Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Yeni Nesne Tanıma ve Hipokampal Biyobelirteçler Kullanılarak Farelerde Uyku Yoksunluğunun Tetiklediği Tanıma Belleği Bozukluklarının Modellenmesi İçin Hızlı Bir İş Akışı

132 görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/73557

⸱

8 Eylül 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Laboratory Medicine, Nanjing Drum Tower Hospital, Affiliated Hospital of Medical School, Nanjing University, 2Department of Neurology, Hefei Eighth People's Hospital, 3Department of Laboratory Medicine, Bengbu First People's Hospital, 4Department of Pathogen Biology, School of Basic Medicine, Tongji Medical College and State Key Laboratory for Diagnosis and Treatment of Severe Zoonotic Infectious Diseases, Huazhong University of Science and Technology

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Bu makale; nazik uygulama ile uyku yoksunluğu, yeni nesne tanıma testi ve aynı hayvanlarda 10 günlük bir süreç boyunca gerçekleştirilen hipokampal biyobelirteç analizlerini, yapılandırılmış müdahale kayıtları ve önceden tanımlanmış kalite kontrol kriterleri ile birleştirerek, farelerde uyku yoksunluğunun tetiklediği tanıma belleği kusurlarını modellemek için hızlı ve tekrarlanabilir bir iş akışı sunmaktadır.

Özet

Yetersiz uyku, bilişsel gerilemeye katkıda bulunur ve nörodejeneratif süreçleri hızlandırabilir. Bu makale, farelerde uyku yoksunluğunun neden olduğu tanıma belleği açıklarını modellemek ve davranışsal sonuçları hipokampal moleküler değişikliklerle ilişkilendirmek için hızlı ve tekrarlanabilir bir iş akışı sunmaktadır. Protokol, standartlaştırılmış 10 dakikalık bir yeni nesne tanıma (NOR) alışma seansının hemen ardından uygulanan 5 saatlik nazik müdahale yöntemli bir uyku yoksunluğu paradigması kullanmaktadır. Tanıma belleği, kesin olarak tanımlanmış 5 saatlik bir tutma aralığından sonra 5 dakikalık bir NOR testi ile değerlendirilir ve ardından aynı hayvanlardan; interleukin-1 beta (IL-1β), interleukin-6 (IL-6) ve tümör nekroz faktör-alfa (TNF-α) dahil olmak üzere proinflamatuar sitokinlerin ve süperoksit dismutaz (SOD), glutatyon peroksidaz (GPx) ve malondialdehit (MDA) dahil olmak üzere oksidatif stres belirteçlerinin miktar tayini için hemen hipokampus örneği toplanır. Temel metodolojik ilerleme, zaten iyi bilinen bireysel davranışsal veya biyokimyasal teknikler değil, bunların birbirine bağlı tek bir iş akışı olarak operasyonel standardizasyonudur. Protokol; nazik müdahale uygulamalarının yapılandırılmış, ölçülebilir bir kaydını gerektirir, eğitimi ve yoksunluğu sabit bir sirkadiyen zaman noktasına sabitler, NOR kayıtları ile doku örnekleri arasındaki hayvan düzeyindeki bağlantıları korur ve kalite kontrol ile analitik kriterleri önceden belirler. Fiziksel kısıtlamayı ve zorunlu egzersizi en aza indirecek şekilde tasarlanan prosedür, kısa bir deneysel pencere içinde tamamlanabilir ve bağımsız tekrarlar yapılması kaydıyla, bireysel laboratuvarların kendi nazik müdahale yöntemli uyku yoksunluğu uygulamalarını kıyaslamak için kullanabilecekleri aday bir referans iş akışı olarak önerilmektedir.

Giriş

Uyku; beyin fonksiyonu, öğrenme ve hafıza konsolidasyonu için temel olan fizyolojik bir süreçtir1. Yetersiz uyku; bilişsel disfonksiyon, duygu durum bozuklukları ve nörodejeneratif hastalıkların ilerlemesi ile ilişkilendirilmektedir2. Kemirgenlerde deneysel uyku yoksunluğu (SD), akut uyku kaybının nörobiyolojik sonuçlarını araştırmak için yaygın olarak kullanılmaktadır. Deklaratif ve mekansal hafızanın merkezi olan bir beyin bölgesi olan hipokampus, uyku yoksunluğuna karşı özellikle hassastır3.

