Yöntem makalesi

Optogenetik Dinamik Kontrol İçin LED Gömülü 32 Kuyucuklu Bir Mikroplakanın Hazırlanması ve Kullanımı

50 görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/73445

⸱

22 Eylül 2026

 ,  ,  ,  , 
1Department of Chemical Engineering, Texas A&M University, 2Department of Electrical Engineering and Computer Science, Massachusetts Institute of Technology

Bu makalede

Özet

Bu protokol, mikrobiyal kültürlerde yüksek kapasiteli optogenetik stimülasyon ve kantitatif gen ekspresyon ölçümleri gerçekleştirmek amacıyla, bir mikroplaka okuyucu içerisinde kullanılacak 32 kuyucuklu, ışık yayan diyot (LED) gömülü bir mikroplakanın (LEMOS 2.0) nasıl imal edileceğini, programlanacağını ve çalıştırılacağını açıklamaktadır.

Özet

Optogenetik kontrol, ışıkla tetiklenen gen ekspresyonu düzenlemesine olanak tanır ve canlı hücreler ile elektronik sistemler arasında programlanabilir bir arayüz sağlar. Ancak, optogenetik yapıların rutin prototiplenmesi altyapı yetersizlikleri nedeniyle sınırlı kalmaktadır. Mevcut kapalı döngü platformlar genellikle kemostatlar, mikroakışkan sistemler, robotik işlemeler veya özel optik sensörler gerektirmekte; bu durum maliyeti artırabilmekte, erişilebilirliği azaltabilmekte veya ölçüm performansını kısıtlayabilmektedir.

Burada, optogenetik çalışmalar için güncellenmiş, ışık yayan diyot (LED) gömülü bir mikroplaka olan ve standart mikroplaka okuyucular içerisinde optogenetik stimülasyon ve gen devresi karakterizasyonu sağlayan düşük maliyetli bir cihaz olan LEMOS 2.0 sunulmaktadır. LEMOS 2.0, kapasiteyi 16'dan 32 mikro kuyuya çıkararak ve komşu mikro kuyular arasındaki ışık sızıntısını azaltarak ek bir aydınlatma durumu olarak karanlık koşullara imkan tanıyıp orijinal LEMOS platformunun üzerine inşa edilmiştir. Cihaz; üç boyutlu (3D) yazıcıyla üretilmiş bir çerçeve, her bir mikro kuyunun yanına yerleştirilmiş tek tek adreslenebilir LED'ler, şarj edilebilir bir pil ve Bluetooth tabanlı kablosuz iletişim için dahili bir mikrodenetleyiciden oluşmaktadır. Biyouyumlu polidimetilsiloksan (PDMS) mikro kuyular, replika kalıplama yöntemiyle doğrudan cihaz içine dökülerek şeffaf kalıp aracılığıyla bakteriyel kültürlerin stimüle edilmesine olanak sağlar. Cihaz standart plaka okuyuculara uyumlu olup  optik yoğunluk ve floresan ölçümüne imkan tanır.

Bu protokol; cihaz imalatı, devre montajı, Arduino programlama, PDMS mikrokuyu dökümü, plaka okuyucu kurulumu, suş ve kültür hazırlama, otomatik deney yürütme, cihaz temizliği ve floresan/OD600 veri analizi dahil olmak üzere tüm LEMOS 2.0 iş akışını açıklamaktadır. Bir gösterim olarak protokol, sfGFP ekspresyonunun yeşil ışıkla aktive edildiği ve kırmızı ışıkla baskılandığı CcaSR optogenetik sistemini kullanmaktadır. LEMOS 2.0, optogenetik pertürbasyonu ve gen ekspresyonu karakterizasyonunu ıslak laboratuvar kullanıcıları için daha erişilebilir hale getirmeyi amaçlayarak, özel biyoreaktör veya mikroakışkan altyapı gereksinimi olmaksızın daha hızlı tasarım-yapım-test-öğrenme döngülerini mümkün kılmaktadır.

Giriş

Optogenetik, canlı hücreler ile elektronik kontrol sistemleri arasında programlanabilir bir arayüz sağlar. Gen ekspresyonunu düzenlemek için ışık kullanılarak; hücresel davranışlar zamansal hassasiyetle, tersine çevrilebilir şekilde ve kültür ortamına minimum müdahale ile aktüate edilebilir1. Floresan veya lüminesans raporlayıcılarla eşleştirildiğinde optogenetik sistemler, biyolojik durumların elektronik olarak ölçülmesine ve geri bildirim yoluyla düzenlenmesine olanak tanır1. Bu çift yönlü optik arayüz; gen ekspresyonu, hücre büyümesi ve popülasyon kompozisyonu dahil olmak üzere hücresel süreçlerin sibergenetik kontrolünü mümkün kılmıştır2,3,4. Ancak, başarılı kapalı döngü optogenetik sistemlerin çoğu; erişilebilirliği kısıtlayabilen ve rutin tasarım-inşa-test-öğrenme döngülerini engelleyebilen özel kemostatlara5, mikroakışkan cihazlara4,6,7 veya robotik örneklemeye2,3,8 ihtiyaç duymaktadır.

Mikroplaka okuyucular, mikrobiyal büyüme ve gen ekspresyon dinamiklerini ölçmek için en yaygın kullanılan cihazlar arasındadır. Bu cihazlar, birçok örnekte güvenilir optik yoğunluk ve floresans ölçümleri sağlar, çevresel kontrolü destekler ve halihazırda standart sentetik biyoloji iş akışlarına entegre edilmiştir9. Ancak, standart ticari plaka okuyuculardaki aydınlatma yolları optik ölçüm için tasarlanmıştır; kültür büyümesi sırasında programlanabilir ve kuyucuğa özgü optogenetik aktivasyon için uygun değildir. Sonuç olarak, optogenetik deneyler sıklıkla ayrı aydınlatma cihazlarına10,11,12,13,14, stimülasyon ve ölçüm platformları arasında robotik transfere8,15 veya özel okuma donanımlarına5,16,17 ihtiyaç duyar. Bu ek adımlar zamansal çözünürlüğü düşürür, işlem değişkenliği oluşturur ve kapalı döngü kontrolünü karmaşıklaştırır.

Optogenetik çalışmalar için LED gömülü mikroplaka veya LEMOS, bu boşluğu doldurmak amacıyla daha önce geliştirilmiştir18. LEMOS, kültür mikro kuyucuklarının çevresine yerleştirilmiş, bireysel olarak adreslenebilen LED'ler içeren ve mikroplaka okuyucuyla uyumlu bir cihazdır. Cihaz, deney boyunca ticari bir mikroplaka okuyucunun içinde kalarak, optik stimülasyonun ve 600 nm'de floresans/optik yoğunluk (OD600) ölçümünün aynı platformda gerçekleştirilmesine olanak tanır. Orijinal uygulamasında LEMOS, 16 kültür mikro kuyucuğunu desteklemiş ve batch kültürde gen ekspresyonunun açık döngü optogenetik stimülasyonu ile kapalı döngü geri bildirim kontrolünü göstermek için kullanılmıştır18. Cihaz, ölçüm pencereleri sırasında LED aydınlatmasının kapatılabilmesi için harici bir bilgisayarla senkronize edilmiş, böylece floresans ve optik yoğunluk okumaları üzerindeki doğrudan girişim minimize edilmiştir.

Bu protokol, cihazın güncellenmiş bir versiyonu olan LEMOS 2.0'ı ve mikrobiyal kültürlerdeki optogenetik deneyler için kullanımını açıklamaktadır. LEMOS 2.0, bağımsız olarak adreslenebilen kültür mikro-kuyucuklarının sayısını 16'dan 32'ye çıkarmak için yeniden tasarlanmış; böylece deneysel verimlilik artırılarak tek bir çalışmada daha fazla koşulun, tekrarlamanın veya kontrolcü tasarımının test edilmesine olanak sağlanmıştır. Cihaz tasarımı ayrıca, aydınlatılan mikro-kuyucuklar ile komşu karanlık mikro-kuyucuklar arasındaki ışık sızıntısını azaltmak için modifiye edilmiş, bu da karanlık kontrollerin güvenilirliğini ve mekansal olarak desenlenmiş stimülasyon deneylerini iyileştirmiştir. Bu modifikasyonlar, platformu karşılaştırmalı optogenetik karakterizasyon, çok koşullu kontrolcü testi ve halihazırda mikroplaka okuyucular kullanan laboratuvarlar tarafından rutin protokol benimsemesi için daha uygun hale getirmektedir.

LEMOS 2.0, programlanabilir kırmızı, yeşil, mavi veya karanlık durum aydınlatması ile tekrarlanan OD600 ve floresans ölçümleri gerektiren mikrobiyal seri kültür deneyleri için tasarlanmıştır. Plaka okuyucunun kinetik OD600 ve floresans ölçümlerini, sıcaklık kontrolünü, çalkalamayı, 32 LEMOS mikro kuyucuğu için özel plaka yerleşim tanımını ve ölçüm dosyalarının Python kontrol scripti tarafından izlenen bir klasöre otomatik olarak dışa aktarılmasını desteklemesi gerekir. Mevcut uygulama, BioTek Gen5 v3.14 yüklü bir BioTek Synergy H1 mikroplaka okuyucusu kullanılarak doğrulanmıştır; diğer plaka okuyucu yazılımlarıyla uygulama, dışa aktarma formatında, dosya ayrıştırıcısında ve ekran otomasyon adımlarında uygun modifikasyonlar gerektirir. Cihaz, emisyon pikleri 620–630 nm, 515–525 nm ve 465–475 nm olan LED'ler kullandığından, kullanıcılar aktivasyon ve okuma spektrumları bu kanallarla uyumlu olan optogenetik aktüatörler ve floresan raporlayıcılar seçmelidir19,20. Yeni konak suşlar, raporlayıcılar, optogenetik sistemler, besiyerleri, büyüme sıcaklıkları, örnekleme aralıkları veya kontrolcü tasarımları; LED yoğunluğunun, görev döngüsü aralığının, kör düzeltmenin, floresans normalizasyonunun ve kontrolcü parametrelerinin yeniden kalibre edilmesini gerektirecektir.

