Bu protokol, izole kristaloidle perfüze edilmiş fare kalbinde bir ex vivo miyokard enfarktüsü modelini tanımlamaktadır. Bu yaklaşım, sistemik değişkenleri devre dışı bırakarak araştırmacıların, kardiyomiyosit sağkalımını etkileyebilecek dış faktörlerin yokluğunda kardiyak etkileri doğrudan değerlendirmelerine ve lokalize farmasötik müdahaleleri test etmelerine olanak tanır.
Yöntem makalesi
Kristaloid Perfüze Fare Kalbinde Ex Vivo Miyokard Enfarktüs Modeli
* These authors contributed equally
Bu makalede
Özet
Özet
Deneysel miyokard enfarktüsü (MI), hayvanlarda yaygın olarak sol anterior desendan (LAD) koroner arterin geçici tıkanıklığıyla veya hücresel düzeyde hipoksi-reoksijenasyon protokolleri ile modellenir. İskeminin organ düzeyindeki alternatif bir modeli olan Langendorff perfüzyonlu kalp, fizyolojik bozulmaların ve farmakolojik müdahalelerin kardiyoproteksiyon üzerindeki etkilerini araştırmak için temel bir araç olmaya devam etmiştir. Burada, izole fare kalbinde bölgesel miyokard iskemisi/reperfüzyon modeli oluşturmak için gereken temel metodolojiyi ve temel kuralları sunuyoruz. Kısaca, kardiyoplejik durdurmanın ardından LAD, buz gibi soğuk PBS ile kısa bir yıkama sonrası bağlanmıştır. Kalp daha sonra bir Langendorff aparatına monte edilmiş ve 37°C'de, 110 cmH₂O sabit perfüzyon basıncı altında, besin açısından zengin oksijenli bir tamponla perfüze edilmiştir. Miyokard iskemisi süresi 30, 45, 60, 90 ve 120 dk olarak indüklenmiş ve ardından 90 dk'lık reperfüzyon uygulanmıştır. Kardiyomiyosit canlılığı ve enfarkt boyutu, mikroskobik 2,3,5-trifeniltetrazolyum klorür (TTC) boyama yaklaşımı kullanılarak değerlendirilmiştir. Ex vivo MI modelinin, iskemik süre uzadıkça enfarkt bölgesi içinde canlı kardiyomiyositlerin kademeli kaybı ile karakterize, güvenilir ve tekrarlanabilir miyokard hasarı oluşturduğunu gösterdik. Ayrıca, enfarktlı miyokardın TTC tabanlı net bir şekilde belirlenmesi için en az 30 dk'lık reperfüzyon gerektiği saptanmıştır. Bu yaklaşım sistemik değişkenleri devre dışı bırakarak, araştırmacıların MI ilerlemesini etkileyebilecek dolaşımdaki humoral faktörler ve immün hücre infiltrasyonu gibi dışsal düzenleyici etkilerin yokluğunda kardiyak etkileri doğrudan değerlendirmelerine ve lokalize farmasötik müdahaleleri test etmelerine olanak tanır. Bu nedenle ex vivo MI modeli, doğrudan kardiyomiyositler üzerinde etkili olan kardiyoprotektif mekanizmaları araştırmak için yararlı bir platform sunmaktadır.
Giriş
Miyokard enfarktüsü (MI), koroner kan akışının durmasıyla meydana gelir; bu durum doku ölümüne ve ciddi fonksiyonel bozukluğa yol açar. Genellikle bütün organizmalarda çalışılsa da bu terim, belirli kalp yapılarıyla sınırlı bölgesel MI'yi veya sistemik etkilerin yokluğunda enfarktüsleri incelemek için kullanılan ex vivo, izole kalp laboratuvar modellerini (örneğin, Langendorff perfüzyonu) ifade edebilir1. Bu yönüyle Langendorff perfüzyonlu kalp, 50 yılı aşkın süredir miyokardiyal iskemik hasarı incelemek için güçlü ve iyi yapılandırılmış bir deneysel model olarak hizmet etmiştir2.
İzole kalp üzerindeki ex vivo MI modeli, deneysel ortamın hassas kontrolü ve farmakolojik ajanlar gibi müdahalelerin miyokard üzerindeki doğrudan etkilerinin; dolaşımdaki humoral faktörler, kan bileşenleri ve nörohümoral düzenleme dahil olmak üzere sistemik etkilerden bağımsız olarak değerlendirilebilmesi gibi çeşitli avantajlar sunar3. Bu karıştırıcı faktörlerin minimize edilmesi sayesinde ex vivo model, in vivo modellere göre daha öngörülebilir ve tekrarlanabilir bir yaklaşım sağlar ve böylece MI'ya dahil olan hastalık süreçlerinin ve moleküler yolların titizlikle araştırılmasını kolaylaştırır4.
İzole kalp modellerinde, miyokardiyal iskemi ya küresel ya da bölgesel olarak indüklenebilir5. Küresel MI modelinde, tüm koroner dolaşım boyunca perfüzat akışı tamamen kesilirken; bölgesel MI modelinde, sadece sol ön inen koroner arter (LAD) ligasyonla geçici olarak tıkanır ve bu durum ligasyon bölgesinin distalindeki miyokard ile sınırlı bir iskemik hasarla sonuçlanır. Küresel MI modelinin uygulanması teknik olarak basit olsa da, kardiyoproteksiyon çalışmalarındaki kullanımını kısıtlayan çeşitli sınırlamaları vardır6. Önemli bir sınırlama, iskemi süresinin tüm kalbin dayanıklılık toleransı ile kısıtlı olmasıdır; bu durum, in vivo durumlarla karşılaştırılabilir düzeyde transmural enfarktüs olasılığı ile uzun süreli iskeminin indüklenmesini zorlaştırır7. Ayrıca, iskemi ve reperfüzyon süreleri dikkatle kontrol edildiğinde ex vivo modeller genellikle mükemmel tekrarlanabilirlik sağlasa da, bu protokoller laboratuvarlar arasında önemli ölçüde farklılık göstermektedir. Bu değişkenlik, özellikle birçok kritik metodolojik detayın literatürde yetersiz şekilde tanımlanmış olması nedeniyle, izole fare kalbinin daha iyi standardize edilmesi ve karakterize edilmesi gerekliliğini vurgulamaktadır8.