Kemirgenlerde uyku kaybı oluşturmak için çeşitli prosedürler mevcuttur. Modifiye edilmiş çoklu platform yöntemi, hızlı göz hareketleri (REM) uykusunu etkili bir şekilde azaltabilir ancak önemli düzeyde stres ve fiziksel bitkinliğe yol açabilir4. Buna karşılık, nazik müdahale (GH), uyku belirtileri ortaya çıktığında kafese vurma, altlığın rahatsız edilmesi veya yeni yuva malzemesi sunulması gibi hafif duyusal uyarımlar aracılığıyla uyanıklığı sürdürür. Öğrenmeden hemen sonra uygulanan kısa bir GH süreci, uzun süreli yoksunluk paradigmalarıyla ilişkili birçok karıştırıcı etkenden kaçınırken hipokampusa bağımlı bellek konsolidasyonunu bozabilir5. Bu protokoldeki müdahaleler EEG ile doğrulanmış REM tespiti yerine duruş ve davranışsal uyanıklık ipuçlarıyla tetiklendiği için, burada uygulandığı şekliyle GH, REM'e özgü bir teknikten ziyade yerleşik bir toplam uyku yoksunluğu yöntemini oluşturur ve on yıllardır bu formda kullanılmaktadır6.

Yeni nesne tanıma (NOR) testi, tanıma belleği için yaygın olarak kullanılan bir analizdir. Ödül, ceza veya kapsamlı bir eğitim gerektirmeden, kemirgenlerin yeni bir nesneyi tanıdık bir nesneye göre daha fazla keşfetme yönündeki doğal eğilimlerine dayanır7,8. Akut SD'nin yeni nesne ayrımını bozduğu gösterilmiştir, bu da bozulan bellek konsolidasyonunun etkili bir davranışsal çıktısını sağlar9. Moleküler düzeyde, uyku kaybı, azalmış antioksidan kapasite ile birlikte pro-inflamatuar sitokinlerin ve lipid peroksidasyon ürünlerinin artan seviyelerini içeren hipokampal nöroinflamasyonu ve oksidatif stresi tetikleyebilir10,11.

Bu modelin uygulanmasındaki zorluk, bireysel bileşenlerin mevcudiyeti değil, çalışmalar arasındaki operasyonel tutarlılık eksikliğidir. Nazik tutum genellikle müdahale yoğunluğuna dair yapılandırılmış bir kayıt olmadan rapor edilmektedir; davranışsal ve moleküler son noktalar sıklıkla ayrı kohortlardan toplanmaktadır ve keşif davranışı için kalite kontrol kriterleri ile örneklem büyüklüğü planlaması her zaman açıkça belirtilmemektedir. Mevcut makalenin genel amacı, davranışsal sonuçları aynı hayvanlardaki hipokampal moleküler ölçümlerle ilişkilendirirken, uykusuzlukla tetiklenen tanıma belleği eksikliklerini modellemek için standartlaştırılmış bir iş akışı sağlamaktır. Bu yöntem; eğitim sonrası 5 saatlik bir GH penceresini, bir müdahale yoğunluğu günlüğünü, aynı kohorttan davranışsal veri ve doku toplamayı ve önceden tanımlanmış analitik kriterleri tek bir 10 günlük süreçte birleştirerek bu tekrarlanabilirlik boşluklarını gidermektedir (Şekil 1). GH uygulamasındaki standardizasyon eksikliği, daha önce uyku araştırmaları metodoloji literatüründe de belirtilmiştir6.

figure-introduction-1
Şekil 1. Deneysel iş akışının şematik gösterimi. Protokol; taşıma ve alıştırma süreçleri dahil olmak üzere 10 günü kapsamakta olup, bunu 10 dakikalık bir NOR alışma evresi, 5 saatlik GH uyku yoksunluğu, 5 dakikalık bir NOR testi ve ardından biyobelirteç analizi için aynı hayvanlardan derhal hippocampal doku toplama işlemlerini içeren kritik bir test günü takip etmektedir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Tüm hayvan prosedürleri, Nanjing Drum Tower Hastanesi'nden (Sorumlu Araştırmacı: Yuan Liu) yapılan başvuru kapsamında, yürürlükteki kurumsal ve ulusal düzenlemelere uygun olarak AILIMO (Zhejiang AILIMO Biotechnology Co., Ltd.) Laboratuvar Hayvan Refahı ve Etik Komitesi tarafından incelenmiş ve onaylanmıştır (Onay No. AP CODE: ALM202605070, onay tarihi 7 Mayıs 2026, 4 yıl geçerlidir). Aşağıda açıklanan protokol için yetişkin erkek C57BL/6J fareler (8–12 haftalık) kullanın.

