Araştırma makalesi

Ülseratif Kolitte Ferroptozis ve Kuproptozis Hedeflemesi: Kapsamlı Biyoinformatik ve Deneysel Doğrulama Bulguları

80 görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/73656

⸱

25 Ağustos 2026

 ,  ,  , 
1Liaoning University of Traditional Chinese Medicine, 2The Third Affiliated Hospital of Liaoning University of Traditional Chinese Medicine

Bu makalede

Özet

Bu çalışma, entegre makine öğrenimi, tek hücreli RNA dizileme ve deneysel doğrulama yoluyla ülseratif kolitte kuproptoz ve ferroptoz ile ilişkili beş biyobelirteç belirleyerek, klinik tanı ve hedefe yönelik immünoterapi hakkında bilgiler sunmaktadır.

Özet

Ülseratif kolit (UK), patogenezi tam olarak tanımlanmamış olan ve yeni sanayileşmiş ülkelerde prevalansı ve hastaneye yatış oranları artan kalıcı bir bağırsak bozukluğudur. UK'de, aşırı bağırsak epitelyal hücre ölümü mukozal bariyeri bozar ve enflamatuar yanıtları tetikler. Ferroptozis ve kuproptozis, yakın zamanda tanımlanmış iki düzenli hücre ölümü biçimidir. UK üzerine yapılan çalışmaların çoğu bu süreçleri ayrı ayrı incelemiştir; ancak, UK progresyonundaki ortak rolleri yetersiz şekilde karakterize edilmiştir. UK patogenezindeki sinerjik rollerini araştırmak için, aday hedefleri belirlemek amacıyla geniş ölçekli transkriptomik profillemeyi ve ardından in vitro modellerde doğrulamayı içeren aşamalı bir yaklaşım kullandık. Diferansiyel olarak eksprese olan genler (DEG'ler), ferroptozisle ilişkili genler (FRG'ler) ve kuproptozisle ilişkili genler (CRG'ler) ile kesiştirildi. Örtüşen hedefler, makine öğrenimi algoritmaları konsensüsü ve ağırlıklı gen eş-ekspresyon ağ analizi (WGCNA) kullanılarak önceliklendirildi. Beş biyobelirteç — LCN2, IDO1, CXCL2, NOS2 ve CD274 — UK'de anlamlı düzeyde artış göstermiştir. Tek hücre analizi, bu belirteçlerin farklı hücre tipleri arasındaki ekspresyonunu karakterize etmiş ve LCN2 ile NOS2'nin öncelikle epitelyal hücrelerde zenginleştiğini göstermiştir. Bu belirteçlerin mekanistik ilişkisi, in vitro analizler yoluyla daha detaylı olarak değerlendirilmiştir. Ferroptozis veya kuproptozis inhibitörleri ile yapılan tedavi, Caco-2 hücre modellerinde UK ile ilişkili enflamasyonu hafifletmiş ve biyobelirteç ekspresyonunu modüle etmiştir. Bu bulgular, UK progresyonu ile ilişkili beş biyobelirteç tanımlamakta ve bunların klinik tanı ve terapötik müdahaledeki potansiyel uygulamalarını destekleyen deneysel kanıtlar sunmaktadır.

Giriş

Ülseratif kolit (UC), artan küresel yük ve önemli uzun vadeli tedavi maliyetleri ile ilişkili, nüks eden bir inflamatuar bağırsak hastalığıdır1,2. Aminosalisilatlar, kortikosteroidler, biyolojikler ve küçük moleküllü tedaviler tedavi seçeneklerini genişletmiş olsa da, birçok hasta için kalıcı remisyonu sağlamak hala zordur3,4. Bu karşılanmamış klinik ihtiyaç, daha erken tanıya ve mekanizma odaklı tedaviye destek sağlayabilecek tekrarlanabilir moleküler markerların ve yönetilebilir mekanizmaların belirlenmesinin önemini vurgulamaktadır5.

Ferroptoz; lipid peroksidasyonu, glutatyon tükenmesi ve bozulmuş GPX4 aktivitesi tarafından tetiklenen, demire bağımlı bir düzenlenmiş hücre ölümü biçimidir6. Ülseratif kolitte (UK) artan demir ve malondialdehit seviyeleri ferroptotik epiteliyal hasarla uyumludur; SLC7A11–GSH–GPX4 aksının deneysel aktivasyonu veya ferroptozun doğrudan inhibisyonu intestinal bariyeri koruyabilir7,8.

2022 yılında tanımlanan kuproptoz, bakırın lipoylanmış mitokondriyal proteinlere bağlanmasıyla tetiklenir; bu durum protein agregasyonuna ve proteotoksik strese yol açar9. Bağırsak, bakır yönetimi üzerinde merkezi bir rol oynadığından, bu yolaktaki bozulmalar ÜK'deki oksidatif ve inflamatuar epitelyal hasarı artırabilir10.

Ferroptoz ve kuproptoz; metal iyonu dengesizliği, mitokondriyal metabolizma, glutatyon tükenmesi ve oksidatif stres yoluyla ortak noktada buluşabilir11. Ancak, bu etkileşimin ÜK'de tekrarlanabilir bir moleküler imza oluşturup oluşturmadığı ve böyle bir imzanın yola özgü inhibisyona yanıt verip vermediği henüz çözülmemiştir.

Çalışma hipotezi, ÜK'de (ülseratif kolit) düzensizleşmiş ferroptoz-kuproptoz etkileşiminin, bulk ve tek hücreli transkriptomik veri setleri genelinde önceliklendirilebilen ve bir intestinal epitel hasarı modelinde yola özgü inhibisyonla hafifletilebilen, tekrarlanabilir bir biyobelirteç imzasına odaklandığı yönündeydi. Buna uygun olarak, aday biyobelirteçleri tanımlamak ve fonksiyonel olarak değerlendirmek için çok kohortlu biyoinformatik, makine öğrenimi, tek hücre analizi ve hedeflenmiş Caco-2 deneyleri entegre edilmiştir (Şekil 1).

Entegre çalışma tasarım diyagramı; transkriptomik keşif, biyobelirteç değerlendirmesi, deneysel doğrulama.
Şekil 1: Çalışma iş akışı. Çoklu kohort transkriptomik tarama, makine öğrenimi ve ağ tabanlı biyobelirteç önceliklendirmesi, tek hücre lokalizasyonu ve Caco-2 hücrelerinde inhibitör tabanlı doğrulama için entegre iş akışı. UC: ülseratif kolit; GEO: Gene Expression Omnibus; WGCNA: ağırlıklı gen eş-ekspresyon ağ analizi; PPI: protein-protein etkileşimi; ROC: alıcı işletim karakteristiği; GSEA: gen seti zenginleştirme analizi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Protokol

Bu çalışmada halka açık veri setleri ve ticari olarak temin edilebilen insan hücre hatları kullanılmıştır. Herhangi bir insan katılımcı, yeni toplanmış insan dokusu veya omurgalı hayvan kullanılmadığı için kurumsal etik kurul onayı gerekmemiştir. Protokolde kullanılan araştırma araçları, yazılımlar ve çevrimiçi kaynaklar Materyal Tablosu'nda listelenmiştir.

1. Diferansiyel ekspresyon analizi için veri işleme

Transkriptomik keşif ve doğrulama kohortlarını oluşturmak için Gene Expression Omnibus (GEO) veri tabanında “ulcerative colitis” terimi kullanılarak arama yapılmıştır. GSE87466, GSE92415, GSE107499 ve GSE75214 olmak üzere dört veri seti eğitim seti olarak kullanılırken, GSE47908 harici doğrulama için ayrılmıştır. Eğitim veri setleri Sangerbox 3.0 içindeki ComBat kullanılarak normalize edilmiş ve grup etkisinden (batch effect) arındırılmış, doğrulama veri seti ise bağımsız olarak işlenmiştir.

Tek kaynak yanlılığını azaltmak amacıyla FerrDB'den toplam 583 ferroptozis ilişkili gen (FRG) elde edilmiş ve literatürde bildirilen genlerle desteklenmiştir12. Yayınlanmış çalışmalardan 96 kuproptozis ilişkili gen (CRG) içeren bir set derlenmiştir12,13,14. Diferansiyel ekspresyon analizi, |log₂ fold change| > 1 ve Benjamini-Hochberg düzeltmeli P < 0.05 eşik değerleri kullanılarak limma ile gerçekleştirilmiştir. Normalizasyon, grup düzeltmesi (batch correction), diferansiyel ekspresyon ve kümeleme analizlerine ait tanısal grafikler Ek Şekil 1'de sunulmuştur. Örnek kompozisyonu, platformlar ve kohort atamaları Ek Tablo 1'de verilmiştir.