Protokol, tüm LEMOS 2.0 iş akışını kapsamaktadır: cihaz üretimi, devre montajı, Arduino programlama, polidimetilsiloksan (PDMS) mikrokuyu dökümü, plaka okuyucu kurulumu, suş ve kültür hazırlama, otomatik deney yürütme, cihaz temizliği ve floresans/OD600 veri analizi. Örnek iş akışı bakteriyel optogenetik gen ekspresyon kontrolüne odaklanmış olsa da, aynı çerçeve diğer mikrobiyal suşlara, floresan raporlayıcılara, optogenetik aktüatör sistemlerine ve kontrol algoritmalarına uyarlanabilir. Programlanabilir aydınlatmayı standart plaka okuyucu ölçümleriyle birleştiren güncellenmiş LEMOS 2.0 platformu, batch kültürlerde yüksek verimli optogenetik perturbasyon ve geri besleme kontrol deneyleri için erişilebilir bir yol sunar.

Protokol

Deneylerle ilgili tüm deneysel işlemler Escherichia coli suş MG1655  Texas A&M Üniversitesi'ndeki belirlenmiş Biyogüvenlik Seviye 2 (BSL-2) laboratuvarlarında gerçekleştirildi.&M Üniversitesi. Bakteri kültürleri ve manipülasyonları, standart koruma kılavuzlarına uygun olarak sertifikalı Sınıf II Biyogüvenlik Kabini'nde gerçekleştirildi. Prosedürler, Texas A&M Kurumsal Biyogüvenlik Komitesi (IBC), IBC2023-044 numaralı izinle.

1. LEMOS 2.0 Çerçevesi ve LED Dizisinin Üretilmesi

NOT: LEMOS 2.0'ı üretmeye, LEMOS 2.0 çerçevesini 3D yazıcı ile basarak ve LED şeritlerini cihaz gövdesine yerleştirerek başlayın. Amaç, her LED'in karşılık gelen mikroçukura bitişik olacak şekilde mekanik olarak kararlı bir çerçeve oluşturmakdır. Bu aşamada doğru LED yerleşimi önemlidir çünkü hizalanmama, stimülasyon homojenliğini azaltabilir ve mikroçukurlar arasındaki optik sinyal taşmasını artırabilir.

  1. LEMOS 2.0 iç çerçevesini ve PDMS mikrokuyular için kalıp kalıbını, GitHub deposunda (github.com/synbiosystems/LEMOS-2.0) verilen STL dosyalarını kullanarak 3D yazdırın. Yazdırma işleminden sonra tüm destek malzemelerini çıkarın.
    NOT: Polilaktik asit (PLA) filament ve aşağıdaki baskı parametrelerine sahip bir füzyonlu birikim modelleme (FDM) yazıcı kullanılması önerilir: 0,2 mm katman yüksekliği, LEMOS 2.0 çerçevesi için %20 dolgu ve kalıp için %40 dolgu.
  2. LED şeritleri lehimleme padlerinin ortasından keserek 16'şar LED'lik 2 set haline getirin. Her şerit ucunda, Bölüm 2'de daha ayrıntılı anlatıldığı gibi, lehimleme için üç adet lehimleme padinin mevcut olduğundan emin olun.
  3. Her LED şeridini, LED'ler dışa bakacak şekilde olmak üzere ikiye katlayın (Ek Şekil 1A, Ek Video 1).
  4. LED şeridini cihazın geometrisine uyacak şekilde elle biçimlendirin ve +5 V lehimleme padlerinin aşağıya bakacak şekilde mikrokuyuların arasına yerleştirin, LED şeridindeki oku göz önünde bulundurunEk Şekil 1A, Ek Video 1). Devam etmeden önce her LED'in yuvasına doğru şekilde oturduğundan emin olmak için şeridin konumunu tekrarlı olarak ayarlayın.

2. Elektrik Devresinin Montajı ve Doğrulanması

NOT: Kablosuz cihazın çalışması için gereken güç, şarj, mikrodenetleyici, anahtar ve LED bağlantılarını monte edin. Montajdan sonra LEMOS 2.0 cihazı dahili pilinden çalışmalı, şarj modülü üzerinden yeniden şarj edilmeli ve çevre birim Arduino kartından LED komutlarını almalıdır. LED şeritlerine bağlantı yapmadan önce her bir güç bağlantısını doğrulayın, çünkü yanlış voltaj yönlendirmesi mikrodenetleyiciyi veya LED'leri hasarlandırabilir.

UYARI: Bu protokol, lehimleme konusunda önceden yeterlilik gerektirir ve bunlara uygun güvenlik uygulamaları (örneğin, duman emici kullanmak, koruyucu gözlük takmak ve yanıkları önleyici yöntemler), lehim teli bakımı ve temel delikten geçiş/kablo lehimleme teknikleri dahildir. Bu deneyime sahip olmayan kullanıcılar, bu bölümdeki adımları denemeden önce eğitim almalıdır.

  1. Listelenen tüm elektronik bileşenleri toplayın Malzemeler Tablosu ve görünür fiziksel hasarlara karşı inceleyin. Kablolama şemasını gözden geçirin (Ek Dosya 1).
  2. Adım yukarı gerilim dönüştürücüyü varsayılan 12 V yerine 5 V çıkış verecek şekilde ayarlayın. Kartın arka yüzündeki yapılandırma anahtarını takip ederek, lehimleme demiriyle ısı uygulayarak A ve B padler arasındaki bağlantıyı kesin.
  3. Arduino Nano BLE Rev2'nin (buradan sonra BLE Nano olarak anılacaktır) VIN pinini yükseltici devrenin OUT+ pinine ve BLE Nano'nun GND pinini yükseltici devrenin OUT- pinine lehimleyin (Ek Şekil 1B).
  4. Yükseltici dönüştürücüyü lehimleyin IN– pili şarj modülünün negatif (-) pinine bağlayın.
  5. İki kabloyu ayırın 'JST PH 2-Pin Kablo – Dişi Bağlantı Elemanı, 100 mm' beyaz muhafazadan pil bağlantı uçlarını çıkararak. Cihaza daha iyi oturması için, pil bağlantı uçları olmayan uçlarından keserek her birini yaklaşık 70 mm'ye kısaltın (Ek Şekil 1C).
  6. Anahtarı değiştirin. İlk olarak, her köşedeki sabitleme pimlerini çıkarın. İkinci olarak, tüm pimlerin uzunluğunu %30'una kadar kısaltın. Daha sonra, T1, T3 ve B3'ü tamamen çıkarın (Notasyon: T = üst, B = alt; pimlere doğrudan bakıldığında soldan sağa doğru 1'den 4'e kadar numaralandırılır, anahtar üstteyken)Ek Şekil 1D).
  7. Kırmızı JST kablosunu B2'ye lehimleyin ve pille bağlantı ucunu pilin takılması için açık bırakın’daha sonra erkek konektörEk Şekil 1D).
  8. B1 ve B4 arasında bir bağlantı kablosu lehimleyin.
  9. Pil şarj modülünün B+ pin'ini B1'e lehimlerken, önceki adımdaki bağlayıcı telin de B1'e lehimli olarak kalmasına dikkat edin (Ek Şekil 1E).
  10. Adım yukarı çevirici IN+ pin'ini T4'e lehimleyin.
  11. Pil şarj modülünün pozitif (+) pin'ini T2'ye lehimleyin.
  12. Siyah JST kablosunu pil şarj modülünün B kısmına lehimleyin– pimi bırakın. Pili takacağınız ucu, daha sonra pile bağlamak üzere sabitlemeyin’erkek konektör
  13. Normal cihaz çalışma modunda bağlantıları doğrulayın. Anahtarı orta/kapalı konumda tutarak, lehimleme adımlarında gevşek bırakılan pil bağlantı kabloları aracılığıyla Li-iyon pilini devreye bağlayın (Ek Şekil 1E).
  14. Anahtarı sola/açık konuma çevirin (sadece 2 pimi dolu olan taraf).
  15. BLE Nano'nun üzerindeki güç LED'si (etiketli) aracılığıyla cihaza giden gücü doğrulayın ‘AÇIK’, USB bağlantı noktasının yanındaki) yeşil renk almalıdır (Ek Şekil 1E, Ek Video 1).
  16. Adım-yukarı dönüştürücüye gelen gücü, maviye dönmelidir, üzerindeki LED aracılığıyla doğrulayın.
    NOT: LED göstergeler ışık vermiyorsa, ilerlemeden önce tüm bağlantıları bir multimetre ile kontrol edin.
  17. 1.4. adımda yerleştirilen ilk LED şeridi çıkarın ve her iki VIN, DIN ve GND yamasına teller lehimleyin. LED şeridini tekrar yerleştirin ve telleri çerçevenin yan tarafındaki porttan geçirin (Ek Şekil 1F, Ek Video 1).
  18. İkinci LED şeridi için yukarıdakilere göre tekrarlayın Ek Video 1.
  19. İlk LED şeridini BLE Nano GND pini, BLE Nano D13 pini ve BLE Nano VIN pini'ne lehimleyin.
    NOT: VIN pinine lehimlemek, aynı Arduino pinine iki tel lehimlemeyi gerektirir. Bir telin ucunu pin delisinin içine, diğerini ise Nano karttaki girintinin, iğne deliğinin dış kısmına.
  20. İki LED şeridi birbirine lehimleyin.
  21. Bağlantıları, BLE Nano üzerindeki VIN pinine ve son lehimlenmemiş LED pad'indeki +5 V pad'ine dokunarak, çoklu ölçerle süreklilik modunda kontrol edin. GND için aynı işlemi tekrarlayın.
  22. LED şeritleri yerlerine sıcak tutkal tabancası kullanarak sabitleyin (Ek Şekil 1F, Ek Video 1). Yavaş hareket edin ve uygulamalar arasında yapıştırıcının soğumasına izin vererek bir seferde yalnızca bir veya iki LED çiftini yapıştırın. LED'leri yerinde tutmak için gerektiğinde pense kullanın.

3. Merkezi ve Periferik Arduino Kartlarının Programlanması

NOT: Kablosuz iletişim ve LED kontrolü için kullanılan iki Arduino kartını programlayın. Merkezi Arduino (Arduino Nano IOT 33), deney sırasında bilgisayara bağlıdır ve Python betiğinden gelen komutları iletir. Periferik Arduino (Arduino Nano 33 BLE Rev 2), LEMOS 2.0 cihazında bulunur ve LED dizisini kontrol eder. Her iki kartın da deneye başlamadan önce uygun skriptlerle yüklenmiş olması gerekir. Arduino betiklerinde listelenen satırların yorum satırı işaretlerinin kaldırılmasıyla, diğer cihaza başarıyla bağlanmaya dair görsel göstergeler kullanılabilir: Merkezi – 34. satır–37, Sarı LED yanıp söner; Periferik – 99. satır–106, Yeşil LED yanıp söner. Cihazlar arasında başarılı bağlantılar gözlemlendikten sonra bu satırları tekrar yorum haline getirin. Aksi takdirde, cihaz plaka okuyucunun içindeyken yanıp sönen LED'ler açılabilecek ve ölçümleri bozabilecektir.

