Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Araştırma makalesi

Amygdalin, Farelerde Oksidatif Stresi İnhibe Etmek ve Alopesi Areatayı İyileştirmek İçin FOXO3a Sinyal Yolağını Düzenler

71 görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/73759

⸱

29 Eylül 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Dermatology, Sichuan Provincial People's Hospital, University of Electronic Science and Technology of China, 2Neurosurgery, Institute of Sichuan Cancer Hospital, 3Department of Dermatology, The Affiliated Hospital, Southwest Medical University

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Bu çalışma, C3H/HeJ farelerdeki alopecia areata modelinde ve H2O2 ile indüklenen insan primer epidermal melanosit hasar modelinde amigdalinin antioksidan ve anti-inflamatuar etkilerinin altında yatan potansiyel moleküler mekanizmaları araştırmayı amaçlamaktadır.

Özet

Bu çalışma, amigdalinin (AMG) alopecia areata (AA) üzerindeki terapötik etkisinin mekanizmasını araştırmayı amaçlamaktadır. AMG'nin hepatorenal toksisitesini incelemek için hematoksilin-eozin boyaması kullanılmıştır. C3H/HeJ farelerinde AA modeli oluşturulduktan ve H2O2hasarlı insan primer epidermal melanositleri (HPEM'ler) kullanıldı ve AMG müdahalesinin ardından reaktif oksijen türleri (ROS) içeriği ile forkhead box O3A (FOXO3a) protein ve gen seviyeleri izlendi. Biyokimyasal kitler veya ‌enzimle bağlantılı immünosorbent analiz‌ süperoksit dismutaz (SOD), katalaz (CAT), glutatyon peroksidaz 4 (GPX-4), malondialdehit (MDA), interlökin-15 (IL-15), interferon-gamma (IFN- gamma) içerikleri saptamak için kullanılmıştırγ), ve interlökin-6‌ (IL-6). MHC I, IL-15, FOXO3a, SOD, CAT, GPX-4 ve IFN- düzeylerini değerlendirmek için Western blot analizi gerçekleştirildi.γ, IL-6 ve IL-15. FOXO3a'da SOD, CAT ve GPX-4 promoterlerinde AMG'nin zenginleşmesini değerlendirmek için ChIP-PCR gerçekleştirildi. Bu sırada, düşük FOXO3a ekspresyonuna sahip HPEM'lerde ROS, apoptoz ile FOXO3a, SOD, CAT ve GPX-4'ün protein ve gen seviyeleri incelendi. AMG'nin potansiyel bir karaciğer veya böbrek toksisitesi yoktur; ciltteki MHC I ve IL-15 proteinlerinin ekspresyonunu ve ayrıca serum IL-15 düzeylerini azaltabilir. AMG, ROS ve MDA düzeylerini düşürürken ciltteki FOXO3a protein ve gen ekspresyonunu ve ayrıca SOD, CAT ve GPX-4 seviyelerini artırabilir. AMG; MHC I, IFN- proteinlerini inhibe edebilir.γ, IL-6 ve IL-15, MDA, HPEM'lerdeki apoptoz ve ROS üretimini azaltır ve SOD, CAT ile GPX-4 içeriklerini artırır. Önemli bir nokta olarak AMG; FOXO3a, SOD, CAT ve GPX-4 gen ve proteinlerinin ekspresyonunu yukarı regüle edebilir ve SOD, CAT ile GPX-4 promotörlerinde FOXO3a'yı zenginleştirebilir. Bu veriler, AMG'nin FOXO3a ekspresyonunu artırabildiğini, oksidatif stresi ve inflamatuar yanıtları inhibe edebildiğini, böylece C3H/HeJ farelerinde AA'yı iyileştirebildiğini göstermektedir.

Giriş

Ani ve skar bırakmayan saç kaybı ile karakterize bir otoimmün bozukluk olan alopecia areata'nın (AA) küresel prevalansı yaklaşık %2–3'tür ve Çin'de 30 milyondan fazla hasta bulunmaktadır1. Epidemiyolojik veriler, hastalığın tüm yaş gruplarındaki bireyleri etkileyebileceğini, ancak genç yetişkinler arasında daha yüksek bir prevalans sergilediğini; hastaların yaklaşık %60'ının ilk başlangıcı 20 yaşından önce yaşadığını ve erkek-kadın oranının neredeyse eşit olduğunu göstermektedir1,2. Küresel olarak AA'nın yıllık insidansı yaklaşık %0,2–0,3'tür; bunun %40'ı tek bölge AA, %35'i çok bölge AA, %5'i totalis ve %2'si universalis formudur3,4,5. Komplikasyonlar açısından, hastaların yaklaşık %30'unda tırnak çökmesi, boylamsal çizgilenmeler ve diğer hasarlar görülmekte olup, tiroid bozuklukları ve vitiligo gibi otoimmün hastalıklarla beraber görülme oranı genel popülasyonda gözlemlenen seviyelerin üzerindedir6,7. Zararlı etkileri bakımından AA, yalnızca görünümü etkilemekle kalmayıp aynı zamanda depresyon ve anksiyete gibi psikolojik sorunlara yol açmaya eğilimlidir; yeni tanı alan hastaların yaklaşık %70'i başlangıçtan önceki 3 ay içinde majör stres olayları yaşamıştır8,9. Uzun süre tedavi edilmediğinde, hastalar totalis veya universalis formuna ilerleyebilir, bu da sosyal işlevlerini ve yaşam kalitelerini ciddi şekilde etkileyebilir10.