2. UC'de CF-DEGs'lerin Belirlenmesi

Ortak eksprese edilen FRG'ler ve CRG'leri belirlemek amacıyla |r| > 0.5 ve P < 0.05 eşik değerleri kullanılarak Pearson korelasyon analizi gerçekleştirilmiştir. Elde edilen gen seti, kuproptoz-ferroptoz ortak eksprese edilen diferansiyel eksprese genleri (CF-DEG'ler) belirlemek için diferansiyel eksprese genler (DEG'ler) ile kesiştirilmiştir.

3. Zenginleştirme analizi

Gen Ontolojisi (GO) ve Kyoto Gen ve Genom Ansiklopedisi (KEGG) zenginleştirme analizleri, clusterProfiler ve Bioinformatics.com.cn platformu kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Anlamlılık eşiği olarak Benjamini–Hochberg düzeltmeli P < 0.05 değeri kullanılmıştır. Zenginleştirme grafikleri Ek Şekil 2'de sunulmuştur.

4. Ağırlıklı gen ko-ekspresyon ağ analizi (WGCNA)

Gen ekspresyon profillerinin temelini oluşturan modüler yapı, ağırlıklı gen eş-ekspresyon ağ analizi (WGCNA) kullanılarak incelenmiştir. Anormal örnekler, hiyerarşik kümeleme ve goodSamplesGenes fonksiyonu kombinasyonuyla belirlenmiş ve analiz dışı bırakılmıştır. Ardından, ağ kurulumu için ölçeksiz topoloji kriterini karşılayacak uygun bir yumuşak eşikleme gücü (β) belirlenmiştir.

İşlenmiş ekspresyon verileri, gen ko-ekspresyon analizi için bir topolojik örtüşme matrisi (TOM) oluşturmak amacıyla kullanıldı. Dinamik ağaç kesme yaklaşımı kullanılarak, oldukça tutarlı ekspresyon modellerine sahip genler, her biri en az 100 gen içeren gen modülleri halinde organize edildi. Hastalık süreciyle ilişkili modülleri belirlemek ve ilgili gen setlerini çıkarmak için modül özgenleri (ME'ler) ve fenotipler arasındaki ilişkiler analiz edildi. WGCNA tarama tanıları Ek Şekil 3'te sunulmuştur.

5. Biyobelirteçlerin seçimi

Deneysel takip için adayları önceliklendirmek amacıyla, üç makine öğrenimi algoritması paralel olarak uygulanmıştır15. Özellik seçimi için en küçük mutlak küçültme ve seçme operatörü (LASSO) regresyonu, gen önem sırasını belirlemek için ntree = 500 ile rastgele orman (random forest) ve en düşük çapraz doğrulama hatasına sahip özellik alt kümesini tanımlamak için destek vektör makinesi-özyinelemeli özellik eleme (SVM-RFE) kullanılmıştır. Tam tarama tanıları Ek Şekil 5'te sunulmuştur.

Gen önemi, tekil genlerin sınıflandırma doğruluğuna olan katkısına göre değerlendirilmiş ve öncül bir gen seti oluşturmak için yüksek sıralamadaki genler toplanmıştır16. SVM-RFE algoritması, iteratif özellik elemesi yoluyla özellik taraması ve model optimizasyonu gerçekleştirerek sınıflandırma için optimal özellik alt kümesinin belirlenmesini sağlamıştır17. Üç algoritma arasında ortak olan genler, makine öğrenimi yoluyla belirlenen aday biyobelirteçler olarak kabul edilmiştir.

CF-DEG'ler bir protein-protein etkileşim (PPI) ağı oluşturmak için kullanılmış ve çekirdek düğümleri sıralamak için CytoHubba kullanılmıştır. Temel WGCNA modüllerinin, üç makine öğrenimi çıktısının ve PPI çekirdek setinin kesişimi; LCN2, IDO1, CXCL2, NOS2 ve CD274 olmak üzere beş entegre aday biyobelirteci tanımlamıştır. Bu genler, UC ile ilişkili tanı adayları olarak sınıflandırılmıştır. Müteakip inhibitör deneyleri, LCN2, IDO1, CXCL2 ve NOS2'yi ferroptoz inhibisyonuna yanıt veren belirteçler, CD274'ü ise kuproptoz inhibisyonuna yanıt veren bir belirteç olarak daha ileri düzeyde sınıflandırmıştır. Bu genler, her iki yolun da kanıtlanmış üst regülatörleri olarak değerlendirilmemiştir.

6. Öngörücü model geliştirme ve çok yöntemli değerlendirme

Belirlenen gen imzasının klinik translasyonel potansiyelini değerlendirmek amacıyla, tanısal performansı ölçmek için rms paketi kullanılarak bir nomogram oluşturulmuştur. Model performansı; bir kalibrasyon eğrisi, Hosmer–Lemeshow (HL) testi ve Harrell uyum indeksi (C-indeksi) kullanılarak değerlendirilmiştir.

Model kalibrasyonu, HL testi ve ortalama mutlak hata (MAE) kullanılarak değerlendirildi. Kabul edilebilir model uyumu ve doğruluğu için eşik değerleri sırasıyla P değeri > 0,05 ve MAE < 0,1 olarak belirlendi. Nomogramın UC için öngörücü performansını değerlendirmek amacıyla alıcı işletim karakteristik (ROC) eğrileri oluşturuldu ve eğri altında kalan alan (AUC) hesaplandı. Modelin genellenebilirliğini ve stabilitesini değerlendirmek için bağımsız bir veri seti kullanıldı.

7. Gen seti zenginleştirme analizi (GSEA)

Eğitim setinde, her bir biyobelirteç ile diğer tüm genler arasında Spearman korelasyon analizi gerçekleştirilmiştir. Korelasyon sonuçları, sıralı bir gen seti oluşturmak amacıyla derecelendirilmiştir. Referans olarak Molecular Signatures Database (MSigDB) bünyesindeki c2.cp.kegg_medicus.v2025.1.Hs.symbols gen seti kullanılarak Gen Seti Zenginleştirme Analizi (GSEA) yapılmıştır. P < 0.05 olan biyolojik yolaklar anlamlı düzeyde zenginleşmiş olarak kabul edilmiştir.

8. İmmün manzara analizi

Ekspresyon verilerinin dekonvolüsyon analizini gerçekleştirmek ve 22 immün hücre alt tipinin oranlarını tahmin etmek için CIBERSORT aracı ve LM22 imza matrisi kullanılmıştır. Beş biyobelirteç ile immün hücre alt tipleri arasındaki ilişkileri değerlendirmek için ardından Spearman korelasyon analizi yapılmıştır.

9. Düzenleyici ağ analizi

Genle ilişkili transkripsiyon faktörü (TF) ve mikroRNA (miRNA) regülasyonuna ilişkin bilgiler, NetworkAnalyst platformu aracılığıyla entegre ChEA3 ve TarBase 9.0 veri tabanlarından elde edilmiştir. En az iki düğümle ilişkili olan miRNA'lar regülasyon ağına dahil edilmiştir.

10. Tek hücreli RNA-seq

Üç sağlıklı ve üç UC örneğinden oluşan GSE116222 ile altı sağlıklı ve altı UC örneğinden oluşan GSE214695 UC tek hücre veri setleri entegre edildi. 200–5.000 arası saptanan gen, >1.000 benzersiz moleküler tanımlayıcı, < %30 mitokondriyal transkript, < %3 hemoglobin transkripti ve < %50 ribozomal transkript içeren hücreler tutuldu. Normalizasyon için NormalizeData fonksiyonu, kümeleme ve anotasyon öncesindeki grup düzeltmesi (batch correction) için ise Harmony kullanıldı.

Filtreleme işleminden sonra, veriler NormalizeData fonksiyonu kullanılarak normalize edildi. Örnekler arasındaki batch etkilerini minimize etmek için Harmony kullanıldı. Hücre popülasyonu içindeki lokal ve global yapıları karakterize etmek amacıyla boyut indirgeme ve hücre kümeleme için Uniform manifold approximation and projection (UMAP) ve t-distributed stochastic neighbor embedding (t-SNE) kullanıldı. Daha ileri analizler için toplam 31.712 yüksek kaliteli hücre tutuldu. Hücre tipleri, kanonik hücre belirteç genlerine göre tanımlandı.

UC dokularındaki epitelyal ve miyeloid hücrelerin durumlarındaki değişiklikleri incelemek için Monocle 2 kullanılarak psödozaman analizi gerçekleştirildi. Hücre gelişim yörüngeleri ve gruplar arası farklar değerlendirildi ve psödozaman yörüngesi boyunca biyobelirteç ekspresyon modelleri görselleştirildi.