1. Hazırlık ve Hayvan Alıştırma

  1. Ev farelerini 22°C ± 1°C sıcaklık, %50–60 nem ve 12 sa ışık/12 sa karanlık döngüsü (ışıkların açılış saati 07:00, ZT0 olarak tanımlanmıştır) altında standart laboratuvar koşullarında barındırın. Standart kemirgen yemine ve suya ad libitum erişim sağlayın.
  2. Testten önce, en az 7 ardışık gün boyunca her fareyi günlük 3–5 dakika boyunca tutun.
    NOT: Bu prosedür, keşif davranışını etkileyebilecek tutma kaynaklı stresi en aza indirir.
  3. Yansıtıcı olmayan duvarlara sahip, 40 cm × 40 cm × 40 cm ölçülerinde kare, opak bir NOR arenası hazırlayın. Hayvanların tüy rengiyle kontrast oluşturan bir arena rengi kullanın.
  4. Yer değiştirmeyi önleyecek kadar ağır ve gözeneksiz malzemeden yapılmış NOR nesneleri seçin. Genel boyutları benzer olmasına rağmen şekil ve doku açısından ayırt edilebilir nesneler kullanın.
    NOT: Şekil 2, eğitim ve test konfigürasyonunu göstermektedir.
  5. 8. ve 9. Günlerde, fareleri alıştırma işleminden 1 saat önce test odasına transfer edin. Her fareyi 10 dakika boyunca boş arenaya yerleştirin ve ardından ana kafesine geri götürün.
  6. Hayvanlar arasında arenayı ve nesneleri %70 etanol ile silin. Bir sonraki hayvanı yerleştirmeden önce etanolün normal laboratuvar havalandırması altında yaklaşık 3–5 dakika boyunca havada kurumasını bekleyin.
    DİKKAT: Etanol yüksek derecede yanıcıdır. Yeterli havalandırma sağladığınızdan emin olun ve tutuşturma kaynaklarından uzak tutun.

figure-protocol-1
Şekil 2. Yeni nesne tanıma düzeneğinin şeması ve deneysel tasarım. Tanıdıklaştırma sırasında, arenanın zıt köşelerine iki özdeş nesne (A ve A′) yerleştirin. 5 h'lik tutma aralığından sonraki test aşamasında, tanıdık nesnelerden birini yeni bir nesne (B) ile değiştirin. Uzamsal yanlılığı en aza indirmek için yeni nesnenin konumunu hayvanlar arasında sol ve sağ pozisyonlar şeklinde dengeleyin; her gruptaki hayvanların yaklaşık yarısı yeni nesneyi her bir pozisyonda alacak şekilde düzenleme yapın. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

2. NOR Eğitimi (Alıştırma)

  1. 10. Günde, ZT1'de (belirtilen ışık programına göre 08:00'de) NOR eğitimine başlayın. Sirkadiyen varyasyonu minimize etmek için bu başlangıç saatini tüm kohortlar boyunca koruyun.
  2. Fareleri, eğitim seansının başlamasından 1 saat önce test odasına taşıyın. Arenanın zıt köşelerine, duvarlardan yaklaşık 10 cm uzağa iki özdeş nesne (A ve A′) yerleştirin.
  3. Gerektiğinde nesneleri zemine sabitleyin.
  4. Fareyi, nesnelerin ters yönüne bakacak şekilde arenanın merkezine yerleştirin. Fareye 10 dk boyunca serbestçe keşif yapmasına izin verin.
  5. Davranışları, üstten görünüşlü bir video takip sistemi kullanarak kaydedin. Aktif keşfi; burnun bir nesneye ≤2 cm mesafede yönlendirilmesi, nesnenin koklanması veya burnun nesneye değmesi olarak tanımlayın.
    NOT: Aktif koklama olmadan bir nesnenin üzerine oturmayı veya tırmanmayı nesne keşfi olarak saymayın.
  6. NOR davranışını, Basler acA1300-60gm üstten görünüşlü kamera ile birlikte EthoVision XT versiyon 17.5 kullanarak kaydedin ve puanlayın. Aktif keşfi puanlamak için, takip yazılımını adım 2.5'te tanımlanan kriterlerle uyumlu olacak şekilde, her bir nesneden ≤2 cm uzaklıkta bir burun noktası tespit bölgesiyle yapılandırın.
  7. 10 dk'lık alışma seansının sonunda, fareyi derhal arenadan çıkarın.
  8. Bir sonraki hayvanı yerleştirmeden önce arenayı ve nesneleri %70 etanol ile iyice temizleyin.