Günümüzde modern tıp, AA tedavisi için temel olarak lokal ilaçlar, oral ilaçlar, fizik tedavi ve saç ekiminin bir kombinasyonunu kullanmaktadır11,12. Lokal tedavi temel olarak kıl foliküllerini uyaran ve saç büyümesini teşvik etmek için lokal immün yanıtları inhibe eden minoksidil solüsyonu ve kortikosteroidleri (flutikazon propiyonat krem gibi) içerir; ancak uzun süreli kullanım cilt atrofisi gibi advers reaksiyonlara yol açabilir13,14. Progresif hastalığı olan hastalarda, oral immünosupresanlar (prednizon ve siklosporin gibi) sistemik immün yanıtı etkili bir şekilde düzenleyebilir, ancak karaciğer ve böbrek fonksiyonlarının düzenli olarak izlenmesi gerekir12,15. Fizik tedavide, dar bantlı orta dalga ultraviyole radyasyon ve düşük enerjili lazer tedavisi, saç büyümesine yardımcı olmak için mikrosirkülasyonu iyileştirir, ancak çok sayıda tedavi seansı gereklidir ve etki kişiden kişiye farklılık gösterir16,17. İnatçı vakalar için saç ekimi cerrahisi, sağlıklı kıl foliküllerini kellik bölgesine nakledebilir; ancak nakil başarısızlığı riski vardır ve ilaçla desteklenmesi gerekir18. Modern tıp tedavisinin avantajları, özellikle erken evre lokalize AA için hızlı etki etmesi ve yüksek standartlaşmasında yatmaktadır19. Ancak dezavantajları arasında hormon ilaçları için geri dönme (rebound) eğilimi, immünosupresanlar için belirgin yan etkiler ve total kellik/alopesi üniversalis hastalarında sınırlı etkinlik yer almaktadır20,21. Ayrıca, tedavi döngüsünün uzun olması (genellikle 3–6 ay) ve maliyetlerin yüksek olması (örneğin JAK inhibitörlerinin ve biyolojik ajanların yıllık maliyetinin 100.000 yuan'ı aşması), yaygın uygulamasını kısıtlayan diğer faktörlerdir19,22. Yukarıda belirtilen çok sayıda nedenle, yazarlar acilen yeni hedefli ilaçlar araştırma ihtiyacı duymaktadırlar.

Oksidatif stres, AA'nın patojenik mekanizmasına önemli ölçüde katkıda bulunur. Melanosit pigment sentezi sürecinde, yüksek miktarda hidrojen peroksit (H2O2) üretilir23,24. Normal koşullar altında, bu madde antioksidan enzimler (süperoksit dismutaz (SOD) ve katalaz (CAT) gibi) tarafından temizlenebilir25. Bununla birlikte, AA olan bireylerde antioksidan enzimlerin aktivitesi genellikle daha düşüktür; bu durum oksidatif ürünlerin birikmesine yol açarak DNA hasarına ve hücre apoptozuna neden olur26,27. Bu oksidatif stres durumu, pro-inflamatuar medyatörleri (TNF-α ve IFN-γ gibi) salarak inflamatuar yanıtı daha da aktive edecek ve oksidatif stres ile inflamasyondan oluşan kısır bir döngü oluşturacaktır28. İnflamatuar yanıt, T lenfositleri aracılığıyla kıl foliküllerine saldırarak kıl foliküllerinin dinlenme fazına girmesine ve dökülmesine neden olur29. Klinik çalışmalar, AA hastalarının sıklıkla diğer otoimmün hastalıklara (tiroid hastalıkları gibi) sahip olduğunu ortaya koymuştur30; bu durum, sistemik immün disregülasyonun kritik bir tetikleyici faktör olduğu yönünde bir kanıt sunmaktadır. Ek olarak, oksidatif stres ve inflamasyon kıl folikülü hücre apoptozunu ortaklaşa teşvik eder ve apoptotik sinyallerdeki bozulma, kıl folikülünün rejenerasyon yeteneğine daha fazla zarar vererek saçın yeniden uzamasını engeller31. Bu nedenle, AA tedavisi, bu kısır döngüyü kırmak için antioksidan ve anti-inflamatuar etkileri ve apoptotik yolların düzenlenmesini dikkate almalıdır.

Amygdalin (AMG), temel olarak Rosaceae ailesine ait bitki tohumlarında (kayısı, badem, şeftali çekirdekleri ve malta eriği gibi) bulunan doğal bir siyanojenik glikozid bileşiğidir32,33,34. Önceki çalışmalar, AMG'nin cilt bariyer fonksiyonunu güçlendirerek sedef hastalığını iyileştirebildiğini göstermiştir35. Bunun yanı sıra, AMG'nin anti-apoptotik ve anti-oksidatif stres etkileri, AA tedavisinde kullanımını mümkün kılmaktadır36,37. Mevcut kanıtlar ayrıca AMG'nin, C3H/HeJ farelerinde AA semptomlarını hafifletmek için inflamatuar yanıtı inhibe edebildiğini doğrulamıştır38. Ancak, AMG'nin AA'yı azaltmak için inflamasyonu inhibe ettiği ve oksidatif stresi hafiflettiği moleküler mekanizma yeterince rapor edilmemiştir. Bu çalışma temel olarak, C3H/HeJ farelerinin AA modeli ve H2O2 tarafından indüklenen insan primer epidermal melanosit (HPEM) hasar modelinin tedavisinde, AMG müdahalesi ile gerçekleşen forkhead box O3A (FOXO3a) sinyal iletimi aracılı oksidatif stres olaylarını ortaya koymuştur.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Etik onay ve katılıma izin
Hayvanları içeren deneysel protokoller, ARRIVE 2.0 ve NIH Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu'na uygun olarak, Scientist Biotechnology Co., Ltd. Etik Komitesi tarafından onaylanmıştır (Etik Onay Numarası: SYST-2024-014). Ayrıca, Sichuan Eyalet Halk’s Hastanesi, insan klinik örneklerinin etik kullanımına onay verdi. in vitro deneyler (Etik Onay Numarası: 2024103). Tüm doku bağışçılarından yazılı onam alınmıştır. Bu çalışmada kullanılan reaktiflerin ve ekipmanların tüm ticari detayları aşağıdaki bölümlerde verilmiştir. Malzemeler Tablosu.

