Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Araştırma makalesi

Pulmoner Hipertansiyon Biyobelirteçlerinin ve Aday Terapötik Bileşiklerin Biyoenformatik ve Makine Öğrenmesi ile Belirlenmesi

82 görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/73519

⸱

25 Ağustos 2026

 ,  , 
1College of Biological and Food Engineering, Huaihua University

Bu makalede

Özet

Bu makale, pulmoner hipertansiyon biyobelirteçlerini ve aday terapötik bileşikleri belirlemek amacıyla kamuya açık transkriptomik veri setleri, makine öğrenimi, harici doğrulama, kantitatif ters transkripsiyon PCR, Connectivity Map taraması ve moleküler kenetlenmeyi entegre eden tekrarlanabilir bir biyoinformatik iş akışı sunmaktadır.

Özet

Bu çalışma, halka açık transkriptomik veriler ve bağımsız doğrulama kaynakları kullanarak pulmoner hipertansiyon (PH) ile ilişkili moleküler biyobelirteçleri ve aday küçük moleküllü bileşikleri belirlemeyi amaçlamıştır. Normalizasyon, prob anotasyonu ve ComBat grup etkisi (batch-effect) düzeltmesinin ardından üç Gene Expression Omnibus veri seti (GSE22356, GSE33463 ve GSE48149) entegre edilmiştir. Çekirdek özellik genlerini belirlemek için diferansiyel ekspresyon analizi, ağırlıklı gen ko-ekspresyon ağ analizi, fonksiyonel zenginleştirme analizi, protein-protein etkileşim ağı analizi ve üç makine öğrenimi algoritması kullanılmıştır. Tanısal performans, alıcı işletim karakteristik (ROC) eğrileri kullanılarak değerlendirilmiştir. Harici doğrulama, bağımsız bir akciğer dokusu kohortunu (GSE117261), bir pulmoner arter tek hücreli RNA dizileme veri setini (GSE210248) ve bağımsız akciğer dokusu örneklerinde kantitatif ters transkripsiyon PCR doğrulamasını içermiştir. Aday bileşikleri taramak için Connectivity Map tabanlı ilaç yeniden konumlandırma ve moleküler kenetleme (docking) kullanılmıştır. Yetmiş sekiz diferansiyel eksprese olmuş gen belirlenmiş ve CXCL10, JUN, IFIH1, MX1 ve TLR7 çekirdek özellik genleri olarak seçilmiştir. Bağımsız GSE117261 akciğer dokusu kohortunda, JUN en güçlü harici desteği gösterirken, diğer genlerin replikasyonu değişkenlik göstermiştir. 20 biyolojik olarak bağımsız pulmoner arteriyel hipertansiyon örneği ve 20 kontrol örneğinde yapılan kantitatif ters transkripsiyon PCR, beş genin tamamının yukarı yönlü düzenlendiğini (upregulation) doğrulamıştır. Görünür beş genli qRT-PCR modeli ve 100 tekrarlı stratifiye beş katlı çapraz doğrulama analizlerinin her ikisi de eğri altında kalan alanı (AUC) 1,000 olarak vermiştir; ancak küçük kohort, dikkatli bir yorumlama ve bağımsız prospektif doğrulama gerektirmektedir. GSE210248'in tek hücreli analizi, immün ve yapısal hücreler arasındaki değişmiş iletişimi ve düz kas hücresi fenotipik geçişini desteklemiştir. Connectivity Map taramasında BRD-K91900765/VX-745 en yüksek sırayı almıştır. Bunun yerleşik farmakolojik hedefi olan MAPK14/p38α, pozitif referans kenetleme proteini olarak dahil edilmiş, beş biyobelirteçle ilişkili proteine karşı yapılan kenetleme ise keşifsel olarak değerlendirilmiştir. Bu bulgular, söz konusu beş genin aday PH biyobelirteçleri olduğunu ve VX-745'in deneysel doğrulama gerektiren hesaplamalı bir ilaç yeniden konumlandırma hipotezi olduğunu desteklemektedir.

Giriş

Pulmoner hipertansiyon (PH); kalıcı olarak yüksek seyreden pulmoner arter basıncı, artmış pulmoner vasküler direnç ve nihayetinde sağ ventrikül yetmezliği ile karakterize, progresif bir kardiyopulmoner sendromdur. Güncel hemodinamik kriterler, PH'yi istirahat halindeki ortalama pulmoner arter basıncının şu değerde olması şeklinde tanımlamaktadır: >sağ kalp kateterizasyonu ile ölçüldüğü üzere 20 mmHg1Farklı klinik alt tipler arasında, pulmoner arteriyel hipertansiyon (PAH) en şiddetli formlardan biridir ve progresif pulmoner vasküler yeniden şekillenme ile karakterizedir. Patolojik özellikleri arasında endotelyal disfonksiyon, pulmoner arter düz kas hücrelerinin anormal proliferasyonu ve migrasyonu, adventisyal fibroblast aktivasyonu, hücre dışı matris birikimi, inflamatuar hücre infiltrasyonu ve distal pulmoner arterlerin daralması veya obliterasyonu yer almaktadır.2Bu değişiklikler, PH/PAH'nin yalnızca bir vazokonstriksiyon bozukluğu değil, aynı zamanda koordineli moleküler, hücresel ve immün-inflamatuar mekanizmalar tarafından yönlendirilen karmaşık bir vasküler yeniden yapılanma hastalığı olduğunu göstermektedir.

