3.10: Sedimentten Lipid Biyobelirteçlerinin Sonikasyon Ekstraksiyonu

1. Gerekli malzemeleri toplayın

1. Ekstraksiyondan önce genellikle dondurulmuş, dondurularak kurutulmuş, ezilmiş ve homojenize edilmiş numuneler (yapraklar, kir, mantarlar, ağaç kabuğu, doku), verimliliği en üst düzeye çıkarmak için gruplar halinde ekstrakte edilir. Üç örnek ayıklayın.
2. Numunenin boyutuna bağlı olarak, hacimleri 4-60 mL arasında değişen şişeler kullanılabilir. Bu deney için borosilikat cam şişeler (40 mL) ve solvent güvenli kapaklar kullanılır. Şişeler, borosilikat cam pipetler ve tartım kutuları, olası organik kirleticilerin uzaklaştırılmasını sağlamak için önce 6 saat boyunca 550 °C'de yakılmalıdır.
3. Diklorometan ve metanol çoğu organik jeokimya laboratuvarında yaygındır. Kullanmadan önce laboratuvar aletlerini ve cam malzemeleri durulamak için ayrı ayrı kullanılırlar. Diklorometan (DCM) ile metanol (MeOH; 9:1) karışımı, birçok laboratuvarda çok çeşitli polaritelere sahip biyobelirteçleri verimli bir şekilde çıkarmak için kullanılır. Solventler organik kirleticilerden arındırılmış olmalıdır.
4. Oda sıcaklığında bir sonikasyon su banyosu kullanın. Isı ile veya ısı olmadan bir dizi sonikatör boyutu ve sonikasyon, büyük bilimsel ekipman perakendecilerinden temin edilebilir.
5. Su geçirmez olması gereken flakon rafları sonikasyon banyosuna yerleştirilecektir.
6. Solvent onaylı kimyasal davlumbaz.

2. Numunenin Hazırlanması

1. Laboratuvar terazisine yanmış bir tartım tenekesi yerleştirin ve ardından dara alın.
2. Laboratuvar spatulasını çözücü ile durulayın, ardından uygun bir numune kütlesini tartım kutusuna aktarmak için kullanın ve kütleyi kaydedin.
   1. Numunenin kütlesi, organik madde içeriğine bağlı olarak değişir. Nispeten organik madde bakımından zengin materyal (deniz çamuru) birkaç gram gerektirebilirken, organik madde bakımından zengin materyal (yaprak dokusu) çok daha azına ihtiyaç duyabilir.
3. Tartım kutusundaki tüm malzemeyi yanmış, önceden tartılmış ve etiketlenmiş bir şişeye aktarın. Şişeyi kapatın, ardından tartım kutusunu atın.
4. Çıkarılacak her örnek için 2.1 - 2.3 arasındaki adımları gerçekleştirin.

3. Çıkarma

1. Önceden yanmış bir pipet ve ampul kullanarak, her şişeye ~ 20 mL DCM: MeOH (9: 1) karışımını aktarın (şişenin yaklaşık yarısı dolu olmalıdır). Bir sonraki numuneye geçmeden önce şişeleri kapatın, böylece uçucu çözücüler buharlaşmaz.
   1. DCM ve MeOH'nin oynaklıkları farklıdır. Kapaksız numune şişeleri nedeniyle ekstraksiyon çözücüsünün buharlaştırılması, polaritesini ve dolayısıyla ekstraksiyonu değiştirme yeteneğine sahiptir.
2. Numune şişelerini su geçirmez bir şişe rafına yerleştirin.
3. Sonikasyon banyosundaki su seviyesinin, numune şişelerini ekstraksiyon çözücüsünün tepesine kadar daldırmak için yeterince derin olduğunu kontrol edin. Çok fazla su, şişelerin yüzmesine neden olabilir; Çok az su, numunelerin uygun şekilde çalkalanmasını durdurabilir.
4. Flakon rafını, içindeki örneklerle birlikte doğrudan sonikasyon banyosuna yerleştirin.
5. Oda sıcaklığında 30 dakika boyunca sonikate.
6. Örnek rafını sonikatörden çıkarın. Tortuları çıkarıyorsanız, çökelmenin gerçekleşmesine izin vermek için 30 dakika bekletin. Başka bir örnek seti çıkarıyorsanız, şu anda sonikatör koyun.
7. DCM: MeOH karışımını önceden yanmış bir pipet ve ampul kullanarak ekstraksiyon şişesinden çıkarın ve önceden tartılmış, önceden yanmış ve etiketlenmiş başka bir 40 mL şişeye yerleştirin.
8. Tüm numuneler için 3.1 - 3.7 3x tekrarlayın.
9. Ekstrakte edilen numunelerin şişelerinde, kapaklarının kapalı ve kaputta kurumasına izin verin, bir parça folyo ile gevşek bir şekilde örtülmüş. 'Çıkarılan kalıntı' olarak etiketleyin ve saklayın.
10. Her numune için birleştirilmiş ekstraktları 'TLE' olarak etiketleyin.