C3H/HeJ farelerinde AA modelinin oluşturulması ve AMG uygulaması
Literatürdeki önceki çalışmalara dayanarak C3H/HeJ farelerde AA modeli oluşturuldu ve AMG ile tedavi edildi38,39. Kısa bir şekilde, otuz adet dişi C3H/HeJ fare (6–8 haftalık fareler, rastgele beş ayrı gruba atanmadan önce bir haftalık aklimatizasyon döneminden geçirildi: Kontrol, AA, AMG-L, AMG-M ve AMG-H. Kontrol grubu hariç, kalan dört grupta AA modeli, farelerin dorsal cildine 0,05 g imikvimod krem uygulanarak oluşturuldu. Bu uygulama haftada üç kez yapıldı ve toplam dokuz doza ulaşıldı. Uygulanan cilt alanı 1,5 cm idi × 1.5 cm. Kontrol ve AA gruplarındaki farelere gavaj yoluyla her gün 0.02 mL/g normal salin verildi. AMG gruplarındaki farelere ise her gün 60, 90 ve 120 mg/kg dozlarında intragastrik enjeksiyonlar yapıldı. Uygulama süresi 21 gündür. AA modelinin genel gözlemi ve değerlendirmesi için iyi tanımlanmış dairesel alopesi alanı ≥ Çapı 1 cm, skar veya şiddetli inflamasyon olmaması ve kırık kıl şaftlarının bulunması gereklidir. Farelerde yaygın tüm vücut tüy kaybı, şiddetli cilt ülserasyonu veya spontan hızlı tüy yenilenmesi görülüyorsa dışlanırlar.

HPEM'ler
Önceki yöntemi takiben40, hastanede sünnet ameliyatı olan hastalardan alınan sağlıklı cilt dokuları seçildi ve %75 alkolde 5 dakika boyunca bekletildi. Cilt dokuları daha sonra ampisilin (100 U/mL) ve streptomisin sülfat (100 mg/mL) içeren PBS ile defalarca yıkandı ve dispaz II çözeltisinde 4 °C'de°C’de sindirime bırakılır. Ayrılan ve izole edilen epidermal tabakalar doğranır ve steril bir membran üzerinden filtrelenerek hücre süspansiyonu elde edilir. Santrifüj sonrası, çökelmiş alt tabaka hücreleri toplanır ve ardından serum içermeyen melanosit 254 ortamında yeniden süspanse edilerek yaklaşık 5 yoğunluğunda tekrar ekilir × 105 kültür şişelerinde ve bir CO2 inkübatör. Üç pasajdan sonra, saf melanositler sonraki deneylerde kullanıldı.

H'nin Kurulması2O2-indüklenen insan melanosit oksidatif stres hasarı modeli ve AMG müdahalesi
İnsan melanositleri, %60 ila %80 füzyon derecesine ulaştıktan sonra kontrol grubu ve farklı konsantrasyonlarda H içeren gruplara bölündü2O2 (200, 400, 600, 800 ve 1000 µM). 24 saatlik inkübasyonun ardından hücre canlılığı ‌değerlendirildi‌ CCK-8 yöntemiyle. Daha sonra, H'nin optimal konsantrasyonu2O2 melanosit oksidatif stres modelinin oluşturulmasında kullanıldı ve farklı konsantrasyonlarda AMG (0,1, 0,25, 0,5, 1, 2,5, 5 ve 10 mg/mL) 24 saatlik kültür süresince eklendi. Daha sonra hücre viyabilitesi, AMG konsantrasyonunun değerlendirilmesi ve taraması için seçildi.

HE incelemesi
Fare karaciğer ve böbrek dokuları %4 paraformaldehit ile 24 saat süreyle tespit edildi ve parafine gömüldü, ardından aşağıdaki adımlarda bir dehidrasyon işlemi uygulandı: %70 etanolde 4 saat, %80 etanolde 2 saat, %90 etanolde 2 saat, %95 etanolde 2 saat, susuz etanolde iki kez, her birinde 1 saat; ksilende iki kez, her birinde 30 dakika38,39,41. Ardından, 4-µm parafin kesitleri H&E boyaması yapılan örnekler, dehidre edildi, şeffaflaştırıldı ve nötral gomla monte edildi. Doku kesitlerinin dijitalleştirilmesi için bir 3D HISTECH tarayıcısı kullanıldı ve 20× ve 40× büyütme görüntüleri alındı.

Enzime bağlı immünosorbent assay (ELISA) ve biyokimyasal tespit
Cilt dokuları 1:9 (w/v) oranında bir tampon çözeltide homojenize edildi, ardından 1006–1789 × g 10 dakika boyunca. BCA kullanarak serum, deri doku ekstraktları ve hücre süpernatantlarında protein miktarının belirlenmesinin ardından MDA, IL-6, IL-15 ve IFN-γ karşılık gelen ELISA kitleri kullanılarak değerlendirildi. SOD, CAT ve GPX-4 enzim aktiviteleri ise ilgili biyokimyasal kitlerin talimatlarına göre belirlendi.

Reaktif oksijen türlerinin (ROS) tespiti için akış sitometrisi
Sera içermeyen kültür ortamı, 10'u seyreltmek için kullanıldıµM DCFH-DA'yı 1:1000 oranında. Daha sonra fare deri dokuları veya insan melanositleri 1–20×106 hücre/mL, 10 kullanılarakµM DCFH-DA. Hücreler 37 °C'de inkübe edildi°20 dakika boyunca C. Bu süre zarfında hücreler her 3 dakikada bir sallanarak karıştırıldı–5 dakika. Sera içermeyen ortamla üç kez yıkamadan sonra, intrasellüler ROS düzeyleri akış sitometrisi ile nicelendirildi ve bunun için uyarma ve emisyon dalgaboyları sırasıyla 488 nm ve 525 nm olarak ayarlandı.42,43.