Epitel ve miyeloid hücre alt kümeleri arasındaki hücre-hücre iletişimini değerlendirmek için CellChat kullanılmıştır. Epitel ve miyeloid hücreler arasındaki etkileşim olasılıklarını ve temel sinyal yolaklarını belirlemek ve potansiyel hücreler arası düzenleyici ağlarını karakterize etmek için alt popülasyona özgü ekspresyon paternleri entegre edilmiştir.

11. Hücre deneyleri

İnsan Caco-2 kolon adenokarsinom hücreleri; %10 fetal bovine serum, 100 U/mL penisilin ve 100 µg/mL streptomisin içeren Dulbecco’s modified Eagle besiyerinde, 37 °C sıcaklıkta ve %5 CO₂ ortamında kültüre edilmiştir. Caco-2 hücreleri, intestinal bariyer ve inflamatuar hasar analizleri için tekrarlanabilir bir epitelyal monolayer modeli olarak seçilmiştir; ancak, malign kökenleri bu sonuçların malign olmayan kolon epitelyumuna doğrudan genellenmesini sınırlar. Arşivlenmiş deneysel kayıtlarda pasaj bilgisine ulaşılamamıştır.

Hücrelerin 24 saat boyunca 1 µg/mL lipopolisakkarit (LPS) maruziyetine bırakılmasıyla bir in vitro inflamatuar hasar modeli oluşturuldu. Hücreler; eşleşmiş nihai çözücü konsantrasyonları ile bir dimetil sülfoksit taşıyıcı kontrol grubuna, yalnızca LPS grubuna, LPS + 4 µM ferrostatin-1 grubuna veya LPS + 40 µM tetratiyomolibdat grubuna ayrıldı. Yalnızca LPS grubuna, inhibitör kurtarma karşılaştırmaları için pozitif hasar/model kontrolü olarak hizmet edildi.

  1. Hücre canlılığı
    Hücre canlılığı, üretici talimatlarına uygun olarak bir hücre canlılığı testi kullanılarak değerlendirilmiştir. Yaklaşık 2 saat boyunca 37 °C'de inkübasyon sonrası, 450 nm'deki absorbans bir mikroplaka okuyucu kullanılarak ölçülmüştür.
  2. MDA ve Fe²⁺ seviyelerinin ölçümü
    Hücre içi malondialdehit (MDA) ve Fe2⁺ seviyeleri, üretici talimatlarına uygun olarak ilgili analiz kitleri kullanılarak ölçülmüştür. Toplam protein miktarı bir bisinkoninik asit testi kullanılarak belirlenmiş ve her okuma, ilgili örneğin protein içeriğine göre normalize edilmiştir.
  3. Bakır iyonu floresan prob analizi
    Kültür ortamı uzaklaştırıldıktan sonra, 1 µM final konsantrasyonunda Cu2⁺-spesifik bir floresan prob eklenmiş ve 37 °C'de 30 dakika inkübe edilmiştir. Görüntüler, yıkama işlemi yapılmadan, sırasıyla 510 ve 578 nm eksitasyon ve emisyon dalga boylarında bir ters floresans mikroskobu kullanılarak anlık olarak elde edilmiştir. Görüntüleme ayarları tüm gruplar için sabit tutulmuş ve görüntü ölçek çubuğu 50 µm olarak kalibre edilmiştir.
  4. RT-qPCR
    Toplam RNA, fenol-guanidinyum tabanlı bir RNA ekstraksiyon reaktifi kullanılarak izole edilmiştir. Komplementer DNA, 1 µg RNA'dan bir birinci zincir komplementer DNA sentez kiti kullanılarak sentezlenmiş ve gerçek zamanlı PCR için SYBR Green tabanlı reaktifler kullanılmıştır. Her reaksiyon teknik olarak üç tekrarlı (triplicate) gerçekleştirilmiştir. Primer dizileri Ek Tablo 2'de verilmiş olup, göreceli haberci RNA bolluğu 2⁻ΔΔCt yöntemi kullanılarak hesaplanmıştır.

12. İstatistiksel analiz

Normallik ve varyans homojenliği, sırasıyla Shapiro-Wilk ve medyan merkezli Levene testleri kullanılarak değerlendirildi. Her iki varsayımı da karşılayan veriler, eşleşmemiş iki yönlü t-testi veya ardından Tukey'nin dürüst anlamlı fark testi ile tek yönlü varyans analizi kullanılarak analiz edildi. Varsayımlardan herhangi birinin karşılanmadığı durumlarda, Welch t-testi veya ardından Games-Howell karşılaştırmaları ile Welch varyans analizi kullanıldı.

Sonuçlar ortalama ± standart sapma olarak sunulmuştur. Gerçek biyolojik replika sayıları, kesin iki yönlü P değerleri ve varsayım kontrolleri Ek Tablo 3'te raporlanmıştır. Arşivlenen Şekil 13 kaynak sayfası, A (n = 4), C (n = 4) ve F (n = 2) panelleri için daha az kontrol replikası içerirken, diğer tüm panel/grup kombinasyonları n = 6 içermektedir.

Hesaplamalı analizler R ve limma, WGCNA, clusterProfiler, glmnet, randomForest, e1071, pROC, rms, Seurat v4, Harmony, Monocle 2, CellChat ve Cytoscape/CytoHubba iş akışları kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Çevrimiçi kaynaklar arasında FerrDB, GEO, STRING, ChEA3, TarBase 9.0, NetworkAnalyst, CIBERSORT/LM22, MSigDB, Bioinformatics.com.cn ve Sangerbox 3.0 yer almıştır.

Sonuçlar

Kuproptozis–ferroptozis ko-ekspresyon gösteren genlerin tanımlanması ve fonksiyonel anotasyonu

421 UC örneği ve 97 sağlıklı kontrolden oluşan dört eğitim veri seti entegre edildi. 362'si artmış ve 189'u azalmış olmak üzere toplam 551 diferansiyel ekspresyon gösteren gen tanımlandı. Korelasyon analizi sonucunda 444 ferroptoz-kuproptoz ile ilişkili gen elde edildi ve diferansiyel ekspresyon gösteren genlerle yapılan kesişim analizi, 32 kuproptoz-ferroptoz ko-eksprese diferansiyel ekspresyon gösteren gen (CF-DEG) ortaya çıkardı.

32 CF-DEG; yaralanma yanıtları, bakır iyonları, yağ asidi taşınımı, lipopolisakkarit, inflamatuar bağırsak hastalığı, NF-κB sinyali, TNF sinyali ve ferroptozis süreçlerinde zenginleşmiştir (Ek Tablo 4).

Entegre makine öğrenimi ve WGCNA aracılığıyla temel biyobelirteçlerin önceliklendirilmesi

Ağırlıklı gen ko-ekspresyon ağ analizi (WGCNA), MEpurple, MEbrown ve MEblack modüllerini UC ile en güçlü şekilde ilişkili modüller olarak tanımlamıştır. Seçilen modüller toplamda 1.426 gen içermektedir (Ek Tablo 5).

En küçük mutlak büzülme ve seçim operatörü (LASSO), destek vektör makinesi-özyinelemeli özellik eleme (SVM-RFE) ve rastgele orman yöntemleri sırasıyla 21, 32 ve 19 özellik seçmiştir. On üç gen her üç model tarafından ortaklaşa seçilmiştir. Makine öğrenmesi konsensüsünün, CytoHubba ile sıralanmış protein-protein etkileşim çekirdeğinin ve seçilen WGCNA modüllerinin entegrasyonu; LCN2, IDO1, CXCL2, NOS2 ve CD274 olmak üzere UC ile ilişkili beş aday biyobelirteç sağlamıştır.

Biyobelirteç imzasının tanısal değerlendirmesi ve yol zenginleştirmesi

Eğitim kohortunda, beş aday biyobelirtecin tamamı pozitif korelasyon göstermiş ve ÜK'de yukarı regüle olmuştur (Şekil 2A, B). Her bir belirteç, alıcı işletim karakteristik eğrisi altında bir alan değerine ulaşmıştır > eğitim kohortunda 0,80 ve > bağımsız GSE47908 doğrulama kohortundaki 0,75 (Şekil 2C–E).

Beş genli nomogram, Hosmer–Lemeshow P > 0.05 ve ortalama mutlak hata < 0.1 ile uygun kalibrasyon; analiz edilen kohortta ise 0.945'lik bir eğri altı alan ve konkordans indeksi ile konkordans indeksi için 0.922–0.968'lik bir %95 güven aralığı ile ayırt edicilik göstermiştir (Şekil 3).