Mevcut PAH tedavileri temel olarak prostasiklin, endotelin, nitrik oksit–çözünür guanilat siklaz ve fosfodiesteraz tip 5 yollarını hedeflemektedir3˒4. Bu tedaviler semptomları, egzersiz kapasitesini ve hemodinamik parametreleri iyileştirse de etkileri büyük ölçüde vazodilatör ve hemodinamik düzeyde kalmaktadır. Yerleşmiş pulmoner vasküler yeniden şekillenmeyi (remodeling) geri döndürme yetenekleri sınırlıdır ve birçok hasta kombinasyon tedavisine rağmen hastalık progresyonu yaşamaya devam etmektedir. Bu nedenle, yeniden şekillenme sürecini yansıtan yeni moleküler biyobelirteçlerin ve terapötik adayların belirlenmesi, karşılanmamış önemli bir ihtiyacı temsil etmektedir. Özellikle, immün-inflamatuar aktivasyon, interferon ile ilişkili sinyalleme, Toll benzeri reseptör yolları, kemokin aracılı immün hücre göçü ve düz kas hücresi fenotipik değişimi, PH/PAH progresyonuna potansiyel katkıda bulunan unsurlar olarak ortaya çıkmıştır5˒6.

Yüksek kapasiteli transkriptomik veri setleri, PH/PAH ile ilişkili moleküler imzaların belirlenmesi için değerli kaynaklar sağlamaktadır. Ancak, tek bir veri setine dayanan çalışmalar genellikle küçük örneklem boyutları, grup etkileri (batch effects), platform heterojenliği ve yetersiz doğrulama ile sınırlıdır. Diferansiyel ekspresyon analizi, ekspresyonu değişmiş genleri belirleyebilir ancak hastalıkla ilgili ko-ekspresyon modüllerini veya ağ düzeyindeki etkileşimleri tam olarak yakalayamayabilir. Ağırlıklı gen ko-ekspresyon ağı analizi (WGCNA), hastalık özellikleriyle ilişkili gen modüllerini tanımlayabilirken, protein-protein etkileşim (PPI) ağı analizi biyolojik ağlar içindeki yüksek bağlantılı genleri ortaya çıkarabilir. Makine öğrenimi yöntemleri ayrıca tanısal veya sınıflandırma değeri olan genleri önceliklendirebilir. Bununla birlikte, tek bir algoritmaya güvenmek modele özgü yanlılıklara yol açabilir. Bu nedenle; diferansiyel ekspresyon analizi, WGCNA, PPI ağ analizi ve birden fazla makine öğrenimi algoritmasının entegre edilmesi, biyobelirteç keşfinin güvenilirliğini artırabilir.

Transkriptomik biyobelirteç çalışmalarındaki bir diğer büyük zorluk ise biyolojik yorumlamadır. Toplu doku (bulk-tissue) sinyalleri; yerleşik vasküler hücrelerdeki gen ekspresyonu değişikliklerini, immün hücre infiltrasyonunu veya birden fazla hücre popülasyonunun değişen oranlarını yansıtabilir. Tek hücreli RNA sekanslama, toplu dokudan elde edilen aday genlerin hücresel bir bağlama yerleştirilmesi için fırsat sunar. PH/PAH'ta pulmoner vasküler yeniden şekillenme; endotel hücrelerini, düz kas hücrelerini, fibroblastları, monositleri/makrofajları, lenfositleri ve diğer immün veya yapısal hücreleri kapsar. Hastalık progresyonu ayrıca, değişen hücre-hücre iletişimi ve düz kas hücresi fenotipik geçişi ile ilişkilidir. Bu nedenle, toplu transkriptomik taramanın tek hücreli doğrulama ile birleştirilmesi, aday biyobelirteçlerin immün aktivasyon, vasküler yapısal yeniden şekillenme veya çok hücreli iletişimdeki bir dengesizlik ile ilişkili olup olmadığının belirlenmesine yardımcı olabilir.

Biyobelirteç keşfinin yanı sıra, transkriptomik imzalar hesaplamalı ilaç yeniden konumlandırma için de kullanılabilir. Connectivity Map (CMap), hastalıkla ilişkili gen ekspresyon profillerini, bu imzaları tersine çevirebilecek veya modüle edebilecek küçük moleküllerle ilişkilendirir7. Bileşik kürasyonu ve moleküler docking ile birleştirildiğinde bu strateji, deneysel olarak test edilebilir terapötik hipotezler üretebilir. CMap tahmini ve moleküler docking ilaç etkinliğini kanıtlayamasa da, gelecekteki hedef-bağlanma analizleri, hücre tabanlı deneyler ve hayvan modeli doğrulamaları için aday bileşikleri önceliklendirebilir.