İmmünofloresans ölçümü
FOXO3a (1:1000) birincil antikoru, 4-µm deri doku kesitleri veya sabitlenmiş HPEM'ler gece boyu 4°C. Daha sonra örnekler, Alexa Fluor floforlarıyla etiketlenmiş ikincil antikorlarla işlenmiş ve DAPI çözeltisiyle karşıt boyanmıştır. Son olarak, kesitler floresans mikroskobu ile incelenmiş ve görüntülenmiştir. ROS ile floresans görüntülemesi için, bir 4-µDonmuş deri doku kesiti veya HPEM slaytları oda sıcaklığında ısıtıldı ve kurutuldu. Doku etrafına histokimyasal kalemle bir daire çizildi. Slaytlar 5 dakika boyunca otofloresans bastırıcı ile muamele edildikten sonra 10 dakika süreyle akan su altında yıkandı. ROS boyama çözeltisi damlatıldı ve karanlıkta 37 °C'de inkübe edildi.°30 dakika boyunca C. Bölümler, bir dekolorizasyon sallayıcısı kullanılarak PBS'de üç kez 5 dakika yıkandı. Daha sonra DAPI boyama çözeltisi damlatıldı ve inkübe edildi ‌karanlık koşullarda oda sıcaklığında 10 dakika boyunca. Lameller, anti-fluoresans söndürücü ortam ile kapatıldı. Daha sonra örnekler incelendi ve floresans mikroskobu ile görüntüler alındı. Uyarım/emisyon profilleri 330'dır–380/420 nm DAPI ve 510 için–560/590 nm, Cy3 için.

Batı blotu
Fare deri dokusu veya insan melanositleri için 50 mg deri dokusu veya 2 × 105 hücreleri ve proteaz inhibitörleriyle zenginleştirilmiş 1 mL RIPA lizis tamponu, 1,5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne konuldu. 30 dakikalık bir buz banyosundan sonra, süpernatant fraksiyonunun toplanması için 12.000 g'de 5 dakika santrifüj uygulandı. BCA yöntemiyle protein konsantrasyonu belirlendikten sonra, proteine ek olarak 5× SDS yükleme tamponu, hacim oranı 4:1 olacak şekilde karıştırıldı ve ardından 95 °C'de bir metal banyoda kaynatıldı °C'de 5 dakika. Örnek, %10 SDS-PAGE elektroforezi ile 80 V veya 120 V'ta uygulandıktan sonra proteinler 0,22-µsabit 200 mA akımda 1 saat boyunca PVDF membran44,45Membranlar, daha sonra santrifüj shaker üzerinde oda sıcaklığında 1 saat boyunca %5 yağsız süt (TBST tamponu ile hazırlanmış) ile bloke edildi. Ardından membranlar, birincil antikorlara maruz bırakıldı. ‌birinci sınıf major histouyumluluk kompleksi‌ (MHC I) (1:1000), IFN-γ (1:1000), IL-6 (1:1000), IL-15 (1:1000), β-Actin (1:1000), SOD (1:1000), CAT (1:1000), glutatyon peroksidaz 4 (GPX-4) (1:1000) ve FOXO3a (1:1000) 4 °C'de °C'de gece boyu inkübe edildi. Membranlar, oda sıcaklığında 1 saat boyunca ikincil antikor (1:10000) ile muamele edildi. ChemiScope 6100 kullanılarak görüntüleri geliştirmek ve çekmek için ECL kemilüminesans reaktifi kullanıldı.

Nicel ters transkripsiyon-polimeraz zincir reaksiyonu (qRT-PCR)
İlk olarak, fare deri dokusundan veya insan melanositlerinden örnek RNA'sı üreticinin talimatlarına uygun olarak elde edildi’toplam RNA ekstraksiyon kiti talimatlarına göre. Ters transkripsiyon kiti kullanım talimatlarına göre, PCR cihazı parametreleri 25 olarak ayarlandı°10 dakika boyunca C, 42°C'de 15 dakika ve 85°C'de 5 dakika boyunca cDNA örnekleri elde edildi. Benzer şekilde, yeterli DNA kopya sayısı elde etmek için PCR cihazının ayarlanma parametreleri şu şekildeydi: Ön denatürasyon: 95°C'de 5 dk, 1 döngü; Denatürasyon: 95°C için 10 s, 40 döngü; Çekirdeklenme ve uzama: 60°C 30 s, 40 döngü. ‌İlgilenilen genin normalize edilmiş ekspresyonu, aşağıdaki formül kullanılarak hesaplanır: 2‑ΔΔCq (ΔΔCq = Cqhedef‑Cqβ‑Aktin)46,47. qRT-PCR için gen primer dizileriyle ilgili bilgi şu şekilde gösterilmiştir: Tablo 1.

ChIP-PCR analizi
ChIP-PCR analizi, önceki protokole uygun olarak gerçekleştirildi48İlk olarak, hücreler %1 formaldehit ile 10 dakika boyunca çapraz bağlandı ve çapraz bağlama reaksiyonunu sonlandırmak için glisin çözeltisi eklendi. PMSF içeren soğuk PBS ile yıkamadan sonra hücreler PMSF içeren SDS lizis tamponu ile lizis edildi. Daha sonra, kromatin DNA'sı bir ultrasonik hücre parçalayıcı kullanılarak çoğunlukla 200 ila 1.000 bp aralığında parçalara ayrıldı ve parça boyutu agaroz jel elektroforezi ile doğrulandı. Parçalanmış kromatin örnekleri PMSF içeren ChIP seyreltme tamponunda yeniden süspanse edildi ve 20µL örnek, giriş kontrol grubu olarak alındı. Kalan örnekler Protein A+G Agaroz/Sağanak Somon Sperm DNA'sı ile önceden işlendi. Ardından, 0.5µbirincil antikor uygulandı ve ardından 4 °C'de gece boyu inkübasyon yapıldı°Yavaşça sallanarak C'de inkübe edildi. Negatif kontrol grubuna eşit miktarda tavşan IgG'si uygulandı. Ertesi gün, antijen-antikor komplekslerini yakalamak için Protein A+G agaroz boncukları eklendi ve kompleksler düşük tuzlu immün kompleks yıkama tamponu, yüksek tuzlu immün kompleks yıkama tamponu, LiCl immün kompleks yıkama tamponu ve TE tamponu ile ardışık olarak yıkandı. İmmünopresipite edilen kompleksler elüsyon tamponu ile elüe edildi ve hem elüsyon ürünleri hem de giriş kontrol grubundaki örnekler 65°C'de ısı uygulamasına maruz bırakıldı°4 saat boyunca C'de çapraz bağları kırmak için inkübe edildi. Proteinaz K ile protein sindiriminden sonra DNA, fenol-kloroform ekstraksiyonu ve ardından etanol çöktürmesi yöntemiyle izole edildi. Saflaştırılan DNA TE tamponunda çözüldü ve ardından qRT-PCR analizi için kullanıldı. ChIP-PCR için gen dizi bilgisi şu şekildedir Tablo 2.

