veya düzensiz şekilli hücreler dahil olmak üzere bu morfolojiden sapmalar; kontaminasyona, suboptimal kültür koşullarına veya fenotipik kaymaya işaret edebilir. Kontraktil durumdan sentetik duruma fenotipik geçişe işaret eden morfolojik özellikler arasında artmış hücre yayılımı, iğ şeklindeki morfolojinin azalması, paralel hizalanmanın kaybı ve daha heterojen büyüme paternleri yer alır.
Morfolojik değerlendirme bilgilendirici olsa da, SMC fenotipini kesin olarak belirlemek için yetersizdir ve uygulama alanına bağlı olarak α-SMA ve MYH11 gibi markörler kullanılarak moleküler doğrulama ile tamamlanmalıdır. Mevcut çalışmada, α-SMA immünofloresansı izole edilen hücrelerin kimliğini doğrulamış ve hem THX hem de ABD kültürlerinde yüksek oranda α-SMA-pozitif hücre olduğunu göstermiştir (Şekil 5). Bu protokolün temel bir avantajı, THX ve ABD segmentleri dahil olmak üzere farklı aortik bölgelerden SMC izole edebilme yeteneğidir. Bu bölgeler; hücre dışı matris kompozisyonu, embriyolojik köken ve hastalığa yatkınlık gibi doğal biyolojik farklılıklar sergiler. Bölgeye özgü SMC'lerin izolasyonu, vasküler biyolojideki uzaysal heterojenliğin araştırılmasına olanak tanır ve anevrizma oluşumuna karşı bölgeye özgü duyarlılık hakkında bilgi sağlayabilir16,17,18. Mevcut fare aortik VSMC izolasyon yöntemleri, ya gece boyu süren kollagenaz sindirimi13 ya da 5-6 saatin daha iyi geri kazanım sağladığı bildirilen 4-6 saatlik enzimatik sindirim kullanmaktadır14; buna karşılık mevcut protokolde, ötanaziden hücre ekimine kadar toplam yaklaşık 4 saatlik bir işlem süresiyle, 8-10 dakikalık bir ön sindirimi takip eden 2-3 saatlik bir sindirim uygulanmıştır. Adhikari ve ark., 5 günlük kültür sonrası mL başına 25–35 × 103 canlı hücre ve sm22α ile Acta2 için %97–99 pozitiflik bildirirken; mevcut protokol, pasaj-3 hücre sayıları olarak THX için 5.10 × 105 ± 7.81 × 104 hücre ve ABD için 4.63 × 105 ± 2.31 × 104 hücre üretmiş ve genel α-SMA pozitifliği %95,8 olarak gerçekleşmiştir. Hubert ve ark. gece boyu sindirim kullanmış ancak kantitatif hücre verimi veya saflık yüzdesi bildirmemiştir13,14. Buna karşın, McMurray ve ark. tarafından uygulanan eksplant tabanlı yöntem, normal aortik eksplantlardan SMC çıkışından önce yaklaşık 7,6 günlük ortalama bir lag dönemi gerektirmiş; eksplantların %>90'ı 10. güne kadar ve %>95'i 12. güne kadar çıkış göstermiştir, oysa mevcut enzimatik yöntem, izole edilen hücrelerin izolasyon gününde doğrudan ekilmesine izin verir18. Mevcut protokol, adventisya uzaklaştırmayı kolaylaştıran kısa bir ön sindirim adımını, tutarlı doku işlemesi ve hücre geri kazanımını teşvik etmek için standartlaştırılmış sindirim ve mekanik disosiasyon koşullarıyla birleştirir. THX ve ABD SMC'lerinin bölgeye özgü izolasyonu ile birlikte, daha kısa işlem süresi ve hücre geri kazanımı ile α-SMA pozitifliğinin kantitatif karakterizasyonu, tekrarlanabilir in vitro çalışmalar için pratik avantajlar sağlar.
Bu yöntem, genetik ve farmakolojik manipülasyon içeren mekanistik çalışmalar için oldukça uygundur. Primer SMC kültürleri, siRNA aracılı susturma dahil olmak üzere gen susturma yaklaşımlarının yanı sıra aşırı ekspresyon çalışmaları ve ilaç tedavileri için kullanılabilir. Bu yaklaşımlar; aortik anevrizma gelişimi ve ilerlemesi için merkezi süreçler olan SMC fenotipik değişimi, inflamasyon ve hücre dışı matriks yeniden yapılanmasında yer alan sinyal yollarının doğrudan sorgulanmasına olanak tanır1,5.