Gen seti zenginleştirme analizi, beş adayı JAK–STAT, interferon–RIPK1/3 ve Toll-benzeri reseptör–NF-κB sinyal yollarıyla ilişkilendirmiştir (Şekil 4).

Gen ekspresyon analiz grafikleri; UC ile sağlıklı karşılaştırması için pasta grafikleri, ROC eğrileri ve kutu grafikleri.
Şekil 2: Aday biyobelirteç ekspresyonu ve tanısal performans. (A) Korelasyon ısı haritası. (B, C) Eğitim kohortundaki biyobelirteç ekspresyonu ve alıcı işletim karakteristiği eğrileri. (D, E) GSE47908 doğrulama kohortundaki biyobelirteç ekspresyonu ve alıcı işletim karakteristiği eğrileri. ROC: alıcı işletim karakteristiği; AUC: eğri altındaki alan; UC: ülseratif kolit. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Öngörücü model değerlendirmesi için nomogram diyagramı, kalibrasyon eğrisi ve ROC analizi.
Şekil 3: UC nomogramının geliştirilmesi ve değerlendirilmesi. (A) Beş genli nomogram. (B) Kalibrasyon grafiği. (C) Alıcı işletim karakteristik eğrisi. ROC: receiver operating characteristic; UC: ülseratif kolit; AUC: eğri altındaki alan; C-index: konkordans indeksi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Gen seti zenginleştirme analizi grafikleri; sıralamalar ile zenginleştirme skorları; karşılaştırmalı veri setleri.
Şekil 4: Beş aday biyobelirtecin gen seti zenginleştirme analizi. (A–E) Sırasıyla LCN2, IDO1, CXCL2, NOS2 ve CD274 için gen seti zenginleştirme analizi sonuçları. GSEA: gen seti zenginleştirme analizi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

İmmün mikroçevre manzarası ve düzenleyici ağ analizi

UC örnekleri; nötrofillerin, aktiveye memory CD4⁺ T hücrelerinin, M1 makrofajların ve aktive mast hücrelerinin oranlarında artış, buna karşılık M2 makrofajların, dinlenme halindeki mast hücrelerin ve dinlenme halindeki dendritik hücrelerin oranlarında azalma göstermiştir. Bu paternler doğrulama kohortunda da tekrarlanmıştır (Şekil 5A–E).

Beş aday; nötrofiller, aktive olmuş hafıza CD4⁺ T hücreleri ve M1 makrofajlar ile pozitif, dinlenme halindeki mast hücreleri ve M2 makrofajlar ile ise ters korelasyon gösterdi (Şekil 5F–J). Gen miRNA ağı 98 düğüm ve 146 kenar içeriyordu. hsa-miR-34a-5p ve hsa-miR-16-5p en yüksek biyobelirteç bağlantısallığını gösterirken, AR ve RELA en bağlantılı transkripsiyon faktörleriydi (Şekil 6).

İmmün hücre kompozisyonu ve korelasyon ısı haritaları; gen ekspresyon verilerini görselleştiren analiz grafikleri.
Şekil 5: İmmün infiltrasyon analizi. (A) İmmün hücre kompozisyonu. (B) İmmün hücre oranlarındaki gruplar arası farklar. (C) İmmün hücre korelasyon ısı haritası. (D, E) Eğitim ve doğrulama kohortlarındaki immün hücre infiltrasyonu. (F–J) Aday biyobelirteçler ile immün hücre popülasyonları arasındaki korelasyonlar. UC: ülseratif kolit. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Gen ağı etkileşim diyagramı; protein etkileşimlerini ve düzenleyici yolak analizlerini vurgular.
Şekil 6: Öngörülen miRNA ve transkripsiyon faktörü ağları. (A) Gen–miRNA ağı. Daireler aday biyobelirteçleri, kareler ise miRNA'ları göstermektedir. (B) Transkripsiyon faktörü–gen ağı. Baklava dilimleri aday biyobelirteçleri, ters üçgenler ise transkripsiyon faktörlerini göstermektedir. miRNA: mikroRNA; TF: transkripsiyon faktörü. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tek hücre çözünürlüğünde spatiotemporal ekspresyon dinamikleri

Kalite kontrolünden sonra, 31.712 hücre, dokuz ana hücre popülasyonu olarak tanımlanan 22 küme oluşturmuştur (Şekil 7A–C). Epitel ve plazma hücresi oranları UC grubunda daha yüksekti. Epitel hücrelerinde LCN2 ve NOS2 zenginleşmişken, miyeloid hücrelerde IDO1, CXCL2 ve CD274 zenginleşmişti (Şekil 7D–G).

Epitel hücre alt kümeleme analizi 11 alt küme belirlemiş olup, bu alt kümede inflamatuar kolonositlerin genişlediği ve LCN2 ile NOS2'nin zenginleştiği görülmüştür (Şekil 8). Miyeloid hücre alt kümeleme analizi ise yedi alt küme belirlemiş olup, monositlerin arttığı, makrofajların azaldığı ve monositlerde IDO1, CXCL2 ve CD274'ün zenginleştiği tespit edilmiştir (Şekil 9).

İnflamatuar kolonositler, artan LCN2 ve NOS2 ekspresyonu ile epitelial yörüngenin geç evrelerinde birikmiştir (Şekil 10). Monositler; IDO1, CXCL2 ve CD274'ün dinamik ekspresyonu ile belirgin bir UC ile ilişkili yörünge sergilemiştir (Şekil 11).

İnflamatuar kolonositler en güçlü dışa dönük sinyalleşmeyi ve monositlerle belirgin bir iletişimi göstermiştir. APP–CD74, bu alt kümeler arasındaki baskın ligand-reseptör çiftiydi (Şekil 12).

Örneklerdeki hücre tipi dağılımını ve gen ekspresyonunu gösteren UMAP kümeleme diyagramı ve nokta grafiği.
Şekil 7: Hücre popülasyonları genelindeki aday biyobelirteç ekspresyonu. (A) Hücre kümeleri. (B) Anotasyon belirteçleri. (C) Anote edilmiş dokuz hücre popülasyonu. (D, E) Sağlıklı ve UC örneklerindeki hücre dağılımları ve oranları. (F, G) UMAP ve balon grafiği ile görselleştirilmiş aday biyobelirteç ekspresyonu. UC: ülseratif kolit; UMAP: uniform manifold approximation and projection. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Epitel hücre tiplerinin t-SNE kümelemesi ve analizi; veri modellerini gösteren grafik ve ısı haritası.
Şekil 8: Epitel hücre alt kümelemesi ve aday ekspresyonu. (A) Başlangıç epitel hücre kümeleri. (B) Notasyon markörleri. (C) Notasyonlanmış epitel hücre alt kümeleri. (D) Sağlıklı ve UC örneklerindeki alt küme oranları. (E) Epitel hücre alt kümelerinde LCN2 ve NOS2 ekspresyonu. t-SNE: t-distributed stochastic neighbor embedding; UC: ülseratif kolit. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Miyeloid kümelerin t-SNE küme analizi ve sütun grafiği; immün ekspresyon; tek hücreli RNA sekanslama.
Şekil 9: Miyeloid hücre alt kümelemesi ve aday ekspresyonu. (A) Başlangıç miyeloid hücre kümeleri. (B) Annotasyon markerları. (C) Annote edilmiş miyeloid hücre alt kümeleri. (D) Sağlıklı ve UC örneklerindeki alt küme oranları. (E) Miyeloid hücre alt kümeleri genelinde IDO1, CXCL2 ve CD274 ekspresyonu. t-SNE: t-distributed stochastic neighbor embedding; UC: ülseratif kolit. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Bileşen eşlemesini ve psödozaman analiz grafiklerini gösteren boyut indirgeme ve kümeleme sonuçları.
Şekil 10: Epitel hücre psödozaman analizi. (A) Psödozaman yörüngesi ve durum atamaları. (B) Sağlıklı ve UC epitel hücrelerinin yörünge boyunca dağılımı. (C) Psödozaman boyunca LCN2 ve NOS2 ekspresyon dinamikleri. UC: ülseratif kolit. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Spektral uyum grafiği; bileşen ilişkilerinin veri analizi; küresel analiz uyum sonuçları.
Şekil 11: Miyeloid hücre psödozaman analizi. (A) Psödozaman yörüngesi ve durum atamaları. (B) Sağlıklı ve UC miyeloid hücrelerinin yörünge boyunca dağılımı. (C) IDO1, CXCL2 ve CD274 ekspresyon dinamiklerinin psödozaman boyunca seyri. UC: ülseratif kolit. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Protein etkileşim ağları ve etkileşim gücü; veri sonuçları saçılım ve ısı haritası grafiklerinde verilmiştir.
Şekil 12: Epitel–miyeloid iletişimi. (A) Etkileşim sayısı ve gücü. (B) Giden ve gelen sinyalizasyon güçleri. (C) İnflamatuar kolonositleri içeren etkileşimler. (D) İletişim gücü ısı haritası. (E) İnflamatuar kolonositleri içeren ligand–reseptör çiftleri. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

In vitro ferroptozis ve kuproptozis müdahalelerinin deneysel doğrulaması

Lipopolisakkarit (LPS) maruziyeti, araç kontrolüne kıyasla Caco-2 hücre canlılığını azaltmış ve IL-6 ile IL-1β ekspresyonunu artırmıştır (Şekil 13A–C ve Ek Şekil 5).

