Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Araştırma makalesi

Kronik Kalp Yetmezliğinde Elektroakupunkturun Merkezi Mekanizmaları: Nucleus Tractus Solitarius'un Kantitatif Proteomiğinden Elde Edilen Veriler

172 görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/73867

⸱

18 Eylül 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1School of Chinese Medicine, Anhui University of Chinese Medicine, 2Anhui Province Key Laboratory of Meridian Viscera Correlationship, 3School of Chinese Medicine, Shandong University of Traditional Chinese Medicine, 4Department of Rehabilitation Medicine, Zhongda Hospital, Southeast University, 5School of Acupuncture and Tuina, Anhui University of Chinese Medicine, 6College of Integrated Chinese and Western Medicine (School of Life Science), Anhui University of Chinese Medicine, 7South China Research Center for Acupuncture and Moxibustion, Medical College of Acu-Moxi and Rehabilitation, Guangzhou University of Chinese Medicine

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Elektroakupunktur, nucleus tractus solitarius içindeki nöronal aktiviteyi geri getirerek kronik kalp yetmezliğini ve patolojik kardiyak yeniden şekillenmeyi hafifletir. Bu terapötik merkezi nöromodülasyon, aday biyolojik hedef transkripsiyon faktörü YY1'in yukarı regülasyonu ile ilişkilidir.

Özet

Kronik kalp yetmezliği (KKY), otonom disregülasyon ve sempatik aşırı aktivasyonun tetiklediği, küresel çapta kardiyovasküler mortalitenin önde gelen nedenlerinden biridir. Elektroakupunktur (EA), merkezi nöromodülasyon yoluyla kardiyoprotektif etkiler gösterse de, temel bir otonom entegrasyon merkezi olan nucleus tractus solitarius (NTS) içindeki spesifik moleküler hedefleri belirsizliğini korumaktadır. Bunu araştırmak amacıyla, sol anterior descendens koroner arter ligasyonu yoluyla KKY sıçan modeli oluşturulmuştur. Sıçanlar, yedi ardışık gün boyunca bilateral HT7 akupunktur noktalarından EA uygulamasına tabi tutulmuştur. Kardiyak fonksiyon ve miyokardiyal hasar; ekokardiyografi, enzimle bağlantılı immünosorbent analizler ve histolojik boyama kullanılarak değerlendirilmiştir. NTS nöral aktivitesi, c-Fos immünofloresansı ve in vivo elektrofizyoloji ile analiz edilmiştir. Moleküler mekanizmalar, kantitatif proteomik ve biyoinformatik kullanılarak araştırılmış; temel hedefler kantitatif PCR ve Western blotting ile doğrulanmıştır. EA, sol ventrikül ejeksiyon fraksiyonunu iyileştirmiş, miyokardiyal fibrozisi hafifletmiş ve serum kalp yetmezliği belirteçlerini azaltmıştır. Eş zamanlı olarak EA, NTS içindeki spontan nöronal ateşleme hızlarını, yerel alan potansiyeli enerjisini ve c-Fos ekspresyonunu restore etmiştir. Proteomik profilleme, EA tarafından modüle edilen 85 temel diferansiyel eksprese protein tanımlamıştır. Downregüle olan 58 ve upregüle olan 27 proteinin fonksiyonel stratifikasyonu, bu proteinlerin sırasıyla hücre dışı matris organizasyonu ve ATP-bağımlı kromatin yeniden düzenlenmesine katıldığını ortaya koymuştur. Topolojik ağ haritalama, yolak zenginleştirme ve doku ekspresyon profillemesini entegre eden kademeli tarama yaklaşımı, transkripsiyon faktörü YY1'i yüksek yanıt veren bir aday hedef olarak belirlemiştir. In vivo doğrulama, EA'nın YY1 ekspresyonunu upregüle ettiğini onaylamıştır. Genel olarak EA, patolojik kardiyak yeniden şekillenmeyi hafifletmiş ve NTS nöronal aktivitesini restore etmiştir. YY1, bu merkezi nöromodülasyonla ilişkili bir aday hedef olarak tanımlanmış ve KKY'de EA etkilerinin altında yatan mekanizmalara dair moleküler içgörü sağlamıştır.

Giriş

Kronik kalp yetmezliği (KKY), çeşitli kardiyovasküler patolojilerin son evresi olarak yaygın bir şekilde kabul edilmekte ve dünya çapında kardiyovasküler ölümlerin önde gelen nedeni olmaya devam ederek küresel sağlık sistemleri üzerinde büyük bir yük oluşturmaktadır1. KKY'nin patofizyolojik ilerlemesi, temel olarak sürekli sempatik aşırı aktivasyon ve parasempatik çekilme ile karakterize otonom sinir sistemi düzensizliği tarafından yönlendirilir2. Bu nedenle, otonom homeostazın yeniden sağlanması, patolojik kardiyak yeniden şekillenmeyi azaltmak ve genel kardiyak fonksiyonu iyileştirmek için kritik bir terapötik strateji olarak değerlendirilmektedir3.

Elektroakupunktur (EA), geleneksel akupunkturun modern bir gelişimi olup kardiyovasküler durumların yönetimindeki klinik etkinliğiyle yaygın bir kabul görmüştür4. Önceki çalışmalarımız da dahil olmak üzere kapsamlı araştırmalar, bu tedavinin öncelikle merkezi otonom sinir sistemini modüle ederek önemli kardiyoprotektif etkiler gösterdiğini vurgulamıştır. Özellikle, Shenmen (HT7) akupunktur noktasına uygulanan EA'nın, hedeflenmiş merkezi nöral mekanizmalar aracılığıyla aşırı sempatik çıkışı etkili bir şekilde baskılayabildiğini ve sempatovagal dengeyi yeniden kurabildiğini, böylece CHF'nin patolojik ilerleyişini hafiflettiğini göstermişiz5,6,7,8.