Öte yandan, bölgesel MI modelini kurmak teknik olarak daha zordur. Burada, özellikle kardiyoproteksiyona yönelik farmakolojik müdahalelerin değerlendirilmesi için, izole fare kalbinde güvenilir ex vivo MI indüksiyonunu optimize etmeye yönelik çeşitli modifikasyonlar ve pratik stratejiler sunuyoruz9,10. Bu nedenle, Langendorff perfüzyonlu fare kalbi kullanılarak oluşturulan bu modifiye ex vivo MI protokolü, terapötik müdahalelerin ardından miyokardyal sağkalımı doğrudan değerlendirmek için etkili bir platform sağlamaktadır.
Protokol
Burada açıklanan izole perfüze kalp modeli, akut, hayatta kalma amaçlı olmayan bir deneydir ve yerel makamlar tarafından onaylanmıştır (O1019/25, Nordrhein-Westfalen, Almanya LANUV). Tüm prosedürler, ARRIVE kılavuzlarına ve NIH Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu'na uygun olarak yürütülmüştür. Deneyler için gerekli olan ekipman ve kimyasallar Materyaller Tablosu'nda listelenmiştir.
1. İzole fare kalbi için Langendorff retro-perfüzyon sisteminin kurulması
NOT: İzole fare kalbine, 110 cmH2O sabit basınçta oksijenlendirilmiş kristaloid perfüzat (Krebs-Henseleit tamponu, KHB) iletmek için yeniden dolaşımsız, yerçekimi destekli bir sistem tasarlanmıştır (Şekil 1A).
- Sistemi kurmadan önce Langendorff cam malzemelerini 0.1 M/L HCl ve %100 etanol ile temizleyin ve ardından distile su ile durulayın.
- 2 L modifiye KHB hazırlamak için gerekli tüm kimyasalları şu nihai konsantrasyonlara (mM) göre tartın: 116.02 NaCl, 4.63 KCl, 1.10 MgSO4·7H2O, 1.21 KH2PO4, 2.52 CaCl2·2H2O, 24.88 NaHCO3, 8.30 D-glucose, 2.0 sodyum piruvat.
- CaCl₂ hariç tüm kimyasalları, pH değerini 7.4'e dengelemek için en az 10 dk boyunca sürekli Carbogen ( %95 O₂/%5 CO₂) kabarcıkları gönderirken 2 L'lik bir erlen içinde çift distile suda çözün.
- Çökmeyi önlemek için CaCl₂'yi çözeltiye daha sonra ekleyin.
- Çözeltiyi 10 dk daha Carbogen ile havalandırmaya devam edin.
- Koroner mikrovaskülatürü tıkayabilecek küçük partikülleri uzaklaştırmak için KHB çözeltisini 0.2 µm membran filtreden vakum altında süzün.
- Süzülmüş KHB çözeltisini 37 °C'de tutulan önceden ısıtılmış bir su banyosuna yerleştirilmiş 2 L'lik cam rezervuara aktarın.
- KHB rezervuarını cam basınç kolonuna bağlayarak, rezervuardaki Carbogen gazının oluşturduğu basınç aracılığıyla oksijenlendirilmiş KHB'nin kolonu sürekli doldurmasını sağlayın.
- Çıkış borulama sisteminin hava kabarcıklarından arındırılmış olduğundan emin olun.
- Deney başlamadan önce KHB çözeltisini 30 dk daha Carbogen ile dengeleyin.
2. Kalbin izolasyonu ve kanülasyonu
NOT: Mevcut deneylerde 20–25 g ağırlığındaki erkek C57BL/6J fareler kullanılmıştır. Tüm deneysel prosedürler; gerekçe, tarih ve ötanazi yöntemi dahil olmak üzere yerel düzenlemelere uygun olarak uygun şekilde belgelenmelidir.
- Anestezi indüksiyonu için fareyi, %5 isofloran (v/v) içeren bir indüksiyon haznesine nazikçe yerleştirin.
- Anestezi derinliğini, parmak ucuna sıkıca bastırıldığında yanıt alınmadığını doğrulayarak kontrol edin ve ardından fareyi ameliyat masasına taşıyın. Solunumun durması ve vücudun alt kısmındaki kas tonusunun kaybı ile belirtilen şekilde, fareyi servikal dislokasyon yoluyla hemen ötanize edin.
- Kalbi ve çıkan aortayı tamamen açığa çıkarmak için göğüs kafesini her iki taraftan sternuma doğru kesin.
- Ekstrakardiyak dokuyu forsepsle tutun ve kalbi çıkarın.
- Kardiyoplejik duruşu başlatmak için kalbi, en az 30 s boyunca 50 mL buz gibi soğuk KHB solüsyonu içeren küçük, önceden soğutulmuş bir behere yerleştirin.
NOT: Kardiyak aktivite sıcaklığa karşı son derece hassas olduğundan, kalp buz gibi soğuk KHB solüsyonuna daldırılarak tamamen durdurulur. - Kalbi, üç yollu bir musluğa bağlı kanül sisteminin kurulduğu metal bir kap içerisindeki önceden soğutulmuş, KHB ile nemlendirilmiş pamuk pedin üzerine taşıyın. (Şekil 1B).
NOT: Perfüzyon sistemi hava kabarcıklarından arındırılmış olmalıdır. - Kanülün distal ucuna 5-0 ipek iplik kullanarak gevşek bir yarım kare düğüm önceden yerleştirin.
- Aort kökünü açığa çıkarmak ve düzeltmek için timusu, bağ dokusunu ve kalıntı ekstrakardiyak dokuları (akciğerler ve yemek borusu dahil) dikkatlice diseke edin.