3. Nazik Müdahale ile Uyku Yoksunluğu

  1. 10. gün eğitim oturumundan önce, her hayvana benzersiz bir tanımlama kodu atayın. Davranış kaydı ve doku toplama süreci boyunca bu tanımlama kodunu koruyun.
  2. Hayvanlar, Excel RAND fonksiyonu ile oluşturulan bilgisayar üretimi rastgele sayılar kullanılarak, 1:1 oranında SD ve NSD gruplarına atayın.
  3. NOR eğitiminin hemen ardından, NSD farelerini kendi kafeslerine geri döndürün ve 5 saat boyunca rahatsız etmeyin. SD ve NSD hayvanlarını, eşleştirilmiş çevresel koşullar altında ve aynı sirkadiyen zaman penceresi içerisinde tutun.
  4. NOR eğitiminin hemen ardından, SD fareleri için GH uyku yoksunluğunu başlatın. Ev kafesinde ardışık olarak 5 saat boyunca uyanıklık durumunu sürdürün.
  5. Hayvanları sürekli olarak izleyin. Bir fare kıvrılma, göz kapama veya uzun süreli hareketsizlik dahil olmak üzere uykuyla ilişkili pozisyonlar aldığında müdahale edin.
  6. Kafese hafifçe vurarak başlayarak, stimülasyonu kademeli olarak uygulayın. Gerekirse, altlığı hafifçe karıştırın, kağıt tüp gibi temiz ve yeni bir nesne tanıtın veya yumuşak bir fırça ile hayvana nazikçe dokunun.
  7. Fiziksel kısıtlamadan, zorunlu lokomosyondan ve itici veya ağrılı stimülasyondan kaçının.
  8. müdahale günlüğünü doldurun Tablo 1 5 saatlik GH süresi boyunca her bir kafes için; saat başına yaklaşık müdahale sayısını, baskın müdahale türünü ve her türlü protokol sapmasını veya refahla ilgili endişeleri kaydedin.
  9. Kohortlar genelinde aynı müdahale günlüğü şablonunu kullanın.
    DİKKAT: Fiziksel kısıtlama, zorunlu egzersiz veya ağrılı stimülasyonlar kullanmayın; çünkü bunlar hafıza, stres ve inflamatuar sonuçları bağımsız olarak etkileyebilir.
Kafes/Kohort KimliğiH1H2H3H4H5Baskın müdahale tür(ler)iSapma veya refah gözlemi
Kayıt KimliğiH1 sayısını kaydedinH2 sayısını kaydedinH3 sayısını kaydedinH4 sayısını kaydedinH5 sayısını kaydedinVurma / altlık / yeni nesne / yumuşak fırçaVarsa kaydedin

Tablo 1: Nazik tutuş müdahale günlüğü şablonu. Kafes veya kohort kimliğini, 5 saatlik uyku yoksunluğu döneminin her saati (H1–H5) boyunca gerçekleştirilen nazik tutuş müdahalelerinin sayısını, baskın müdahale tür(ler)ini ve her türlü protokol sapmasını veya refah gözlemini kaydedin.

4. NOR Test Aşaması

  1. Sabit bir 5 saatlik tutma aralığını korumak için, NOR eğitiminin tamamlanmasından tam 5 saat sonra NOR test aşamasına başlayın.
  2. Arenaya bir tanıdık nesne (A) ve bir yeni nesne (B) yerleştirin.
  3. Yeni nesnenin konumunu, her gruptaki hayvanların yaklaşık yarısı yeni nesneyi solda, diğer yarısı ise sağda alacak şekilde sol ve sağ konumlar arasında dönüşümlü olarak yerleştirerek hayvanlar arasında dengeleyin.
  4. Fareyi arenanın merkezine yerleştirin. Fareye 5 dakika boyunca serbestçe keşfetme imkanı tanıyın.
  5. Oturumu, alıştırma için kullanılan aynı üstten video takip sistemiyle kaydedin. Adım 2.5'te belirtilen keşif tanımını uygulayın.
  6. Hayvanlar arasında arenayı ve nesneleri %70 etanol ile temizleyin.

5. Aynı Kohorttan Doku Toplama ve Hipokampal Diseksiyon

  1. NOR testi hemen ardından, doku toplama işlemi için davranışsal olarak test edilen aynı hayvanı tanımlayın.
  2. Anestezik ajanların inflamatuar ve fosforilasyona bağlı biyobelirteçler üzerindeki olası karıştırıcı etkilerini önlemek için, onaylanmış hayvan protokolüne uygun olarak, hayvanı anestezi uygulamadan giyotinleme (baş kesme) yöntemiyle ötanize edin. Ötanazi sonrası beyin dokusunu hemen toplayın.
  3. Her bir moleküler örneğin o hayvanın NOR sonucuyla doğrudan bağlantılı kalmasını sağlamak için, tüm örnek tüplerinde ve kayıtlarda hayvanın benzersiz davranış kayıt kimliğini (ID) koruyun.
  4. Beyni hızla çıkarın ve steril, buz gibi soğuk bir diseksiyon yüzeyine yerleştirin.
  5. Hemisferleri mid-sagittal bir kesi ile ayırın. Soğutulmuş mikro-spatulalar kullanarak her bir hemisferden hipokampüsü disseke edin.
  6. Disseke edilen hipokampüsleri sıvı azot içerisinde şok dondurun. Örnekleri analiz yapılana kadar −80°C'de saklayın.
    DİKKAT: Sıvı azot ciddi soğuk yanıklarına neden olabilir. Uygun kriyojenik kişisel koruyucu ekipman kullanın.