Bu protokolün sınırlamalarının hastalık modelleme bağlamında değerlendirilmesi önemlidir. Bu protokoldeki düz kas hücreleri, sağlıklı fare aortlarından izole edilmiştir ve bu nedenle doğal olarak anevrizma ile ilişkili fenotipler sergilemezler. Bu nedenle; inflamatuar aktivasyon, hücre dışı matris yeniden şekillenmesi ve fenotipik geçiş gibi hastalıkla ilgili süreçleri yeniden oluşturmak için farmakolojik stimülasyon, genetik manipülasyon veya in vivo modellerle entegrasyon dahil olmak üzere ek deneysel yaklaşımlar gereklidir. Yukarıda açıklanan değerlendirmelere ek olarak, bu protokolün birkaç sınırlaması daha vardır. Hayvanlar arasındaki biyolojik farklılıklar veya teknikteki küçük varyasyonlar nedeniyle, izolasyonlar arasında hücre verimi ve büyüme kinetiğinde değişkenlikler meydana gelebilir. Ayrıca, enzimatik sindirim tabanlı izolasyon, hücre yüzey reseptörü ekspresyonunu veya sinyal yolaklarını etkileyebilir; bu durum, sonraki fonksiyonel çalışmalar yorumlanırken dikkate alınmalıdır. Primer SMC'ler ayrıca pasaj sayısı arttıkça kontraktil fenotiplerini kademeli olarak kaybederler ve bu durum deneysel sonuçları etkileyebilir. Prosedürlerin dikkatli bir şekilde standardize edilmesi ve erken pasaj hücrelerin kullanılması bu sınırlamaların azaltılmasına yardımcı olabilir. Bu protokol için yaygın teknik zorluklar ve önerilen çözümler Tablo 2'de özetlenmiştir.
Özetle bu protokol, primer murin aortik SMC'lerin izolasyonu ve kültürü için güvenilir ve uyarlanabilir bir çerçeve sunmaktadır. In vivo modellerle birleştirildiğinde bu yaklaşım, vasküler yeniden şekillenme ve aort anevrizması patogenezinin altında yatan hücresel ve moleküler mekanizmaların kapsamlı bir şekilde araştırılmasına olanak tanır.
Açıklamalar
Yazarlar, herhangi bir çıkar çatışması olmadığını beyan ederler. Dil düzenlemesi ve dil bilgisi düzeltmeleri için Grammarly kullanılmıştır; tüm bilimsel içerik ve yorumlar yazarlar tarafından oluşturulmuştur.
Teşekkürler
Finansal destek, kısmen Kentucky Üniversitesi Tıp Fakültesi tarafından sağlanmıştır. Grafik özet (Şekil 1), GI2A3W9TY8 numaralı yayın sözleşmesi ile Akademik Yayın Lisansı kapsamında BioRender.com kullanılarak oluşturulmuştur.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| 0,2 μm Naylon Şırınga Filtreleri | VWR | 76439-080 | Steril filtrasyon |
| 15 mL Konik Tüpler | VWR | — | Temizlik sonrası aorta transferi ve hücre toplama için |
| 6 kuyucuklu / 12 kuyucuklu kültür plakaları (İşlem görmemiş) | Corning | — | Hücre kültürü |
| 50 mL Konik Tüpler | VWR | — | Hücre toplama |
| 96 kuyucuklu Optik Tabanlı Mikroplaka | Thermo Fisher Scientific | 165305 | SMC Doğrulaması için |
| α-Düz Kas Aktin Antikoru (Monoklonal) | Cell Signaling Technology | 19245S | SMC doğrulaması için; 1:1000 çalışma dilüsyonu |
| Alexa Fluor 488 IgG sekonder Antikoru (Poliklonal) | Invitrogen | A-11008 | SMC doğrulaması için; 1:2500 çalışma dilüsyonu |
| Amfoterisin B | Thermo Fisher Scientific | 15290018 | Antifungal |
| Sığır Serum Albumini | Sigma-Aldrich | A7906 | SMC Doğrulaması için |
| CO2 İnkübatörü (37 °C) | Çeşitli | — | Hücre kültürü koşulları |
| Kollagenaz Tip II | Worthington Biochemical | LS004174 | Enzimatik sindirim için; 260 U/mg kullanıldı |
| Countess Otomatik Hücre Sayıcı | Invitrogen | C10281 | Hücre sayımı için |
| Diseksiyon Mikroskobu | Çeşitli | — | Doku temizleme |
| DMEM/F12 Besiyeri | Thermo Fisher Scientific | 21041-025 | Temel kültür besiyeri |
| Elastaz | Worthington Biochemical | LS002279 | Matriks parçalanması için; 4,17 U/mg protein kullanıldı |
| Fetal Sığır Serumu (Kömür/Dekstran İşlemli) | Cytiva (Hyclone) | SH30068.03 | Kültür için %20 oranında kullanıldı |
| Ca2+ ve Mg2+ içeren HBSS | Thermo Fisher Scientific | 14025-092 | Sindirim tamponu olarak kullanıldı |
| Hoechst 33342 Çözeltisi | BD Pharmingen | 561908 | SMC doğrulaması için |
| Sıcak Boncuk Sterilizatörü | Fine Science Tools | 18000-45 | Aorta ekstraksiyonu için |
| Ketamin | Dechra | — | Fare Anestezisi için |
| Penisilin/Streptomisin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Antibiyotik |
| Fosfat Tamponlu Salin (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 20012-027 | Yıkama tamponu |
| Sodyum Klorür | Fisher Scientific | BDH9286 | SMC Doğrulaması için; 150 mM çalışma konsantrasyonu (1 L için 8,8 g) |
| Soya Trypsin İnhibitörü | Worthington Biochemical | LS003570 | Aşırı sindirimi önler |
| Tris Bazı | Fisher Scientific | BP152 | SMC Doğrulaması için; 20 mM çalışma konsantrasyonu (1 L için 2,4 g) |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151 | SMC Doğrulaması için; %0,1 çalışma konsantrasyonu |
| Tripan Mavisi Boyası | Thermo Fisher Scientific | T10282 | Hücre sayımı için |
| Trypsin-EDTA (%0,05) | Thermo Fisher Scientific | 15400054 | Pasajlama için |
| Tween 20 | Fisher Scientific | BP337 | SMC Doğrulaması için; %0,1 çalışma konsantrasyonu |
| Ksilazin | Covetrus | 61035 | Fare Anestezisi için |
| Opsiyonel Materyaller (kullanıldıysa) | |||
| Kültür Flaskları (T25/T75) | Corning | — | Hücre genişletme |
Kaynaklar
- Ensor M, et al. Nicotine promotes Ang II-induced abdominal aortic aortopathies in female and male mice: role of sex hormones. Clin Sci (Lond). 2025;139(8):411-429.