  1. GitHub deposundan Arduino dosyalarını indirin: LEMOS_Central.ino, LEMOS_Peripheral.ino. Arduino entegre geliştirme ortamının (IDE) en son sürümünü http://www.arduino.cc/en/software adresinden indirin ve yükleyin.
  2. Yazılım Kartları Yöneticisi'nden kart paketinin en son sürümünü yükleyin (Araçlar > Kurul > Kurul Yöneticisi) (Ek Şekil 2A).
    Orta: Arduino SAMD Panoları
    Periferik: Arduino Mbed OS Nano Kartları
  3. Kütüphane Yöneticisine aşağıdaki Arduino kütüphanelerini yükleyin (Araçlar > Kütüphaneleri Yönet) (Ek Şekil 2B): 'ArduinoBLE’ her iki çevre birim ve merkezi cihaz arasında Bluetooth Düşük Enerji iletişimi için ve ‘Adafruit_NeoPixel’ LED programlama için.
  4. Arduino IDE'de LEMOS_Central.ino Arduino dosyasını açın.
  5. Cihazı, evrensel seri veri yolu (USB) veri kablosu aracılığıyla bilgisayara bağlayın.
  6. Bağlı cihaz için doğru COM portunu seçin (Araçlar > Liman). COM portu belirsizse, cihazı bağladığınızda ve çıkardığınızda hangi portun göründüğünü ve kaybolduğunu gözlemleyin.
  7. Arduino Nano 33 IoT kartını kart menüsünden seçin (Araçlar > Kurul).
  8. Betimi cihaza yükleyin.
  9. LEMOS_Peripheral.ino dosyası ve çevre birimi (Arduino Nano 33 BLE Rev 2) için aynı işlemi tekrarlayın.

4. Replica Kalıplama ile PDMS Mikrokuyuların Dökümü

NOT: LEMOS 2.0 çerçevesinin içine, kopya kalıplama yöntemiyle optik olarak şeffaf PDMS mikroçukurları doğrudan dökün21PDMS mikroçukurlar, plaka okuyucu deneyleri sırasında bakteriyel kültürleri barındırır ve güvenilir OD değerleri için hava kabarcığı içermeyen, şeffaf altlara sahip olmalıdır.600 ve floresans ölçümleri. Toz, kabarcıklar veya eksik sertleşme, kuyu arası değişkenliğe neden olabilir ve döküm sırasında kaçınılmalıdır. PDMS içindeki herhangi bir toz veya artıkların optik şeffaflığı bozarak tutarsız OD sonuçlarına yol açacağından, döküm öncesi havalandırma dolabının yüzeyinin temiz olduğundan emin olun.600 mikrokuyuculardaki ölçümler

UYARI: Kürlenmemiş PDMS ile çalışırken bir duman ocağında çalışın. Kürleme ajanıyla deri temasından kaçının.

  1. LEMO 2.0 çerçevenin mikrokuyuların döküldüğü iç kısmını, LED'ler dışındaki elektriksel bileşenlere doğrudan temas etmemeye dikkat ederek %70 etanol ile dezenfekte edin. PDMS mikrokuyuları dökmeden önce LEMOS 2.0 çerçeveyi tamamen kurumaya bırakın.
    NOT: LED'lere etanol teması güvenlidir ancak diğer tüm elektrikli bileşenlere zarar verir.
  2. PDMS mikroçukurların kalıp kalıbını bir ayırıcı ajanla püskürtün ve spreyin plastik yüzeye yerleşmesi için 10 dakika bekleyin. Ek 10 dakika sonra ikinci bir uygulama kalıbın ayrılmasını iyileştirebilir, ancak bu isteğe bağlıdır.
    NOT: Sürüm ajanı (örneğin, Ease Release 200), kalıp kalıbını hidrofobik hale getirerek sertleşmiş PDMS mikroçukurlardan kalıp kalıbının kolayca çıkarılmasını sağlar.
  3. 184 silikon elastomerin katkılama ajanı ve bazını, bazın katkılama ajana kütlece 10:1 oranında olacak şekilde tek kullanımlık plastik bir kâse içinde tartın ve karıştırın.
    NOT: Bir LEMOS 2.0 cihazı için toplam 27,5 g karışım elde etmek üzere 2,5 g sertleştirici + 25 g baz kullanımı önerilir; aynı anda birden fazla cihaz dökülmesi durumunda oranlar buna göre artırılmalıdır.
  4. En az 5 dakika boyunca bir tek kullanımlık spatula veya tahta çubuk kullanarak kuvvetlice karıştırın ve tam karışım sağlanması için kabın kenarlarını ve dibini kazıyın.
    NOT: Titiz karıştırma çok önemlidir. Yetersiz karıştırılan PDMS düzgün sertleşmez ve tutarlı olmayan temel OD değerleri verir.600 mikrokuyuculardaki ölçümler
  5. PDMS karışımını içeren kabı bir vakumlu desikatöre yerleştirin. 45 dakika boyunca (en az 65 cmHg/25 inHg) vakum uygulayın–60 dakika boyunca, karışımın içindeki tüm görünür hava kabarcıkları tamamen çıkıncaya kadar. Hava kabarcıkları yüzeye çıktıkça PDMS genişler ve kabın dışına taşıp düşebilir. En az 3 katı hacim kapasitesine sahip bir kap kullanın.× karışımın hacmi.
    UYARI: Sertleşmiş PDMS içinde kalan hava kabarcıkları mikrokuyu tabanlarının ışık geçirgenliğini değiştirerek tutarsız bazal OD değerlerine neden olur600 ölçümler.
  6. LEMOS 2.0 çerçevesini dört kenarından uygun boyutlarda klipler kullanarak dış kabuğa sabitleyin.
    NOT: Klıp klipsleri, dış kabuk ile LEMOS 2.0 çerçevesi arasındaki boşluğa sızan PDMS miktarını en aza indirir. Bu boşlukta fazla PDMS birikmesi, cihazın toplam yüksekliğini artırabilir ve LEMOS 2.0 çerçevesinin dış kabuk içinde düz bir şekilde oturmasını engelleyebilir. Mikroçukurların yanındaki LEMOS 2.0 çerçevesinin alt çevresine Kapton bant yerleştirmek, sızmayı daha da azaltabilir.
  7. Dekontamine edilmiş PDMS'yi dikkatlice LEMOS 2.0 çerçevesine dökün. Mikrokuyucuların minimum kabarcıkla dolmasını sağlamak için her birine PDMS eklemek üzere bir şırınga kullanın.
    NOT: Küçük kabarcıkların oluşması kaçınılmazdır; zamanla yüzeye doğru yükselir ve kaybolur. Kabarcıkların işlem sırasında tekrar girmesini en aza indirmek için deaerasyon sonrası PDMS'yi hemen dökün.
  8. 3D baskılı kalıbı PDMS ile dolu çerçeveye yerleştirin. Kalıbı hafifçe ve eşit bir şekilde basın ve kalıptaki dairesel çıkıntıların LEMOS 2.0 çerçevesinin deliklerine oturduğundan emin olun. Kalıp, LED'lerin yanına hizalanmış kare mikroçukurları tanımlar. Kenarlardan taşan fazla PDMS'yi temiz, parlatmasız bir bezle silerek temizleyin.
  9. PDMS'nin oda sıcaklığında (25 °C) en az 30 saat boyunca düz bir yüzeyde bekletin. Gerekirse, cihazı 37 °C’de tutarak sertleşmeyi hızlandırın. °PDMS'ten görülebilir tüm hava kabarcıkları uzaklaştırıldıktan sonra 4 saat boyunca C
    UYARI: LEMOS cihazını 37 °C'nin üzerindeki sıcaklıklara maruz bırakmayın °C, çünkü bu, araçtaki Li-iyon pilin aşırı ısınmasına ve patlamasına neden olabilir.
  10. PDMS mikrokuyular sertleştikten sonra kalıbı kenarlarından tutarak sabit bir kuvvetle yukarı doğru çekerek çıkarın. PDMS mikrokuyuların çerçevede kaldığından emin olun.
  11. Her bir mikrokuyunun duvarlarının optik olarak berrak olduğundan ve alt kısmında hava kabarcığı bulunmadığından emin olmak için inceleyin. Taze PDMS mikrokuyularla donatılmış LEMOS 2.0 cihazı artık kullanıma hazırdır.

5. Mikroplaka Okuyucuyu ve Veri Dışa Aktarma İş Akışını Yapılandırma

NOT: Mikroplaka okuyucuyu, LEMOS 2.0 ile uyumlu kinetik ölçümler alacak ve veri dışa aktarımını otomatikleştirecek şekilde ayarlayın. Okuyucu, özel LEMOS 2.0 mikroçukur düzenini tanımalı, OD değerlerini600 belirli aralıklarla floresans ölçümleri yapın ve veri dosyalarını Python kontrol betiğinin izlediği klasöre aktarın. PDMS mikroçukurların ve mikroplaka okuyucu ayarlarının tutarlı ölçümler ürettiğini doğrulamak için biyolojik deneylerden önce steril ortam ile bir temel çizgisi ölçümü gerçekleştirin. Bu protokol, BioTek Gen5 yazılımı v3.14 ile çalıştırılan bir BioTek Synergy H1 mikroplaka okuyucusu kullanır.