Medulla oblongatada bulunan nucleus tractus solitarius (NTS), merkezi otonom dengenin sürdürülmesi için hayati bir entegrasyon merkezidir. Kardiyovasküler refleksler ve periferik duyusal girdiler için birincil aktarma istasyonu olarak görev yapar ve sempatik ile vagal tonus arasındaki dinamik dengeyi düzenler9. Anatomik ve fonksiyonel önemine rağmen, CHF için uygulanan EA tedavisi sırasında bu kritik beyin sapı merkezindeki spesifik moleküler değişiklikler büyük ölçüde bilinmemektedir. Biyoenformatik analizle birleştirilmiş ileri yüksek kapasiteli proteomik, bu merkezi nörobiyolojik süreçte yer alan karmaşık protein ağlarını ve sinyal kaskadlarını tarafsız bir şekilde haritalamak için güçlü bir araç sunar10.

Bu nedenle, bu çalışma HT7 akupunktur noktasındaki EA'nın, CHF'de kalp fonksiyonu ve NTS nöronal aktivitesi üzerindeki etkilerini incelemeyi ve EA tedavisiyle ilişkili NTS içindeki moleküler değişiklikleri karakterize etmeyi amaçlamıştır. İn vivo elektrofizyolojiyi kantitatif proteomik, biyoinformatik analiz ve moleküler doğrulama ile entegre ederek bu çalışma, CHF'de EA aracılı merkezi nöromodülasyonla ilişkili aday moleküler hedefleri belirlemeyi hedeflemiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Omurgalı hayvanları içeren tüm yöntemler, AHUCM-rats-2024145 onay numarası ile Anhui Çin Tıbbı Üniversitesi Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi ile uyumlu olarak gerçekleştirilmiştir. Kullanılan reaktifler ve ekipmanlar Malzemeler Tablosu'nda listelenmiştir.

Hayvan hazırlığı ve gruplandırma

Tüm deneylerde, 8 haftalık ve 200 ila 250 g ağırlığında, temiz sınıfa ait erkek Sprague-Dawley sıçanlar kullanılmıştır. Hayvanlar, 24 ± 2 °C sıcaklık ve %50–60 bağıl nemde tutulan kontrollü bir ortamda, standart 12 saatlik ışık-karanlık döngüsünde barındırılmıştır. Tüm sıçanların yeme ve suya serbest erişimi sağlanmış ve herhangi bir deneysel işlemden önce 1 haftalık alışma sürecine tabi tutulmuşlardır.

Fonksiyonel ve merkezi sinirsel aktivitenin değerlendirildiği Deney I için, 24 sıçan rastgele altışarlı dört gruba ayrılmıştır: Sham, CHF, EA ve Sham EA grupları (Şekil 1A). Moleküler hedeflerin ve yüksek kapasiteli proteomiğin değerlendirildiği Deney II için ise, 36 sıçan rastgele on ikişarlı üç gruba atanmıştır: Sham, CHF ve EA. Örneklem büyüklükleri, istatistiksel geçerliliği sağlarken hayvan refahı etiğine ve azaltma ilkesine bağlı kalmak amacıyla Kaynak Denklemi Yöntemi baz alınarak belirlenmiştir (Deney I için E değeri = 20; Deney II için E değeri = 33)11. Bu örneklem büyüklüğü stratejisi, kardiyovasküler hastalıklar için EA üzerine yapılan önceki çalışmalarda kullanılan protokollerle tutarlıdır8,12. Post hoc güç analizleri, 0,90'ı aşan istatistiksel gücün bu dağılımın yeterliliğini desteklediğini göstermiştir. Ön fonksiyonel değerlendirmelerin terapötik etkinlik eksikliğine işaret etmesi nedeniyle Sham EA grubu Deney II'den hariç tutulmuştur.

Kronik kalp yetmezliği modelinin oluşturulması

Sıçanlar cerrahi işlemden önce 12 sa boyunca aç bırakılmış ve suya serbest erişimleri sağlanmıştır. Anestezi %3 isoflurane ile indüklemiş ve işlem boyunca %1,5%–2% isoflurane ile sürdürülmüştür. İsoflurane uçucu bir anestezik olduğu için uygun bir gaz tahliye sistemi kullanılmış ve mesleki maruziyeti önlemek amacıyla işlem iyi havalandırılan bir alanda gerçekleştirilmiştir.

Standart ekstremite elektrokardiyogramları (EKG) sürekli olarak kaydedildi. Kalbi açığa çıkarmak için sol torakotomi gerçekleştirildi ve sol anterior descended koroner (LAD) arter, sol atriyal apandisin 2 ila 3 mm altına 7-0 emilmeyen bir sütür kullanılarak kalıcı olarak bağlandı13. Başarılı iskemi, EKG üzerinde en az 0,2 mV'luk bir ST segment yükselmesi saptanarak doğrulandı (Şekil 1B). Enfeksiyonu önlemek ve ağrıyı hafifletmek amacıyla ameliyat sonrası üç ardışık gün boyunca günlük olarak intraperitonal penisilin (200.000 U/mL) ve subkutan karprofen (5 mg/kg) enjeksiyonları uygulandı.

Sham kontrol kohortu için, LAD koroner arter ligasyonu yapılmaksızın, eşleşen anatomik konuma yüzeysel iğne yerleşimini takiben özdeş bir torakotomi prosedürü uygulanmıştır. Özdeş postoperatif bakım ve izleme sağlanmıştır. Ekokardiyografik değerlendirme, cerrahi sonrası 4. haftada gerçekleştirilmiştir. Sol ventrikül ejeksiyon fraksiyonu (LVEF) ≤45%8 olduğunda (Şekil 1C), modelin başarıyla kurulduğu kabul edilmiştir. Bu kriterleri karşılamayan, preoperatif bazal EKG anomalileri gösteren veya erken ölüm yaşayan hayvanlar sistematik olarak dışlanmıştır. Dışlanan hayvanların yerini hemen doldurmak ve tekdüze bir örneklem büyüklüğünü korumak amacıyla, ek sıçanlara özdeş cerrahi protokoller uygulanmıştır.