6. Hipokampal Biyobelirteçlerin Kantifikasyonu

  1. Buz gibi RIPA lizis tamponunu, 1× çalışma konsantrasyonunda (100× stoktan, her mL lizis tamponu başına 10 µL) kombine bir proteaz ve fosfataz inhibitör kokteyli ile destekleyin.
  2. Hipokampal dokuyu, desteklenmiş buz gibi RIPA lizis tamponu içinde 1:10 doku-tampon oranında (a/h) homogenize edin (mg doku başına 10 µL lizis tamponu). Hemisfer başına yaklaşık 25–30 mg olan tipik bir hipokampal doku kütlesi için, hemisfer başına yaklaşık 250–300 µL lizis tamponu veya yaklaşık 50–60 mg bilateral hipokampal doku için yaklaşık 500–600 µL lizis tamponu kullanın.
  3. RIPA homojenatını 4°C'de 15 dakika boyunca 14,000 × g hızda santrifüjleyin ve süpernatantı toplayın. Süpernatantı toplam protein kantifikasyonu ve üç sitokin ELISA'sı için kullanın.
    NOT: Enzimatik aktiviteyi korumak için SOD, GPx ve MDA analizlerinde, üretici tavsiyelerine uygun olarak kite özel homogenizasyon tamponlarını kullanın.
  4. RIPA lizis tamponu yerine ilgili kite özel homogenizasyon tamponunu kullanarak, SOD, GPx ve MDA ölçümleri için 1:9 doku-tampon oranında ayrı bir %10 (a/h) hipokampal homojenat hazırlayın.
  5. Toplam protein konsantrasyonunu bir BCA protein analizi kullanarak belirleyin.
  6. Materyal Tablosu'nda listelenen hedefe özgü ELISA veya biyokimyasal analiz kitlerini kullanarak IL-1β, IL-6, TNF-α, SOD, GPx ve MDA miktarını belirleyin. Her analiz için üreticinin talimatlarını izleyin.
  7. Standartları ilgili analiz tamponunda hazırlayın. Optik yoğunluk değerleri standart eğrinin lineer kısmına düşecek şekilde numuneleri dilüe edin.
  8. Sitokin ELISA'ları için hipokampal numuneleri ilgili analiz dilüenti ile yaklaşık 1:5 oranında dilüe edin. Optik yoğunluk değerlerini standart eğrinin lineer kısmında elde etmek için dilüsyonu gerektiği gibi 1:2–1:10 aralığında ayarlayın.
  9. Adım 6.4'te açıklanan %10 (a/h) hipokampal homojenatların süpernatantlarını SOD, GPx ve MDA analizleri için doğrudan kullanın. Adım 6.8'de açıklanan sitokin ELISA dilüsyon şemasını bu üç analize uygulamayın.
  10. IL-1β, IL-6 ve TNF-α ELISA'ları için, kuyucuk başına çift örneklü (duplicate) olarak 100 µL standart veya uygun şekilde dilüe edilmiş hipokampal numune ekleyin ve 37°C'de 90 dakika inkübe edin. 100 µL biyotinile deteksiyon antikoru ekleyin ve 37°C'de 60 dakika inkübe edin.
  11. Her sitokin ELISA kuyucuğuna 100 µL HRP konjuge ekleyin ve 37°C'de 30 dakika inkübe edin. TMB substratı ile 37°C'de karanlıkta yaklaşık 15 dakika boyunca geliştirin.
  12. SOD analizi için, 20 µL hipokampal homojenat süpernatantını 20 µL enzim çalışma çözeltisi ve 200 µL substrat çözeltisi ile karıştırın. 37°C'de 20 dakika inkübe edin ve absorbansı 450 nm'de ölçün.
  13. GPx analizi için, 200 µL hipokampal homojenat süpernatantını GSH içeren reaksiyon karışımı ile birleştirin ve 37°C'de 5 dakika inkübe edin. Reaksiyonu sonlandırın ve karışımı 4°C'de 10 dakika boyunca 3500 × g hızda santrifüjleyin. Süpernatantı yaklaşık 15 dakika boyunca renk geliştirmeye tabi tutun ve 200 µL reaksiyon süpernatantı kullanarak absorbansı 412 nm'de ölçün.
  14. MDA analizi için, 100 µL hipokampal homojenat süpernatantını 1.0 mL MDA çalışma reaktifi ile karıştırın ve 95°C'lik su banyosunda 40 dakika inkübe edin. Karışımı soğutun ve santrifüjleyin. Süpernatantın yaklaşık 250 µL'sini bir mikroplakaya aktarın ve absorbansı 532 nm'de ölçün.
  15. Sitokin ELISA'ları için absorbansı, mevcut olduğunda referans dalga boyu düzeltmesi kullanarak, kit tarafından belirtilen dalga boyunda (tipik olarak 450 nm) okuyun.
  16. Dört parametreli lojistik regresyon gibi uygun bir model kullanarak standart bir eğri oluşturun. Her biyobelirteç ölçümünü toplam protein içeriğine normalize edin.
  17. Seçilen kit ile uyumlu olduğu durumlarda, sitokin konsantrasyonlarını pg/mg protein, antioksidan enzim aktivitelerini U/mg protein ve MDA miktarını nmol/mg protein olarak raporlayın.