LPS; Fe2⁺, malondialdehit ile LCN2, IDO1, CXCL2 ve NOS2 haberci RNA bolluğunu artırırken, ferrostatin-1 LPS ile ilişkili her bir değişikliği tersine çevirmiştir (Şekil 13D–I). LPS ile LPS + ferrostatin-1 karşılaştırmaları için, her biyolojik tekrar içindeki teknik tekrarların ortalaması alındıktan sonra kesin iki yönlü P değerleri 9,45 × 10⁻5 ile 0,0027 arasında değişmiştir.

LPS canlılığı azaltmış; IL-6, IL-1β, FDX1/DLAT, CD274 ve bakıra duyarlı floresansı artırmışken, tetratiyomolibdat bu değişiklikleri tersine çevirmiştir (Şekil 14 A–E). LPS ile LPS + tetratiyomolibdat karşılaştırmaları için kesin çift yönlü P değerleri < 1 × 10⁻15 ile 0,0008 arasında değişmiştir.

Analizler hep birlikte, UC ile ilişkili beş tanısal aday belirlemiş, bunların ekspresyonlarının epitelyal ve miyeloid popülasyonlarda yerelleştiğini saptamış ve Caco-2 hücrelerinde LCN2, IDO1, CXCL2 ve NOS2'nin ferroptoz inhibisyonuna, CD274'ün ise bakır şelasyonuna yanıt verdiğini göstermiştir.

Kontrol, LPS ve LPS+Fer tedavilerini karşılaştıran hücre canlılığı ve mRNA ekspresyon diyagramları.
Şekil 13: Ferrostatin-1, Caco-2 hücrelerinde LPS ile ilişkili inflamatuar ve ferroptozla ilgili değişiklikleri hafifletir. (A) Hücre canlılığı. (B, C) IL-6 ve IL-1β haberci RNA ekspresyonu. (D, E) Hücre içi malondialdehit ve Fe2⁺ seviyeleri. (F–I) LCN2, IDO1, CXCL2 ve NOS2 haberci RNA ekspresyonu. Teknik triplikatlar, her bağımsız biyolojik replika içinde ortalaması alınmıştır; hata çubukları standart sapmayı göstermektedir. Mevcut biyolojik replika sayıları A ve C'de Kontrol n = 4, F'de Kontrol n = 2 ve diğer tüm panel/grup kombinasyonları için n = 6'dır. Kesin iki yönlü P değerleri ve varsayım kontrolleri Ek Tablo 5'te bildirilmiştir. Fer-1: ferrostatin-1; LPS: lipopolisakkarit; MDA: malondialdehit. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Hücre canlılığı ve mRNA ekspresyonu sütun grafikleri; bakır prob dağılımını gösteren mikroskopi.
Şekil 14: Tetratiyomolibdat, Caco-2 hücrelerinde LPS ile ilişkili inflamatuar ve kuproptozla ilgili değişiklikleri hafifletir. (A) Hücre canlılığı. (B, C) IL-6 ve IL-1β haberci RNA ekspresyonu. (D) FDX1 ve DLAT haberci RNA ekspresyonu. (E) CD274 haberci RNA ekspresyonu. (F) Hücre içi Cu2⁺ floresansı; ölçek çubuğu = 50 µm. Grup başına altı bağımsız biyolojik tekrardan her birinde teknik triplikaların ortalaması alınmıştır; hata çubukları standart sapmayı göstermektedir. Kesin iki taraflı P değerleri ve varsayım kontrolleri Ek Tablo 5'te bildirilmiştir. TTM: tetratiyomolibdat; LPS: lipopolisakkarit. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Ham ve işlenmiş veriler, analiz betikleri ve hücre deneyi kaynak tablolarına https://doi.org/10.5281/zenodo.21202720 adresinden açıkça erişilebilir.

Ek Şekil 1: Veri ön işleme ve diferansiyel ekspresyon tanıları. (A–F) Parti düzeltmesi öncesi (A–C) ve sonrası (D–F) örnek dağılımları. (G) Diferansiyel olarak eksprese edilen genlerin yanardağ grafiği. (H) Normalize edilmiş ekspresyon paternlerinin ısı haritası. DEGs: diferansiyel olarak eksprese edilen genler; GEO: Gene Expression Omnibus.Lütfen bu dosyayı indirmek için buraya tıklayın.

Ek Şekil 2: CF-DEG'lerin zenginleştirme analizi. (A) Gen Ontolojisi zenginleştirmesi. (B) Genler ve Genomlar Kyoto Ansiklopedisi zenginleştirmesi. CF-DEGs: kuproptozis-ferroptozis ortak ifade edilen farklı ifade edilen genler; GO: Gen Ontolojisi; KEGG: Genler ve Genomlar Kyoto Ansiklopedisi.Lütfen bu dosyayı indirmek için buraya tıklayın.

Ek Şekil 3: WGCNA tarama tanıları. (A) Yumuşak eşik seçimi. (B) Modül-eigengene kümelemesi. (C) Gen-modül dendrogramı. (D) Modül-özellik ilişkileri. (E–G) Mor, kahverengi ve siyah modüller için gen anlamlılığı/modül üyeliği ilişkileri. WGCNA: ağırlıklı gen ko-ekspresyon ağ analizi; UC: ülseratif kolit.Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil 4: Çok aşamalı biyobelirteç taraması. (A, B) LASSO özellik seçimi. (C, D) SVM-RFE özellik seçimi. (E, F) Random-forest özellik sıralaması. (G) Üç model arasındaki konsensüs. (H, I) PPI ağı ve CytoHubba çekirdek düğümleri. (J) Makine öğrenimi, WGCNA ve PPI sonuçlarının entegrasyonu. (K) Beş adayın kromozomal konumları. LASSO: en küçük mutlak daralma ve seçim operatörü; SVM-RFE: destek vektör makinesi–özyinelemeli özellik eleme; RF: rastgele orman; PPI: protein–protein etkileşimi; WGCNA: ağırlıklı gen eş-ekspresyon ağ analizi.Lütfen bu dosyayı indirmek için buraya tıklayın.

Ek Şekil 5: Caco-2 hücrelerinde LPS model doğrulaması. (A) Hücre canlılığı. (B, C) IL-6 ve IL-1β haberci RNA ekspresyonu. Grup başına altı bağımsız biyolojik tekrarda teknik triplikelerin ortalaması alınmıştır; hata çubukları standart sapmayı göstermektedir. LPS: lipopolisakkarit.Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Tablo 1: Keşif ve doğrulama için kullanılan GEO veri setleri. Keşif ve doğrulama analizlerine dahil edilen GEO veri setleri için veri seti erişim numaraları, platformlar, örnek kompozisyonu ve kohort atamaları. GEO: Gene Expression Omnibus.Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayınız.

Ek Tablo 2: Ters transkripsiyon kantitatif PCR primer dizileri. Bu çalışmada değerlendirilen genlerin ters transkripsiyon kantitatif PCR analizi için kullanılan primer dizileri.Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayınız.

Ek Tablo 3: Şekil 13, 14 ve Ek Şekil 1 için istatistiksel ayrıntılar. Belirtilen deneysel karşılaştırmalar için biyolojik tekrarlama sayıları, varsayım kontrolleri, istatistiksel analiz yöntemleri ve kesin P değerleri.Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Tablo 4: Kuproptozis–ferroptozis ortak eksprese edilen diferansiyel eksprese olan genler. Ferroptozis–kuproptozis ile ilişkili genlerin, diferansiyel eksprese olan genlerle kesiştirilmesiyle belirlenen CF-DEG listesi.Lütfen bu dosyayı indirmek için buraya tıklayın.