Elektroakupunktur müdahalesi

Kabul görmüş karşılaştırmalı anatomik protokollere14 uygun olarak, El-Shaoyin Kalp Meridyenindeki bilateral HT7 akupunkturları, transverse wrist crease'in palmar yüzünde, ulnar kenara yakın, flexor carpi ulnaris tendonunun radial çöküntüsünün doğrudan içinde belirlendi. Yerel bölge rutin olarak dezenfekte edildi. İki adet steril tek kullanımlık akupunktur iğnesi (0.25 x 25 mm), her bir HT7 akupunktur bölgesine 2 ila 3 mm hedef derinliğe kadar dik olarak ilerletildi ve tamamen aynı akupunktur bölgesi içinde kalacak şekilde yaklaşık 1 mm aralıkla konumlandırıldı. Video dokümantasyonu için, yerleştirme derinliği, iğne şaftının yerleştirme öncesinde 3 mm pozisyonundan önceden işaretlenmesiyle görsel olarak doğrulandı.

Yerelleştirilmiş bir elektrik devresi oluşturmak için bir iğne EA cihazının katot terminaline, bitişiğindeki iğne ise anot terminaline bağlandı (Şekil 1D). İzofluran anestezisi altında, birbirini takip eden yedi gün boyunca günlük 30 dakika boyunca, ilgili uzuvlarda gözlemlenebilir ancak hafif kas seğirmeleri oluşturacak şekilde kalibre edilmiş 1 mA şiddetinde ve 2 Hz sabit frekansta sürekli bir elektrik dalga formu uygulandı.

Spesifik olmayan somatosensör yanıtları hesaba katmak için sham müdahale kohortuna minimal bir iğneleme protokolü uygulanmıştır15,16. Steril iğneler, elektrik kabloları bağlanmadan veya akım verilmeden, 30 dakikalık anestezik süresine uygun olarak, aynı HT7 bölgelerine 0.5–1 mm derinliğinde yüzeysel olarak yerleştirilmiştir. Bazal Sham ve CHF kontrol grupları, iğneleme veya elektriksel stimülasyon yapılmadan, yedi ardışık gün boyunca günlük aynı izofluran maruziyetine (günlük 30 dakika boyunca %1.5–%2 izofluran) tabi tutulmuştur. Bu prosedür, tüm deneysel kohortlarda anestezik baz hattını standartlaştırmış ve tekrarlayan volatil anestezinin tetikleyebileceği potansiyel nörosupresif veya kardiyoprotektif artefaktlar kontrol altına alınmıştır.

Ekokardiyografi değerlendirmesi ve hayvan ötanazisi

Müdahalenin ardından, sıçanlar indüksiyon için %3 ve idame için %1 isoflurane ile anestezi altına alınmış ve hayvan platformuna sırt üstü pozisyonda sabitlenmiştir. Göğüs kılları bir epilasyon maddesi kullanılarak dikkatlice temizlenmiş ve açığa çıkan cilde homojen bir şekilde akustik kuplaj maddesi uygulanmıştır. Kardiyak fonksiyon, 18 MHz eko transdüser ile donatılmış bir dijital ultrason sistemi kullanılarak değerlendirilmiştir. LVEF ve sol ventrikül fraksiyonel kısalmasını (LVFS) ölçmek için M-mod ekokardiyografi kaydedilmiş ve nihai analiz için 3 teknik tekrardan elde edilen ortalama değer hesaplanmıştır.

Sonraki kan kaybını ve pıhtılaşmayı önlemek ve enzim bağlı immünosorbent analiz (ELISA) için örnek kalitesini sağlamak amacıyla, hayvanlar anestezi altındayken abdominal aortadan kan alındı. Sıçanlar, kalp atışı ve solunum durana kadar %5 izofluran ile sürekli indüksiyon uygulanarak hemen ötanize edildi.

Doku örnekleri daha sonra deneysel tasarıma göre paylaştırıldı. Deney I için, hematoksilin ve eozin (HE)/Masson boyaması için kalp ve c-Fos immunofloresansı için beyin dokusu toplamak amacıyla grup başına 3 sıçan kullanıldı. Geri kalan üç sıçan in vivo elektrofizyoloji için ayrıldı. Deney II için, proteomik analizler amacıyla grup başına altı sıçanın bilateral NTS dokuları çıkarıldı. Geri kalan altı sıçanın dokuları moleküler doğrulama için toplandı: üçü Western blotting ve qPCR için, üçü ise yalnızca qPCR için kullanıldı.

Enzim bağlı immünosorbent assay

Toplanan kan örneklerinin 4 °C'de 10–20 dk boyunca doğal olarak pıhtılaşması sağlandı. Serumun ayrılması için örnekler 4 °C'de 1.000 x g hızda 15 dk boyunca santrifüj edildi ve süpernatanlar toplandı. Analiz hemen gerçekleştirilmediğinde, serum örnekleri ihtiyaç duyulana kadar −80 °C'de saklandı. N-terminal pro-beyin natriüretik peptid (NT-proBNP) ve kardiyak troponin T (cTnT) serum konsantrasyonları, standart talimatlara uygun olarak spesifik ELISA kitleri kullanılarak belirlendi. Absorbans değerleri ölçüldü ve biyobelirteç seviyeleri standart eğrilere göre hesaplandı.