7. Veri Analizi ve Kalite Kontrol

  1. NOR test fazı sırasında tanıdık nesneye (Tfamiliar) ve yeni nesneye (Tnovel) yöneltilen keşif sürelerini çıkarın.
  2. Diskriminasyon indeksini (DI) şu şekilde hesaplayın:
    figure-protocol-2.
    NOT: 0,5'in üzerindeki bir DI, yeni nesneye yönelik bir tercihi gösterir.
  3. Toplam nesne keşif süresi (Tnovel + Tfamiliar) 10 s'den az olduğunda hayvanı NOR analizinden hariç tutun. Bu kriteri grup düzeyindeki analizden önce uygulayın ve tüm hariç tutmaları raporlayın.
  4. Her grup için normalliği Shapiro–Wilk testiyle ve varyans homojenliğini Levene testiyle değerlendirin. Her grup için DI'yı, iki kuyruklu tek örneklem t-testi kullanarak 0,5 şans düzeyine karşı değerlendirin; normallik varsayımı karşılanmazsa, bunun yerine 0,5'e karşı tek örneklem Wilcoxon işaretli sıralama testi kullanın.
  5. Aksi belirtilmedikçe tüm istatistiksel testler için alfa değerini 0,05 olarak belirleyin.
  6. Normallik ve varyans homojenliği varsayımları karşılandığında, bağımsız NSD ve SD grupları arasındaki DI'yı iki kuyruklu bağımsız örneklemler t-testi ile karşılaştırın. Aksi takdirde Mann–Whitney U testi kullanın.
  7. Tanıdık ve yeni nesne keşif sürelerini, faktörler olarak Grup ve Nesne Türünün yer aldığı iki yönlü tekrarlı ölçümler varyans analizi ile analiz edin. Sidak düzeltmeli ikili post hoc karşılaştırmalar yapın ve tüm grup karşılaştırma tahminlerinin yanında %95 güven aralıklarını raporlayın.
  8. Normallik ve varyans homojenliği varsayımları karşılandığında, her bir hipokampal biyobelirteci bağımsız NSD ve SD grupları arasında iki kuyruklu bağımsız örneklemler t-testi ile karşılaştırın. Aksi takdirde Mann–Whitney U testi kullanın.
  9. Aynı kohorttan birden fazla biyobelirteç değerlendirilirken, biyobelirteç paneli genelindeki yanlış keşif oranını Benjamini–Hochberg prosedürü kullanarak kontrol edin. Hem nominal hem de FDR-düzeltmeli p-değerlerini raporlayın.
  10. Birincil çıktı olarak NOR diskriminasyon indeksinin kullanıldığı, iki yönlü bağımsız örneklemler karşılaştırması için G*Power versiyon 3.1 kullanarak a priori güç analizi gerçekleştirin. Beklenen etki değerini, öğrenme sonrası uyku yoksunluğunun yeni nesne tercihinde belirgin bir bozulmaya yol açtığını gösteren daha önce yayınlanmış çalışmalara dayandırın.
  11. Cohen’s d = 1,35 standartlaştırılmış etki büyüklüğü, iki yönlü 0,05 alfa, %80 güç ve 1:1 tahsis oranı kullanarak a priori güç analizini gerçekleştirin. Bu parametreler, grup başına hesaplanan minimum 10 hayvanlık bir örneklem büyüklüğü sağlar.
    NOT: Etki büyüklüğü, daha önce yayınlanmış nesne tanıma verilerinden tahmin edilmiştir9. Palchykova ve ark., eğitimden hemen sonra uyku yoksunluğu uygulanan fareler ile zamanla eşleştirilmiş kontroller (n = grup başına 9) için test fazındaki yeni nesne keşif süresi üzerinde anlamlı bir grup etkisi (F(1,16) = 8,26, p < 0,007) raporlamıştır ve bu değer Cohen’s d ≈ 1,36'ya karşılık gelmektedir. Bu nedenle, a priori güç analizi için d = 1,35 standartlaştırılmış etki büyüklüğü benimsenmiştir.
  12. Önceden belirlenmiş davranışsal veya teknik hariç tutmalara izin vermek için planlanan örneklem büyüklüğünü grup başına 12 hayvana (%20 artış, toplam 24 hayvan) yükseltin. NOR testi sırasında toplam nesne keşfinin <10 s olması, refahla ilgili hariç tutmalar, kullanılamaz video kayıtları ve doku/numune analizlerinin teknik başarısızlıklarını hariç tutma kriterleri olarak önceden belirleyin.
  13. Hayvanları, gözlemlenen tedavi etkisinin yönü veya büyüklüğü temelinde analiz dışı bırakmayın.
  14. İstatistiksel analizleri Python versiyon 3.12, hipotez testleri ve etki büyüklüğü hesaplamaları için SciPy versiyon 1.17 ve Benjamini–Hochberg yanlış keşif oranı düzeltmesi için statsmodels versiyon 0.14 kullanarak gerçekleştirin.
  15. Resmi bir veri seti oluşturmak için bu protokolü kullandığınızda, 7.4–7.9 adımlarında belirtilen tüm istatistiksel testler için p-değerlerinin yanında etki büyüklüklerini (örneğin, grup karşılaştırmaları için Cohen's d) raporlayın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Bu protokolün başarılı bir şekilde uygulanması, tek bir sonucun izole olarak yorumlanmasına gerek kalmadan tutarlı bir davranışsal-moleküler sonuç örüntüsü vermelidir. Tam deneysel sekans Şekil 1'de örneklendirilmiş olup, NOR aparatı ve deneysel tasarım Şekil 2'de gösterilmiştir. NSD grubundaki farelerin, 0.5 şans seviyesinin üzerindeki bir DI ile yansıtılan, yeni nesneye karşı belirgin bir tercih göstermesi gerekir. Eğitim sonrası 5 saatlik GH protokolüne maruz...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Bu makale, akut uyku yoksunluğunun tetiklediği tanıma belleği kusurlarını ve hipokampal moleküler değişiklikleri incelemek için hızlı ve tekrarlanabilir bir çerçeve sunmaktadır. Standartlaştırılmış 10 dakikalık bir öğrenme aşamasından hemen sonra 5 saatlik nazik müdahale uygulanarak, prosedür tanımlanmış bir öğrenme sonrası konsolidasyon pencelesini hedefler ve uzun süreli yoksunluk modelleri veya zorunlu harekete dayalı prosedürlerle ilişkili fiziksel yükü azaltmak üzere tasarlanmıştır4,