NOT: Başarılı kanülasyon için çıkan aortanın yeterli uzunlukta olduğundan emin olun. - Kalbi kanüle yerleştirin ve önceden yerleştirilmiş sütürle sabitleyin.
- Koroner dolaşımdaki kalıntı kanı temizlemek için kalbi 5 mL buz gibi soğuk PBS ile durulayın.
3 Ex vivo miyokardiyal iskemi ve reperfüzyon
NOT: Global miyokardiyal iskemi, kalbin perfüzyonu basitçe durdurularak indüklenmiş; bölgesel miyokardiyal iskemi ise bir stereomikroskop altında LAD'nin geçici ligasyonu ile oluşturulmuştur.
- Alttaki pamuk pedini ayarlayarak kalbi nazikçe döndürün ve LAD'yi görüş alanının merkezine yerleştirin. PBS perfüzyonu sırasında LAD şeffaflaşmış ve çevreleyen miyokarddan net bir şekilde ayırt edilebilir hale gelmiştir.
- 8–0 polipropilen sütür taşıyan konik bir iğneyi, sol atriumun alt kenarının 1 mm altına, LAD'nin altından geçirin.
NOT: Ligasyonun neden olabileceği vasküler yaralanmaları önlemek için LAD'nin iki delme noktasının tam ortasında yer aldığından emin olun. - LAD'nin üzerine yumuşak bir pledget parçası yerleştirin.
- Ligasyon bölgesinin distalinde perfüzyonu durdurmak için sütürü sıkıca bağlayın.
- Kanüle edilmiş kalbi Langendorff aparatına aktarın ve retrograd perfüzyonu başlatın.
- Deney süresi boyunca sabit bir sıcaklığı (37 °C) korumak için kalbi su ceketli organ banyosuna daldırın.
- Pik ve kararlı durum koroner akışını izleyin (Tablo 1).
- Belirlenen miyokardiyal iskemi zaman noktalarında (sonuçlar bölümüne bakınız), perfüzyonu durdurun ve kanüle edilmiş kalbi perfüzyon aparatından çıkarın.
- Kardiyak kontraksiyonu tamamen durdurmak için kalbi derhal buz gibi soğuk KHB (4 °C) içine daldırın.
- Kalbi, önceden soğutulmuş metal kap içindeki pamuk pede geri yerleştirin ve LAD ligasyonunu çözün.
- Farmakolojik müdahale çalışmaları için bu aşamada, 30 G insülin şırıngası kullanarak enfarkte ön duvara 5 µL Interleukin-6 (IL-6, 0.1 mg/mL) enjekte edin.
- Kanüle edilmiş kalbi perfüzyon aparatına tekrar monte edin ve kardiyak perfüzyonu (reperfüzyon) yeniden başlatın.
4. Miyokardiyal hasarın ve sağkalımın değerlendirilmesi
NOT: 2,3,5-Trifeniltetrazolyum klorür (TTC) boyaması, canlı miyokardı koyu kırmızıya boyarken, enfarktüse uğramış/nekrotik doku Zamboni solüsyonu ile fikse edildikten sonra bej renkte görünür.
DİKKAT: TTC genel olarak tehlikeli kabul edilir ve hafif cilt tahrişine, ciddi göz tahrişine neden olabileceği ve solunması durumunda zararlı olduğu için dikkatli taşınması gerekir. Atıkları ve kalıntıları yerel makamların gerekliliklerine uygun olarak bertaraf edin.
- Reperfüzyondan 90 dakika sonra perfüzyonu durdurun ve kalp kasılmasını durdurmak için kalbi derhal buz soğukluğundaki KHB içerisine daldırın.
- Kanülü, TTC boyama çözeltisiyle (PBS içinde çözünmüş %1 TTC) önceden doldurulmuş 3 mL'lik bir şırıngaya bağlayın aracılığıyla üç yollu musluk.
- Kalbe 1 mL TTC solüsyonu infüze edin, infüzyonu üç kez tekrarlayın ve toplam 3 mL hacmi 15 dakika boyunca uygulayın.
- Yüzeyin kurumasını önlemek için kalbi nemli doku kağıdı ile örtün.
- Kalbi, içerisinde 3 mL TTC çözeltisi bulunan bir santrifüj tüpüne yerleştirin 4 °C gece boyunca.
- Optimal Cutting Temperature (OCT) bileşiği ile doku bloğu hazırlayın.
NOT: Doku bloğu − derecede saklanabilir80 °C bir sonraki analize kadar birkaç ay boyunca. - Doku bloğunu, OCT bileşiği kullanarak bir kriyostat tutucusuna monte edin.
- Kalbi şu kalınlıkta ardışık olarak kriyoseksiyonlayın: 50 µm ve her 10'uncuyu toplayınth kesit; kalp başına genellikle yaklaşık 8 doku kesiti elde edilir.
- Sekiz kesitin tamamını tek bir mikroskop lamı üzerine hizalayın ve bir saç kurutma makinesiyle 2–3 dakika boyunca kurutun.
- Kesitleri, Zamboni çözeltisi (ağırlık/hacim oranında %2 paraformaldehit ve %0,4 pikrik asit içeren bir fiksatif) içeren bir boyama haznesinde gece boyunca şu sıcaklıkta bekletin: 4 °C.
DİKKAT: Zamboni fiksatifi alerjik cilt reaksiyonlarına neden olabilir; genetik defektlere ve kanserojenliğe yol açtığından şüphelenilmektedir. Atıkları ve kalıntıları yerel makamların düzenlemelerine uygun olarak bertaraf edin. - Kesitleri 3 kez PBS ile yıkayın ve kesitlerin üzerini kapatma medyumu ile örtün.
NOT: TTC ile boyanmış kalp örneği oda sıcaklığında birkaç ay boyunca saklanabilir. - CellSens yazılımı ve 1,25x objektifli bir ışık mikroskobu kullanarak kalp görüntüleri elde edin.