PH/PAH biyobelirteçlerini ve aday terapötik bileşikleri tanımlamak amacıyla entegre ve tekrarlanabilir bir iş akışı geliştirilmiştir. Normalizasyon ve grup etkisi (batch-effect) düzeltmesinin ardından üç kamuya açık Gene Expression Omnibus transkriptomik veri seti entegre edilmiştir. Güçlü özellik genlerini taramak için diferansiyel ekspresyon analizi, WGCNA, fonksiyonel zenginleştirme analizi, PPI ağ analizi ve üç makine öğrenimi algoritması kullanılmıştır. Seçilen genleri daha detaylı değerlendirmek için alıcı işletim karakteristik analizi, bağımsız bir akciğer dokusu doğrulama kohortu, pulmoner arter tek hücre RNA dizileme kanıtları ve bağımsız örneklerde kantitatif ters transkripsiyon PCR doğrulaması kullanılmıştır. Son olarak, aday bileşikleri belirlemek için CMap tabanlı ilaç yeniden konumlandırma ve moleküler kenetleme uygulanmıştır. Çalışmanın özgünlüğü; dökme (bulk) transkriptomik keşfi, makine öğrenimi önceliklendirmesini, bağımsız doğrulamayı, deneysel kantitatif ters transkripsiyon PCR onayını, tek hücre mekanistik yorumlamasını ve hesaplamalı bileşik taramasını birbirine bağlayan çok katmanlı doğrulama çerçevesinde yatmaktadır. Çalışma hipotezi, PH/PAH'nin koordineli bir immün-inflamatuar ve vasküler remodeling programı tarafından yönlendirildiği ve bu program içindeki güçlü genlerin aday biyobelirteçler olarak hizmet edebileceği ve ilaç yeniden konumlandırma fırsatları sunabileceğidir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Bu çalışmada analiz edilen halka açık Gene Expression Omnibus (GEO) veri setleri, daha önce yayınlanmış çalışmalardan elde edilen kimliksizleştirilmiş transkriptomik verileri içeriyordu ve ek bir etik onay gerektirmedi. Huaihua Üniversitesi Etik Kurulu, bağımsız insan akciğer dokusu kantitatif ters transkripsiyon PCR (qRT-PCR) doğrulama çalışmasını onaylamıştır (onay no. 2024(A05112)). Örnek toplama işleminden önce tüm katılımcılardan veya yasal olarak yetkilendirilmiş temsilcilerinden yazılı bilgilendirilmiş onam alınmıştır. Onay ve rıza prosedürleri, qRT-PCR doğrulamasına dahil edilen tüm 20 pulmoner arteriyel hipertansiyon (PAH) ve 20 kontrol akciğer dokusu örneği için uygulanmıştır. Bu protokol için kullanılan araştırma araçları Materyaller Tablosunda listelenmiştir.

1. Kamu transkriptomik veri setlerinin toplanması ve ön işlemesi

Pulmoner hipertansiyon (PH) ile ilişkili GSE22356, GSE33463 ve GSE48149 mikroarray veri setleri GEO veri tabanından elde edilmiştir. PH/pulmoner arteriyel hipertansiyon (PAH) ve kontrol örnekleri, orijinal fenotip açıklamalarına göre ayıklanmıştır. Ekspresyon matrisleri ve platform açıklama dosyaları, tekrarlanabilir R betikleri ve GEOquery paketi kullanılarak indirilmiştir.

Prob anotasyonu ve gen sembolü eşleştirmeleri tüm veri setleri genelinde tutarlı bir şekilde gerçekleştirilmiştir. Birden fazla prob aynı gene eşleştiğinde, ortalama ekspresyon değeri hesaplanmıştır. Kantil normalizasyonu uygulanmış, düşük ekspresyona veya düşük varyansa sahip genler çıkarılmıştır. Veri setleri birleştirilmiş ve grup etkileri (batch effects), sva paketindeki8 ComBat algoritması kullanılarak düzeltilmiştir. Düzeltme işlemi, kutu grafikleri (boxplots) ve temel bileşenler analizi (principal component analysis) kullanılarak değerlendirilmiştir.

2. Diferansiyel ekspresyon gösteren genlerin belirlenmesi

Yığın düzeltmeli ekspresyon matrisindeki PH ve kontrol örnekleri arasındaki ekspresyon seviyelerini karşılaştırmak için limma paketi kullanılmıştır9. Bir doğrusal model kurulmuş ve ampirik Bayes istatistikleri uygulanmıştır. Diferansiyel ekspresyon gösteren genler, düzeltilmiş P değeri <0,05 ve mutlak log2 kat değişimi > 0,585 kriterlerine göre tanımlanmıştır. Sonuçlar, volkan grafikleri ve ısı haritaları kullanılarak görselleştirilmiştir.

3. Ağırlıklı gen eş-ifade ağı oluşturma

WGCNA paketi10 kullanılarak ağırlıklı bir gen eş-ifade ağı oluşturulmuştur. Aykırı değerleri tespit etmek için örnek kümelemesi yapılmıştır. Yumuşak eşikleme gücü, ölçeksiz topoloji uyum indeksine göre seçilmiştir. Gen modülleri, dinamik ağaç kesme algoritması kullanılarak tanımlanmıştır. Modül özgenleri PH fenotipi ile korele edilmiş ve en güçlü korelasyona sahip hastalıkla ilişkili modül seçilmiştir. Konsensüs genleri elde etmek için ana modüldeki genler ile diferansiyel olarak ifade edilen genlerin kesişimi alınmıştır.

4. Fonksiyonel zenginleştirme analizi

Gen Ontolojisi biyolojik süreç, hücresel bileşen ve moleküler fonksiyon kategorileri clusterProfiler11 kullanılarak analiz edildi. Sinyal yolaklarını belirlemek için Kyoto Gen ve Genom Ansiklopedisi yolak zenginleştirme analizi gerçekleştirildi12. Zenginleştirme eşikleri olarak P değeri < 0.05 ve q değeri < 0.2 kullanıldı ve zenginleşen terimler balon grafikleri kullanılarak görselleştirildi11.

5. Protein-protein etkileşim ağının oluşturulması ve hub-genlerin belirlenmesi

Konsensüs gen listesi, STRING veri tabanına şu parametrelerle sunulmuştur: Homo sapiens tür olarak seçilen ve bir etkileşim güven eşiği > 0.413Etkileşim dosyası Cytoscape'e aktarıldı ve genleri düğüm derecesine göre sıralamak için CytoHubba eklentisi kullanıldı. Yüksek bağlantılı genler, hub genler olarak tanımlandı.

