Sedimentlerden Biyobelirteçlerin Ekstraksiyonu - Hızlandırılmış Solvent Ekstraksiyonu
Kaynak: Jeff Salacup Laboratuvarı - Massachusetts Amherst Üniversitesi
Bir dizi arke ve bakteri tarafından üretilen gliserol-dialkil gliserol-tetraete…
1. Gerekli Malzemelerin Toplanması
- Örnekleri ayıklayın. Numuneler (bu durumda tortu) ekstraksiyondan önce dondurulur, dondurularak kurutulur, ezilir ve homojenize edilir ve verimliliği en üst düzeye çıkarmak için gruplar halinde ekstrakte edilir.
- Numunenin boyutuna bağlı olarak, 40 veya 60 mL hacimli toplama şişeleri kullanın. Bu deney için borosilikat cam şişeler (40 mL) ve solvent güvenli kapaklar kullanılır. Olası organik kirleticilerin uzaklaştırılmasını sağlamak için şişeleri, borosilikat cam pipetleri ve tartım kutularını 550 °C'de 6 saat boyunca yakın.
- Diklorometan (DCM) ve metanol çoğu organik jeokimya laboratuvarında yaygındır. Kullanmadan önce laboratuvar aletlerini ve cam malzemeleri durulamak için bunları ayrı ayrı (önce metanol, ardından DCM) kullanın. Diklorometan ile metanol karışımı (MeOH; 9:1), birçok laboratuvarda çok çeşitli polaritelere sahip biyobelirteçleri verimli bir şekilde çıkarmak için kullanılır. Solventler organik kirleticilerden arındırılmış olmalıdır.
- Bu deney için kullanmak üzere bir Hızlandırılmış Çözücü Çıkarıcı edinin.
2. Örnek Hücrelerin Hazırlanması
- Çıkarılacak her numune için bir numune hücresi ve bir boş numune oluşturun.
- Her hücre için, hücre gövdesinin bir ucuna bir uç kapağı vidalayın.
- Solventle durulanmış cımbız kullanarak her hücrenin üzerine yanmış bir cam elyaf filtre yerleştirin. Ardından, filtre pistonunu kullanarak filtreyi hücreye nazikçe ve yavaşça bastırın.
- Her örnek için hücre gövdelerini numaraya göre etiketleyin (, örneğin 1 - 22) ve boş hücreye "boş" yazın.
- Boşluğu diyatomlu toprakla (veya kumla) doldurun ve ikinci bir uç kapakla kapatın. Elle sıkın.
3. Numunelerin Hazırlanması
- Laboratuvar terazisine yanmış bir tartım tenekesi yerleştirin ve ardından dara alın.
- Laboratuvar spatulasını çözücü ile durulayın, ardından uygun bir numune kütlesini tartım kutusuna aktarmak için kullanın ve kütleyi kaydedin.
- Numunenin kütlesi, organik madde içeriğine bağlı olarak değişir. Nispeten organik madde bakımından zengin materyal (deniz çamuru) birkaç gram gerektirebilirken, organik madde bakımından zengin materyal (yaprak dokusu) çok daha azına ihtiyaç duyabilir.
- Tartım kutusundaki tüm malzemeyi hazırlanmış bir ASE hücresine aktarın.
- Hücrenin üstüne başka bir cam elyaf filtre yerleştirin, ardından filtre pistonunu kullanarak numunenin üst kısmına ulaşana kadar yavaşça ve nazikçe aşağı doğru bastırın.
- Neredeyse dolana kadar hücreye diyatomlu toprak (veya kum) ekleyin. Hücre gövdesi ipliklerindeki kalıntıları temizlemeye dikkat edin.
- Hücrenin üst kısmını başka bir uç kapakla kapatın.
- Her örnek için 3.1 - 3.6 arasındaki adımları tekrarlayın.
4. Toplama şişelerinin hazırlanması
- Her şişeyi karşılık gelen bir hücrenin numarasıyla etiketleyin (, örneğin 1 - 22 veya boş) ve ASE toplama şişesi kapağı ile kapatın.
5. Çıkarma
- Her örnek hücreyi, üst ASE tepsisindeki numaralı bir yuvaya yerleştirin.
- İlgili toplama şişesini alt ASE tepsisindeki aynı sayı yuvasına yerleştirin.