  1. Gen5'i başlatın.
  2. Gitmek için Plaka Türleri ve içeri al LEMOS 2.0.xml GitHub'dan veya alternatif olarak Gen5'te LEMOS 2.0 için özel plaka düzenini ayarlayarak Ek Dosya 2 (Bölüm 1)  ve Ek Dosya 3.
  3. Temel ölçümü, mikroçukurlara 200 µL µL steril M9CA ortamı, tıbbi sınıfı bir kaplama filmiyle [örneğin, Breathe-Easy filmi] kaplanmış şekilde). OD'yi kaydedin600 ve tüm 32 mikrokuyunun floresans baz çizgisi değerlerini ölçün ve bu değerleri standart bir 96 kuyucuklu mikroplaktan elde edilen değerlerle karşılaştırın. Büyük bir farklılık gözlemlenirse, sertleşmiş PDMS içindeki kabarcıklar veya kalıntılar en olası neden olduğundan, PDMS mikrokuyuları yeniden dökün.
    NOT: Breathe-Easy filmi gaz geçirgendir ve hücre büyümesi için aerobik koşulları korur, aynı zamanda floresans ve OD ölçümlerinde interferansa neden olmaması için optik olarak şeffaf kalır.600 ölçümler.
  4. Deney protokolünü açın closed_loop_protocol.prt Gen5'teki GitHub deposundan
    NOT: Kolaylık olması açısından GitHub deposunda önceden yapılandırılmış bir deney dosyası şablonu olan template.xpt mevcuttur. Ancak ayarlar, ayrıntılı olarak aşağıdaki şekilde açıklanmıştır. Ek Dosya 2 (Bölüm 2) ve Ek Dosya 3 farklı Gen5 sürümlerine sahip kullanıcılar için sorun gidermeye yönelik bir referans sunmak.

6. LEMOS 2.0 Deneyleri için Bakteri Kültürlerinin Hazırlanması

NOT: LEMOS 2.0 optogenetik zaman serisi deneyi için bakteriyel kültürleri hazırlayın. Başlangıç yoğunluğu ve deney öncesi ışık maruziyeti, ölçülen gen ekspresyonu dinamiklerini etkileyebileceğinden kültür hazırlama işlemine dikkatli yaklaşmak önemlidir. Gösterim suşu şudur Escherichia coli (E. coli) pSR58.6 ve pNO286-3 içeren MG165522. pSR58.6, süper katlanır yeşil floresan protein (sfgfp) P altındacpcG2 ve konstitütf CcaR, kloramfenikol direnci ve bir pColE1 kökeni. pNO286-3, konstitütf CcaS, spektinomisin direnci ve bir p15A kökeni içerir. Birlikte, bu plazmidler yeşil ışıkla indüklenen, kırmızı ışıkla bastırılabilen bir gen ekspresyon sistemi oluşturur. pSR58.6 ve pNO286-3, kimyasal olarak kompetan hâle getirilmiş E. coli MG1655'in standart ısı şoku dönüşümü kullanılarak23Plakalar, optogenetik devrenin erken aktivasyonundan kaçınmak için hücreleri ortam ışığından korumak amacıyla bir kutuya yerleştirildi.

  1. CcaSR optogenetik suşu ve floresans negatif kontrol suşunun her biri için tek bir koloni, içinde 50 µg/mL kloramfenikol ilave edilmiş 2 mL M9CA besiyeri bulunan ayrı 14 mL'lik yuvarlak uçlu kültür tüplerine ekilir. µg/mL spektinomisin ve 25 µg/mL kloramfenikol. Deney boyunca tüm sonraki kültür adımlarında bu besiyeri formülasyonunu kullanın.
  2. Her tüpü alüminyum folyo ile kaplayın ve gece boyu (14–16 saat) 37 °220 dev/dk’de sallayarak C
    NOT: Folyo kaplama, karanlık koşulları korur ve CcaSR sisteminin istenmeden aktive olmasını önler. Alternatif olarak, kültürler, bölüm 2'de tanımlanan aynı elektrik kurulumuna sahip LED bir kap içinde sabit kırmızı ışık altında inkübe edilebilir; bu durum, sistemin deney öncesi baskılanmış durumunu daha iyi yansıtır.
  3. 100'ü aktarın µHer bir gece boyu kültürün L'sini, yeni bir folyo ile sarılmış kültür tüpündeki 2 mL taze besiyerine ekleyin. 37 °C'de 4 saat inkübe edin. °220 dev/dk’de sallayarak C
  4. OD'yi ölçün600 4 saat sonra mikroplak okuyucu kullanarak her alt kültürün
    NOT: Kültürlerin OD değerinin600 0,4'ün–0.6.
  5. Her bir kültürün OD'sini sulandırın600 = 0,1 oranında taze besiyerine 200 µL pipetleyin µL'yi LEMOS 2.0 cihazının her bir mikrokuyusuna, pipetleme sırasında hava kabarcığı oluşmasını önlemeye dikkat ederek ekleyin ve cihazı tıbbi sınıf bir sızdırmazlık filmiyle kapatın.

7. LEMOS 2.0 Optogenetik Zaman Serisi Deneyinin Başlatılması

NOT: Mikroplaka okuyucu, merkezi Arduino ve Python kontrol betiği olmak üzere üçlü koordinasyon ile otomatik LEMOS 2.0 deneyine başlayın. Çalışma süresince bilgisayar, plaka okuyucu ölçümlerini, veri dışa aktarmayı, Bluetooth iletişimini ve LED devreye girme işlemlerini koordine eder. Python betiği, plaka okuyucu yazılımıyla ekran tabanlı otomasyon kullanarak etkileşime girdiğinden, Gen5 penceresinin açık ve görünür durumda kalması kritik önem taşır. Başarılı bir başlangıç, beklenen klasörde dışa aktarılan veri dosyalarının görünmesi, terminal çıktısında Bluetooth iletişimini doğrulayan mesajlar ve her kontrol aralığında LED komutlarının güncellenmesi ile belirlenir.

  1. LEMO 2.0 cihazını çalıştırmak için anahtarı sola kaydırın. LEMOS 2.0'daki LED şeridin ilk LED'i yeşil renkte ışık verir.
  2. Merkezi Arduino'yu bir USB kabloyla bilgisayara bağlayın ve Arduino IDE'de açılır menüden onu seçin (Araçlar > Kurul).
  3. Açın Seri İzleme ve LEMOS 2.0'da yer alan çevre Arduino'yu merkezi Arduino'ya bağlayın.
  4. LED şeridindeki gösterge LED'sini harf girerek kapatın 'o' seri monitöre
  5. Deney dosyasını açın LEMOS-start-data.xpt Gen5'te kültürlerin aygıt içindeki temel okumalarını yapın ve OD'yi sağlayın600 ve floresans değerleri beklenenlerle uyumludur. Deney dosyasını kapatın.
  6. 5.4. adımda kaydedilen protokol dosyasını Gen5'te açın ve bir deney olarak kaydedin, aşağıdaki adımları Ek Dosya 2 (Bölüm 3) ve Ek Dosya 3.
  7. Sisteminizde Python 3.10 veya daha yeni bir sürümün yüklü olduğundan emin olun ve sağlanan requirements.txt dosyasını kullanarak gerekli paketleri yükleyin.
  8. Açık control_duty_cyle.py (duty cycle deneyleri için) veya control_pid.py (PID deneyleri için) Visual Studio Code veya Spyder gibi herhangi uygun bir entegre geliştirme ortamında (IDE).
    NOT: Çalışma dizininin, tüm Python betiklerini içeren klasöre ayarlandığından emin olun, böylece betikler çalıştırma sırasında içe aktarılabilir. IDE seçimi önemli değildir.
  9. İn the Ana python betiğinin bölümü, değiştirin dosya değişkeni, 7.6. adımda Gen5 deney dosyası için seçilen dosya adıyla eşleşecek şekilde ayarlayın.
  10. Deney dosyasını ve Python betiğini yan yana ayarlayın (Şekil 1).
  11. Tıklayın Çalıştır Gen5 deneyinde, kinetik adım başladığında deneyi iptal edin.
    NOT: Python betiği bir arar Devam edin tıklandıktan sonra düğmesi ÇalıştırAncak yeni bir deney dosyasında bu düğme, ikinci ölçüm alınana veya kinetik çalıştırma iptal edilene kadar görüntülenmez.
  12. Python betiğini çalıştırın. Çalıştırma sırasında Gen5 penceresini küçültmeyin veya kapatmayın.
    NOT: Python betiği, ekran tabanlı otomasyon kullanır ve her kinetik döngüden sonra veri dışa aktarmayı ele alabilmek için yaklaşık her 20 dakikada bir Gen5 penceresini bulabilmelidir. Bu süre zarfında pencerenin kapatılması veya simge durumuna küçültülmesi deneyi bozabilir.

8. Cihazın Temizlenmesi, PDMS'in Kaldırılması ve Pilin Şarj Edilmesi

NOT: Deneyin ardından LEMOS 2.0 cihazını temizleyin ve sıfırlayın. Bakteri kültürlerini ve kullanılmış PDMS mikroçukurları çıkarın, tekrar kullanılabilir çerçeveyi ve kabuğu dezenfekte edin ve bir sonraki kullanım için bataryayı şarj edin. Temizlik sırasında LED olmayan elektronik bileşenlere etanol veya aşırı mekanik kuvvet uygulamaktan kaçının.

  1. LEMOS 2.0 cihazının üst kısmındaki tıbbi sınıf sıfız filmi dikkatlice soyun ve atın.
  2. Her mikrokuyudaki tüm hücre süspansiyon sıvısını, biyolojik atık bertaraf prosedürlerine göre bir pipet kullanarak aspire edin ve atın.
  3. PLA çerçeveye aşırı bükme veya burma uygulamaktan kaçının, çünkü bu çatlama veya kalıcı deformasyona neden olabilir. LEMOS 2.0 çerçevesinden dış kabuğu sabit ve dengeli bir kuvvet uygulayarak ayırın.
  4. Çerçevenin dış kısmından büyük PDMS katmanını ayırın ve LEMOS 2.0 çerçevesinden PDMS mikrokuyuları dikkatlice çıkarmak için forceps kullanın.
  5. LEMOS 2.0 çerçevesini ve dış kabuğunu, adım 4.1'de açıklandığı gibi LED'ler dışındaki elektrikli bileşenlere doğrudan temas etmemesine dikkat ederek %70 etanol ile dezenfekte edin.
  6. Bir sonraki deney için Li-iyon pilin şarjını yenileyin:
    1. Sürgü anahtarı sağa/şarj konumuna getirin.
    2. USB'yi şarj modülüne bağlayın.
    3. Kontrol panelindeki LED aracılığıyla şarj durumunu onaylayın; şarj sırasında LED ışığı yanıp sönecektir (Ek Şekil 1E).