Histolojik ve immünofloresan boyama

Toplanan kalp dokuları, önceden soğutulmuş %0,9 sodyum klorür çözeltisi ile durulandı, apeksin 5 mm üzerinden kesildi ve parafine gömüldü. Doku kesitleri deparafinize edildi ve yeniden hidrate edildi. HE boyaması, 10 dakika hematoksilin uygulamasının ardından 2,5 dakika eozin karşı boyama yapılarak gerçekleştirildi. Masson boyaması, 60 saniye hematoksilin ve 30–60 saniye Masson trikrom uygulanarak gerçekleştirildi. Kesitler %6–8'lik fosforik asitte farklılaştırıldı ve 5 dakika boyunca açık yeşil ile karşı boyandı. Miyokardiyal fibrozisi değerlendirmek için kollajen hacim fraksiyonu (CVF) nicelendirildi.

Toplanan beyin dokuları %4'lük paraformaldehit ile fikse edildi, dereceli sükroz çözeltilerindeydehidre edildi ve 30 µm kalınlığında kesitler alındı. Paraformaldehit toksik ve şüpheli bir karsinojen olduğu için, uygun kişisel koruyucu ekipman giyilmiş halde kimyasal çeker ocak içerisinde çalışıldı. Kesitler, %0,5 Triton X-100 ve %3 sığır serum albümini içeren bir tamponla bloke edildi, ardından c-Fos'a karşı bir primer antikor ile 4 °C'de gece boyunca inkübe edildi. Kesitler daha sonra fosfat tamponlu salin ile yıkandı ve karşılık gelen sekonder antikorlar ile oda sıcaklığında karanlıkta 2 saat boyunca inkübe edildi. Kesitler, 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) içeren bir floresans söndürme çözeltisi ile lam üzerine monte edildi ve c-Fos-pozitif nöronların görüntülemesi yapıldı.

In vivo elektrofizyoloji

Sıçanlar, indüksiyon için %3 ve idame için %1 izofluran ile anestezi altına alınmış ve beyin stereotaksik aparatına sabitlenmiştir. Kafa derisi tıraş edilmiş ve dezenfekte edilmiştir. Bregma'yı açığa çıkarmak için orta hat boyunca bir insizyon yapılmış ve dura mater uzaklaştırılmıştır. Bregma'ya göre şu stereotaksik koordinatlar baz alınarak NTS bölgesi üzerine hassas bir kraniyal delik açılmıştır: anteroposterior (AP) ±12.6 mm, mediolateral (ML) ±0.9–2.1 mm ve dorsoventral (DV) ±7.6–8.1 mm.

Elektrofizyolojik kayıtlar tamamlandıktan sonra, elektrot ucunun kesin stereotaksik konumu doğrulandı. Küçük bir elektrolitik lezyon oluşturmak için kayıt elektroduna 10 s boyunca kısa süreli 1 mA doğrudan akım uygulandı. Deney sonrası beyin sapı kesitlere ayrıldı ve lezyon hattının anatomik olarak NTS içinde yer aldığı histolojik olarak onaylandı.

Sekiz kanallı (2 x 4) bir mikroelektrot dizisi implante edildi ve motorlu bir mikromanipülatör kullanılarak 5 µm/s hızla hedef beyin bölgesine yavaşça ilerletildi. Stabil nöral aktivite sağlandığında, 400 s boyunca sürekli kayıtlar alındı. Nöronal spike boşalımlarını (150–8,000 Hz'de filtrelenmiş, örnekleme hızı 40 kHz) ve lokal alan potansiyellerini (LFP; 0.7–400 Hz'de filtrelenmiş, örnekleme hızı 1 kHz) yakalamak için çok kanallı bir veri toplama sistemi kullanıldı.

Tipik yüksek genlikli girişim sinyallerini ve artifaktları dalga formu çapraz korelasyonu aracılığıyla elemek için spike-sorting yazılımı kullanılmıştır. Sonraki nöronal sinyal analizi, nöral analiz yazılımı kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Nöronlar, yalnızca spontan ortalama ateşleme hızları >2 Hz olduğunda ve >3:1 oranında stabil bir sinyal-gürültü oranını koruduklarında aktif olarak sınıflandırılmıştır. 2 Hz eşiği, otonomla ilişkili NTS nöronlarının belirlenmiş fizyolojik özelliklerine dayanarak seçilmiştir; bu eşik, ağırlıklı olarak sessiz hücreleri ve düşük frekanslı solunum-ritmik patlamaları etkili bir şekilde dışlayarak, analizin bazal kardiyovasküler düzenlemeyi yöneten tonik olarak aktif nöronlara odaklanmasını sağlamıştır17,18,19,20. Ortalama nöronal ateşleme frekansı ve spike boşalım raster grafikleri bu kriterlere göre oluşturulmuştur. Nöral osilatuvar enerji karakteristiklerini değerlendirmek için 2D LFP enerji spektrogramları ve 3D güç spektral yoğunluğu (PSD) topografyaları oluşturulmuştur.

Kayıt işleminin ardından insizyon sütüre edildi ve sıçanlar anesteziden tamamen uyanana kadar izlendi. İntraperitonal enjeksiyon yoluyla penisilin uygulanırken, üç ardışık gün boyunca günlük olarak karprofen (5 mg/kg, s.c.) verildi.

Veriden bağımsız kazanım kantitatif proteomik analizi

Toplam protein, bir lizis tamponu ile ekstrakte edildi ve bisinkoninik asit yöntemiyle miktar tayini yapıldı. Proteinler denatüre edildi, redüktif alkilasyona tabi tutuldu ve 37 °C'de 2 saat boyunca tripsin ile sindirildi. Elde edilen peptitler C18 kolon kullanılarak tuzdan arındırıldı, 45 °C'de konsantre edildi ve sonraki kütle spektrometrisi analizi için yeniden süspanse edildi.