- ASE'deki tuş takımını kullanarak ayıklama yöntemini oluşturun. 100 °C ve 1.200 psi'de ekstrakte edin. Her bir örneği 10 dakikalık statik tutma ile 3 kez çıkarın ve hücre gövdesini statik tutma işlemleri arasında toplam hacminin %50'si ile yıkayın.
- Solvent şişesinin tüm numuneleri çıkarmak için yeterli solvent içerdiğinden emin olun.
- Çalıştırmaya başlamadan önce ASE kontrol pedi üzerindeki "durulama" düğmesine basarak ASE 3x'i durulayın.
- Başlat'a basın.
Hızlandırılmış solvent ekstraksiyonu, organik biyobelirteçleri çok sayıda jeolojik tortu örneğinden ayırmak için kullanılan hızlı, verimli ve yüksek verimli bir tekniktir.
Geleneksel olarak, sonikasyon veya Soxhlet gibi ekstraksiyon yöntemleri kullanılır, ancak bu protokollerin dezavantajı, ayrıntılı paleoiklim rekonstrüksiyonu için yeterli materyali işlemek için çok yavaş olmalarıdır. Daha yeni bir teknik olan Hızlandırılmış Solvent Ekstraksiyonu veya ASE yöntemi, verimlilik ve yüksek verim göz önünde bulundurularak geliştirilmiştir.
ASE yöntemi, numuneleri çıkarmak için yüksek sıcaklıklar ve yüksek basıncın bir kombinasyonunu kullanır ve tek, nispeten hızlı bir hazırlama çalışmasında birden fazla numune gerçekleştirebilir.
Bu video, tortudan biyobelirteçlerin nasıl çıkarılacağını detaylandıran bir serinin üçüncüsüdür. Prosedürü kapsayacak ve sonikasyon veya Soxhlet ekstraksiyonu üzerinde ASE'nin yararları hakkında fikir verecektir.
Hızlandırılmış solvent ekstraksiyonunda, numuneler çelik hücrelere yüklenir ve daha sonra bir atlıkarınca üzerine yüklenir. Her numune hücresi için toplama şişeleri de ayrı bir karusele yüklenir. Cihaz, bir numune hücresini dahili bir fırına yükler. Solvent, yeterli bir basınca ulaşılana kadar bir solvent şişesinden bir dizi valf aracılığıyla pompalanır.
Bu basınç, numune ve analit tarafından belirlenen bir süre boyunca tutulur. Daha sonra, çözücü numune hücresinden çelik bir hat aracılığıyla ilgili toplama şişesine yıkanır. İşlem birkaç kez tekrarlanabilir. Sıcaklık, basınç ve sürenin tümü numune için özelleştirilebilir.
Kullanılan yüksek sıcaklık, ekstraksiyonun kinetiğini arttırırken, yüksek basınç çözücünün buharlaşmasını önler. Toplama şişesi artık bir toplam lipit özütü içerir ve örnek hücrede kalanlara kalıntı denir. Organik olmayan materyalin yanı sıra kerojen adı verilen, solventle ekstrakte edilemeyen organik materyali de içerir.
Artık hızlandırılmış solvent ekstraksiyonunun arkasındaki ilkelere aşina olduğumuza göre, bunun laboratuvarda nasıl yapıldığına bir göz atalım.
İlgilenilen örnekleri topladıktan sonra; Bu serideki başka bir videoda gösterildiği gibi dondurarak kurutun, homojenize edin ve dekontamine edin.
Tüm numuneler hazırlandıktan sonra, her birinin çıkarılması için bir hücre ve bir boşluk için fazladan bir hücre birleştirin. Bunu yapmak için, hücre gövdesine bir uç kapağı vidalayın. Solventle durulanmış cımbız kullanarak, her birinin üzerine yanmış bir cam elyaf filtre yerleştirin. Filtreyi piston ile yavaşça ve nazikçe aşağı doğru bastırın.
Her numune için hücre gövdelerini numaraya göre etiketleyin ve boşluğu ayrı ayrı etiketleyin. Yanmış bir tartım tenekesini laboratuvar terazisine koyun ve darasını alın. Bir spatulayı çözücü ile durulayın, ardından 5 ila 10 g numuneyi tartım kabına aktarmak için kullanın ve kütleyi kaydedin.