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması beyan etmemektedir.

Teşekkürler

Bu çalışma Nanjing Drum Tower Hastanesi Gençlik Yetiştirme Fonu, Çin Ulusal Doğal Bilimler Vakfı (Hibe No. 82502706) ve Jiangsu Temel Araştırma Programı (Hibe No. BK20250258) tarafından desteklenmiştir. Metnin taslağının oluşturulması ve geliştirilmesinin yanı sıra şematik şekillerin oluşturulması ve düzenlenmesi dahil olmak üzere, taslağın hazırlanması ve revizyonu sırasında yapay zeka destekli araçlar kullanılmıştır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
%70 etanolHerhangi bir tedarikçiBelirtilmediNOR arenasının ve nesnelerin temizlenmesi
Yetişkin erkek C57BL/6J fareler (8–12 hafta)Zhejiang AILIMO Biotechnology Co., Ltd.Lütfen çevrilecek metni sağlayın.Deney hayvanları
BCA Protein Analiz KitiThermo Fisher Scientific (Pierce)23225Toplam protein tayini ve normalizasyonu
Davranış analiz yazılımıNoldus Information Technology B.V.EthoVision XT versiyon 17.5NOR keşif puanlaması ve analizi
14.000'e kadar çıkabilen santrifüj × g at 4 °CEppendorfSantrifüj 5424 R; Kat. 5404000610Hipokampal homojenatların berraklaştırılması
Temiz kağıt tüplerHerhangi bir tedarikçiGirdi sağlanmadı. Lütfen çevrilmesini istediğiniz metni iletiniz.Hassas tutuş müdahalesi
Kriyojenik kişisel koruyucu donanımHerhangi bir tedarikçiGirdi sağlanmamıştır. Lütfen çevrilmesini istediğiniz metni giriniz.Sıvı azotun güvenli kullanımı
Glutatyon Peroksidaz Analiz KitiAbcamab102530GPx kantifikasyonu
Hipokampal doku homojenizatörüIKA-Werke GmbH & Co. KGT 10 basic ULTRA-TURRAX; Kat. 0003737000Hipokampal dokunun lizis tamponunda homojenizasyonu
Sıvı nitrojenHerhangi bir tedarikçiMetin sağlanmamıştır. Lütfen çevrilmesini istediğiniz kaynak metni giriniz.Diseke edilmiş hipokampusların şok dondurulması
MDA Analiz KitiSigma-AldrichMAK085MDA kantifikasyonu
Mikroplaka okuyucuAgilent Technologies / BioTekBioTek Epoch 2 Mikroplaka SpektrofotometresiKit tarafından belirtilen dalga boylarında absorbans ölçümü
Mikro spatulalarHerhangi bir tedarikçiSistemde herhangi bir kaynak metin bulunmamaktadır. Lütfen çevrilmesini istediğiniz metni sağlayın.Hippocampus diseksiyonu; soğutulmuş olarak kullanıldı
Fare IL-1β ELISA KitiR&D SistemleriMLB00CIL-1β nicelleştirme
Mouse IL-6 ELISA KitiR&D SistemleriM6000BIL-6 kantifikasyonu
Fare TNF-α ELISA KitiR&D SistemleriMTA00BTNF-α nicelleştirme
Nesne setleri A/A′ ve BHerhangi bir tedarikçiBelirtilmediNOR alışma ve test aşamaları
Opak NOR arenası (40 cm × 40 cm × 40 cm)Herhangi bir tedarikçiMetin sağlanmadığı için çeviri yapılamamıştır. Lütfen çevrilmesini istediğiniz kaynak metni iletiniz.Davranışsal testler
Üstten video kayıt sistemiBasler AGacA1300-60gmNOR alıştırma ve test oturumlarının video kaydı
Proteaz/Fosfataz İnhibitör KokteyliThermo Fisher Scientific (Thermo Scientific)784401'de lizis tamponuna eklendi× çalışma konsantrasyonu (10 µL/mL 100'den× stok)
RIPA Lizis TamponuThermo Fisher Scientific89900Hipokampal doku homojenizasyonu
Kriyojenik saklamaya uygun numune tüpleriThermo Fisher Scientific (Nunc)Nunc CryoTube, 1,8 mL; Kat. 375418Hayvana özgü örnek kimliklerinin takibi ve diseke edilmiş hipokampal dokunun saklanması
Yumuşak fırçaHerhangi bir tedarikçiMetin sağlanmamıştır. Lütfen çevrilmesini istediğiniz kaynak metni giriniz.Hassas tutuş müdahalesi
SOD Analiz KitiSigma-Aldrich19160SOD kantifikasyonu
İstatistik ve güç analizi yazılımıG*Power; Python Software FoundationG*Power versiyon 3.1; Python versiyon 3.12 (SciPy 1.17; statsmodels 0.14)Protokol Bölüm 7'de açıklanan a priori güç analizi ve istatistiksel analizler
Standart kemirgen yemiJiangsu Xietong Pharmaceutical Bio-engineering Co., Ltd.Işınlanmış Sıçan/Fare Bakım Diyeti; XTI01WC-010Hayvanların ad libitum beslenmesi
−80 °C dondurucuHaier BiomedicalDW-86L626Şok dondurulmuş hipokampal dokunun uzun süreli saklanması