ChIP-PCR için aday genomik bölgeler, JASPAR veri tabanı kullanılarak in silico tahminleme yöntemiyle seçildi (https://jaspar.elixir.no/). Özellikle, araştırmacılar TSS'nin 2000 bp yukarı akımına uzanan promotör dizilerini aldılar Katalaz, SODve GPX4 genleri. Bu diziler, karşılık gelen pozisyon ağırlık matrisi kullanılarak FOXO3a bağlanma motifleri için tarandı. Duyarlılık ve özgüllük arasında denge sağlamak amacıyla, yazarlar bir relatif profil skoru eşik değerini >%80. Bu kriteri karşılayan tüm öngörülen motifler arasında, yazarlar her gen için ChIP-PCR doğrulaması için aday bölgeler olarak en yüksek puanlı iki olası bölgeyi seçtiler. Örneğin, CAT geni, seçilen bölgeler TSS'ye göre -733 bp ve -1259 bp konumlarında yer almaktadır. Bu çalışmada kullanılan anti-FOXO3a antikoru, ticari olarak temin edilebilen ChIP kalitesinde bir antikordur. Özgüllüğü sağlamak için yazarlar, her bir ChIP-PCR analizi için iki bağımsız negatif kontrol uygulamıştır: izotip IgG ve negatif genomik lokus. İzotip IgG kontrolü, aynı türden immün olmayan IgG kullanılarak paralel immün çöktürmeler şeklinde gerçekleştirilmiştir. Negatif genomik lokus için yazarlar, tahmini FOXO3a konsensus motifinin bulunmadığı, bağlanma olmayan bir bölgeyi hedefleyen özel bir primer çifti tasarlamıştır. Bu kontrol bölgesi, rastgele kromatin parçalanmasına veya spesifik olmayan PCR çoğaltılmasına bağlı zenginleşmeyi dışlamalarını sağlamıştır. Kat zenginleştirme değeri, üç aşamalı bir normalizasyon stratejisi kullanılarak hesaplanmıştır.

Adım 1: Normalize edilmiş girdi ΔCt, ΔCt [normalize edilmiş IP] = Ct[IP]-(Ct[Giriş]-log₂(DF)    (1)

ΔCt [normalize edilmiş IgG] = Ct[IgG] - (Ct[Giriş] - log₂(DF).     (2)

DF = Giriş seyreltme faktörü; deneyde %10 giriş kullanıldığından DF = 10'dur.

Adım 2: ΔΔIP ve IgG arasındaki Ct

ΔΔCt [IP/IgG] =ΔCt [normalize edilmiş IP]ΔCt [normalize edilmiş IgG]      (3)

3. Adım: Katlanma zenginleştirme değeri = 2(-ΔΔCt [IP/IgG].       (4)

İstatistiksel analiz
Veriler ortalama olarak ifade edilir ± en az üç bağımsız deneyin standart sapması temel alınmıştır. İstatistiksel analizler GraphPad Prism yazılımı (sürüm 6.0) kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Normal dağılım ve varyans homojenliği gösteren çoklu gruplardaki verilerin karşılaştırılması tek yönlü varyans analizi (ANOVA) ile değerlendirilmiş, ardından Tukey testi uygulanmıştır’s sonrası testi. İstatistiksel anlamlılık, p < 0.05.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

AMG, normal C3H/HeJ farelerde hepatorenal toksisite göstermemiştir
AMG'nin potansiyel karaciğer ve böbrek toksisitesini deneysel bir perspektiften net bir şekilde belirlemek için araştırmacılar, daha önce çalışılan üç dozu (60, 90 ve 120 mg/kg), normal C3H/HeJ farelerine gavage yoluyla uygulamışlardır 38. Şekil 1'de gösterildiği üzere, üç farklı dozda 21 gün boyunca intragastrik AMG uygulamasından sonra, hepatositlerin düzenli bir şekilde dizildiği hepatik lobül mimari...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

AMG'nin kendisinin doğrudan bir toksisitesi yoktur. Bağırsak mikrobiyal enzimleri veya mide asidi tarafından hidrolize edilerek yüksek derecede toksik olan hidrojen siyanür üretir ve açığa çıkarır49. Hidrojen siyanür daha sonra sindirim sistemi yoluyla hızla kan dolaşımına emilir ve vücut dokularına yayılıp sinir sistemi, kardiyovasküler sistem ve solunum sistemi dokularında hipoksiye neden olur50. Mekanizma açısından hidrojen siyanür, sitokrom oksidazdaki demir iyonları il...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak çıkar çatışmaları yoktur.

YAZARLAR’ KATKIDA BULUNAN:
Xun He: Soruşturma, Yöntemoloji, Yazma – orijinal taslak. Jingsong Liu, Jiawei Wang ve Zhe Dai: Veri yönetimi. Yugang Gong, Wei Lu ve Xiaowei Sha: Yazılım, Görselleştirme ve Doğrulama. Xun He: Kavramsallaştırma, Yazım – İnceleme & Düzenleme, fon sağlama ve denetim.