9. Floresans ve Büyüme Dinamiklerinin Analizi

NOT: Floresans ve OD'yi işleme600 LEMOS 2.0 deneyi sırasında oluşturulan veriler. Analiz defteri, dışa aktarılan mikroplaka okuyucu verilerini içeri aktarır, boş örnek ve negatif kontrol düzeltmelerini uygular, normalize edilmiş floresans değerlerini hesaplar ve zamanla değişimi gösteren grafikler oluşturur. Defteri çalıştırmadan önce, mikrokuyu atamalarının ve koşul etiketlerinin deneysel düzeneyle eşleştiğinden emin olun.

  1. Açın ya da FL_OD_Data_Analysis_Duty_Cycle.ipynb veya FL_OD_Data_Analysis_PID.ipynb.
    UYARI: Bu işlem, çalıştırma sırasında oluşturulan ve bu dosyalarda depolanan floresans (FL) ve optik yoğunluk (OD) verilerini kullanır: Veri dosyası/fl.csv ve Datafile/od.csv. PID analiz sayfası aynı zamanda set noktasından kaynaklanan ve depolanan ifade hatalarını kullanır. Datafile/errors.csv.
  2. Koşullar değişkenini, koşul adları ve kuyucuklarla ayarlayın.
  3. Ayarla neg_wells negatif kontrol mikrokuyu adlarının köşeli parantez içine alınmış listesine eşit
  4. Ayarla od_blank ve boş boş kuyuların ortalamalarına veya boş çalıştırılmamışsa bilinen değerlere.
  5. Ayarla renkler_4_figürler istenilen renklere (isimlendirilmiş renklerin tam listesi için bkz. https://matplotlib.org/stable/gallery/color/named_colors.html).
  6. Sonuç grafiklerinin istenen genişliğini ve yüksekliğini inç cinsinden belirlemek için figsize değerini ayarlayın.
  7. Dosya adlarının listelendiğini doğrulayın Sabitler.
  8. Defteri çalıştırın, şekiller .png dosyaları olarak oluşturulacaktır.

10. Sorun Giderme

  1. LED kablolaması sırasında LED lehimleme yastıkları koparsa şunları göz önünde bulundurun:
    1. LED şeridin köşesini bükerek kabloları kablolama deliğinden daha kolay geçirebilirsiniz.
    2. Daha sert (katı) bir tel kullanıldıysa, daha esnek (yapraklı) bir tele geçin.
  2. Eğer anahtar açık konumdaysa ve BLE Nano'LED'nin ışık vermediğini düşünün:
    1. Öncelikle, pilin şarj olup olmadığını doğrulayın. Anahtarı şarj moduna getirin ve şarj modülünü elektrik kaynağına bağlayın. Eğer pil doluysa, gösterge LED’i birkaç dakika sonra yanıp sönmesini bırakmalı ve sabit yeşil ışık vermeye başlamalıdır. Eğer pil tamamen boşalmışsa, yeniden denemeden önce pilin tamamen şarj olmasını bekleyin.
    2. Pil şarjlıysa ve LED hâlâ ışık vermiyorsa, BLE Nano'nun uçları arasındaki voltajı ölçmek için bir multimetre kullanın's VIN ve GND pinleri.
      1. 0 V: Bir kablolu bağlantı kopuk. Pil boyunca her bir lehim birleşimini kontrol edin > anahtar > yükseltici dönüştürücü > Nano yolu izleyin ve soğuk veya eksik görünen herhangi bir lehim birleştirmesini yeniden eritin.
      2. 5 V: Nano'ya güç doğru şekilde ulaşıyor, bu nedenle kartın kendisi hasar görmüş olabilir. Bunu doğrulamak için kabloyla Nano'yu çalıştırın. Güç LED'i hâlâ yanmıyorsa, arızalı Nano'nun yerine yeni bir Nano'yı lehimleyin.
      3. 5 V’tan fazla: Arttırıcı çevirici, 5 V çıkış vermek üzere yapılandırılmamıştır. Cihaz montaj bölümü bölümünde açıklandığı gibi, arttırıcı çeviricideki A ve B padlerinin bağlantısının kesildiğinden emin olun.
  3. Python betiği çalıştırılamazsa aşağıdaki noktaları göz önünde bulundurun:
    1. Python betiğinin tek başına bir dosya olarak değil, tam proje klasöründen açılıp açılmadığını doğrulayın; hem control_duty_cycle.py hem de control_pid.py diğer yerel modüllere bağımlıdır ve bağımsız olarak açılırsa çalışmayı başarısız olur.
    2. Arduino IDE'nin kapalı olduğundan emin olun, çünkü Arduino aynı anda yalnızca bir etkin bağlantıya izin verir. İşletim sistemi, portu ilk açan programa erişim izni verir.
    3. Farklı bir yazılım kullanılıyorsa, Gen5 protokolünün doğru şekilde ayarlandığından emin olun. Başvurun: Ek Dosya 2 (Bölüm 2).
    4. Gerekli paketlerin yüklü olduğundan emin olun. Bir sanal ortam oluşturun ve paketleri requirements.txt dosyasında listelenen şekilde yükleyin.
  4. Deney beklenmedik şekilde durursa aşağıdaki hususları göz önünde bulundurun:
    1. İlk döngünün ardından durur: Gen5 veri dışa aktarma yolu muhtemelen yanlış yapılandırılmıştır. Dışa aktarma hedefinin, Python betiğinin okumasını beklediği klasörle eşleştiğini doğrulayın. dosya değişken
    2. Birkaç döngüden sonra durur: PyAutoGUI bazen ekran çözünürlüğü, ekran ölçeklendirmesi veya pencere boyutunda bir değişiklikten sonra ekrandaki öğeleri tanımayı başaramaz. Betiğin kullandığı referans ekran görüntüleri yeniden yakalanmalı ve çalışma boyunca Gen5 penceresi etkin ve ön planda tutulmalıdır; Python IDE penceresi simge durumuna küçültülebilir.
    3. Gen5, kamaranın sıcaklığının hedef aralığın dışında olduğunu bildirirse, çalışmaya devam etmeden önce okuyucunun dengeye ulaşmasını bekleyin. Sıcaklık uyarısını geçmeyin, çünkü bu işlem manuel olarak kapatılması gereken bir denetim raporu penceresini tetikleyebilir ve otomasyonu kesintiye uğratabilir.
  5. Aşırı yüksek veya tutarsız OD değerleri varsa600/mikrokuyularda floresans baz çizgisi değerleri gözlemlendiğinde, aşağıdakileri dikkate alın:
    1. Hapsetilmiş toz veya artıkların ışığı saçıp ölçümleri şişirmesini önlemek için PDMS mikroçukurları kontrol edin.
    2. PDMS'yi döküm veya kullanım öncesinde uzun süre kapaksız olarak ortam havasına maruz bırakmaktan kaçının.
  6. Işık uygulamasına rağmen hücrelerde belirlenebilir bir yanıt gözlenmiyorsa, aşağıdaki noktaları göz önünde bulundurun:
    1. LED'yi onaylayın "açık" komutlar, IDE terminal çıktısı ve BLE iletişim günlüğü kontrol edilerek verilmektedir.
    2. Eğer komutlar gönderiliyor ancak ışık görünmüyor ise, LED lehim bağlantılarını bir multimetre ile kontrol edin.

Sonuçlar

LEMOS 2.0, programlanabilir optogenetik stimülasyon ve kantitatif gen ekspresyonu ölçümü için kullanılan, mikroplaka okuyucu ile uyumlu 32 kuyucuklu bir platformdur24 (Şekil 2A,B). Her bir mikro kuyucuk, Adafruit_NeoPixel kütüphanesi aracılığıyla bir Arduino Nano 33 BLE Sense Rev2 tarafından kontrol edilen, bireysel olarak adreslenebilir bir WS2812B ışık yayan diyot (LED) ile eşleştirilmiştir. Cihaz, bir harici bilgisayar ile Bluetooth üzerinden haberleşerek aydınlatma komutlarının deney sırasında güncellenmesine olanak tanır. Kullanım öncesinde, replika kalıplama yoluyla cihaza taze PDMS mikro kuyucuklar dökülür (Şekil 2C,D). LEMOS 2.0 içerisinde 30 °C'de sabit LED aydınlatması altında büyütülen E. coli kültürleri, mikro kuyucuklar genelinde tekrarlanabilir büyüme göstermiş; bu durum, cihazın bakteriyel kültürü ve deney süresi boyunca plaka okuyucu ölçümünü desteklediğini göstermiştir18 (Şekil 2E). Ayrıca, büyüme eğrileri farklı aydınlatma koşulları arasında benzerlik göstermiş, bu da LED maruziyetinin bu ayarlarda hücre büyümesini ölçülebilir düzeyde etkilemediğini ortaya koymuştur.

Optogenetik gen ekspresyon kontrolünü göstermek için, sfGFP ekspresyonunu kontrol eden, yeşil ışıkla aktive olan ve kırmızı ışıkla baskılanan iki bileşenli bir sistem olan CcaSR v3.0 sistemi benimsenmiştir22 (Şekil 3A). Yeşil ışık altında, CcaS otofosforilize olur ve fosfatı, PcpcG2 promotörüne bağımlı sfGFP ekspresyonunu aktive etmek için dimerleşen yanıt düzenleyici CcaR'ye aktarır. Kırmızı ışık altında, CcaS defosforilize olur, böylece PcpcG2 aktivitesi azalır ve sfGFP ekspresyonu baskılanır. CcaSR plazmitleri E. coli MG1655'e transforme edilmiş ve bu protokolde açıklanan deneyler için kullanılmıştır (Şekil 3B). Deney sırasında, mikroplaka okuyucu her 10 dk'da bir OD600 ve floresan değerlerini ölçmüştür. LED aydınlatmasının optik ölçümleri etkilemesini önlemek için LED'ler, her 10 dk'lık aralığın başlangıcındaki ve sonundaki ölçüm pencereleri sırasında kapanacak şekilde programlanmıştır (Şekil 3C).