Ek Tablo 5: Biyobelirteç taraması için seçilen WGCNA modüllerindeki genler. Sonraki biyobelirteç taraması için seçilen WGCNA modüllerinde yer alan genlerin listesi. WGCNA: ağırlıklı gen eş-ifade ağ analizi.Lütfen bu dosyayı indirmek için buraya tıklayın.

Tartışma

Bu çalışma, UC'deki ferroptozis–kuproptozis etkileşimini incelemek için toplu transkriptomik, makine öğrenimi, tek hücre analizi ve hedefli hücre deneylerini entegre etmiştir. UC ile ilişkili beş tanısal aday, keşif ve doğrulama kohortları genelinde tekrarlanabilir bulunmuş, temel olarak epitelyal ve miyeloid kompartmanlarda lokalize olmuş ve Caco-2 hücrelerinde yolak inhibisyonuna yanıt veren bir ekspresyon sergilemiştir. Bu bulgular, beş genin ferroptozis veya kuproptozisin yerleşik üst akış düzenleyicileri olduğu yönündeki güçlü iddiadan kaçınırken, hesaplamalı önceliklendirmenin odaklanmış biyolojik doğrulamaya rehberlik ettiği aşamalı bir iş akışını desteklemektedir.

CF-DEG'ler; lipopolisakkarit yanıtları, bakır yönetimi, lipid transportu, NF-κB/TNF sinyalleşmesi ve ferroptoz açısından zenginleşmiş olup, metal bağımlı oksidatif stres ile mukozal inflamasyon arasında tutarlı bir bağlantı sağlamıştır10,19.

Beş aday, birbirini tamamlayıcı inflamatuar ve metal stresi bağlamlarını temsil etmektedir. LCN2; demir sekestrasyonu, mikrobiyal disbiyoz ve LCN2–ALOX15 ferroptoz ekseni ile ilişkilidir20,21,22,23; IDO1; triptofan metabolizması, mukozal inflamasyon ve bozulmuş demir yönetimi ile bağlantılıdır24,25,26; CXCL2 ise IL-17/IL-22 sinyalleri, nötrofil göçü ve lipid peroksidasyonu ile ilişkilidir27,28,29,30. NOS2, bağlama bağlı etkiler göstermekle birlikte, aşırı indüklendiğinde oksidatif hasarı ve ferroptoz duyarlılığını artırabilir31,32,33,34,35,36. CD274, FDX1 ve bakır-iyonofor duyarlılığı ile olan ilişkisi, yerleşik bir yolak kontrolünden ziyade kuproptoz yanıtlılığına işaret eden immün-regülatör bir epitelyal belirteçtir37,38,39. İnhibitör deneyleri bu sınıflandırmalarla uyumluydu: ferrostatin-1; LCN2, IDO1, CXCL2 ve NOS2'yi azaltırken, tetrathiomolybdate ise CD274'ü azaltmıştır.

İmmün analiz, aday imzayı; sitokinler, reaktif oksijen türleri ve bariyer bozucu sinyaller aracılığıyla epitelyal hasarı sürdürebilen M1 makrofajlar, nötrofiller, aktive olmuş bellek CD4⁺ T hücreleri ve aktive olmuş mast hücreleri ile ilişkilendirmiştir40,41,42,43,44. RELA, hsa-miR-34a-5p ve hsa-miR-16-5p olası üst düzenleyiciler olarak ortaya çıkarken, UC'de doğrudan androjen reseptörü rolüne ilişkin kanıtlar sınırlı kalmıştır45,46,47,48,49,50. Bu bulgular, doğrudan düzenleme kanıtı olarak değil, gelecekteki pertürbasyon deneyleri için ağ düzeyinde hipotezler olarak değerlendirilmelidir.

Tek hücre analizi, LCN2 ve NOS2'nin inflamatuar kolonositlerde; IDO1, CXCL2 ve CD274'ün ise monosit açısından zengin miyeloid popülasyonlarda lokalize olduğunu göstermiştir. İnflamatuar kolonositlerin, APP–CD74'ün önde gelen epitelyal-miyeloid ligand-reseptör çiftleri arasında olduğu bir iletişim merkezi olarak görev yapacağı öngörülmüştür51,52,53,54,55,56. Bu hücre tipi çözünürlüğü, beş adayın test edilmesi gereken biyolojik bağlamı daraltmakta ve bir sonraki deneysel adım olarak ko-kültür veya organoid-immün hücre sistemlerini desteklemektedir.

Yorumlamayı kısıtlayan birkaç sınırlama mevcuttur. Caco-2, kolorektal adenokarsinom hücre hattıdır ve nonmalign kolon epitelyumunu, hasta heterojenitesini, stromal-immün etkileşimleri veya kronik ülseratif koliti (UK) tam olarak yansıtmamaktadır; bu nedenle, primer intestinal epitelyal hücrelerde, hasta kaynaklı organoidlerde, ko-kültür sistemlerinde ve in vivo kolit modellerine ihtiyaç vardır. Arşivlenen Şekil 13 kaynak hesap tablosunda ayrıca A, C ve F panellerindeki bazı kontrol tekrar kayıtları eksikti; bu durum söz konusu karşılaştırmaların hassasiyetini azaltmıştır; mevcut tüm tekrar sayıları ve kesin P değerler şurada açıklanmıştır Ek Tablo 5Son olarak; yaş, cinsiyet, tedavi maruziyeti ve diğer klinik kovaryantlar halka açık kohortlar genelinde tek tip olarak mevcut değildi. Tanısal faydayı ve nedensel rolleri belirlemek için prospektif çok merkezli kohortlara ve beş adayın doğrudan perturbasyonuna ihtiyaç duyulacaktır. Bu sınırlamalar dahilinde çalışma; metal bağımlı hücre ölümü, epitelyal miyeloid iletişim ve ÜK arasında bağlantı kuran, şeffaf ve deneysel olarak temellendirilmiş bir hipotezler seti sunmaktadır. Prostat kanserinde yürütülen benzer ağ farmakolojisi araştırmaları, hesaplamalı hedef önceliklendirmenin hipotez üretme değerini göstermektedir ancak ÜK'ye özgü bir doğrulama teşkil etmemektedir.57Benzer şekilde, osteoartrit ve kemik dejenerasyonunda ferroptozis üzerine yapılan güncel tartışmalar, ferroptozis modülasyonuna yönelik daha geniş terapötik ilgiyi yansıtmaktadır; ancak hastalığa özgü mekanizmalar doğrudan ülseratif kolite (UC) ekstrapole edilemez.58Bu nedenle, biyoinformatik ilişkilendirmeleri abartmadan güçlendirmek amacıyla dış kohort doğrulaması ve inhibitör deneyleri kullanılmıştır.

Açıklamalar

Yazarların beyan edecek herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

Bu çalışma, Ulusal Geleneksel Çin Tıbbı İdaresi'nin Genç Qihuang Bilim İnsanı Projesi (Hibe No. 2022256) tarafından desteklenmiştir. Teknik destek ile veri kürasyonu ve biyoinformatik analizlerine katkıları için Liaoning Geleneksel Çin Tıbbı Üniversitesi ve Liaoning Geleneksel Çin Tıbbı Üniversitesi Üçüncü Bağlı Hastanesi'ndeki tüm araştırma ekibi üyelerine teşekkür edilir.