6. Makine öğrenimi kullanılarak tanısal özellik genlerinin seçimi

Üç bağımsız özellik seçimi algoritması uygulandı. İlk olarak, sıfır olmayan katsayılara sahip genleri belirlemek için glmnet paketi ve 10 katlı çapraz doğrulama kullanılarak en küçük mutlak küçültme ve seçme operatörü (LASSO) lojistik regresyonu gerçekleştirildi14. İkinci olarak, gereksiz özellikleri çıkarmak ve en yüksek çapraz doğrulama doğruluğuna ulaşan özellik alt kümesini seçmek için destek vektör makineleri ile özyinelemeli özellik elemesi uygulandı15. Üçüncü olarak, bir rastgele orman modeli oluşturuldu ve özellikler, Gini safsızlığındaki ortalama azalmaya göre sıralandı16. Üç algoritmadan elde edilen gen setlerinin kesişimi, nihai çekirdek özellik genleri setini tanımlamak için kullanıldı. Alıcı işletim karakteristik eğrilerini oluşturmak ve eğri altındaki alan değerlerini hesaplamak için pROC paketi kullanıldı17.

7. Bağımsız bulk ve tek hücreli veri setleri kullanılarak çekirdek genlerin doğrulanması

58 PAH örneği ve 25 başarısız donör kontrol örneği içeren GSE117261, bağımsız bir harici akciğer dokusu doğrulama kohortu olarak kullanılmıştır18. Bu veri seti; keşif diferansiyel ekspresyon analizinde, ağırlıklı gen ko-ekspresyon ağının oluşturulmasında veya makine öğrenimi özellik seçiminde kullanılmamıştır. Ekspresyon matrisi normalize edilmiş ve açıklanmış, diferansiyel ekspresyon ise limma v3.68.0 kullanılarak analiz edilmiştir. Tüm açıklanmış transkriptom genelinde Benjamini-Hochberg yanlış keşif oranı düzeltmesi uygulanmıştır. Tek genli alıcı işletim karakteristik (ROC) eğrileri; pROC v1.19.0.1, DeLong %95 güven aralıkları ve Youden indeksi kesim değerleri kullanılarak hesaplanmıştır. GSE117261 kapsamında keşif amaçlı beş genli bir lojistik regresyon modeli kurulmuş ve modelin dahili performansı ek olarak tekrarlanan iç içe çapraz doğrulama ile değerlendirilmiştir.

PAH olan üç hasta ve üç sağlıklı donörden alınan örnekleri içeren GSE210248 (Tablo 1), tek hücreli pulmoner arter doğrulama veri seti olarak kullanılmıştır19. Veriler; kalite kontrolü, normalizasyon, boyut indirgeme, kümeleme ve hücre anotasyonu için Seurat v5.5.1 kullanılarak işlenmiştir20. Endotel hücreleri, düz kas hücreleri, fibroblastlar, monositler/makrofajlar ve T/doğal öldürücü hücreler dahil olmak üzere ana hücre popülasyonları tanımlanmıştır. Hücre-hücre iletişimi, CellChat v2.1.2 ve CellChatDB.human ligand-reseptör veri tabanı kullanılarak analiz edilmiştir21. Normalleştirilmiş Seurat ekspresyon matrisi ve hücre tipi meta verilerinden bir CellChat nesnesi oluşturulmuştur. Aşırı eksprese olan genler ve ligand-reseptör etkileşimleri tanımlanmış; iletişim olasılıkları hesaplanmış; 10 hücreden az olan hücre gruplarını içeren etkileşimler çıkarılmış; yolak düzeyindeki iletişim ağları çıkarılmış ve birleştirilmiştir. Bu veri seti sadece harici mekanistik doğrulama için kullanılmış olup model eğitimi için kullanılmamıştır.

ÖğeAçıklama
Veri setiGSE210248
Veri tipi10x Genomics/damlacık tabanlı tek hücre RNA sekanslama; yüksek hacimli transkriptomik profilleme
İnsan örnekleriÜç PAH pulmoner arter örneği ve üç sağlıklı donör pulmoner arter örneği
Doku kaynağıTemel olarak pulmoner vasküler duvarın hücresel ekolojisini ve vasküler yeniden şekillenme sürecini yansıtan ex vivo pulmoner arter dokusu
Ana analitik amaçHücre tipi lokalizasyonu, düz kas hücresi fenotipik geçişi, immün-yapısal hücre iletişimi ve aday genlerin mekanistik tutarlılık doğrulaması

Tablo 1: GSE210248 tek hücreli doğrulama veri seti için temel bilgiler. Tablo; tek hücreli pulmoner arter doğrulama analizinin veri seti erişim numarasını, sekanslama platformunu, doku kaynağını, örnek bileşimini ve analitik amacını özetlemektedir.

8. Gen ekspresyonunun qRT-PCR ile doğrulanması

qRT-PCR doğrulaması, PH/PAH hastalarından alınan 20 biyolojik olarak bağımsız PAH akciğer dokusu örneğini ve 20 biyolojik olarak bağımsız kontrol akciğer dokusu örneğini içermiştir. Toplam RNA, Total RNA Extraction Kit kullanılarak ekstrakte edilmiştir. RNA konsantrasyonu ve saflığı bir spektrofotometre ile değerlendirilmiş, RNA bütünlüğü ise agaroz jel elektroforezi ile incelenmiştir. Yalnızca A260/280 değerleri 1.8 ile 2.1 arasında olan ve görünür bir degradasyon göstermeyen RNA örnekleri çalışmaya dahil edilmiştir.