Peptidler, %96 tampon A (su içinde %0,1 formik asit) ile dengelenmiş bir tuzak kolona (5 µm C18, 300 µm x 5 mm) yüklendi. Peptidler, tampon A ve tampon B'nin (%80 asetonitril içinde %0,1 formik asit) titizlikle optimize edilmiş bir gradyanı kullanılarak, yüksek verimli bir ultra yüksek performanslı sıvı kromatografi analitik kolonunda ayrıştırıldı.

Kütle spektrometrisi, 1,9 kV'luk bir elektrospray voltajı ile pozitif iyon veri-bağımsız kazanım (DIA) modunda gerçekleştirilmiştir. Tam kütle spektrometre taramaları, 240.000 çözünürlükte, 500% otomatik kazanç kontrolü (AGC) hedefi ve 3 ms maksimum enjeksiyon süresi ile 380 ila 980 m/z kütle aralığında elde edilmiştir. MS/MS spektrumları 80.000 çözünürlükte (AGC hedefi: 500%; maksimum enjeksiyon süresi: 3 ms; RF lens genliği: 40%) elde edilmiştir. Prekürsör iyonlar, 0,6 s'lik tanımlanmış bir döngü süresi altında, 2 Th'lık bir izolasyon penceresi ve 25% normalize edilmiş çarpışma enerjisi ile yüksek enerjili çarpışmalı ayrışma kullanılarak fragmente edilmiştir.

Ham kütle spektrometri verileri DIA-NN yazılımı kullanılarak işlenmiştir. Dahili derin öğrenme algoritması kullanılarak bir spektral kütüphane oluşturulmuş ve trypsin sindirimi ile en fazla 2 kaçırılmış kesim (missed cleavage) parametreleri ile Rattus norvegicus referans proteom veri tabanına karşı kantifikasyon için "match-between-runs" fonksiyonu uygulanmıştır. Nihai kantitatif protein matrisi, hem öncül-iyon hem de protein düzeylerinde %1'lik katı bir yanlış keşif oranı (false discovery rate) eşiği kullanılarak filtrelenmiştir.

Biyoinformatik analizi ve hub gen madenciliği

Biyoenformatik analizler ve veri görselleştirmeleri, öncelikle özelleşmiş ağ görselleştirme yazılımlarıyla birlikte R programlama ortamı kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Metodolojik şeffaflığı ve tekrarlanabilirliği sağlamak amacıyla, bu analitik süreçler boyunca kullanılan tüm özel R betikleri Ek Dosya 1'de sunulmuştur. İlk veri kalite kontrolü ve genel dağılım değerlendirmeleri ropls paketi kullanılarak yapılmıştır. Protein tanımlama/nicelik belirleme genel istatistikleri derlenmiş; üç grup arasında kısmi en küçük kareler ayrım analizi (PLS-DA) uygulanmış; ikili karşılaştırmalar için ortogonal kısmi en küçük kareler ayrım analizi (OPLS-DA) gerçekleştirilmiş ve pheatmap paketi kullanılarak örnek korelasyon ısı haritaları oluşturulmuştur.

Temel diferansiyel olarak eksprese edilen proteinler; p-değeri <0,05, kat değişimi (fold change) >1,2 ve projeksiyonda değişken önemi (VIP) skoru >1,0 eşik değerleri kullanılarak taranmıştır. Çift yanardağ grafikleri (double volcano plots) ggplot2 paketi kullanılarak oluşturulmuş, kesişimler ggVennDiagram paketi kullanılarak belirlenmiş ve kesişen proteinleri görselleştirmek için pheatmap paketi kullanılarak hiyerarşik kümeleme ısı haritaları çizilmiştir. Gen Ontolojisi (GO) ve Kyoto Gen ve Genom Ansiklopedisi (KEGG) zenginleştirme analizleri, Enrichr veri tabanına dayalı olarak enrichR paketi kullanılarak, yukarı regüle olan ve aşağı regüle olan proteinler için ayrı ayrı gerçekleştirilmiştir.

Protein-protein etkileşim ağını oluşturmak için tüm diferansiyel eksprese proteinler, 0.4 güven eşiği ile STRING veri tabanına eşlendi. Etkileşim verileri ağ görselleştirme yazılımına aktarıldı. Topolojik skorları hesaplamak için cytoHubba eklentisi uygulandı ve düğüm renk derinliğine göre en yüksek skorlu ilk 18 gen çıkarıldı. 18 hub adayı yol zenginleştirme analizine tabi tutuldu ve Genotype-Tissue Expression (GTEx) veri tabanı kullanılarak insan dokularındaki ekspresyon seviyelerini değerlendirmek üzere en belirgin ilk 10 protein seçildi. İnsan beyin ekspresyon seviyeleri ve ağ topolojik skorlarına göre en kritik hub gen belirlendi. Spesifik hub gen ile ilişkili alt akış transkripsiyon faktörlerini ve histon modifikasyonlarını tahmin etmek için Cistrome Data Browser kullanıldı.

Western blot ve kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu

Toplam protein, fenilmetansülfonil florür lizis tamponu, PMSF ve fosfataz inhibitörleri içeren bir lizat karışımı kullanılarak NTS dokularından ekstrakte edildi. Örnekler, ultrasonik bir hücre parçalayıcı ile homojenize edildi ve süpernatantları toplamak için 4 °C'de 20 dk boyunca 13,800 x g hızında santrifüjle döndürüldü. Protein konsantrasyonları, bisinkoninik asit protein analiz kiti kullanılarak belirlendi. Her örnekten toplam 20 µg protein, %10 sodyum dodekil sülfat-poliakrilamid jel elektroforezi ile ayrıldı ve ardından poliviniliden florür membranlara aktarıldı.