- İnfarkt boyutunun nicelleştirilmesi için görüntü dosyalarını ImageJ platformuna aktarın.
- ImageJ menüsünden şunları seçin Görüntü -> Ayarlayın -> Renk Eşiği Renk Eşikleme (Color Threshold) penceresini açmak için (Şekil 2B).
- Kalp kesiti içerisinde küçük bir ilgi alanı (ROI) seçin ve koyu kırmızı canlı miyokard ile bej rengi infarkte/nekrotik dokuyu renk referansı olarak kullanın.
- Tıklayın Örnek şunların içinde/şurada Renk Eşiği pencereyi ayarlayın ve seçilen bölge hedef renk alanı ile tam olarak eşleşene kadar doygunluk aralığını hassaslaştırın.
- Tıklayın Seçim seçilen renge karşılık gelen alanı belirlemek için.
- ImageJ menüsünden, şunları seçin Analiz et -> ÖlçünSeçilen bölgenin piksel cinsinden bildirilen alanı, Sonuçlar penceresinde görüntülenecektir.
- Planimetrik enfarkt boyutunun hesaplanması için ölçüm verilerini bir Excel hesap tablosuna aktarın.
- İnfarktlı bölgedeki canlı miyokardı nicelleştirmek için, öncelikle IL-6'nın enjekte edildiği infarktlı ön ventrikül duvarında olmak üzere ilgi alanını (ROI) belirleyin.
- Açın ROI Yöneticisi ImageJ menüsünden ve tıklayın Ekleyin seçilen ROI'yi ROI listesine kaydetmek için (Şekil 2C).
- Canlı miyokardın (koyu kırmızı) sınırlarını belirlemek için yukarıda açıklandığı şekilde “Sample” ve “Selection” fonksiyonlarını kullanın.
- Seçilen canlı alanı “ROI Manager” listesine ekleyin, ardından seçin VE ROI ile canlı miyokard arasındaki örtüşmeyi elde etmek için.
- Canlı miyokard alanını ölçün ve seçilen ROI içindeki kardiyomiyosit sağkalım oranını hesaplayın.
NOT: TTC boyama ve enfarkt boyutu nicelendirmesine ilişkin metodolojik ayrıntılar daha önce bildirilmiştir11.
Sonuçlar
ex vivo MI platformunda, izole fare kalbinde iki iskemik protokol değerlendirilmiştir. ex vivo MI çalışmalarında yaygın olarak kullanılan global iskemi, kalbin genelinde heterojen iskemik hasarla sonuçlanmıştır. Güvenilir ve yüksek çözünürlüklü mikroskobik TTC tabanlı bir tespit yaklaşımı12 kullanılarak, atriyal miyokardın ve apikal bölgenin iskemiye karşı nispeten dirençli olduğu ve 45 dakikalık global akımsız iskemi sonrası canlı kaldığı gösterilmiştir (Şekil 2A, üst panel). Buna karşılık, bölgesel MI, LAD ligasyon bölgesinin distalindeki miyokardda lokalize iskemik hasar oluşturmuştur. Bu koşullar altında, subepikardiyal miyokardın bölümleri TTC-pozitif kalmış ve bu da canlı dokunun korunduğunu göstermiştir (Şekil 2A, alt panel). Bu bulgular, iki iskemik protokol arasında belirgin miyokardiyal sağkalım modelleri olduğunu ortaya koymaktadır.
Miyokard enfarktüsünü güvenilir ve tekrarlanabilir şekilde indüklemek için gereken minimum iskemi ve reperfüzyon süresi, izole fare kalbinde daha ayrıntılı olarak incelenmiştir. İskemi süresi 30 dk'dan 120 dk'ya çıkarıldıkça miyokardiyal hasar kademeli olarak artmıştır (Şekil 3A). Özellikle, enfarkt boyutu 30 dk (n = 3) ve 45 dk (n = 5) iskemi arasında iki katından fazla artmış ve iskemi süresi 60 dk (n = 5), 90 dk (n = 4) ve 120 dk'ya (n = 3) uzatıldığında görünürde bir platoya ulaşmıştır (Şekil 3B). Bu bulgular, miyokardiyal canlılığın 30 dk'nın üzerindeki iskemi sürelerine karşı oldukça hassas olduğunu göstermektedir. in vivo MI (ivMI, n = 5) modeli ile karşılaştırıldığında, ex vivo MI (evMI, n = 8) modeli, benzer iskemi ve reperfüzyon süreleri altında neredeyse aynı enfarkt boyutları üretmiştir (36.88% ± 3.91% vs. 37.8% ± 2.17%, p = 0.27); bu durum, miyokardiyal hasarın kristaloid perfüzyondan önemli ölçüde etkilenmediğini düşündürmektedir. Buna rağmen, evMI kalpleri, muhtemelen kristaloid perfüzyona bağlı miyokardiyal ödem nedeniyle daha kalın ventrikül duvarları ve daralmış bir ventrikül lümeni sergilemiştir (Şekil 3C).
Ekstrakardiyak etkilerden arındırılmış ve nispeten kontrollü ortamdan yararlanılarak, intramyokardiyal IL-6 uygulamasının kardiyoprotektif etkileri değerlendirilmiştir. PBS ile tedavi edilen kontrol kalplerinde, 45 dakikalık iskemi sonrası bile infarkte/nekrotik bölgede (bej) dağınık ancak ölçülebilir düzeyde canlı kardiyomiyositler (canlı CM'ler; koyu kırmızı) tespit edilmiştir (Şekil 4; %1,05 ± 0,44, SEM, n = 4). Dikkat çekici bir şekilde, intramyokardiyal IL-6 uygulaması (i.m.; oklar), ilgilenilen bölge (ROI) içinde temel olarak enjeksiyon alanı çevresinde yerleşmiş olan canlı CM miktarını anlamlı derecede artırmıştır (%4,08 ± 0,99, SEM, n = 6; p = 0,005, Student t-testi). Bu bulgular, IL-6'nın iskemik yaralanma sonrası kardiyomiyosit sağkalımını artırabileceğini göstermektedir.