Eşit miktardaki RNA, Solarbio Universal RT-PCR Kit (AMV; katalog no. RP1200) kullanılarak tamamlayıcı DNA'ya tersine transkribe edildi. CXCL10, JUN, IFIH1, MX1 ve TLR7 için kantitatif PCR, bir Real-Time PCR Sistemi üzerinde SYBR Green PCR Master Mix kullanılarak gerçekleştirildi. Her biyolojik örnek, kalıp içermeyen ve ters transkripsiyon içermeyen kontrollerle birlikte üç teknik tekrar halinde analiz edildi. Sonraki analizler için üç teknik tekrarın ortalama Ct değeri kullanıldı; teknik tekrarlar bağımsız gözlemler olarak değerlendirilmedi. Ekzon-ekzon bağlantılarını kapsayan ve 80–200 bp amplikonlar üreten primerler kullanıldı (Tablo 2). Primer özgüllüğü, NCBI Primer-BLAST ve erime eğrisi analizi kullanılarak doğrulandı22.

Hedef genlerin ekspresyon seviyelerini normalize etmek için iç referans gen olarak β-actin (ACTB) kullanılmıştır. Relatif ekspresyon, 2-ΔΔCt yöntemi kullanılarak hesaplanmıştır23. Veri dağılımına bağlı olarak gruplar arası karşılaştırmalar için iki yönlü Mann-Whitney U testleri kullanılmış ve beş gen üzerinden Benjamini-Hochberg yanlış keşif oranı (false-discovery-rate) düzeltmesi uygulanmıştır. Tek genli ROC eğrileri DeLong %95 güven aralıkları ile oluşturulmuş ve optimal kesme noktaları Youden indeksi kullanılarak seçilmiştir. Beş genli lojistik regresyon modeli başlangıçta aynı 40 biyolojik örnek üzerinde kurulmuş ve değerlendirilmiştir; bu nedenle bu tahmin, görünür örnek içi performans (apparent in-sample performance) olarak tanımlanmıştır. Olası aşırı öğrenmeyi (overfitting) değerlendirmek için L2-regülerize lojistik regresyon modeli kullanılarak 100 katmanlı beşli çapraz doğrulama (stratified five-fold cross-validation) tekrarı gerçekleştirilmiş ve birleştirilmiş örnek dışı (out-of-fold) ROC performansı hesaplanmıştır.

GenRefSeq erişim numarasıİleri primer (5′–3′)Geri primer (5′–3′)Ürün boyutu (bp)Tm (°C)Ekzon kapsamlı
CXCL10NM_001565.4GTCAAGCCAT
AATTGTTC		ATAGTGCCAG
GGTAGAGT		14146.1Evet
JUNNM_002228.4ACAAGTGGCA
GAGTCCCG		CGCCCAAGTT
CAACAACC		15254.5Evet
IFIH1NM_022168GCACAGAGCG
GTAGACCCT		GCCCTGAAGC
ACGAGATG		18254.7Evet
MX1NM_002462.5TTAGCCGTGG
TGATTTAGC		CAAGGTGGAG
CGATTCTG		15652.3Evet
TLR7NM_016562.4ATTGCCCTCGT
TGTTATA		TTCCTGGAGTT
TGTTGAT		17948.1Evet
ACTBNM_001101.3CTCACCATGGAT
GATGATATCGC		AGGAATCCTTCT
GACCCATGC		19456.2Evet

Tablo 2: Kantitatif ters transkripsiyon PCR için kullanılan primer dizileri. Tablo, qRT-PCR için kullanılan primerlerin hedef genlerini, RefSeq erişim numaralarını, ileri ve geri primer dizilerini, ürün boyutlarını, erime sıcaklıklarını ve ekzon kapsamı durumlarını listelemektedir.

9. Aday bileşik taraması ve moleküler kenetleme

PH ile ilişkili ekspresyon profilini tersine çevireceği öngörülen küçük molekülleri belirlemek için, artmış ve azalmış temel gen imzaları Connectivity Map veri tabanına sunulmuştur7. Adaylar, Logit puanına ve öngörü olasılığına göre sıralanmıştır.

BRD-K91900765/VX-745'in üç boyutlu yapısı PubChem'den CID 3038525 altında elde edilmiştir24. Bileşikle ilgili farmakolojik bilgiler halka açık ilaç veri tabanlarından derlenmiş ve yapısal tanımlayıcılar DrugBank ve SwissADME kullanılarak hesaplanmıştır25,26. Protein yapıları, şu PDB tanımlayıcıları kullanılarak RCSB Protein Data Bank'ten temin edilmiştir: CXCL10, 1LV9; JUN, 1JUN; IFIH1, 3B6E; MX1, 5GTM; TLR7, 7CYN ve MAPK14/p38α, 1OUK27. Kör boşluk tespiti ve moleküler kenetleme, AutoDock Vina v1.2.0 skorlama motoruna sahip CB-Dock2 v2.0 kullanılarak gerçekleştirilmiştir28,29. Protein ve ligand dosyaları CB-Dock2'ye yüklenmiş, aday boşluklar otomatik olarak tespit edilmiş ve kenetleme işlemi sunucu tarafından oluşturulan boşluğa özgü kutular içerisinde gerçekleştirilmiştir. Her bir protein için boşluk tanımlayıcısı, Vina skoru, boşluk hacmi, kenetleme kutusu merkezi, kenetleme kutusu boyutları ve protein-ligand kompleks dosyası kaydedilmiştir. En negatif Vina skoruna sahip poz, en yüksek sıralamaya sahip öngörülen konformasyon olarak seçilmiştir. MAPK14/p38α, VX-745 için belirlenmiş farmakolojik hedef ve pozitif referans kenetleme proteini olarak dahil edilmiştir. CXCL10, JUN, IFIH1, MX1 ve TLR7'ye karşı yapılan kenetlemeler keşif amaçlıdır ve doğrudan farmakolojik hedefleme, bağlanma, inhibisyon veya etkinlik kanıtı olarak yorumlanmamıştır.