Membranlar, oda sıcaklığında 1 saat boyunca %5 yağsız süt içeren Tris-tamponlu salin Tween (TBST) ile bloke edilmiş ve housekeeping protein olarak β-actin ile Yin Yang 1 (YY1) proteinini hedefleyen spesifik primer antikorlarla 4 °C'de gece boyunca inkübe edilmiştir. Membranlar TBST ile üç kez 5 dakika boyunca yıkanmış ve oda sıcaklığında 1,5 saat boyunca horseradish peroksidaz-konjuge sekonder antikor ile inkübe edilmiştir. Hedef bantlar, geliştirilmiş kemilüminesans kiti kullanılarak görselleştirilmiş, bir görüntüleme sistemi ile yakalanmış ve β-actin'e göre nicelendirilmiştir.

Toplam RNA, bir RNA ekstraksiyon reaktifi kullanılarak NTS dokularından ekstrakte edildi. RNA konsantrasyonu ve saflığı bir spektrofotometre kullanılarak ölçüldü ve bir ters transkripsiyon kiti kullanılarak birinci zincir cDNA sentezlendi. Kantitatif gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (PCR), bir gerçek zamanlı PCR sisteminde SYBR Green PCR kiti kullanılarak gerçekleştirildi. Amplifikasyon için kullanılan spesifik primer dizileri ve ilgili NCBI Referans Sekans erişim numaraları şunlardı: YY1 (NM_001002271.1), ileri 5'-AGCGTTCGTTGAGAGCTCAA-3' ve geri 5'-AGCCTTCGAATGTGCACTGA-3'; DPF2 (NM_001014264.1), ileri 5'-TGTGATGACTGTGACCGTGG-3' ve geri 5'-TCCAAACACAGGTGGCAACT-3'; DMAP1 (NM_001007705.1), ileri 5'-GGTGTGACATTACGGAGCCA-3' ve geri 5'-TCCAGCAGCATCTGTTCCAG-3'; ve gliseraldehit-3-fosfat dehidrogenaz (GAPDH) (NM_017008.4), ileri 5'-GGCACAGTCAAGGCTGAGAATG-3' ve geri 5'-ATGGTGGTGAAGACGCCAGTA-3'. Göreceli mRNA ekspresyon seviyeleri 2-ΔΔCt yöntemi kullanılarak hesaplandı ve internal referans gen GAPDH'ye göre normalize edildi.

İstatistiksel analiz

Tüm deneysel veriler istatistiksel yazılımlar kullanılarak analiz edildi ve ortalama ± standart sapma (SD) olarak sunuldu. Normallik Shapiro-Wilk testi ile değerlendirildi ve varyans homojenliği Brown-Forsythe testi kullanılarak analiz edildi.

İki bağımsız grup arasındaki karşılaştırmalar için, normallik kriterlerini karşılayan verilerde Student's t-testi veya eşli t-testi kullanılmıştır. Normallik varsayımlarını karşılamayan veriler, Mann-Whitney U testi veya Wilcoxon işaretli sıralama testi kullanılarak analiz edilmiştir. Birden fazla grup arasındaki karşılaştırmalar için, normallik ve homojenlik varsayımları karşılandığında, tek yönlü varyans analizi ve ardından Holm-Sidak post hoc testi uygulanmıştır. Bu varsayımların karşılanmadığı durumlarda ise Kruskal-Wallis H testi ve ardından Dunn post hoc testi kullanılmıştır.

Korelasyonlar, R'daki Hmisc paketi kullanılarak hesaplanan Pearson korelasyon katsayısı ile değerlendirildi. Çoklu testlere bağlı olarak artan tip I hata oranını kontrol etmek amacıyla, ilgili p-değerleri stats paketi aracılığıyla Benjamini-Hochberg yanlış keşif oranı yöntemi kullanılarak düzeltildi. Genel istatistiksel anlamlılık düzeyi p <0.05 olarak belirlendi.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Elektroakupunktur, kronik kalp yetmezliği olan sıçanlarda kalp fonksiyonlarını iyileştirir ve miyokardiyal hasarı azaltır

EA'nın CHF üzerindeki etkilerini değerlendirmek için, LAD koroner arter ligasyonu aracılığıyla sıçır modeli oluşturulmuş, ardından spesifik EA veya Sham EA müdahaleleri uygulanmıştır. Ekokardiyografi, biyokimyasal analizler ve histolojik boyama dahil olmak üzere sistematik değerlendirmeler yapılmıştır (Şekil 2A). Fonksiyonel ol...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Bu çalışma, CHF sıçan modelinde HT7 akupunktundaki EA'nın merkezi mekanizmalarını araştırmıştır. Fizyolojik ve histolojik veriler, EA'nın LVEF'yi iyileştirdiğini ve miyokardiyal fibrozisi azalttığını göstermiştir. Bu periferik değişikliklerle paralel olarak, in vivo elektrofizyolojik kayıtlar ve nöral haritalama, EA'nın NTS içindeki nöronal ateşleme hızlarını geri kazandırdığını desteklemiştir. Kütle spektrometrisi tabanlı proteomik aracılığıyla NTS'nin moleküler manzarası haritalanmış ve anormal ekspresyon paternleri mü...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Tüm yazarlar herhangi bir çıkar çatışması olmadığını beyan ederler. Yazarlar ayrıca, metnin hazırlık sürecinin hiçbir aşamasında yapay zeka araçlarının kullanılmadığını beyan ederler.