Kuyu arası çapraz etkileşim, karanlık koşuldaki mikro kuyucuklar sabit yeşil ışık aydınlatması altındaki mikro kuyucukların dikey veya yatay olarak yanına yerleştirilerek değerlendirilmiştir (Şekil 3D). Sabit yeşil ışıklı mikro kuyucukların yanındaki karanlık mikro kuyucuklar, aydınlatılmış komşu mikro kuyucukları olmayan karanlık mikro kuyucuklara kıyasla ekspresyonda anlamlı bir artış göstermemiştir; bu durum, mikro kuyucuklar arasında ışık sızıntısının minimum düzeyde olduğunu göstermektedir. Bu sonuçlara dayanarak, kuyu arası çapraz etkileşimi en aza indirirken yeterli optik stimülasyon sağlamak amacıyla sonraki deneylerde 255'te 1'lik bir darbe genişliği modülasyonu (PWM) değeri kullanılmıştır.

Ardından, LEMOS tabanlı optogenetik kontrol için aktüasyon parametresini belirlemek amacıyla açık döngü stimülasyonu kullanıldı. Aktüasyon parametresi, her bir aktif aydınlatma penceresinin yeşil ışığa ayrılan kısmının oranı olarak tanımlanan yeşil ışık görev döngüsüydü; kalan aydınlatma süresi ise kırmızı ışığa ayrılmıştı. Plaka okuyucu ölçümleriyle girişimi önlemek için her kontrol aralığı 10 dk sürdü; bu sürenin 8 dk'sında LED'ler aktif, kalan 2 dk'sında ise kapalıydı. %5 ile %80 arasındaki yeşil ışık görev döngüleri, kademeli sfGFP ekspresyonu oluşturarak görev döngüsünün optogenetik regülasyon için ayarlanabilir bir girdi olarak kullanılabileceğini gösterdi (Şekil 3E). Ekspresyon hızı, görev döngüsü %5'ten %40'a yükseldikçe arttı, ancak daha yüksek görev döngülerinde anlamlı bir ek artış görülmedi (Şekil 3F); bu durum, sistemin daha uzun süreli yeşil ışık stimülasyonu altında doygunluğa yaklaştığını düşündürmektedir.

Son olarak, LEMOS 2.0'ın gen ekspresyonunu tanımlanmış bir set noktasına doğru dinamik olarak regüle edip edemeyeceğini test etmek için kapalı döngü geri bildirim kontrolü uygulandı25 (Şekil 4A). Kontrol sistemi bileşenleri şu şekilde atandı: aktüatör — LED'ler, kontrolör — PID betiğini çalıştıran harici bilgisayar ve ölçülen çıktı — OD600 ile normalize edilmiş sfGFP floresansı. Kontrolör, ölçülen FL/OD600 değerini atanan set noktasıyla karşılaştırdı ve bir sonraki 10 dakikalık aralık için yeşil ışık görev döngüsünü güncelledi. Her döngüdeki yeşil ışık maruziyet süresinin, tgreen, şu şekilde hesaplandığı Oransal-İntegral-Türevsel (PID) kontrol uygulandı:
figure-results-1

Burada e(t), t zamanındaki ölçülen FL/OD600 sinyali ile ayar noktası arasındaki hatadır. K oransal kazanç, τI  integral zaman sabiti ve τD türev zaman sabitidir. Kapalı döngü kontrol parametreleri, daha önce rapor edilen26 büyüme aşamaları boyunca gen ekspresyonu (GEAGS) modeli kullanılarak seçilmiştir. Bu parametrelerin kullanımıyla, ölçülen sinyal hedef FL/OD600 ayar noktasına yaklaşmış ve onu takip etmiştir (Şekil 4B).

Karşılık gelen görev döngüsü komutları Şekil 4C'de gösterilmiştir. Çubuk yüksekliği, her 8 dakikalık aydınlatma penceresi boyunca iletilen yeşil ışık oranını temsil etmektedir. Denetleyici girişi her 10 dakikada bir güncellediği için görev döngüsü komutu ayrık adımlarla değişmiştir. sfGFP ekspresyonu ayar noktasına yaklaştıkça yeşil ışık maruziyeti azalmış ve kırmızı ışık maruziyeti artmıştır. Ölçülen sinyal ayar noktasına ulaştıktan sonra, düşük düzeyde yeşil ışık girdisi gözlemlenmeye devam etmiştir. Bu kalıntı kontrol girdisi, muhtemelen ayar noktası yakınındaki ekspresyon hızındaki ani değişime yanıt veren türev terimini yansıtmaktadır. Bu sonuçlar, LEMOS 2.0'ın batch kültürde optogenetik gen ekspresyonunun model güdümlü PID geri beslemeli kontrolünü uygulayabildiğini göstermektedir.

figure-results-2
Şekil 1: Bir deney sırasında LEMOS 2.0 yazılım kurulumu. VS Code'da çalışan Python kontrol betiğini (solda), LED komutlarının Arduino mikrodenetleyiciye gönderildikçe terminalde belirdiğini gösteren örnek ekran görüntüsü. Ana betiği ve ilişkili fonksiyon modüllerini içeren proje dizini, dosya gezgini panelinde görülmektedir. Sağda, plaka okuyucu yazılımı devam eden bir kinetik ölçüm döngüsünü göstermektedir; her döngünün sonunda Python betiği, Gen5 arayüzü üzerinden bir sonraki çalışmayı otomatik olarak tetikler ve LED görev döngüsü komutlarını buna göre günceller. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-3
Şekil 2: LEMOS cihazının kurulumu ve hücre büyüme karakterizasyonu. (A) PDMS mikroçukurları, stimülasyon LED'leri, pil, anahtar, mikrodenetleyici, şarj modülü, cihaz çerçevesi ve dış kabuğu gösteren LEMOS cihazının patlatılmış şeması. (B) Deiyonize su ile doldurulmuş PDMS mikroçukurlarına sahip monte edilmiş cihaz. (C) LEMOS cihazı içinde dökülmüş PDMS mikroçukuru. Namboothiri et al. (2026)18 çalışmasından yeniden üretilmiştir, CC BY 4.0 lisanslıdır. (D) Mikroçukurların dökülmesi için 3D yazıcı ile üretilmiş kalıp (E) 30 °C'de LEMOS içerisindeki E. coli büyüme eğrileri (Sürekli olarak yeşil veya kırmızı ışıkla aydınlatılan veya karanlıkta tutulan çukurların her biri için N = 3 teknik tekrar). Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-4
Şekil 3: LEMOS'ta optogenetik sistem karakterizasyonu ve açık döngü kontrol dinamikleri. (A) CcaSR iki bileşenli optogenetik sistemin plazmit haritası: yeşil ışık (522 nm) sfGFP ekspresyonunu yukarıye düzenlemek için CcaS/CcaR'yi aktive eder ve kırmızı ışık (620 nm) ekspresyonu aşağıye düzenler. (B) CcaSR optogenetik sistemi ile optogenetik deneylerin gerçekleştirilme protokolü. (C) LEMOS çalışma şeması. 12 saatlik zaman seyri boyunca cihaz, mikroplaka okuyucuda kalır. Okuyucu sfGFP floresansı ve OD600 ölçer, ardından verileri zamanlamayı yöneten ve Arduino taslaklarını çalıştıran bir bilgisayara aktarır. Arduino taslakları, her ölçüm sırasında LED aydınlatmasını geçici olarak devre dışı bırakması için yerleşik mikrodenetleyiciye komut verir. Namboothiri ve ark. (2026)18 çalışmasından uyarlanmıştır, CC BY 4.0 altında lisanslanmıştır. (D) Karanlık koşulda uyarılmamış hücreler üzerinde yeşil ışık girişiminin etkisi. Plaka düzeninde, yeşil kutular yeşil ışıklı mikrokuyucukları (N = 9), gri kutular çevreleyen mikrokuyucuklarda ışık girişimi olmayan karanlık koşul altındaki mikrokuyucukları (N = 6), mor kutular yeşil ışıklı mikrokuyucuklara dikey olarak komşu olan karanlık mikrokuyucukları (N = 3), sarı kutular yeşil ışıklı mikrokuyucuklara yatay olarak komşu olan karanlık mikrokuyucukları (N = 3) ve mavi kutular otofloresansı ölçmek için kontrol suşu içeren yeşil ışıklı mikrokuyucukları (N = 2) belirtir. (E) Tahrik parametresi olarak değişen yeşil ışık görev döngülerine (5–80%, N = 3) karşı LEMOS'taki açık döngü yanıtları. Düz çizgiler ortalamaları; gölgeli alanlar standart sapmaları belirtir. (F) Değişen görev döngüsü ile büyümenin eksponansiyel evresindeki ortalama ekspresyon hızı. N, teknik tekrarların sayısını belirtir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-5
Şekil 4: LEMOS 2.0'da kapalı döngü geri besleme kontrolü. (A) Kapalı döngü çalışmanın şeması: mikroplaka okuyucu FL/OD600 değerini ölçen sensör, bilgisayar kontrolör ve LEMOS 2.0 cihazı gen ekspresyonunu düzenlemek için LED'leri harekete geçiren aktüatör olarak işlev görür. Süreç, canlı bakteriyel hücrelerdeki gen ekspresyonudur. Namboothiri ve ark. (2026)18'dan uyarlanmıştır, CC BY 4.0 kapsamında lisanslanmıştır. (B) FL/OD600 ayar noktasının (SP = 18,5 × 105 a.u.) Oransal integral türevsel (PID) kontrol takibi. Sabit ışık referansları yeşil ve kırmızıdır (N = 3). Ayar noktası takip denemeleri turuncu çizgilerle tanımlanmıştır (N = 3). Düz çizgiler ortalama FL/OD600 değerini; gölgeli bantlar standart sapmaları göstermektedir. Noktalı çizgi ayar noktasını işaret eder. (C) Kapalı döngü ayar noktası takibi sırasında PID kontrolörü tarafından oluşturulan temsilci görev döngüsü komutları. Çubuk yüksekliği, her aydınlatma aralığında iletilen yeşil ışık oranını belirtir. N, teknik tekrarların sayısını ifade eder. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