- Ailawadi G, et al. Smooth muscle phenotypic modulation is an early event in aortic aneurysms. J Thorac Cardiovasc Surg. 2009;138(6):1392-1399.
- Frismantiene A, Philippova M, Erne P, Resink TJ. Smooth muscle cell-driven vascular diseases and molecular mechanisms of VSMC plasticity. Cell Signal. 2018;52:48-64.
- Alsiraj Y, et al. Female mice with an XY sex chromosome complement develop severe angiotensin II-induced abdominal aortic aneurysms. Circulation. 2017;135(4):379-391.
- Thatcher SE, et al. Exogenous 17-β estradiol administration blunts progression of established angiotensin II-induced abdominal aortic aneurysms in female ovariectomized mice. Biol Sex Differ. 2015;6:12.
- Daugherty A, Manning MW, Cassis LA. Angiotensin II promotes atherosclerotic lesions and aneurysms in apolipoprotein E-deficient mice. J Clin Invest. 2000;105(11):1605-1612.
- AlSiraj Y, et al. Monosomy X in female mice influences the regional formation and augments the severity of angiotensin II-induced aortopathies. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2021;41(1):269-283.
- Alsiraj Y, et al. Sex chromosome complement defines diffuse versus focal angiotensin II-induced aortic pathology. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2018;38(1):143-153.
- Alsiraj Y, et al. Therapeutic assessment of combination therapy with a neprilysin inhibitor and angiotensin type 1 receptor antagonist on angiotensin II-induced atherosclerosis, abdominal aortic aneurysms, and hypertension. J Pharmacol Exp Ther. 2021;377(3):326-335.
- AlSiraj Y, et al. Serotonin 3 receptor antagonism reduces angiotensin II-induced abdominal aortic aneurysms: contribution of periaortic fat-derived serotonin. J Pharmacol Exp Ther. 2025;392(2):100533.
- AlSiraj Y et al. Role of adipocyte angiotensinogen or angiotensin type 1A receptors in the development of diet-induced atherosclerosis or angiotensin II-induced abdominal aortic aneurysms. JVS Vasc Sci. 2025;7:100397.
- Alexander MR, Owens GK. Epigenetic control of smooth muscle cell differentiation and phenotypic switching in vascular development and disease. Annu Rev Physiol. 2012;74:13-40.
- Hubert MO, Rodriguez-Vita J, Wiedmann L, Fischer A. Isolation of murine primary aortic smooth muscle cells. Bio Protoc. 2021;11(3):e3907.
- Adhikari N, et al. Guidelines for the isolation and characterization of murine vascular smooth muscle cells. A report from the International Society of Cardiovascular Translational Research. J Cardiovasc Transl Res. 2015;8(3):158-163.
- AlSiraj Y, Woolley C, Thatcher SE, Cassis LA. Sex differences and the role of the renin-angiotensin system in atherosclerosis and abdominal aortic aneurysms. In: Sex Differences in Cardiovascular Physiology and Pathophysiology. Academic Press; 2019:167-184.
- Boese AC, et al. Sex differences in vascular physiology and pathophysiology: estrogen and androgen signaling in health and disease. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2017;313(3):H524-H545.
- Majesky MW. Developmental basis of vascular smooth muscle diversity. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2007;27(6):1248-1258.
- McMurray HF, Parrott DP, Bowyer DE. A standardised method of culturing aortic explants, suitable for the study of factors affecting the phenotypic modulation, migration and proliferation of aortic smooth muscle cells. Atherosclerosis. 1991;86(2-3):227-237.
Yeniden basım ve izinler
Bu makale yayımlandı
Video yakında