Teşekkürler

Bu çalışma, Sichuan Eyalet Kadroları Sağlık Komitesi (2024-221) tarafından desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
5×Hepsi Bir Arada MasterMix (AccuRT genomik DNA giderme kiti ile)Applied Biological Materials Inc., Jiangsu, ÇinG492
β-Aktin antikoruAffinity Biosciences Co., Ltd., Wuhan, ÇinAF7018
AmigdalinChengdu Herbpurify Co., Ltd., Chengdu, ÇinK-001-181216
Katalaz antikoruProteintech, Wuhan, Çin66765-1-Ig
Katalaz kitiElabscience, Wuhan, ÇinE-BC-K031-M
C3H/HeJ fareleriChengdu Yaokang Biotechnology Co., Ltd., Chengdu, ÇinPirinçle (Oryza sativa) Karşılaştırmalı Olarak Mısırın (Zea mays) Tohum Gelişiminin İncelenmesi
ChIP analiz kitiBeyotime Biotechnology, Şangay, ÇinP2078
254 kültür ortamıGibco, Thermo Fisher Scientific, AmerikaM-254-500
DAPI boyama reaktifiServicebio, Wuhan, ÇinG1012
Dispase IIShanghai Yuanye Bio-Technology Co., Ltd., Şanghay, ÇinS25046
EvaGreen Express 2×qPCR MasterMix-Boya İçermeyenApplied Biological Materials Inc., Jiangsu, ÇinMasterMix-ES
Fast black HBSangon Biotech Co., Ltd., Şanghay, ÇinA602008-0025
Fetal bovine serumHer Şey Yeşil13011-8611
Floresans mikroskobuSOPTOPCX40
FOXO3a antikoruProteintech, Wuhan, Çin10849-1-AP
Kriyostat (Dondurucu mikrotom)ThermoKriyotom E
Glutatyon peroksidaz 4 antikoruProteintech, Wuhan, Çin67763-1-Ig
Glutatyon peroksidaz 4 kitiElabscience, Wuhan, ÇinE-BC-K883-M
Image-pro plus 6.0Media Cybernetics, Inc., Rockville, MD, ABD——
İmikimod kremiSichuan Mingxin Pharmaceutical Co. Ltd., Chengdu, ÇinH20030129
İnterferon gama antikoruProteintech, Wuhan, Çin15365-1-AP
İnterferon gama kitiElabscience, Wuhan, ÇinE-EL-H0108 ve E-EL-M0048
İnterlökin 6 antikoruProteintech, Wuhan, Çin21865-1-AP
İnterlökin 6 kitiElabscience, Wuhan, ÇinE-EL-H6156 ve E-EL-M0044
İnterlökin 15 antikoruAffinity Biosciences Ltd., Wuhan, ÇinDF2521
İnterlökin 15 kitiElabscience, Wuhan, ÇinE-EL-H0222 ve E-EL-M0728 
Malondialdehit kitiElabscience, Wuhan, ÇinE-EL-0060
MHC antikoruAffinity Biosciences Ltd., Wuhan, ÇinDF8558
Optik mikroskopZEISSPrimo Star
Parafin kesiciThermo scientificHM325
Patolojik tarama yazılımı3DHISTECH (Macaristan)Slayt Görüntüleyici 2.5.0
Penisilin-synthroid çözeltisiBiosharp, Pekin, ÇinBL505A
Tavşan IgG Beyotime Biotechnology, Şanghay, ÇinA7016
ROS analiz kitiBeyotime Biotechnology, Şanghay, ÇinS0033M
Süperoksit dismutaz 1 antikoruProteintech, Wuhan, Çin10269-1-AP
Doku gömme cihazı Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd., Wuhan ÇinJB-P5
Doku hidroekstraktörüThermo ScientificSTP420 ES
Toplam RNA izolasyon kitiForegene, Chengdu, ÇinRE-03014
Toplam süperoksit dismutaz kitiElabscience, Wuhan, ÇinE-BC-K020-M
Beyaz vazelinShanghai Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd., Şanghay, ÇinP434227