Teşekkürler

Bu çalışmaya katkıda bulunan tüm araştırmacılara içten teşekkürlerimizi sunar ve deney hayvanlarının fedakarlığını saygıyla anarız. Bu çalışma, Çin Ulusal Temel Araştırma ve Geliştirme Programı (hibe no. 2022YFC3500500 ve 2022YFC3500502) ve Xu Nenggui Üniversite Düzeyi Yetenek Destek Programı (hibe no. DT2400000222) tarafından desteklenmiştir. Fon sağlayanların; çalışma tasarımında, veri toplama ve analizinde, yayın kararında veya taslağın hazırlanmasında herhangi bir rolü olmamıştır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Yetişkin erkek Sprague-Dawley sıçanlarıLiaoning Changsheng Biotechnology Co., Ltd.No. SCXK (LIAO) 2025-0001RGD_70508
Akupunktur iğneleriSuzhou Tianxie Acupuncture Instrument Co., Ltd.——
DAPI içeren antifade montaj medyumuAibixin Biotechnology Co., Ltd.abs9235-25ml—
Anti-YY1 primer antikorProteintech Group, Inc66281-1-IgAB_2881664
Anti-Beta Actin primer antikor66009-1-IgAB_2687938
Sığır serum albümini (BSA)Sigma Odellie Trading Co., Ltd.V900933—
BCA protein analiz kitiShanghai Biyuntian Biotechnology Co., Ltd.P0012S—
c-Fos (9F6) tavşan mAbSai Xin Tong Biological Reagents Co., Ltd.2250SAB_2247211
CytoscapeThe Cytoscape Consortiumversion 3.2.1SCR_003032
ChamQ Universal SYBR qPCR Master MixVazyme Biotech Co., Ltd.Q711-02—
Elektroakupunktur cihazıNanjing Jisheng Medical Technology Co., Ltd.HANS-200A—
Sekiz kanallı (2 × 4) mikroelektrot dizisiKewa Suzhou Medical Technology Co., Ltd.-—
ELISA kiti (NT-proBNP)Wuhan Enzyme Immuno-Biotechnology Co., Ltd.MM-0329R1—
ELISA kiti (cTnT)MM-0795R2—
Geliştirilmiş kemilüminesans kitiProteintech Group, IncPK10001—
Keçi anti-tavşan IgGAimee Technology Co., Ltd.111-545-003AB_2338046
HRP-konjuge Keçi Anti-Fare IgG sekonder antikorBeiJing Cowin Biotech Co.,Ltd.CW0102N/A
HiScript III RT SuperMixVazyme Biotech Co., Ltd.R323-01—
ImageJ yazılımıNational Institutes of Healthversion 4.0SCR_003070
Görüntüleme sistemiBio-Rad Laboratories, IncChemiDoc MP
Çok kanallı küçük hayvan anestezi cihazıRWD Life Science Co., LtdR510-22-10—
MikroskopOlympus Optical Co., Ltd.DP72—
NeuroExplorer yazılımıBeijing Plexon Technology Co., Ltd.version 5.0SCR_001818
Offline Sorter yazılımıBeijing Plexon Technology Co., Ltd.version 4.7.2SCR_000012
Orbitrap AstralThermo Fisher Scientific——
Powerlab standart ekstremite II derivasyon
sistemi		AD Instruments International Trading Co., Ltd.ML118—
PepMap Neo Trap KolonuThermo Fisher Scientific——
Fosfataz inhibitörleriShanghai Biyuntian Biotechnology Co., Ltd.P1081—
R yazılımı—version 4.5.2SCR_001905
RIPA lizis tamponuYeasen Biotechnology Co., Ltd.20115ES60—
RNAiso PlusTaKaRa Biotechnology Co., Ltd.9108—
Küçük hayvan dijital ultrason sistemiFeiyino Technology Co., Ltd.VINNO6 Lab—
İstatistik yazılımıGraphPad Software Version 8.0SCR_002798
The OmniPlex çok kanallı veri toplama
sistemi		Beijing Plexon Technology Co., Ltd.version 1.20.0—
Triton X-100Beijing Solab Technology Co., Ltd.22298142—
Vanquish Neo UHPLC sistemiThermo Fisher Scientific——
µPAC Neo yüksek verimli kolonThermo Fisher Scientific——