Son olarak, mevcut ex vivo MI modelinin, deneysel sonuçların tekrarlanabilirliğini etkileyebilecek birkaç potansiyel tuzağı vardır. Şekil 5'te gösterildiği gibi, ligatür kayması yetersiz LAD oklüzyonuna ve yaygın miyokardiyal sağkalıma (4/168) neden olabilir; öte yandan, LAD dalları hasar gördüğünde eksik reperfüzyon meydana gelebilir (12/168). Ek olarak, aort kanülasyonu sırasında meydana gelen hava embolizasyonu da miyokardiyal hasara (oklar, 7/168) yol açarak, miktar belirleme için iskemik hasarın embolik hasardan ayırt edilmesini zorlaştırabilir. Son olarak, kalp aşırı şekilde perfüze edildiğinde (11/168) yetersiz TTC boyanması meydana gelebilir ve bu durum enfarkt alanının belirlenmesini önemli ölçüde engeller.
Şekil 1Deneysel düzeneğin şeması. Yeniden dolaşımsız, yerçekimi güdümlü sabit basınçlı Langendorff sistemi, besin açısından zengin, oksijenlendirilmiş Krebs-Henseleit tampon çözeltisini (KHB) 110 cmH2O'lık sabit bir hidrostatik basınçta iletmek üzere tasarlanmıştır.₂O. KHB öncelikle şu sıcaklığa ön ısıtılmıştır: 37 °C bir rezervuarda tutulur ve 110 cmH2O'lık sabit bir hidrostatik basıncın bulunduğu, su ceketli bir basınç kolonuna beslenir2O korundu aracılığıyla bir basınç regülatörü. Perfüzyon uygulanan kalp, sabit bir sıcaklık sağlamak amacıyla yüksekliği ayarlanabilir, su ceketli bir organ banyosuna daldırılmıştır; 37 °C deney süresi boyunca (A). Önceden soğutulmuş metal bir kap içindeki pamuk ped üzerinde kardiyoplejik durdurmanın ardından, sol ön inen (LAD) koroner arterin geçici ligasyonu ile miyokard enfarktüsü indüklenmiştir (B). İşlem, bir stereomikroskop altında gerçekleştirilmiştir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Bölgesel ve global miyokard enfarktüsü (MI) ile enfarkt boyutunun belirlenmesi. Global MI, mikroskobik TTC görüntülerindeki sarı boyanma ile belirtildiği üzere, kalbin tamamında iskemik hasara yol açar. Atriyal miyokard ve apikal bölgenin iskemiye karşı daha dirençli olduğu ve 45 dakikalık global akımsız iskemi sonrası canlı kaldığı görülmüştür (A'daki üst panel). Bölgesel MI, LAD ligasyon bölgesinin distalindeki miyokarda iskemik hasara neden olur. Bu durumda, subepikardiyal miyokardın bazı kısımları kırmızıya boyanarak canlı dokunun korunduğunu göstermektedir (A'daki alt panel). Enfarkt boyutu, enfarkte/nekrotik alan ve canlı miyokardın belirgin boyama renklerine göre sınırlandırılmasıyla ImageJ kullanılarak nicelendirilmiştir (B). İlgili bölgedeki (ROI) kardiyomiyosit sağkalımı, seçilen ROI içindeki koyu kırmızı boyanmanın yüzdesi belirlenerek hesaplanmıştır (C). Ölçek çubukları: 1 mm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: İskemi süresinin enfarkt boyutuna etkisi. İskemi süresi 30 dk'dan 120 dk'ya uzatıldıkça miyokardiyal hasar giderek kötüleşmiştir (A). Enfarkt boyutu, 30 dk (n = 3) ve 45 dk (n = 5) iskemi arasında iki kattan fazla artmış ve iskemi süresi 60 dk (n = 5), 90 dk (n = 4) ve 120 dk'ya (n = 3) uzatıldığında görünürde bir platoya ulaşmıştır (B). in vivo MI (ivMI, n = 5) modeli ile karşılaştırıldığında, ex vivo MI (evMI, n = 8) benzer iskemi sürelerinde neredeyse özdeş enfarkt boyutları üretmiştir (36.88% ± 3.91% vs. 37.8% ± 2.17%, p = 0.27, Student’s t-Testi). evMI kalpleri, muhtemelen kristaloid perfüzyona bağlı miyokardiyal ödem nedeniyle daha kalın bir ventriküler duvar ve daralmış bir ventriküler lümen sergilemiştir (C). Hata çubukları, ortalamanın standart sapmasını (SDM) temsil etmektedir. Ölçek çubukları: 1 mm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: İskemik hasarın ardından IL-6 ile artırılmış kardiyomiyosit sağkalımı. evMI modelinde IL-6'nın intramiyokardiyal (i.m.) iletimi, enfarktüs/nekrotik bölge (bej) içinde, ağırlıklı olarak IL-6 enjeksiyon bölgesinin çevresinde yerleşmiş (oklar, sol panel), ölçülebilir sayıda canlı kardiyomiyosit (canlı CM'ler; koyu kırmızı) sağlamıştır. İlgi bölgesindeki (ROI, kesikli çizgilerle belirtilmiştir) canlı CM'lerin kantifikasyonu, PBS enjeksiyonunun yalnızca küçük bir canlı miyokard fraksiyonu ile (%1.05 ± 0.44, SEM, n = 4) sonuçlandığını, buna karşın IL-6 enjeksiyonunun ROI içindeki canlı CM miktarını anlamlı şekilde artırdığını (%4.08 ± 0.99, SEM, n = 6; p = 0.005, Student’s t-testi) ortaya koymuştur. Hata çubukları, ortalamanın standart sapmasını (SDM) temsil etmektedir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Teknik hatalardan kaynaklanan yetersiz veya başarısız sonuçlar.ex vivo MI modelindeki temsili miyokardiyal hasarla gösterildiği üzere (solda), tipik TTC boyamasında canlı ve nekrotik miyokard genellikle net bir şekilde ayırt edilebilir. Bununla birlikte, çeşitli teknik hatalar yetersiz veya yorumlanamaz sonuçlara yol açabilir. Sütür kayması nedeniyle yetersiz LAD ligasyonu, uzamış iskemiye rağmen geniş çaplı miyokardiyal sağkalımla sonuçlanabilir. Ligasyon sırasında LAD dallarının hasar görmesi ve ardından yetersiz perfüze olması durumunda eksik reperfüzyon meydana gelebilir ve bu durum klinik olarak gözlemlenen “no-reflow” (akımsızlık) fenomenine benzer bir patern oluşturur. Bu bölgeler pembemsi bir renk gösterebilir (oklar). Kanülasyon prosedürü sırasında koroner dolaşıma giren hava kabarcıklarının neden olduğu mikrovasküler embolizasyon da miyokardiyal hasara yol açabilir (oklar) ve bu durum, kantifikasyon için iskemik hasarın embolik hasardan ayırt edilmesini zorlaştırır. Son olarak, kalbin aşırı perfüze edilmesi durumunda, iskeminin yanı sıra miyokardiyal hasara yol açabilen yetersiz TTC boyaması meydana gelebilir. Ölçek çubukları: 1 mm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| F-pik (n = 19) | F-steady (n = 19) | RF-pik (n = 19) | RF-steady (n = 19) | |
| Ortalamalar (mL/dak) | 2.54 | 0.78 | 2 | 0.99 |
| SD | 0.59 | 0.29 | 0.56 | 0.53 |
Tablo 1: İskemi ve reperfüzyon sırasında (RF-peak ve RF-steady) maksimal (F-peak) ve kararlı durum (F-steady) seviyelerindeki koroner akış.