Kaynaklar

  1. Li XQ, et al. Burden of alopecia areata in China, 1990-2021: Global Burden of Disease Study 2021. Chin Med J (Engl). 2025;138:318-324.
  2. Rodríguez-Tamez G, Maskan-Bermudez N, Tosti A. Alopecia areata incognita: Current evidence. Dermatol Ther (Heidelb). 2025;15:635-645.
  3. Zhou J, et al. Global burden of alopecia areata and associated diseases: A trend analysis from 1990 to 2021. J Cosmet Dermatol. 2025;24:e70076.
  4. Jeon JJ, Lee S, Kim MS, Kim YS, Hong SH, Yon DK, et al. The burden of alopecia areata among United States, 2000-2021: A systematic analysis for the global burden of disease study 2021. J Am Acad Dermatol. 2025;S0190-9622(25)02673-8.
  5. Todorova L, Kluger N. Alopecia: A Google trends analysis of the past 5 years (2018-2023). Skin Appendage Disord. 2025;11:282-286.
  6. Pratt CH, King LEJr, Messenger AG, Christiano AM, Sundberg JP. Alopecia areata. Nat Rev Dis Primers. 2017;3:17011.
  7. Mistry J, Sibbald C. Clinical presentations and comorbidities of pediatric alopecia areata. Pediatr Dermatol. 2025;42 Suppl 1:5-11.
  8. Kuty-Pachecka M. Psychological and psychopathological factors in alopecia areata. Psychiatr Pol. 2015;49:955-964.
  9. Marahatta S, Agrawal S, Adhikari BR. Psychological impact of alopecia areata. Dermatol Res Pract. 2020;2020:8879343.
  10. Dainichi T, Iwata M, Kaku Y. Alopecia areata: What's new in the epidemiology, comorbidities, and pathogenesis J Dermatol Sci. 2023;112:120-127.
  11. Lintzeri DA, Constantinou A, Hillmann K, Ghoreschi K, Vogt A, Blume-Peytavi U. Alopecia areata - Current understanding and management. J Dtsch Dermatol Ges. 2022;20:59-90.
  12. Singh R, Kumar P, Kumar D, Aggarwal N, Chopra H, Kumar V. Alopecia areata: Review of epidemiology, pathophysiology, current treatments and nanoparticulate delivery system. Ther Deliv. 2024;15:193-210.
  13. Rizzetto G, De Simoni E, Gioacchini H, Molinelli E, Offidani A, Simonetti O. Fractionated CO2 laser in combination with topical tacrolimus for chronic alopecia areata: A case series study. Life (Basel). 2024;14:1128.
  14. Gasques L, de Brito FF, Zobiole R, Bortolini L, Assumpção VCC, Carvalho CL. Corticosteroid atrophy plaque on the scalp treated with 5-fluourouracil and bleomycin infusion in the MMP technique. Skin Appendage Disord. 2024;10:425-428.
  15. Lee D, et al. Serum levels of IL-18 and sIL-2R in patients with alopecia areata receiving combined therapy with oral cyclosporine and steroids. Exp Dermatol. 2010;19:145-147.
  16. Mlacker S, et al. A review on laser and light-based therapies for alopecia areata. J Cosmet Laser Ther. 2017;19:93-99.
  17. Jafari MA, Bazgir G, Hosseini-Baharanchi FS, Jafarzadeh A, Goodarzi A. Efficacy and safety of laser therapy and phototherapy in cicatricial and noncicatricial alopecia: A systematic review study. Health Sci Rep. 2024;7:e70180.
  18. Civaş E, Aksoy B, Aksoy HM, Eski M, Yucel K. Hair transplantation for therapy-resistant alopecia areata of the eyebrows: is it the right choice J Dermatol. 2010;37:823-826.
  19. King BA, Craiglow BG. Janus kinase inhibitors for alopecia areata. J Am Acad Dermatol. 2023;89:S29-S32.
  20. Chim I, Ghiya R, Sinclair RD, Eisman S. Novel investigational drugs for alopecia areata and future perspectives. Expert Opin Investig Drugs. 2024;33:441-449.
  21. Valdez-Zertuche JA, Ramírez-Marín HA, Tosti A. Efficacy, safety and tolerability of drugs for alopecia: A comprehensive review. Expert Opin Drug Metab Toxicol. 2025;21:347-371.
  22. Liu M, et al. Janus kinase inhibitors for alopecia areata: A systematic review and meta-analysis. JAMA Netw Open. 2023;6:e2320351.
  23. Sohn KC, et al. Effect of thioredoxin reductase 1 on glucocorticoid receptor activity in human outer root sheath cells. Biochem Biophys Res Commun. 2007;356:810-815.
  24. Sun C, Ding HH, Zhang L, Wang JL, Su MY. Co-regulatory mechanisms and potential markers of oxidative stress-related genes in vitiligo and alopecia areata. Skin Res Technol. 2024;30:e70001.
  25. Perlmutter J, et al. The role of reactive oxygen species in the pathogenesis of alopecia areata: A systematic review and meta-analysis. Skin Pharmacol Physiol. 2025;38:59-67.
  26. Xie B, Sun JY, Song XZ. Hair follicle melanocytes initiate autoimmunity in alopecia areata: A trigger point. Clin Rev Allergy Immunol. 2022;63:417-430.
  27. Shin JM, et al. The crosstalk between PTEN-induced kinase 1-mediated mitophagy and the inflammasome in the pathogenesis of alopecia areata. Exp Dermatol. 2024;33:e14844.
  28. Mustafa AI, Khashaba RA, Fawzy E, Baghdady SMA, Rezk SM. Cross talk between oxidative stress and inflammation in alopecia areata. J Cosmet Dermatol. 2021;20:2305-2310.
  29. Cohen JN, et al. Regulatory T cells in skin mediate immune privilege of the hair follicle stem cell niche. Sci Immunol. 2024;9:eadh0152.
  30. Kinoshita-Ise M, Martinez-Cabriales SA, Alhusayen R. Chronological association between alopecia areata and autoimmune thyroid diseases: A systematic review and meta-analysis. J Dermatol. 2019;46:702-709.
  31. Chen DY, Yang XY, Wang HX, Fan WL, He YQ. Molecular mechanism of polygonum multiflorum in the treatment of androgenic alopecia: based on bioinformatics and molecular docking method. Diagnosis and Therapy Journal of Dermato-Venereology 2022;29:101–108.
  32. Iwasa K, et al. Long term administration of loquat leaves and their major component, ursolic acid, attenuated endogenous amyloid-β burden and memory impairment. Sci Rep. 2023;13:16770.
  33. Makovi CM, Parker CH, Zhang K. Determination of amygdalin in apricot kernels and almonds Using LC-MS/MS. J AOAC Int. 2023;106:457-463.
  34. Li XJ, et al. Identifying the active components and mechanisms of Persicae Semen in treating androgenetic alopecia: Insights from network pharmacology and experimental evaluations. J Ethnopharmacol. 2025;347:119755.