PlatformKültür formatıOkumaGeri besleme kontrolünün gösterimiBüyüme formatıLEMOS 2.0 ile giderilen kısıtlama
LEMOS 2.0Plaka okuyucudaki 32 PDMS mikro kuyuTicari plaka okuyucuModel güdümlü PID set noktası takibiÇalkalamalı kesikli kültürBu çalışmaBu çalışma
LEMOS 1.0plaka okuyucudaki 16 PDMS mikro kuyuTicari plaka okuyucuModel kılavuzlu PI ve PID set noktası takibiÇalkalamalı kesikli kültürDüşük işlem hacmi; sınırlı karanlık koşul uyumluluğu18
Otomatik turbidostat + robotik örneklemeTurbidostatAkış sitometrisi + OD sensörüPI, PID, MPC set-noktası izlemeSürekli kültürRobotik örnekleme gerektirir; ölçüm-eylem gecikmesi2, 3
Anne makinesi mikroskobisiTek hücreli mikroakışkanlarCanlı hücre mikroskobisiTek hücreli geri besleme / MPCSürekli perfüzyonÖzel mikroakışkan sistemler ve mikroskopi gerektirir4, 6, 7
Chi.BioMinyatür turbidostatDahili OD/FL sensörleriPI set-değeri takibiSürekli kültürDahili sensör dinamik aralığı, floresan geri besleme performansını kısıtlar5
Işık Tüpü DizisiKültür tüpleriHarici OD/akış sitometrisiSadece açık döngüÇalkalamalı kesikli kültürManuel örnekleme; sınırlı çevrimiçi büyüme okuması10
LAVA / LITOS / RainbowCap / DiyaÇok kuyucuklu aydınlatma cihazlarıTicari plaka okuyucuSadece açık döngüKesikli kültürAyrı stimülasyon/okuma; sınırlı otomasyon12, 13, 14, 15
Lustro96 kuyucuklu plaka aydınlatmasıTicari plaka okuyucuYalnızca açık döngüKesikli kültürStimülasyon ve okuma işlemleri arasında robotik transfer gerektirir8
RT-OGENEÇok kuyucuklu/mikroakışkan uyumlu tablaKamera tabanlı OD/FLKapalı döngü denendi; okuma kapasitesi ile sınırlı kalındıStatik kesikli kültürKamera tabanlı okuma ve statik kültür, kontrol performansını kısıtlamaktadır16
optoPlakaOkuyucuÖzel 96 kuyucuklu okuyucu/stimülatörYerleşik fotodiyotlarBang-bang set-noktası takibiÇalkalamalı kesikli kültürRaporlayıcı/filtre bağımlılığı ve daha düşük floresan hassasiyeti, okuma esnekliğini kısıtlamaktadır11,17

Tablo 1: LEMOS 2.0'ın mevcut optogenetik platformlarla karşılaştırılması2,3,4,5,6,7,8,10,11,12,13,14,15,16,17,18.

Ek Şekil 1: Montaj görüntüleri. (A) Cihazın içindeki bükülmüş LED şeridi ve kalıplanmış şerit. (B) Pil şarj modülüne lehimlenmiş olan yükseltici konvertöre lehimlenmiş Nano BLE Sense Rev 2. (C) ‘JST PH 2-Pin Cable – Female Connector 100mm’ ürününün orijinal ve modifiye edilmiş versiyonları. (D) Orijinal anahtar, modifiye edilmiş anahtar, lehimlenmiş kırmızı JST PH kablosu ve alt sıranın her iki yanındaki iki pin arasına lehimlenmiş kısa jumper. (E) Anahtarın devre montajına dahil edilmesi ve devrenin güçlendirilmesi. (F) Sıcak silikon ile konumlandırılmış LED'lerin ve LED şeritlerinin yan görünümü. Lütfen bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.

Ek Şekil 2: Arduino IDE kurulum ekran görüntüleri. (A) Gerekli kartlardan birinin arandığını gösteren Kart Yöneticisi ekran görüntüsü. (B) Gerekli kütüphanelerden ikisini gösteren Kütüphane Yöneticisi ekran görüntüsü. Lütfen bu dosyayı indirmek için buraya tıklayın.

Ek Dosya 1. LEMOS Bağlantı Şeması. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Dosya 2: Gen5'te LEMOS 2.0 için özel plaka düzeni ayarlama protokolü. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Dosya 3: Ek Dosya 2'de açıklanan yazılım adımlarının ekran görüntüleri. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Video 1: Aşağıdaki adımları içeren montaj videosu. LED şeridin çerçeveye yerleştirilmesi, LED şeridin sıcak silikonla sabitlenmesi, LED şeritlere giden ve LED şeritler arasındaki kablo düzenlemesi ve elektronik devre ile nihai montaj. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

Bu protokol, standart bir mikroplaka okuyucu içerisinde optogenetik stimülasyon ve geri bildirim kontrollü deneyler için tasarlanmış, 32 kuyucuklu LED gömülü bir mikroplaka olan LEMOS 2.0'ın imalatını ve çalıştırılmasını açıklamaktadır. Temsili deneyler, LEMOS 2.0'ın mikrobiyal büyümeyi desteklediğini (Şekil 2E) ve aydınlatma altında belirgin bir fototoksisite gözlemlenmediğini kanıtlamaktadır. Ayrıca LEMOS 2.0, komşu karanlık koşullu mikro-kuyucuklara ışık sızmasını azaltarak (Şekil 3D), böylece karanlık kontrollerin ve mekânsal olarak desenlenmiş stimülasyon deneylerinin güvenilirliğini artırır. Dahası LEMOS 2.0, görev döngüsü tabanlı optogenetik aktivasyona (Şekil 3E) olanak tanır ve kesikli kültürlerde gen ekspresyonunun kapalı döngü PID kontrolünü uygular (Şekil 4B).

Optogenetik deneylerde, hem aktivasyon hem de floresan okuması için aynı optik iş akışı kullanıldığından, fotobeyazlama önemli bir husustur.27LEMOS 2.0, emisyon pikleri 620–630 nm (kırmızı), 515–525 nm (yeşil) ve 465–475 nm (mavi) olan üç diyot içeren ticari RGB LED'ler kullanır.19Bu nedenle, optogenetik regülasyon için yeterli ışık girişi sağlandığı sürece, aktivasyon dalga boyları ile floresan reporter'ın eksitasyon spektrumu arasındaki spektral örtüşmeyi en aza indirecek reporter seçimi ve LED çalışma şiddeti belirlenmelidir. Bu protokolde, yeşil ve kırmızı ışık yanıtları bu sistem için rapor edilen geniş aktivasyon ve deaktivasyon bantları içerisinde yer alan CcaSR sistemi kullanılmıştır.22ve 485 nm eksitasyon kullanarak sfGFP floresansı ölçüldü. CcaSR kontrolü için kullanılan yeşil ve kırmızı aktivasyon dalga boyları sfGFP eksitasyon dalga boyundan ayrı olduğundan ve LED çıkışı, güçlü optogenetik regülasyon sağlamaya devam ederken 255'te 1 PWM yoğunluğuna indirgendiğinden, LED aktivasyonuna bağlı fotobezmenin sınırlı olması beklenmektedir. Uzun süreli deneyler sırasında bir miktar fotobezme meydana gelebilir; ancak burada kullanılan koşullar altında bu durum, ölçülen optogenetik indüksiyonu, görev döngüsü yanıtını veya kapalı döngü izleme dinamiklerini gölgeleyecek düzeyde olmamıştır.20.

Güvenilir performans için birkaç adım kritik öneme sahiptir. Fabrikasyon sırasında, stimülasyon tekdüzgünlüğünü korumak ve optik çapraz etkileşimi (crosstalk) azaltmak için her LED, karşılık gelen mikrokuyu ile hizalanmalıdır. Devre montajı sırasında, mikrodenetleyici ve LED şeritler bağlanmadan önce yükseltici konvertör 5 V değerine ayarlanmalıdır. Kabarcıklar, toz, kalıntılar veya eksik kürlenme, mikrokuyu tabanlarından geçen optik iletimi değiştirebileceği ve tutarsız OD600 veya floresan başlangıç değerlerine yol açabileceği için PDMS dökümü de özel özen gerektirir28. Bu nedenle, biyolojik deneylerden önce steril besiyeri ile bir başlangıç ölçümü yapılmalıdır. Eğer kuyucuklar arasında, plakanın geri kalanına kıyasla OD600 okumalarında büyük farklılıklar gözlemlenirse, etkilenen kuyucuklar daha önce bahsedilen fabrikasyon sorunları açısından incelenmelidir. Sorunun şiddetine bağlı olarak, bu mikrokuyular ya analizden çıkarılmalı ya da mikrokuyular tamamen yeniden dökülmelidir.

Yazılım yapılandırması, başarısız deneylerin bir diğer yaygın kaynağıdır. Mevcut iş akışı; plaka okuyucu yöntemi, Gen5 veri dışa aktarımı, Python kontrol betiği ve merkezi ile çevre Arduino kartları arasındaki Bluetooth iletişiminin koordineli çalışmasına bağlıdır. Dışa aktarma yolu ve dosya biçimi, Python betiği tarafından beklenen yapı ile eşleşmelidir ve otomasyon ekran tabanlı etkileşimler kullandığından, çalışma sırasında Gen5 penceresi görünür kalmalıdır. Bir deneye başlamadan önce, LEMOS cihazı merkezi Arduino'ya bağlanmalı ve tüm LED'lerin doğru şekilde aydınlandığını doğrulamak için bir test rutini çalıştırılmalıdır; tespit edilmeyen arızalar deney sırasında kontrolsüz aydınlatma koşullarına yol açacağından, yanıt vermeyen tüm LED'ler bakteriyel kültürler yüklenmeden önce belirlenmeli ve giderilmelidir. İş akışını başka bir plaka okuyucu modeline veya yazılım paketine uyarlayan kullanıcılar, otomasyon katmanını gerektiği gibi değiştirirken aynı zamanlama, ölçüm, dışa aktarma ve ayrıştırma mantığını korumalıdır.

LEMOS, ölçüm aralıklarıyla senkronize otomatik aktüasyonu mümkün kılarak döngüyü tamamlar18. Burada, işlem kapasitesini artırmak amacıyla kuyu sayısı iki katına çıkarılarak başlangıçtaki LEMOS cihazı güncellenmiştir. Ayrıca, revize edilen mikro-kuyu geometrisi kuyular arası ışık sızıntısını minimize ederek, optogenetik devrelerin aynı deneyde aydınlatılmış koşulların yanı sıra karanlık koşullar altında da test edilmesine olanak tanır. LEMOS 2.0 şu anda batch-kültür deneylerini desteklemektedir. Büyüme hızı, kaynak mevcudiyeti ve gen ekspresyon dinamikleri batch-kültür sırasında değiştiğinden; LED yoğunluğu, görev döngüsü aralığı, örnekleme aralığı ve kontrolcü parametreleri gibi parametrelerin diğer suşlar, raporlar, optogenetik sistemler veya büyüme koşulları için yeniden kalibre edilmesi gerekebilir20. LEMOS 2.0'ın optogenetik çalışmalar yürütmek için önceden geliştirilmiş platformlarla detaylı bir karşılaştırması Tablo 1'de sunulmuştur. Gelecekteki versiyonlar, daha tutarlı büyüme koşullarını korurken daha uzun süreli deneylere izin verecek şekilde, kontrollü besiyeri değişimi ve dilüsyon için plaka içi kanallar veya rezervuarlar içerebilir. Ek tasarımlar ayrıca alternatif LED dalga boylarını destekleyebilir veya ekran tabanlı yazılım otomasyonuna olan bağımlılığı azaltabilir.