10. İstatistiksel analiz ve tekrarlanabilirlik kontrolü

Aksi belirtilmedikçe tüm istatistiksel analizler R programında gerçekleştirilmiştir. İki yönlü P değerleri < 0.05 olan sonuçlar istatistiksel olarak anlamlı kabul edilmiştir. Yukarıda belirtildiği üzere; diferansiyel ekspresyon, zenginleştirme, harici doğrulama ve qRT-PCR analizlerine çoklu test düzeltmesi uygulanmıştır. Makine öğrenimi ve kombine qRT-PCR modellerinin stabilitesini değerlendirmek için çapraz doğrulama kullanılmıştır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Kamuya açık transkriptomik veri ön işleme ve diferansiyel eksprese olan genlerin tanımlanması

GSE22356, GSE33463 ve GSE48149'un entegrasyonu ve ComBat düzeltmesi, veri setleri arasındaki sistematik farkları azaltmıştır. Kutu grafikleri, düzeltme sonrası örnek ekspresyon dağılımlarının daha tutarlı hale geldiğini göstermiştir. Temel bileşenler analizi, örneklerin düzeltme öncesinde temel olarak veri seti kaynağına göre kümelendiğini, ancak düzeltme sonrasında daha karışık hale ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Kamuya açık transkriptomik veriler, ağırlıklı gen eş-ekspresyon ağ analizi, fonksiyonel zenginleştirme, protein-protein etkileşim ağı analizi, üç makine öğrenimi algoritması, harici doğrulama, tek hücreli transkriptomik yorumlama, kantitatif ters transkripsiyon PCR doğrulaması, Connectivity Map taraması ve moleküler kenetlemenin birleştirilmesiyle PH/PAH ile ilişkili moleküler biyobelirteçleri ve aday terapötik bileşikleri belirlemek için entegre ve tekrarlanabilir bir iş akışı geliştirilmiştir. CXCL10, JUN, IFIH1, MX1 v...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.