OpenAI Codex (OpenAI), revizyon sırasında yalnızca İngilizce dil düzenleme, belge biçimlendirme ve şekil kalitesi kontrollerine yardımcı olmak amacıyla kullanılmıştır. Tüm bilimsel içerik, analizler, atıflar ve nihai sunum, taslak metnin tüm sorumluluğunu üstlenen yazarlar tarafından incelenmiş ve doğrulanmıştır.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
BCA Protein Assay KitBeyotime Institute of BiotechnologyP0010Normalizasyon için protein nicelleştirmesi.
Bioinformatics.com.cnBioinformatics.com.cnÇevrimiçi platform; 2026'da erişildiGO/KEGG görselleştirme ve analiz platformu.
Caco-2 hücre hattıATCCHTB-37Epitelyal hasar modeli için kullanılan insan kolorektal adenokarsinom hücre hattı.
Cell Counting Kit-8GLPBioGK10001450 nm'de ölçülen hücre canlılık analizi.
LM22 imzalı CIBERSORTCIBERSORT geliştiricileriLM2222 immün hücre fraksiyonunun dekonvolüsyonu.
ChEA3Ma'ayan LaboratoryÇevrimiçi platform; 2026'da erişildiTranskripsiyon faktörü zenginleştirme ve regülatör ağ tahmini.
CO2 inkübatörüKaydedilmediN/A37 °C ve %5 CO2'de kültür için kullanılan nemlendirilmiş inkübatör.
Cu2+  floresan probuBIOFOUNTCAS 98907-26-7Hücre içi Cu2+  floresans tespiti.
CytoHubba ile CytoscapeCytoscape ConsortiumVersiyon kaydedilmediPPI görselleştirme ve çekirdek düğüm sıralaması.
Dulbecco modifiye Eagle ortamıGibco11965092Caco-2 hücre kültür ortamı.
Dimetil sülfoksitKaydedilmediN/AAraç kontrolü.
Fetal sığır serumuKaydedilmediN/A%10 oranında ortam takviyesi.
Fe2+  Analiz KitiAbcamab83366Hücre içi Fe2+ ölçümü.
FerrDBFerrDB geliştiricileriÇevrimiçi veri tabanı; 2026'da erişildiFerroptozla ilişkili genlerin kaynağı.
Ferrostatin-1Sigma-AldrichSML0583Ferroptoz inhibitörü; final konsantrasyonu 4 µM.
HarmonyBroad Institute/toplulukVersiyon kaydedilmediTek hücreli batch düzeltmesi.
Ters floresan mikroskobuOlympusIX71510/578 nm eksitasyon/emisyon'da Cu2+ floresan görüntüleme.
LipopolisakkaritKaydedilmediN/A24 sa boyunca 1 µg/mL oranında inflamatuar hasar stimulusu.
Malondialdehit Analiz KitiBeyotime Institute of BiotechnologyS0131SLipid peroksidasyonunun ölçümü.
Mikroplaka okuyucuKaydedilmediN/A450 nm'de absorbans ölçümü.
MonocleBioconductor/toplulukVersiyon 2Tek hücreli psödozaman analizi.
Molecular Signatures DatabaseBroad Institutec2.cp.kegg_medicus.v2025.1.HsGSEA için referans gen seti.
NetworkAnalystNetworkAnalyst geliştiricileriÇevrimiçi platform; 2026'da erişildiTranskripsiyon faktörü ve miRNA ağlarının entegrasyonu.
Penisilin–streptomisinKaydedilmediN/A100 U/mL penisilin ve 100 µg/mL streptomisin.
RR Foundation for Statistical ComputingVersiyon kaydedilmediBiyoenformatik analiz ortamı.
R paket setiCRAN/BioconductorPaket sürümleri kaydedilmedilimma, WGCNA, clusterProfiler, glmnet, randomForest, e1071, pROC ve rms iş akışları.
Real-time PCR sistemiKaydedilmediN/ASYBR Green RT-qPCR cihazı.
RevertAid First Strand cDNA Synthesis KitThermo Fisher ScientificK16221 µg RNA'dan birinci zincir cDNA sentezi.
SangerboxSangerbox geliştiricileri3.0Normalizasyon ve ComBat batch düzeltmesi.
SeuratSatija Lab/toplulukVersiyon 4Tek hücreli kalite kontrol, normalizasyon, kümeleme ve görselleştirme.
İstatistiksel analiz yazılımıKaydedilmediN/AOrijinal hücre deneylerinin istatistiksel analizi.
STRINGSTRING ConsortiumÇevrimiçi veri tabanı; 2026'da erişildiProtein–protein etkileşim ağı oluşturma.
SYBR Green real-time PCR reaktifleriTakaraRR820AKantitatif real-time PCR.
TarBaseDIANA Tools9.0Deneysel olarak desteklenen miRNA–gen etkileşimleri.
TetratiyomolibdatSigma-Aldrich323446Bakır şelatörü; final konsantrasyonu 40 µM.
TRIzol reaktifiTakara9108Toplam RNA ekstraksiyonu.