Açıklamalar

Yazarların beyan edilecek herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

Yazarlar B.J., T.S.B. ve H.R.N. tarafından Texas A&M Mühendislik Deney İstasyonu

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
22 AWG çok damarlı bağlantı kablosu AmazonASIN: B089CQ2N69Elektrik devresini bağlamak için ucuz iletken tel. Tek damarlı veya çok damarlı tel uygundur.
8 Pinli 3 Konumlu 2P3T DP3T Sürgülü Anahtar Yan DüğmesiAmazonASIN: B007Q9Y8YCAnahtar ve pinler, yaygın olanın aksine karşılıklı kenarlarda değil, bitişik kenarlarda olmalıdır.
Arduino Nano 33 BLE Rev 2ArduinoABX00071Mikrokontrolcü – Yassı profil ve BLE özelliği, çevre birimi gereksinimlerine uygundur.
Arduino Nano 33 IoTArduinoABX00027Mikrokontrolcü – Merkezi cihaz olarak kullanılır.
BioTek Synergy H1 mikroplaka okuyucuAgilent (BioTek)—Veya kinetik mod özelliğine sahip uyumlu bir plaka okuyucu
Breathe-Easy sızdırmazlık filmiUSA Scientific9123-6100Tıbbi sınıfta sızdırmazlık filmi; Gaz geçirgen mikroplaka sızdırmazlık folyosu
Kloramfenikol (etanol içinde 25 mg/mL stok çözelti)Çeşitli—Çalışma kons. 25 µg/mL
E. coli MG1655
Ease Release 200Mann Salım TeknolojileriKalıp ayırıcı
Kapton BantAmazonASIN: B07F8TZZ4N
LB agar plakları ve uygun antibiyotiklerKurum içi—Bunların halihazırda mevcut olduğu varsayılmaktadır.
Li-ion 3,7 V pil, 3000 mAh (11,1 Wh), boyut 104060UfineUFX0391-03 JST PH 2-Pin Erkek Kablo ile birlikte gelmelidir. Liter Energy tarafından üretilmiş olup çeşitli perakendeciler tarafından satılmaktadır.
Type-C USB (5V 1A) bağlantılı Li-ion pil şarj ve deşarj modülüAmazonASIN: B0CTMJMRKZAraştır "TP4056'nın yerini alır" Amazon'da. Standart TP4056 modüllerini geçin. Üzerinde şunlar yazan daha küçük, siyah modüllerin göründüğü herhangi bir listede durun "TP4056'nın yerini alır" başlıkta.
Li-ion JST PH 2 Pinli Kablo – Dişi Konnektör 100 mmÇeşitliASIN: B07NWNPB77Pil ile uyumlu olmalıdır’JST konnektör.
LED göstergeli 3,7 V'tan 5 V/8 V/9 V/12 V'a Mini Boost Modülü Voltaj Yükseltici KartAmazon (Teyleten Robot)ASIN: B0B4TB9QNYVerilen bağlantı bir ürün sayfasına yönlendirmekte olup, herhangi bir metin içermemektedir. Lütfen çevrilmesini istediğiniz kaynak metni iletiniz.
Nunc OmniTray Tek Kuyucuklu PlakaThermo Scientific242811Dış Kabuk
pNO286-3AddgenePlazmid #107746Konstitütif CcaS ekspresyonunu kodlar
pSR58.6AddgenePlazmid #63176PcpcG2 promotörü altında konstitütif CcaR ekspresyonunu ve sfGFP'yi kodlar
Havya ve lehimÇeşitli—Öneriler: İnce uçlu, flux (lehim pastası) veya reçine özlü lehim.
Spektinomisin (50 mg/mL stok)Çeşitli—Çalışma kons. 50 µg/mL
Steril kültür tüpleri (14 mL yuvarlak tabanlı)Çeşitli—
SYLGARD 184 silikon elastomer (baz + kürleme ajanı)SYLGARD 184kütlece 1:10 kürleyici:baz oranı
USB-A - Micro USB kablosuÇeşitli—Arduino kartlarını bilgisayara bağlamak için. Sadece bir şarj kablosu değil, bir veri aktarım kablosu olmalıdır.
USB-A'dan USB-C'ye Şarj KablosuÇeşitli—Pil şarj modülüne bağlanır
Vakum desikatörü ve pompasıÇeşitli—PDMS gaz giderme işlemi için
WS2812B IC SPI RGB Piksel LED Şerit, 100LED/m, DC5V, IP30, SiyahAmazon (BTF-LIGHTING)ASIN: B088B8G8LD ; BTF-LIGHTING Parça No.: WS2812B1M100LB30Bireysel olarak erişilebilir LED şeridi. 100 LED/m. Voltaj: 5 V. IP30 su direncini ifade eder. Daha az ışığı yansıtması için beyaza göre siyah tercih edilir.

Kaynaklar

  1. Kumar S, Khammash M. Platforms for optogenetic stimulation and feedback control. Front Bioeng Biotechnol. 2022;10:918917.
  2. Milias-Argeitis A, et al. Automated optogenetic feedback control for precise and robust regulation of gene expression and cell growth. Nat Commun. 2016;7:12546.
  3. Gutierrez Mena J, Kumar S, Khammash M. Dynamic cybergenetic control of bacterial co-culture composition via optogenetic feedback. Nat Commun. 2022;13(1):4808.
  4. Lugagne JB, Blassick CM, Dunlop MJ. Deep model predictive control of gene expression in thousands of single cells. Nat Commun. 2024;15(1):2148.
  5. Steel H, Habgood R, Kelly CL, Papachristodoulou A. In situ characterisation and manipulation of biological systems with Chi.Bio. PLoS Biol. 2020;18(7):e3000794.
  6. Lugagne JB, et al. Balancing a genetic toggle switch by real-time feedback control and periodic forcing. Nat Commun. 2017;8(1):1671.
  7. Chait R, et al. Shaping bacterial population behavior through computer-interfaced control of individual cells. Nat Commun. 2017;8(1):1535.
  8. Harmer ZP, McClean MN. Lustro: High-throughput optogenetic experiments enabled by automation and a yeast optogenetic toolkit (vol 12, pg 1943, 2023). ACS Synth Biol. 2023;12(11):3505.
  9. Abkar L, et al. Enhanced reproducibility and precision of high-throughput quantification of bacterial growth data using a microplate reader. J Vis Exp. 2022;185:63849.
  10. Olson EJ, et al. Characterizing bacterial gene circuit dynamics with optically programmed gene expression signals. Nat Methods. 2014;11(4):449-456.
  11. Bugaj LJ, Lim WA. High-throughput multicolor optogenetics in microwell plates. Nat Protoc. 2019;14(7):2205-2228.
  12. Repina NA, et al. Engineered illumination devices for optogenetic control of cellular signaling dynamics. Cell Rep. 2020;31(10):107737.
  13. Höhener TC, et al. LITOS: A versatile LED illumination tool for optogenetic stimulation. Sci Rep. 2022;12(1):13139.
  14. Vogt A, et al. Simultaneous spectral illumination of microplates for high-throughput optogenetics and photobiology. Biol Chem. 2024;405(11-12):751-763.
  15. Kumar S, et al. Diya: A universal light illumination platform for multiwell plate cultures. iScience. 2023;26(10):107862.
  16. Soffer G, Perry JM, Shih SCC. Real-time optogenetics system for controlling gene expression using a model-based design. Anal Chem. 2021;93(6):3181-3188.
  17. Benman W, et al. High-throughput feedback-enabled optogenetic stimulation and spectroscopy in microwell plates. Commun Biol. 2023;6(1):1192.
  18. Namboothiri HR, et al. Closed-loop optogenetic control in a microplate reader. ACS Synth Biol. 2026;15(6):2356-2365.
  19. Worldsemi. WS2812B intelligent control LED integrated light source. 2026: https://cdn-shop.adafruit.com/datasheets/WS2812B.pdf
  20. Lambert TJ. FPbase: A community-editable fluorescent protein database. Nat Methods. 2019;16(4):277-278.
  21. Xia YN, et al. Replica molding using polymeric materials: A practical step toward nanomanufacturing. Adv Mater. 1997;9(2):147-149.
  22. Ong NT, Tabor JJ. A miniaturized Escherichia coli green light sensor with high dynamic range. ChemBioChem. 2018;19(12):1255-1258.
  23. Hanahan D, Jessee J, Bloom FR. Plasmid transformation of Escherichia coli and other bacteria. Methods Enzymol. 1991;204:63-113.
  24. ANSI SLAS 1-2004 (R2012). Footprint dimensions. At https://www.slas.org/SLAS/assets/File/public/standards/ANSI_SLAS_1-2004_FootprintDimensions.pdf.
  25. Åström KJ, Murray RM. Feedback systems: An introduction for scientists and engineers. Princeton University Press; Princeton, NJ; 2008.
  26. Namboothiri HR, Pandey A, Hu CY. Resolving emergent transient oscillations in gene circuits with a growth-coupled model. Sci Adv. 2026;12(6):eadz2310.
  27. Song LL, Hennink EJ, Young IT, Tanke HJ. Photobleaching kinetics of fluorescein in quantitative fluorescence microscopy. Biophys J. 1995;68(6):2588-2600.
  28. Campbell DJ, et al. Replication and compression of bulk and surface structures with polydimethylsiloxane elastomer. J Chem Educ. 1999;76(4):537-541.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Optogenetik KontrolLED MikroplakaGen EkspresyonuDinamik Işık StimülasyonuMikroplaka OkuyucuPDMS MikrokuyucuklarDevre MontajıArduino ProgramlamaFloresan ÖlçümüBakteriyel Kültürler

Bu makale yayımlandı

Video yakında

Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.