Tartışma
Mevcut ex vivo MI modeli temel olarak gelişmiş Langendorff perfüzyonlu kalp sistemlerine dayanmaktadır2. Hazırlık sırasındaki yaygın bir hata, koroner dolaşıma hava kabarcıklarının girmesidir; bu durum embolik hasara yol açabilir ve iskemik hasarın değerlendirilmesini yanıltabilir. Bu sorunu önlemek için, her deneyden hemen önce perfüzyon sisteminin titizlikle incelenmesi esastır. Boru hattı sisteminde küçük hava kabarcıkları hapsolursa, kabarcıkları basınç sütununa geri itmek için KHB ile retrograd yıkama yapmak sorunun çözümüne yardımcı olabilir.
Bu protokoldeki temel adım LAD koroner arterinin ligasyonudur. Bu nedenle, öncelikle LAD'nin doğru şekilde görsel olarak tanımlanması kritik önem taşır. Çoğu durumda, kalp buz gibi soğuk PBS ile yıkandıktan sonra koroner damarlar yarı saydam hale gelir ve bu da LAD'nin çevredeki miyokarddan net bir şekilde ayırt edilmesini sağlar. Ayrıca, 8-0 Polipropilen sütüre uygulanan aşırı gerilimin LAD'yi keserek sonraki reperfüzyonu imkansız hale getirebileceği göz önüne alındığında, uygun ve becerikli bir ligasyon tekniği aynı derecede önemlidir. Bu riski en aza indirmek için, ligasyon kuvvetini dağıtmak ve koroner arteri mekanik hasardan korumak amacıyla sütür ile damar arasına uygun boyutlarda yumuşak bir pledget yerleştirilmelidir. Yine de, ligasyon kaynaklı küçük miyokard hasarları kaçınılmazdır ancak genellikle koroner perfüzyonu bozmaz veya deneyin sonucunu etkilemez. Son olarak, miyokard hasarı sıcaklığa karşı oldukça hassas olduğundan13, deney boyunca sabit bir sıcaklığın korunması kritik öneme sahiptir. Özellikle sabit basınçlı perfüzyon koşulları altında, perfüzyon kolonu ile kalp arasında ısı kaybı meydana gelebilir ve bu durum koroner akış hızına bağlı olarak dinamik bir şekilde değişir14. Dolayısıyla, bu dalgalanmalar potansiyel olarak miyokard sıcaklığında değişikliklere yol açabilir. Bu ortamda, stabil termal koşulları sürdürmek için su ceketli bir organ banyosu kullanılması oldukça istenir (Şekil 1A).
Bu teknik zorluklar aşıldığında, ex vivo MI modeli, izole fare kalbinde miyokardiyal hasar oluşturmak için güvenilir ve tekrarlanabilir bir platform sağlar (Şekil 3A). Bu nedenle, MI sonrası miyokardiyal sağkalımı incelemek, lokal olarak uygulanan terapötik müdahaleleri değerlendirmek ve solunum veya kalp hareketlerinden kaynaklanan girişimler olmaksızın yüksek çözünürlüklü görüntüleme yapmak için değerli bir deneysel sistem teşkil eder. Küresel MI protokolü teknik olarak basit olsa ve önceki çalışmalarda yaygın olarak kullanılsa da4, temel sınırlaması küresel iskemi süresinin genellikle 45 dakikadan azla sınırlı olmasıdır3. Sonuç olarak, bölgesel MI modelinin aksine, nadiren transmural bir enfarktüs oluşturur (Şekil 2).
ex vivo MI modelinin benzersiz bir özelliği, nöral regülasyon ve dolaşımdaki kan bileşenleri dahil olmak üzere sistemik etkilerin yokluğudur; bu durum araştırmacıların, terapötik müdahalelerin miyokard üzerindeki doğrudan yerel etkilerini değerlendirmelerine olanak tanır8. Bu durum, izole kardiyomiyositlerde kardiyoprotektif olduğu gösterilen IL-6 gibi sitokinler ve aşağı akış PI3K/AKT sinyal yolu için özellikle geçerlidir15. Ancak in vivo koşullarda, IL-6'nın kardiyak etkileri genellikle tutarsız ve hatta çelişkilidir; çünkü IL-6 aynı zamanda bağışıklık hücrelerini aktive eder ve doğrudan kardiyoprotektif etkilerini dengeleyebilecek inflamatuar yanıtları teşvik eder16. Bu kavramla uyumlu olarak, ex vivo modelimiz, IL-6'nın yerel intramiyokardiyal uygulamalarının iskemik yaralanma sonrası miyokard canlılığını önemli ölçüde koruduğunu ikna edici bir şekilde göstermiş17,18, IL-6'nın kardiyomiyositler üzerindeki doğrudan kardiyoprotektif etkisini desteklemiştir (Şekil 4).