Kaynaklar

  1. Walker MP, Stickgold R. Sleep, memory, and plasticity. Annual Review of Psychology. 2006;57:139-166.
  2. Musiek ES, Holtzman DM. Mechanisms linking circadian clocks, sleep, and neurodegeneration. Science. 2016;354(6315):1004-1008.
  3. Havekes R, Abel T. The tired hippocampus: the molecular impact of sleep deprivation on learning and memory. Current Opinion in Neurobiology. 2017;44:33-39.
  4. Machado RB, Hipólide DC, Benedito-Silva AA, Tufik S. Sleep deprivation induced by the modified multiple platform technique: quantification of sleep loss and recovery. Brain Research. 2004;1004(1-2):45-51.
  5. Hagewoud R, et al. Sleep deprivation impairs spatial working memory and reduces clearance of hippocampal β-amyloid in rats. Neurobiology of Aging. 2013;34(1):22-30.
  6. Fenzl T, et al. Fully automated sleep deprivation in mice as a tool in sleep research. J Neurosci Methods. 2007;166(2):229-35.
  7. Ennaceur A, Delacour J. A new one-trial test for neurobiological studies of memory in rats. 1: Behavioral data. Behavioural Brain Research. 1988;31(1):47-59.
  8. Leger M, et al. Object recognition test in mice. Nature Protocols. 2013;8(12):2531-2537.
  9. Palchykova S, et al. Sleep deprivation impairs object recognition in mice. Neurobiology of Learning and Memory. 2006;85(3):263-271.
  10. Wadhwa M, et al. Sleep deprivation induces spatial memory impairment by altered hippocampus neuroinflammation and microglia activation in rats. Journal of Neuroimmunology. 2011;238(1-2):14-23.
  11. Silva RH, et al. Role of hippocampal oxidative stress in memory deficits induced by sleep deprivation in mice. Neuropharmacology. 2016;104:1-8.
  12. Wang Y, et al. Ellagic acid ameliorates sleep deprivation-induced cognitive impairment and neuroinflammation in mice. Aging. 2020;12(10):10327-10340.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Daha fazla makale keşfet

Fare ModeliNazik MüdahaleProinflamatuar SitokinlerOksidatif Stres Belirteçleriİnterlökin-1 BetaTümör Nekroz Faktörü
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.