  35. Wang Q, et al. Amygdalin alleviates psoriasis-like lesions by improving skin barrier function. Arch Dermatol Res. 2025;317:115.
  36. Li SY, et al. Effects of amygdalin on ferroptosis and oxidative stress in diabetic retinopathy progression via the NRF2/ARE signaling pathway. Exp Eye Res. 2023;234:109569.
  37. Kimura K, Liu YH, Hsieh CL. Amygdalin's neuroprotective effects on acute ischemic stroke in rats. J Ethnopharmacol. 2025;345:119621.
  38. He X, et al. Amygdalin ameliorates alopecia areata on C3H/HeJ mice by inhibiting inflammation through JAK2/STAT3 pathway. J Ethnopharmacol. 2024;331:118317.
  39. He X, et al. The antiinflammatory effects of Xuefu Zhuyu decoction on C3H/HeJ mice with alopecia areata. Phytomedicine. 2021;81:153423.
  40. Ma LP, et al. Melatonin inhibits senescence-associated melanin pigmentation through the p53-TYR pathway in human primary melanocytes and the skin of C57BL/6 J mice after UVB irradiation. J Mol Med (Berl). 2023;101:581-593.
  41. Hou Y, et al. Longzhibu disease and its therapeutic effects by traditional Tibetan medicine: Ershi-wei Chenxiang pills. J Ethnopharmacol. 2020;249:112426.
  42. Hou Y, Fan FH, Xie N, Zhang Y, Wang XB, Meng XL. Rhodiola crenulata alleviates hypobaric hypoxia-induced brain injury by maintaining BBB integrity and balancing energy metabolism dysfunction. Phytomedicine. 2024;128:155529.
  43. Hou Y, et al. Salidroside intensifies mitochondrial function of CoCl2-damaged HT22 cells by stimulating PI3K-AKT-MAPK signaling pathway. Phytomedicine. 2023;109:154568.
  44. Fan FH, et al. Association between systemic immune-inflammation indexes and Nuodikang capsule’s protection in LPS-induced acute lung injury in mice. Phytomedicine. 2025;147:157229.
  45. Wang XB, et al. Mechanistic insights into salidroside's mitochondrial protection via AMPK/Sirt1/HIF-1α pathway in hypoxic HT22 cells. JoVE. 2025;218:e66923.
  46. Wang XB, et al. Rhodiola crenulata attenuates apoptosis and mitochondrial energy metabolism disorder in rats with hypobaric hypoxia-induced brain injury by regulating the HIF-1α/microRNA 210/ISCU1/2(COX10) signaling pathway. J Ethnopharmacol. 2019;241:111801.
  47. Fan SJ, et al. PRMT5 encourages cell migration and metastasis of tongue squamous cell carcinoma through methylating ΔNp63α. Cell Death Differ. 2026; 33:465-479.
  48. Zhao Y, et al. Integrated analysis reveals that EGR1 promotes epithelial IL33 production in T2 asthma. J Transl Med. 2025;23:203.
  49. He XY, Wu LJ, Wang WX, Xie PJ, Chen YH, Wang F. Amygdalin - A pharmacological and toxicological review. J Ethnopharmacol. 2020;254:112717.
  50. Alan-Albayrak E, Simonsen U. Cyanide beyond toxicity: A systematic review of its effects on vascular function. Basic Clin Pharmacol Toxicol. 2025;137:e70124.
  51. Lachowicz JI, Alexander J, Aaseth JO. Cyanide and cyanogenic compounds-toxicity, molecular targets, and therapeutic agents. Biomolecules. 2024;14:1420.
  52. Jaszczak-Wilke E, Polkowska Ż, Koprowski M, Owsianik K, Mitchell AE, Bałczewski P. Amygdalin: Toxicity, anticancer activity and analytical procedures for its determination in plant seeds. Molecules. 2021;26:2253.
  53. Deeths MJ, Endrizzi BT, Irvin ML, Steiner LP, Ericson ME, Hordinsky MK. Phenotypic analysis of T-cells in extensive alopecia areata scalp suggests partial tolerance. J Invest Dermatol. 2006;126:366-373.
  54. Garzorz N, et al. Dissecting susceptibility from exogenous triggers: the model of alopecia areata and associated inflammatory skin diseases. J Eur Acad Dermatol Venereol. 2015;29:2429-2435.
  55. Belpaire A, Demeyer A, Van Caelenberg E, van Geel N, Speeckaert R. The AhR pathway is dysregulated in alopecia areata. J Transl Autoimmun. 2025;10:100282.
  56. Gilhar A, Schrum AG, Etzioni A, Waldmann H, Paus R. Alopecia areata: Animal models illuminate autoimmune pathogenesis and novel immunotherapeutic strategies. Autoimmun Rev. 2016;15:726-735.
  57. Oelert T, Gilhar A, Paus R. T-cell "induced-self" MHC class I/peptide complexes may enable "de novo" tolerance induction to neo-antigens occurring outside of the thymus: Lessons from the hair follicle. Exp Dermatol. 2017;26:529-531.
  58. Freyschmidt-Paul P, et al. Interferon-γ-deficient mice are resistant to the development of alopecia areata. Br J Dermatol. 2006;155:515-521.
  59. Lensing M, Jabbari A. An overview of JAK/STAT pathways and JAK inhibition in alopecia areata. Front Immunol. 2022;13:955035.
  60. Suzuki T, et al. Interleukin-15 is a hair follicle immune privilege guardian. J Autoimmun. 2024;145:103217.
  61. Fitzhugh MH, Hansen JG, Jabbari A, Berrebi KG. Pathophysiology of Alopecia Areata in the Pediatric Patient. Pediatr Dermatol. 2025;42:24-30.
  62. Ma YQ, Sun Z, Li YM, Xu H. Oxidative stress and alopecia areata. Front Med (Lausanne). 2023;10:1181572.
  63. Bakry OA, Elshazly RM, Shoeib MA, Gooda A. Oxidative stress in alopecia areata: A case-control study. Am J Clin Dermatol. 2014;15:57-64.
  64. Peterle L, Sanfilippo S, Borgia F, Cicero N, Gangemi S. Alopecia areata: A review of the role of oxidative stress, possible biomarkers, and potential novel therapeutic approaches. Antioxidants (Basel). 2023;12:135.
  65. Yang X, et al. Exosomes derived from platelet-rich plasma promote hair regeneration by regulating the SIRT1/FoxO3a pathway to alleviate oxidative stress. Regen Ther. 2025;30:710-718.
  66. Xu SC, Huang P, Yang JH, Du HX, Wan HT, He Y. Calycosin alleviates cerebral ischemia/reperfusion injury by repressing autophagy via STAT3/FOXO3a signaling pathway. Phytomedicine. 2023;115:154845.
  67. Tang QY, et al. Orlistat facilitates immunotherapy via AKT-FOXO3a-FOXM1-mediated PD-L1 suppression. J Immunother Cancer. 2025;13:e008923.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Daha fazla makale keşfet

Amygdalin TedavisiC3H/HeJ FareleriReaktif Oksijen TürleriSüperoksit DismutazGlutatyon PeroksidazWestern Blotİnflamatuar Yanıt
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.