Teşekkürler

Bu çalışma, Hunan Yenilikçi Eyalet İnşa Projesi (No. 2022JJ30465) tarafından desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
2× SYBR Green PCR MastermixBeijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd.Katalog no. SR1110Boya tabanlı kantitatif gerçek zamanlı PCR amplifikasyonu ve floresan deteksiyonu
AI21.msvmRFE.R ve e1071CRAN e1071 paketi ile hazırlanan özel R betiğiAI21.msvmRFE.R; e1071 v1.7-17Destek vektör makinesi-özyinelemeli özellik eleme
AgarozBeijing Solarbio Science & Teknoloji Co., Ltd.Katalog no. A8201; CAS 9012-36-6Toplam RNA bütünlüğünün agaroz jel elektroforezi ile değerlendirilmesi
Agaroz jel elektroforez cihazıBeijing Liuyi Biotechnology Co., Ltd.Model DYCZ-24DNRNA bütünlüğünün elektroforetik değerlendirmesi
AutoDock Vina skorlama motoruHesaplamalı Yapısal Biyoloji Merkezi, Scripps Researchv1.2.0; RRID: SCR_011958CB-Dock2 iş akışında protein-ligand poz skorlaması
CB-Dock2Cao Laboratuvarı, CB-Dock2 web sunucusuv2.0; Temmuz 2026 tarihinde erişilmiştirSeçilen protein yapıları ile VX-745'in kör boşluk tespiti ve moleküler kenetlenmesi
CellChatCellChat R paketiv2.1.2Tek hücreli ekspresyon matrisinden hücre-hücre etkileşiminin çıkarımı ve görselleştirilmesi
CellChatDB.humanCellChat R paketi ile dağıtılmıştırCellChatDB.human; Salgılanan Sinyalizasyon alt kümesi; minimum hücre eşiği = 10CellChat için insan ligand-reseptör etkileşim veri tabanı
clusterProfilerBioconductor R paketiv4.20.0; Bioconductor sürümü 3.23Gen Ontolojisi ve Genlerin ve Genomların Kyoto Ansiklopedisi zenginleştirme analizleri
Bağlantı Haritası (CMap/CLUE)Broad InstituteL1000/CLUE kaynağı; RRID: SCR_016204; erişim tarihi Temmuz 2026Hesaplamalı ilaç yeniden konumlandırma analizi
Özel oligonükleotid primerlerBeijing Solarbio Science & Teknoloji Co., Ltd.Özel olarak sentezlenmiştir; primer dizileri Tablo 2'de verilmiştirACTB, CXCL10, JUN, IFIH1, MX1 ve TLR7 Amplifikasyonu
cytoHubbaCytoscape Uygulama Mağazasıv0.1Protein-protein etkileşim ağında derece tabanlı hub-gen sıralaması
CytoscapeCytoscape Konsorsiyumuv3.10.4; RRID: SCR_003032Protein-protein etkileşim ağı görselleştirme ve analizi
DrugBankDrugBank Bilgi Tabanıv6.0; RRID: SCR_002700Bileşik kimliği ve farmakolojik bilgi kürasyonu
Jel dokümantasyon sistemiBeijing Liuyi Biotechnology Co., Ltd.Model WO-9413BAgaroz jel RNA bütünlük sonuçlarının görselleştirilmesi ve kaydedilmesi
Gene Expression Omnibus (GEO)Ulusal Biyoteknoloji Bilgi MerkeziGSE22356, GSE33463, GSE48149, GSE117261 ve GSE210248; RRID: SCR_005012Toplu ve tek hücreli transkriptomik veri setlerinin geri çağrılması
GEOqueryBioconductor R paketiv2.80.0; Bioconductor sürümü 3.23GEO ekspresyon ve fenotip verilerinin programlı olarak indirilmesi ve içe aktarılması
glmnetCRAN R paketiv5.0En küçük mutlak küçültme ve seçim operatörü lojistik regresyonu ve düzenlenmiş lojistik modelleme
limmaBioconductor R paketiv3.68.0; Bioconductor sürüm 3.23; RRID: SCR_010943Diferansiyel ekspresyon analizi ve ampirik Bayes istatistikleri
NanoDrop spektrofotometreThermo Fisher ScientificNanoDrop ND-1000; yazılım v3.8RNA konsantrasyonunun ve A260/280 ile A260/230 saflık oranlarının ölçümü
NCBI Primer-BLASTUlusal Biyoteknoloji Bilgi MerkeziWeb aracı; RRID: SCR_003095; erişim tarihi Temmuz 2026Primer özgüllüğünün doğrulanması
pROCCRAN R paketiv1.19.0.1; RRID: SCR_024286Alıcı işletim karakteristik analizi, DeLong güven aralıkları ve Youden indeksi kesim değerleri
Protein Veri Bankası (PDB)RCSB Protein Veri BankasıCXCL10: 1LV9; JUN: 1JUN; IFIH1: 3B6E; MX1: 5GTM; TLR7: 7CYN; MAPK14/p38α: 1OUK; RRID: SCR_012820Moleküler kenetleme için deneysel olarak belirlenmiş protein yapılarının geri çağrılması
PubChemUlusal Biyoteknoloji Bilgi MerkeziPubChem CID 3038525; RRID: SCR_004284BRD-K91900765/VX-745'in üç boyutlu yapısının ve kimyasal tanımlayıcılarının elde edilmesi
RR Foundation for Statistical Computingv4.6.1; RRID: SCR_001905İstatistiksel hesaplama, veri işleme, makine öğrenimi ve görselleştirme
rastgeleOrmanCRAN R paketiv4.7-1.2Rastgele orman özellik seçimi ve değişken önem sıralaması
Gerçek zamanlı PCR sistemiŞu an Agilent Technologies olan StratageneMx3000P Real-Time PCR SistemiqRT-PCR amplifikasyonu, floresan kazanımı, erime eğrisi analizi ve Ct dışa aktarımı
SeuratCRAN R paketi; Satija Laboratuvarıv5.5.1; RRID: SCR_016341Tek hücreli RNA dizileme kalite kontrolü, normalizasyonu, boyut indirgeme, kümeleme ve anotasyonu
Lütfen çevirmemi istediğiniz metni (STRING) paylaşın. Metni ilettiğinizde, belirttiğiniz tüm bilimsel ve akademik standartlara uygun olarak çevirisini gerçekleştireceğim.STRING Konsorsiyumuv12.0; RRID: SCR_005223Protein-protein etkileşim ağı oluşturma
sva (ComBat)Bioconductor R paketiv3.60.0; Bioconductor sürümü 3.23Veri setleri arası grup etkilerinin düzeltilmesi
SwissADMEİsviçre Biyoenformatik EnstitüsüWeb sunucusu; erişim tarihi Temmuz 2026İlaç benzerliği, fizikokimyasal özellik ve ADME ön taraması
Toplam RNA Ekstraksiyon KitiBeijing Solarbio Science & Teknoloji Co., Ltd.Katalog no. R1200Akciğer dokusu örneklerinden toplam RNA ekstraksiyonu ve saflaştırılması
Evrensel RT-PCR Kiti (AMV)Beijing Solarbio Science & Teknoloji Co., Ltd.Katalog no. RP1200Toplam RNA'nın komplemanter DNA'ya ters transkripsiyonu
WGCNA (Ağırlıklı Gen Ko-ekspresyon Ağ Analizi)CRAN R paketiv1.74Ağırlıklı gen eş-ifade ağı kurulumu ve modül-özellik analizi