Kaynaklar

  1. Valente V, et al. The global epidemiology of heart failure: a comprehensive and contemporary review. Eur J Heart Fail. 2026.
  2. Triposkiadis F, et al. The sympathetic nervous system in heart failure physiology, pathophysiology, and clinical implications. J Am Coll Cardiol. 2009;54(19):1747-62.
  3. Arshad MS, et al. Sympathetic nervous system in heart failure: targets for treatments. Curr Hypertens Rep. 2025;27(1):20.
  4. Fan H, et al. The hypotensive role of acupuncture in hypertension: clinical study and mechanistic study. Front Aging Neurosci. 2020;12:138.
  5. Zuo H, et al. Electroacupuncture alleviates acute myocardial ischemic injury in mice by regulating the β1 adrenergic receptor and post-receptor protein kinase A signaling pathway. Acupunct Med. 2024;42(6):342-55.
  6. Wu HS, et al. Neural mechanism of HT7 electroacupuncture in myocardial ischemia: critical role of the paraventricular nucleus oxytocin system. Front Neurosci. 2025;19:1678938.
  7. Kun W, et al. Electroacupuncture ameliorates cardiac dysfunction in myocardial ischemia model rats: a potential role of the hypothalamic-pituitary-adrenal axis. J Tradit Chin Med. 2023;43(5):944-54.
  8. Xu W, et al. Electroacupuncture ameliorates chronic heart failure: the role of CRH neurons in the paraventricular nucleus of the hypothalamus. Front Neurosci. 2026;20:1741523.
  9. Andresen MC, Kunze DL. Nucleus tractus solitarius--gateway to neural circulatory control. Annu Rev Physiol. 1994;56:93-116.
  10. Craft GE, et al. Recent advances in quantitative neuroproteomics. Methods. 2013;61(3):186-218.
  11. Charan J, Kantharia ND. How to calculate sample size in animal studies? J Pharmacol Pharmacother. 2013;4(4):303-6.
  12. Zhou J, et al. Electroacupuncture pretreatment mediates sympathetic nerves to alleviate myocardial ischemia-reperfusion injury via CRH neurons in the paraventricular nucleus of the hypothalamus. Chin Med. 2024;19(1):43.
  13. Litwin SE, et al. Serial echocardiographic assessment of left ventricular geometry and function after large myocardial infarction in the rat. Circulation. 1994;89(1):345-54.
  14. Shu Q, et al. Electroacupuncture alleviates myocardial ischemia-reperfusion injury by inhibiting hypothalamic paraventricular nucleus neurons projecting to the rostral ventrolateral medulla. Eur J Neurosci. 2024;60(5):4861-76.
  15. Wan F, et al. Electroacupuncture improves cerebral blood flow in vascular cognitive impairment mice by activating the locus coeruleus-prefrontal cortex circuit. Neuroscience. 2025;583:33-42.
  16. Xu R, et al. Electroacupuncture ameliorates incisional pain via suppressing IL-33 signaling-related macrophage infiltration and ROS overproduction in incised skin. Chin Med. 2026;21(1):26.
  17. Quiroga RQ, et al. Unsupervised spike detection and sorting with wavelets and superparamagnetic clustering. Neural Comput. 2004;16(8):1661-87.
  18. Goldwyn JH, et al. Gain control with A-type potassium current: IA as a switch between divisive and subtractive inhibition. PLoS Comput Biol. 2018;14(7):e1006292.
  19. Buzsáki G. Large-scale recording of neuronal ensembles. Nat Neurosci. 2004;7(5):446-51.
  20. Zhang J, Mifflin SW. Responses of aortic depressor nerve-evoked neurones in rat nucleus of the solitary tract to changes in blood pressure. J Physiol. 2000;529(Pt 2):431-43.
  21. Benarroch EE. The central autonomic network: functional organization, dysfunction, and perspective. Mayo Clin Proc. 1993;68(10):988-1001.
  22. Scheitz JF, et al. Bidirectional brain-heart interactions in health and disease. Nat Rev Neurol. 2026;22(4):209-25.
  23. Floras JS. Sympathetic nervous system activation in human heart failure: clinical implications of an updated model. J Am Coll Cardiol. 2009;54(5):375-85.
  24. Iannetta D, et al. Dissecting the exercise pressor reflex in heart failure: a multi-step failure. Auton Neurosci. 2025;259:103269.
  25. Sved AF, et al. Baroreflex dependent and independent roles of the caudal ventrolateral medulla in cardiovascular regulation. Brain Res Bull. 2000;51(2):129-33.
  26. Liu Y, et al. Neurophysiological basis of electroacupuncture stimulation in the treatment of cardiovascular-related diseases: vagal interoceptive loops. Brain Behav. 2024;14(10):e70076.
  27. Zhou W, Benharash P. Effects and mechanisms of acupuncture based on the principle of meridians. J Acupunct Meridian Stud. 2014;7(4):190-3.
  28. Fawcett JW, et al. The roles of perineuronal nets and the perinodal extracellular matrix in neuronal function. Nat Rev Neurosci. 2019;20(8):451-65.
  29. Moon S, Ito Y. Vasculature cells control neuroglial co-localization and synaptic connection in a central nervous system tissue mimic system. Hum Cell. 2023;36(6):1938-47.
  30. Ferrer-Ferrer M, Dityatev A. Shaping synapses by the neural extracellular matrix. Front Neuroanat. 2018;12:40.
  31. Rabinowitch I, et al. Understanding neural circuit function through synaptic engineering. Nat Rev Neurosci. 2024;25(2):131-9.
  32. McGeachie AB, et al. Stabilising influence: integrins in regulation of synaptic plasticity. Neurosci Res. 2011;70(1):24-9.
  33. Qiu L, et al. RNA modification: mechanisms and therapeutic targets. Mol Biomed. 2023;4(1):25.
  34. Clapier CR, et al. Mechanisms of action and regulation of ATP-dependent chromatin-remodelling complexes. Nat Rev Mol Cell Biol. 2017;18(7):407-22.
  35. Du W, et al. Mechanisms of chromatin-based epigenetic inheritance. Sci China Life Sci. 2022;65(11):2162-90.
  36. Rashid F, et al. Mechanomemory of nucleoplasm and RNA polymerase II after chromatin stretching by a microinjected magnetic nanoparticle force. Cell Rep. 2024;43(7):114462.
  37. Weintraub AS, et al. YY1 is a structural regulator of enhancer-promoter loops. Cell. 2017;171(7):1573-88.e28.
  38. Zurkirchen L, et al. Yin Yang 1 sustains biosynthetic demands during brain development in a stage-specific manner. Nat Commun. 2019;10(1):2192.
  39. Cunningham JT, et al. mTOR controls mitochondrial oxidative function through a YY1-PGC-1alpha transcriptional complex. Nature. 2007;450(7170):736-40.
  40. van Weperen VYH, Vaseghi M. The brain-heart axis: effects of cardiovascular disease on the CNS and opportunities for central neuromodulation. Nat Rev Neurosci. 2026;27(3):159-77.
  41. Lam JC, et al. YY1-controlled regulatory connectivity and transcription are influenced by the cell cycle. Nat Genet. 2024;56(9):1938-52.
  42. Montuoro S, et al. Neuroimmune cross-talk in heart failure. Cardiovasc Res. 2025;121(4):550-67.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Daha fazla makale keşfet

Elektroakupunktur MekanizmalarıKardiyak RemodellemeSempatik Aşırı AktivasyonEkokardiyografi Değerlendirmesic-Fos İmmünofloresansıWestern BlottingYY1 Transkripsiyon Faktörü
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.