Paleoklimatolojinin ilk adımı, içinde bulundukları tortudan biyobelirteçleri toplamak veya çıkarmaktır. Çevresel numuneler, mineraller, su ve metaller gibi organik olmayan bileşenlerden ve bölgedeki canlı organizmalar tarafından oluşturulan organik bileşenlerden oluşur. Bu organik bileşenler, bilim adamları tarafından geçmişle ilgili bilgileri aydınlatmak için kullanılmadan önce, çevrelerinden uzaklaştırılmalıdır. Ultrasonik dalgaları kullanan sonikasyon, bu tekniklerin en basit ve en ucuz olanıdır.

Bu video, tortulardan lipid ekstraksiyonu, saflaştırılması ve analizi ile ilgili bir serinin parçasıdır. Ultrason ile lipid ekstraksiyonunu gösterecek ve yöntemin birkaç uygulamasını sunacaktır.

Çok çeşitli biyobelirteçler nedeniyle, hepsini çıkarmak için optimize edilmiş tek bir çözücü yoktur. Bu, 'benzer şekilde çözülür' kuralı ile özetlenir, bu sayede nispeten apolar moleküller diklorometan gibi apolar çözücüler içinde çözünür ve daha fazla polar molekül metanol gibi daha polar çözücüler içinde çözülür. Spesifik lipitlerin veya lipit gruplarının ekstraksiyonu için çözücü karışımları genellikle ampirik olarak optimize edilir.

Ekstraksiyonu hızlandırmak ve verimi artırmak için, çözücü karışımı ile birlikte 20 kHz'den daha yüksek frekanslara sahip ultrason dalgalarını uygulamak için bir sonikasyon sistemi kullanılır. Bu dalgalar sıvı organik faza temas ettiğinde, hızla büyüyen ve çöken kısa ömürlü mikro çözücü buharlarının oluşumuna neden olurlar. Çöktüğünde, bu kabarcıklar mekanik kesme olarak muazzam miktarda enerji açığa çıkarır, lipit çözünmesini kolaylaştırır ve ekstraksiyon verimliliğini önemli ölçüde artırır.

Ultrason destekli solvent ekstraksiyon işleminden sonra sonuç, lipid imzalarının kalitatif ve kantitatif incelemesine izin vermek için daha fazla saflaştırmaya tabi tutulan, toplam lipid ekstraktı adı verilen ham bir ekstrakt preparatıdır. Artık sonikasyon ile lipit ekstraksiyonunun arkasındaki ana ilkelerden bazılarını anladığınıza göre, prosedürün nasıl gerçekleştirildiğine dair bir protokole göz atalım.

Seçilen bir yerden gerekli numune malzemelerini toplayın. Bazı örnekler göl ve deniz çökeltileri, karasal topraklar, mikrobiyal kültürler veya bitki yapraklarıdır. Toplanan materyal gece boyunca dondurulur. Bunu takiben 2 ila 3 gün dondurarak kurutucuda dondurularak kurutulur. Dondurularak kurutulmuş numuneleri, ekstraksiyondan önce çözücü ile durulanmış bir havan ve havan tokmağı ile ezin ve homojenize edin. Organik kirleticileri gidermek için gerekli borosilikat cam pipetleri, şişeleri ve tartım tenekelerini bir fırında yakın. Cam eşyaların fırında soğumasına izin verdikten sonra, metal aletleri diklorometan ve metanol karışımı ile durulayın. Numune ve cam eşya hazırlandıktan sonra, sonikasyon prosedürü başlayabilir.