Kaynaklar

  1. Fu M, Wang QW, Liu YR, Chen SJ. The role of the three major intestinal barriers in ulcerative colitis in the elderly. Ageing Res Rev. 2025;108:102752. https://doi.org/10.1016/j.arr.2025.102752.
  2. Le Berre C, Honap S, Peyrin-Biroulet L. Ulcerative colitis. Lancet. 2023;402:571–584.
  3. Wangchuk P, Yeshi K, Loukas A. Ulcerative colitis: Clinical biomarkers, therapeutic targets, and emerging treatments. Trends Pharmacol Sci. 2024;45:892–903.
  4. Kobayashi T, et al. Ulcerative colitis (primer). Nat Rev Dis Primers. 2020;6:74. https://doi.org/10.1038/s41572-020-0205-x.
  5. Huang J, et al. Comprehensive analysis of cuproptosis-related genes in immune infiltration and diagnosis in ulcerative colitis. Front Immunol. 2022;13:1008146. https://doi.org/10.3389/fimmu.2022.1008146.
  6. Liu Y, et al. Development and experimental validation of machine learning-based disulfidptosis-related ferroptosis biomarkers in inflammatory bowel disease. Genes. 2025;16:496. https://doi.org/10.3390/genes16050496.
  7. Hu W, et al. HIF-1α alleviates ferroptosis in ulcerative colitis by regulation of GPX4. Cell Death Dis. 2025;16:542. https://doi.org/10.1038/s41419-025-07883-8.
  8. Zhao C, et al. FXR acts as a therapeutic target for ulcerative colitis via suppressing ferroptosis. Mol Med. 2025;31:258. https://doi.org/10.1186/s10020-025-01305-3.
  9. Tsvetkov P, et al. Copper induces cell death by targeting lipoylated TCA cycle proteins. Science. 2022;375:1254–1261.
  10. Liu J, et al. Unveiling the cuproptosis in colitis and colitis-related carcinogenesis: A multifaceted player and immune moderator. Research (Wash D C). 2025;8:0698. https://doi.org/10.34133/research.0698.
  11. Liu N, Chen M. Crosstalk between ferroptosis and cuproptosis: From mechanism to potential clinical application. Biomed Pharmacother. 2024;171:116115. https://doi.org/10.1016/j.biopha.2023.116115.
  12. Hao S, et al. Development of prognostic model incorporating a ferroptosis/cuproptosis-related signature and mutational landscape analysis in muscle-invasive bladder cancer. BMC Cancer. 2024;24:958. https://doi.org/10.1186/s12885-024-12716-1.
  13. Wang Z, et al. Exosomes secreted by macrophages upon copper ion stimulation can promote angiogenesis. Mater Sci Eng C Mater Biol Appl. 2021;123:111981. https://doi.org/10.1016/j.msec.2021.111981.
  14. Zou M, Zhang W, Zhu Y, Xu Y. Identification of 6 cuproptosis-related genes for active ulcerative colitis with both diagnostic and therapeutic values. Medicine (Baltimore). 2023;102:e35503. https://doi.org/10.1097/MD.0000000000035503.
  15. Chen W, Miao J, Chen J, Chen J. Development of machine learning models for diagnostic biomarker identification and immune cell infiltration analysis in PCOS. J Ovarian Res. 2025;18:1. https://doi.org/10.1186/s13048-024-01582-8.
  16. Lv JH, et al. WGCNA combined with machine learning to find potential biomarkers of liver cancer. Medicine (Baltimore). 2023;102:e36536. https://doi.org/10.1097/MD.0000000000036536.
  17. Wu Q, Yang C, Huang C, Lin Z. Screening key genes for intracranial aneurysm rupture using LASSO regression and the SVM-RFE algorithm. Front Med. 2025;11:1487224. https://doi.org/10.3389/fmed.2024.1487224.
  18. Tang D, Pu B, Liu S, Li H. Identification of cuproptosis-associated subtypes and signature genes for diagnosis and risk prediction of ulcerative colitis based on machine learning. Front Immunol. 2023;14:1142215. https://doi.org/10.3389/fimmu.2023.1142215.
  19. Yang C, et al. Identification of cuproptosis hub genes contributing to the immune microenvironment in ulcerative colitis using bioinformatic analysis and experimental verification. Front Immunol. 2023;14:1113385. https://doi.org/10.3389/fimmu.2023.1113385.
  20. Yadav SK, et al. Fecal Lcn-2 level is a sensitive biological indicator for gut dysbiosis and intestinal inflammation in multiple sclerosis. Front Immunol. 2022;13:1015372. https://doi.org/10.3389/fimmu.2022.1015372.
  21. Luo Q, et al. Bioinformatics analysis reveals potential crosstalk genes and molecular mechanisms between ulcerative colitis and psoriasis. Arch Dermatol Res. 2024;317:118. https://doi.org/10.1007/s00403-024-02856-1.
  22. Nielsen OH, et al. Rectal dialysate and fecal concentrations of neutrophil gelatinase-associated lipocalin, interleukin-8, and tumor necrosis factor-alpha in ulcerative colitis. Am J Gastroenterol. 1999;94:2923–2928.
  23. Sun Y, et al. Natural polyphenol rutin inhibits ferroptosis in ulcerative colitis by regulating lipid metabolism via blocking the LCN2-ALOX15 axis. Food Funct. 2025;16:7169–7186.
  24. Sofia MA, et al. Tryptophan metabolism through the kynurenine pathway is associated with endoscopic inflammation in ulcerative colitis. Inflamm Bowel Dis. 2018;24:1471–1480.
  25. Shon WJ, et al. Severity of DSS-induced colitis is reduced in Ido1-deficient mice with down-regulation of TLR-MyD88-NF-kB transcriptional networks. Sci Rep. 2015;5:17305. https://doi.org/10.1038/srep17305.
  26. Zeng T, et al. Indoleamine 2, 3-dioxygenase 1 enhances hepatocytes ferroptosis in acute immune hepatitis associated with excess nitrative stress. Free Radic Biol Med. 2020;152:668–679.
  27. Pavlidis P, et al. Interleukin-22 regulates neutrophil recruitment in ulcerative colitis and is associated with resistance to ustekinumab therapy. Nat Commun. 2022;13:5820. https://doi.org/10.1038/s41467-022-33333-3.
  28. Urzua U, et al. The ovarian transcriptome of reproductively aged multiparous mice: Candidate genes for ovarian cancer protection. Biomolecules. 2020;10:113. https://doi.org/10.3390/biom10010113.
  29. Zahn A, et al. Transcript levels of different cytokines and chemokines correlate with clinical and endoscopic activity in ulcerative colitis. BMC Gastroenterol. 2009;9:13. https://doi.org/10.1186/1471-230X-9-13.
  30. Yi Q, et al. Application of genomic selection and experimental techniques to predict cell death and immunotherapeutic efficacy of ferroptosis-related CXCL2 in hepatocellular carcinoma. Front Oncol. 2022;12:998736. https://doi.org/10.3389/fonc.2022.998736.
  31. Kolios G, Valatas V, Ward SG. Nitric oxide in inflammatory bowel disease: A universal messenger in an unsolved puzzle. Immunology. 2004;113:427–437.
  32. Cheng F, et al. Identification of differential intestinal mucosa transcriptomic biomarkers for ulcerative colitis by bioinformatics analysis. Dis Markers. 2020;2020:8876565. https://doi.org/10.1155/2020/8876565.
  33. Tratensek A, et al. Oxidative stress-related biomarkers as promising indicators of inflammatory bowel disease activity: A systematic review and meta-analysis. Redox Biol. 2024;77:103380. https://doi.org/10.1016/j.redox.2024.103380.
  34. Zhang JL, et al. Jatrorrhizine alleviates ulcerative colitis via regulating gut microbiota and NOS2 expression. Gut Pathog. 2022;14:41. https://doi.org/10.1186/s13099-022-00516-7.
  35. Li H, et al. Development of a prognostic model based on ferroptosis-related genes for colorectal cancer patients and exploration of the biological functions of NOS2 in vivo and in vitro. Front Oncol. 2023;13:1133946. https://doi.org/10.3389/fonc.2023.1133946.
  36. Seibt TM, Proneth B, Conrad M. Role of GPX4 in ferroptosis and its pharmacological implication. Free Radic Biol Med. 2019;133:144–152.
  37. Holland T, Mattner J. Intestinal eosinophils: Characterization of elusive granulocytes as anti-bacterial and immunomodulatory effector cells in colitis. Signal Transduct Target Ther. 2023;8:321. https://doi.org/10.1038/s41392-023-01588-4.
  38. Nguyen J, et al. Overexpression of programmed death ligand 1 in refractory inflammatory bowel disease. Hum Pathol. 2022;126:19–27.
  39. Shen Z, et al. Exploration of a screening model for intrahepatic cholangiocarcinoma patients prone to cuproptosis and mechanisms of the susceptibility of CD274-knockdown intrahepatic cholangiocarcinoma cells to cuproptosis. Cancer Gene Ther. 2023;30:1663–1678.
  40. Niu Y, et al. Platelet activation stimulates macrophages to enhance ulcerative colitis through PF4/CXCR3 signaling. Int J Mol Med. 2025;55:78. https://doi.org/10.3892/ijmm.2025.5499.
  41. Qu F, et al. The role of macrophage polarization in ulcerative colitis and its treatment. Microb Pathog. 2025;199:107227. https://doi.org/10.1016/j.micpath.2025.107227.
  42. Danne C, Skerniskyte J, Marteyn B, Sokol H. Neutrophils: From IBD to the gut microbiota. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 2024;21:184–197.
  43. Zhao Q, et al. CD4+ T cell activation and concomitant mTOR metabolic inhibition can ablate microbiota-specific memory cells and prevent colitis. Sci Immunol. 2020;5:eabc6373. https://doi.org/10.1126/sciimmunol.abc6373.
  44. Chen E, et al. Inflamed ulcerative colitis regions associated with MRGPRX2-mediated mast cell degranulation and cell activation modules, defining a new therapeutic target. Gastroenterology. 2021;160:1709–1724.
  45. Xu H, Wu C, Wang D, Wang H. Alleviating effect of Nexrutine on mucosal inflammation in mice with ulcerative colitis: Involvement of the RELA suppression. Immun Inflamm Dis. 2024;12:e1147. https://doi.org/10.1002/iid3.1147.
  46. Luo Y, et al. Rab27A promotes cellular apoptosis and ROS production by regulating the miRNA-124-3p/STAT3/RelA signalling pathway in ulcerative colitis. J Cell Mol Med. 2020;24:11330–11342.
  47. Pace F, Watnick PI. The interplay of sex steroids, the immune response, and the intestinal microbiota. Trends Microbiol. 2021;29:849–859.
  48. Rodriguez J, Olivares M, Delzenne NM. Implication of the gut microbiota in metabolic inflammation associated with nutritional disorders and obesity. Mol Nutr Food Res. 2021;65:e1900481. https://doi.org/10.1002/mnfr.201900481.
  49. Ojha R, et al. Emerging role of circulating microRNA in the diagnosis of human infectious diseases. J Cell Physiol. 2019;234:1030–1043.
  50. Tian Y, et al. LncRNA CDKN2B-AS1 relieved inflammation of ulcerative colitis via sponging miR-16 and miR-195. Int Immunopharmacol. 2020;88:106970. https://doi.org/10.1016/j.intimp.2020.106970.
  51. Kulkarni N, Pathak M, Lal G. Role of chemokine receptors and intestinal epithelial cells in the mucosal inflammation and tolerance. J Leukoc Biol. 2017;101:377–394.
  52. Stadnyk AW. Intestinal epithelial cells as a source of inflammatory cytokines and chemokines. Can J Gastroenterol. 2002;16:241–246.
  53. Xu Y, Chen N. DUOX2-mediated innate immune hyperactivation drives macrophage M1 polarization via the APP-CD74 axis in inflammatory bowel disease. Presented at: 19th Congress of the European Crohn’s and Colitis Organisation (ECCO 2026); Stockholm, Sweden; 2026. https://academic.oup.com/ecco-jcc/article/20/Supplement_1/jjaf231.232/8432779.
  54. Shi CL, et al. Single-nucleus transcriptome unveils the role of ferroptosis in ischemic stroke. Heliyon. 2024;10:e32727. https://doi.org/10.1016/j.heliyon.2024.e32727.
  55. Tu H, et al. Integrated single-cell analysis with experimental validation reveals ANXA2 as a therapeutic target for ferroptosis in inflammatory bowel disease. Am J Transl Res. 2026;18:91–111.
  56. Yan C, et al. Exploring the anti-ferroptosis mechanism of Kai-Xin-San against Alzheimer's disease through integrating network pharmacology, bioinformatics, and experimental validation strategy in vivo and in vitro. J Ethnopharmacol. 2024;326:117915. https://doi.org/10.1016/j.jep.2024.117915.
  57. Shaik JP, Ahmad A. Pharmacological mechanism of cinnamic acid in the treatment of prostate cancer by network pharmacology. Archives of Medical Reports. 2024;1(2):1–6. https://doi.org/10.26524/amr.2024.2.1.
  58. Nimmagadda S, Patel S, MR Vishwathika. Targeting ferroptosis: A novel therapeutic avenue in osteoarthritis and bone degeneration. Archives of Medical Reports. 2025;2(5):6–9. https://doi.org/10.26524/amr.2025.5.2.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Düzenli Hücre ÖlümüBağırsak Epitel HücreleriTranskriptomik ProfillemeDiferansiyel Eksprese GenlerMakine Öğrenimi AnaliziTek Hücre AnaliziBiyobelirteç Doğrulama
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.