Mevcut ex vivo MI modelinin çeşitli kısıtlılıklarını kabul ediyoruz. Mevcut kurulumda, kalp kasılma fonksiyonu mevcut protokolde3 değerlendirilmemiştir. Bunun nedeni, temel amacın bölgesel bir MI modelinde miyokardiyal sağkalımı karakterize etmek olması ve kasılma disfonksiyonunun iskemik yaralanma sonrası fonksiyonel bozulmayı yansıtması ancak mutlaka kardiyomiyosit ölümüne işaret etmemesidir8. Ayrıca, ex vivo MI modeli, doğası gereği in vivo ortamda MI ilerlemesine ve kardiyak yeniden şekillenmeye önemli ölçüde katkıda bulunabilecek dolaşımdaki kan bileşenlerini, bağışıklık hücrelerini ve nörohümoral etkileri dışarıda bırakır. Sistemik karmaşıklıktaki bu azalma, ex vivo MI modelinin temel bir avantajı olsa da, in vivo ortamda meydana gelebilecek enflamatuar, vasküler, nöral ve endokrin yanıtların taklit edilmesinde kullanımını sınırlar. Son olarak, in vivo MI kalplerine kıyasla artan ventriküler duvar kalınlığı ve azalmış ventriküler lümen ile kanıtlandığı üzere, kristaloid perfüzyonun miyokardiyal ödem ile ilişkili olduğu bulunmuştur. Ödemin belirgin oluşumu miyokardiyal mimariyi, doku difüzyonunu ve potansiyel olarak hücresel canlılığı değiştirebilir. Bu nedenle, mevcut model, miyokardiyal yaralanmayı ve kardiyomiyosit spesifik mekanizmaları araştırmak için kontrollü bir platform olarak kabul edilmelidir.
Buna rağmen, burada açıklanan ex vivo MI modeli, dışsal düzenleyici etkilerin yokluğunda miyokardyal sağkalımı değerlendirmek için basit ve düşük maliyetli bir platformdur. Genetik olarak modifiye edilmiş fare modellerinin artan kullanımı göz önüne alındığında, bu yaklaşım; ileri görüntüleme, elektrofizyolojik kayıt ve moleküler analizler kullanılarak kardiyoprotektif mekanizmaların araştırılması için özellikle değerli olabilir. Ayrıca model, lokalize farmakolojik veya gen tabanlı müdahaleleri sistematik olarak test etmek ve sistemik karıştırıcı faktörler olmaksızın kardiyomiyosit spesifik mekanizmaları çözümlemek için uyarlanabilir. Böylece, ex vivo MI modeli, kalp koruyucu yolların tanımlanmasını ve mekanistik olarak araştırılmasını kolaylaştıran tamamlayıcı bir deneysel platform sunmaktadır.
Açıklamalar
Yazarlar, herhangi bir çıkar çatışması olmadığını beyan ederler. Yazarlar, bu çalışmanın taslağının oluşturulmasında, veri analizinde, şekil üretiminde veya doğrulanmasında herhangi bir yapay zeka (AI) aracının veya üretken AI destekli teknolojinin kullanılmadığını beyan ederler.
Teşekkürler
Bu çalışma; Jiangsu Geriatri Derneği Genel Projesi (WO'ya JGS2026MS019), Zhenjiang Şehri Bilim ve Teknoloji Departmanı Sosyal Kalkınma Vakfı (H.Z.'ye SH2023023 ve X.L.'ye SH2023057 numaralı hibeler), FoKo Programı (ZD'ye 23/2013 numaralı hibe) ve Düsseldorf Kardiyovasküler Araştırma Enstitüsü (CARID) tarafından desteklenmiştir.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| 2,3,5-trifeniltetrazolyum klorür | Milipore | 1.08380.0100 | Kimyasallar |
| Aort kanülü | BD | 305895 (20 G) | Retro-perfüzyon |
| Aquamount | BDH | 362262H | Kriyoseksiyon |
| Terazi | Ohaus | - | Kimyasal tartımı |
| Büyük pens | AESCULAP | - | Cerrahi aletler |
| Kan gazı analizörleri | Radiometer | ABL90 FLEX PLUS | Gaz analizörü |
| Kalsiyum klorür dihidrat | Fluka | 21097 | Kimyasallar |
| Karbogen | Linde | 4040152 | Langendorff düzeneği |
| CellSens | Olympus | Version 3.1.1 | Görüntüleme yazılımı |
| Pamuk pedler | BEESana | PZN-1330900 | Cerrahi aletler |
| Lameller | Epredia | BB02400500A113MN20 | Kriyoseksiyon |
| Kriyostat | Leica | M850 | Kriyoseksiyon |
| D(+)-Glukoz susuz | Merck | 8337.1000 | Kimyasallar |
| Çift distile su | Milipore | - | Kimyasalların çözülmesi |
| Etanol (%100) | Merck | 64-17-5 | Tüplerin temizliği |
| Etanol (%70) | VWR | UN1170 | Tüplerin temizliği |
| Filtre membranı (0.2 µm) | Thermo Scientific | 8-000-230511 | Langendorff düzeneği |
| Akışölçer | Transonic | T4S410 | Langendorff düzeneği |
| Cam mikroskop lamları | Engelbrecht | 11102 | Kriyoseksiyon |
| Cam su kolonu | Homemade | - | Langendorff düzeneği |
| Hidroklorik asit | Roth | P074.1 | Kimyasallar |
| ImageJ | NIH | version 1.54g | Yazılım |
| Interleukin-6 | Biolegend | 570804 | Kimyasallar |
| İzofluran | Piramal | 14150097146754 | Kimyasallar |
| Işık mikroskobu | Olympus | BX61 | Görüntüleme |
| Magnezyum sülfat heptahidrat | Merck | 5886.1000 | Kimyasallar |
| Tıbbi akış probu | Transonic | 3PXN | Langendorff düzeneği |
| Metal kap | Homemade | - | Cerrahi aletler |