Bu adımdan itibaren, tüm kaplar ve cam eşyalar kullanılmadan önce yakılmalıdır. Tartı tenekesini bir teraziye koyun ve darasını alın. Laboratuvar spatulasını çözücü karışımıyla durulayın, ardından uygun bir dondurularak kurutulmuş, homojenize numune kütlesini tartım kabına aktarmak ve kütleyi kaydetmek için kullanın. Tartılan numuneyi dikkatli bir şekilde etiketli bir şişeye aktarın. DCM: MeOH fışkırtma şişesini kullanarak, numunenin 1 ila 2 cm çözücü ile kaplanmasına yetecek kadar ekleyin ve şişeyi kapatın. Şişeyi su geçirmez bir rafa yerleştirin, şimdi sonikasyon için hazır. Rafı doğrudan sonikasyon banyosuna yerleştirin. Sonikasyon banyosundaki su seviyesinin, numune şişelerini ekstraksiyon çözücüsünün üstüne kadar daldırmak için yeterince derin olduğunu kontrol edin. Oda sıcaklığında 30 dakika boyunca sonikate. Sonikasyondan sonra, rafı sonikatörden çıkarın. Tortu çökelmesinin gerçekleşmesine izin vermek için şişeleri oturtun.

Diklorometan-metanol üst fazını bir pipet ve ampul kullanarak ekstraksiyon şişesinden çıkarın ve önceden tartılmış ve etiketlenmiş başka bir şişeye aktarın. Sonikasyon işlemini her örnek için toplam üç kez tekrarlayın. Ekstraktları bir şişede toplayın. Ekstrakte edilen numunelerin şişelerinde, kapaklarının kapalı ve kaputta kurumasına izin verin, bir parça folyo ile gevşek bir şekilde örtülmüş. 'Ekstrakte edilmiş kalıntı' olarak etiketleyin ve ekstraksiyon çözücüsünde saklayın. Artık biyobelirteçler ekstrakte edildiğine göre, analiz yapılmadan önce saflaştırılmaları gerekir.

Sonikasyon, birkaç çözücü ekstraksiyon işlemini hızlandırır ve jeokimyasal çalışmalarda yaygın olarak kullanılır. Birçok arkeolog, erken insan uygarlıklarının yaşadığı çevresel ve kültürel koşulları yeniden inşa etmek için jeokimyacılarla birlikte çalışır. En eski insan icatlarından biri olan çanak çömlek, ortaya çıkarıldığında, bir zamanlar içinde saklanan şarap, pirinç veya diğer içeriklerden kalan moleküler fosiller içerdiği bulunabilir.

Yüzeylere emilen maddelerin kimyasal kanıtlarını ortaya çıkarmak için, küçük çanak çömlek örnekleri organik çözücülerin varlığında sonikleştirilir ve ekstrakte edilen bileşikler daha sonra spektroskopik yöntemlerle aşağı akışta tanımlanabilir. Bu tür bir analiz, arkeologların eski popülasyonlar için mevcut olan kaynak türlerini tespit etmelerine ve yaşam alanlarının koşullarını yeniden yapılandırmalarına yardımcı olur.

Fotosentetik mikroalgler deniz ve tatlı su ekosistemlerinde bulunur. Deniz suyu bazlı ortamlarda büyüdükleri ve kültürleri önemli ölçüde daha küçük alanları kapladığı için, şu anda biyoyakıt üretimi için karasal bitkilere umut verici bir alternatif olarak geniş çapta incelenmektedirler.

Bir mikroalg biyokütlesinden lipitleri çıkarmak için, bu araştırmacılar sonikasyon destekli bir çözücü ekstraksiyonunu tanımlarlar. Sonikasyon sırasında akustik kavitasyon, lipitleri serbest bırakmak için sert mikroalg hücre duvarlarını etkili bir şekilde bozar. Bu tür teknikler, petrol dışı enerji kaynaklarının üretimi için çevreden gelen yeni mikroalglerin karakterizasyonuna yardımcı olur.

JoVE'nin Sedimentlerden Biyobelirteçlerin Sonikasyon Destekli Ekstraksiyonuna girişini az önce izlediniz. Aşağıdaki videolar, ekstraktın analiz için nasıl daha fazla saflaştırıldığını açıklayacaktır.

İzlediğiniz için teşekkürler!