Kaynaklar

  1. Simonneau G, et al. Haemodynamic definitions and updated clinical classification of pulmonary hypertension. Eur Respir J. 2019;53(1):1801913. doi: 10.1183/13993003.01913-2018.
  2. Rabinovitch M, Guignabert C, Humbert M, Nicolls MR. Inflammation and immunity in the pathogenesis of pulmonary arterial hypertension. Circ Res. 2014;115(1):165–175.
  3. Humbert M, et al. 2022 ESC/ERS Guidelines for the diagnosis and treatment of pulmonary hypertension. Eur Heart J. 2022;43(38):3618–3731.
  4. Galiè N, et al. 2015 ESC/ERS Guidelines for the diagnosis and treatment of pulmonary hypertension. Eur Respir J. 2015;46(4):903–975.
  5. Soon E, et al. Elevated levels of inflammatory cytokines predict survival in idiopathic and familial pulmonary arterial hypertension. Circulation. 2010;122(9):920–927.
  6. George PM, et al. Evidence for the involvement of type I interferon in pulmonary arterial hypertension. Circ Res. 2014;114(4):677–688.
  7. Subramanian A, et al. A next-generation Connectivity Map: L1000 platform and the first 1,000,000 profiles. Cell. 2017;171(6):1437–1452.e17.
  8. Leek JT, et al. The sva package for removing batch effects and other unwanted variation in high-throughput experiments. Bioinformatics. 2012;28(6):882–883.
  9. Ritchie ME, et al. limma powers differential expression analyses for RNA-sequencing and microarray studies. Nucleic Acids Res. 2015;43(7):e47. doi: 10.1093/nar/gkv007.
  10. Langfelder P, Horvath S. WGCNA: an R package for weighted correlation network analysis. BMC Bioinformatics. 2008;9:559. doi: 10.1186/1471-2105-9-559.
  11. Yu G, Wang LG, Han Y, He QY. clusterProfiler: an R package for comparing biological themes among gene clusters. OMICS. 2012;16(5):284–287.
  12. Kanehisa M, Goto S. KEGG: Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes. Nucleic Acids Res. 2000;28(1):27–30.
  13. Szklarczyk D, et al. The STRING database in protein–protein association networks and functional enrichment analyses for any sequenced genome of interest. Nucleic Acids Res. 2023;51(D1):D638–D646.
  14. Friedman J, Hastie T, Tibshirani R. Regularization paths for generalized linear models via coordinate descent. J Stat Softw. 2010;33(1):1–22.
  15. Guyon I, Weston J, Barnhill S, Vapnik V. Gene selection for cancer classification using support vector machines. Mach Learn. 2002;46:389–422.
  16. Breiman L. Random forests. Mach Learn. 2001;45(1):5–32.
  17. Robin X, et al. pROC: an open-source package for R and S+ to analyze and compare ROC curves. BMC Bioinformatics. 2011;12:77. doi: 10.1186/s12859-011-0077-8.
  18. Stearman RS, et al. Systems analysis of the human pulmonary arterial hypertension lung transcriptome. Am J Respir Cell Mol Biol. 2019;60(6):637–649.
  19. Crnkovic S, et al. Single-cell transcriptomics reveals skewed cellular communication and phenotypic shift in pulmonary artery remodeling. JCI Insight. 2022;7(20):e153471. doi: 10.1172/jci.insight.153471.
  20. Hao Y, et al. Integrated analysis of multimodal single-cell data. Cell. 2021;184(13):3573–3587.e29.
  21. Jin S, et al. Inference and analysis of cell–cell communication using CellChat. Nat Commun. 2021;12(1):1088. doi: 10.1038/s41467-021-21246-9.
  22. Bustin SA, et al. MIQE 2.0: revision of the Minimum Information for Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments guidelines. Clin Chem. 2025;71(6):634–651.
  23. Livak KJ, Schmittgen TD. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2−ΔΔCt method. Methods. 2001;25(4):402–408.
  24. Kim S, et al. PubChem 2023 update. Nucleic Acids Res. 2023;51(D1):D1373–D1380.
  25. Knox C, et al. DrugBank 6.0: the DrugBank Knowledgebase for 2024. Nucleic Acids Res. 2024;52(D1):D1265–D1275.
  26. Daina A, Michielin O, Zoete V. SwissADME: a free web tool to evaluate pharmacokinetics, drug-likeness, and medicinal chemistry friendliness of small molecules. Sci Rep. 2017;7:42717. doi: 10.1038/srep42717.
  27. Burley SK, et al. RCSB Protein Data Bank: powerful new tools for exploring 3D structures of biological macromolecules for basic and applied research and education. Nucleic Acids Res. 2021;49(D1):D437–D451. doi: 10.1093/nar/gkaa1038.
  28. Eberhardt J, Santos-Martins D, Tillack AF, Forli S. AutoDock Vina 1.2.0: new docking methods, expanded force field, and Python bindings. J Chem Inf Model. 2021;61(8):3891–3898. doi: 10.1021/acs.jcim.1c00203.
  29. Liu Y, et al. CB-Dock2: improved protein-ligand blind docking by integrating cavity detection, docking, and homologous template fitting. Nucleic Acids Res. 2022;50(W1):W159–W164. doi: 10.1093/nar/gkac394.
  30. Duffy JP, et al. The discovery of VX-745: a novel and selective p38α kinase inhibitor. ACS Med Chem Lett. 2011;2(10):758–763.
  31. Sheng Y, et al. Crocin inhibits neutrophil migration and activation to treat hypoxic pulmonary hypertension through targeting HCK. Phytomedicine. 2025;148:157334. doi: 10.1016/j.phymed.2025.157334.
  32. Cui H, et al. Leonurine ameliorates hypoxic pulmonary hypertension by inhibiting cross-talk between neutrophils and endothelial cells via SERPINB3 targeting. Int Immunopharmacol. 2026;176:116467. doi: 10.1016/j.intimp.2026.116467.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Biyobelirteç TanımlamaTranskriptomik VeriDiferansiyel EkspresyonGen Ko-EkspresyonuProtein Etkileşim AğıTek Hücre RNA Sekanslamaİlaç Yeniden KonumlandırmaKantitatif PCR
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.