| Micro-Fine şırınga | BD | 30G / 0.3 mL | Langendorff düzeneği |
| Fare | Janvier | C57BL/6J | Hayvanlar |
| Objektif (x 1.25) | Olympus | PlanApo 1.25X/0.04 | Görüntüleme |
| OCT bileşiği | Sakura | 4583 | Kimyasallar |
| Petri kabı | Thermo Scientific | 172931 | Langendorff düzeneği |
| Fosfat tamponlu salin | Roth | 9143.1 | Kimyasallar |
| Potasyum klorür | Merck | 4936.1000 | Kimyasallar |
| Potasyum dihidrojen fosfat | Merck | 4873.1000 | Kimyasallar |
| İpek sütür | F.S.T | 18020-60 | Cerrahi aletler |
| Sodyum klorür | Sigmaaldrich | SZBD0810V | Kimyasallar |
| Sodyum hidrojen karbonat | Roth | 6885.2 | Kimyasallar |
| Sodyum piruvat | Sigmaaldrich | 113-24-6 | Kimyasallar |
| Yumuşak pledget | Deknatel | L-705 | Cerrahi aletler |
| Paslanmaz pens (8m/m) | F.S.T | 11052-10 | Cerrahi aletler |
| Paslanmaz makas | AESCULAP | BC702R | Cerrahi aletler |
| Paslanmaz makas | AESCULAP | BC257R | Cerrahi aletler |
| Stereomikroskop | Leica | MZ6 | Cerrahi aletler |
| Sütür (8-0) | Ethicon | TG-108 | Cerrahi aletler |
| Şırınga (3 mL) | B. Braun | 4617100V | Retro-perfüzyon |
| Üç yollu musluk | B. Braun | 16494C | Retro-perfüzyon |
| Tüp | Tygon | T3304-23 | Langendorff düzeneği |
| Su banyosu | HAAKE | DC1/B3 | Langendorff düzeneği |
| Zamboni solüsyonu | Morphisto | 12773.0050 | Kimyasallar |
Kaynaklar
- Pendexter CA, et al. Modified Langendorff perfusion method for extended perfusion times of rodent cardiac grafts. J Vis Exp. 2024;(208):66815.
- Bell RM, Mocanu MM, Yellon DM. Retrograde heart perfusion: the Langendorff technique of isolated heart perfusion. J Mol Cell Cardiol. 2011;50(6):940-950.
- Rossello X, Hall AR, Bell RM, Yellon DM. Characterization of the Langendorff perfused isolated mouse heart model of global ischemia-reperfusion injury: impact of ischemia and reperfusion length on infarct size and LDH release. J Cardiovasc Pharmacol Ther. 2016;21(3):286-295.
- Yang T, et al. Isolated perfused hearts for cardiovascular research: an old dog with new tricks. J Cardiovasc Transl Res. 2024;17(5):1207-1217.
- Martin TP, et al. Preclinical models of myocardial infarction: from mechanism to translation. Br J Pharmacol. 2022;179(5):770-791.
- Hurt CM, et al. Transient receptor potential vanilloid 1 regulates mitochondrial membrane potential and myocardial reperfusion injury. J Am Heart Assoc. 2016;5(9):3774.
- Herr DJ, Aune SE, Menick DR. Induction and assessment of ischemia-reperfusion injury in Langendorff-perfused rat hearts. J Vis Exp. 2015;(101):52908.
- Lindsey ML, et al. Guidelines for experimental models of myocardial ischemia and infarction. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2018;314(4):H812-H838.
- Zhu H, et al. Sfrp1 as a pivotal paracrine factor in the trained pericardial stem cells that foster reparative activity. Stem Cells Transl Med. 2023;12(12):137-150.
- Ouyang W, et al. An immunostaining-based approach for assessing myocardial viability in the infarcted mouse hearts. Front Cardiovasc Med. 2025;12:1598314.
- Ding Z, Zhang H, Bouvain P, Ding Z, Flögel U. A microscopic 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride assay for accurate and reliable analysis of myocardial injury. J Vis Exp. 2025;(225):68596.
- Ding Z, et al. A refined TTC assay precisely detects cardiac injury and cellular viability in the infarcted mouse heart. Sci Rep. 2024;14(1):25214.
- El Farissi M, et al. Hypothermia for reduction of myocardial reperfusion injury in acute myocardial infarction: closing the translational gap. Circ Cardiovasc Interv. 2021;14(8):010326.
- Ding Z, Gödecke A, Schrader J. Contribution of cytochrome P450 metabolites to bradykinin-induced vasodilation in endothelial NO synthase deficient mouse hearts. Br J Pharmacol. 2002;135(3):631-638.
- Smart N, et al. IL-6 induces PI 3-kinase and nitric oxide-dependent protection and preserves mitochondrial function in cardiomyocytes. Cardiovasc Res. 2006;69(1):164-177.
- Broch K, et al. Randomized trial of interleukin-6 receptor inhibition in patients with acute ST-segment elevation myocardial infarction. J Am Coll Cardiol. 2021;77(15):1845-1855.
- Fontes JA, Rose NR, Čiháková D. The varying faces of IL-6: from cardiac protection to cardiac failure. Cytokine. 2015;74(1):62-68.
- Preda A, et al. IL-6 in the spotlight: from cardiovascular pathophysiology to therapy. Eur J Clin Invest. 2026;56(1):e70161.
Yeniden basım ve izinler
Bu makale yayımlandı
Video yakında