Tartım kabındaki tüm malzemeyi ilgili hücresine aktarın. Üstüne başka bir cam elyaf filtre yerleştirin ve numunenin üst kısmına ulaşana kadar hafifçe bastırın.
Hücre gövdesi ipliklerine herhangi bir kalıntı girmemesine dikkat ederek, neredeyse dolana kadar diyatomlu toprak veya kum gibi bir dağıtıcı ekleyin. Hücrenin üst kısmını başka bir uç kapakla kapatın. Her örnek ve boşluk için bu adımları tekrarlayın.
Her bir toplama şişesini karşılık gelen bir numune hücresinin veya boşluğun numarasıyla etiketleyin ve bir şişe kapağı ile kapatın. Her hücreyi üst ASE tepsisindeki numaralandırılmış bir yuvaya yerleştirin. 100'de çıkarmak için ASE üzerindeki tuş takımını kullanarak ekstraksiyon yöntemi için parametreleri ayarlayın. C?ve 1.200 psi. Her bir numuneyi 10 dakikalık statik tutma ile 3 kez çıkarın ve statik tutma süreleri arasında hücre gövdesini toplam hacminin %50'si ile yıkayın.
Ardından, solvent şişesinin tüm numuneleri çıkarmaya yetecek kadar içerdiğinden emin olun. Çalışmaya başlamadan önce alet hatlarını 3 kez durulayın. Son olarak, başlat'a basın.
Şişeyi ASE'den çıkarın. Artık biyobelirteçler ekstrakte edildiğine göre, analizden önce saflaştırılmaları gerekir.
Hızlandırılmış Solvent Ekstraksiyonu, bazıları burada keşfedilen çeşitli uygulamalar için kullanılabilen çok yönlü bir tekniktir.
Hızlandırılmış solvent ekstraksiyonu, gıda da dahil olmak üzere diğer numune türlerinde de kullanılabilir. Pestisit kontaminasyonunu test etmek için kalıntı analizi, meyve veya sebze gibi gıda ürünlerinin güvenliğini ve kalitesini belirlemek için düzenleyici ve endüstriyel tesislerde sıklıkla yapılır. ASE, gıda örneklerinden organoklor pestisitleri çıkarmak ve üründe bulunan kalıntı türlerini veya seviyelerini belirlemek için kullanılabilir. Bu bilgi daha sonra ürünün insan veya hayvan tüketimine uygun olup olmadığını belirlemek için kullanılabilir. Örneğin, dieldrin, ürüne bağlı olarak gıdada milyonda 0 ila 0.1 parça arasında bulunmalıdır.
Gıda besin bileşenleri de ASE kullanılarak ekstrakte edilebilir. Örneğin, yüksek gravimetrik yağ içeriğine sahip olabilen çikolata gibi ürünler ekstrakte edilebilir. Çözücü olarak petrol eteri ile ASE kullanılarak, çikolata numunelerinden yağ ayrılabilir ve bilinen çikolata miktarı başına doğru bir yağ yüzdesi belirlemek için kantitatif analize tabi tutulabilir. Düzenleyici kurumlar bu bilgileri kullanarak çikolata üreticileri tarafından yapılan iddiaları doğrulayabilir veya üreticiler doğru gıda etiketleri oluşturmak için bilgi edinebilir.
JoVE'nin hızlandırılmış solvent ekstraksiyonu veya ASE kullanarak lipid biyobelirteçlerinin ekstraksiyonuna girişini izlediniz. Daha fazla işleme ve analiz için yöntemler sonraki videolarda bulunabilir.
İzlediğiniz için teşekkürler!
View the full transcript and gain access to JoVE Science Education videos
Q1: Why is accelerated solvent extraction better than sonication or Soxhlet extraction?
Accelerated solvent extraction is faster and more efficient than traditional methods like sonication or Soxhlet extraction. ASE combines high temperature and high pressure to extract biomarkers from sediment samples in a single, relatively fast preparation run. This high-throughput capability enables researchers to process hundreds or thousands of samples needed for detailed paleoclimate reconstruction, which older extraction methods cannot achieve.
Q2: How do temperature and pressure work together in accelerated solvent extraction?
In accelerated solvent extraction, high temperature increases the kinetics of the extraction process, speeding up biomarker separation from sediment. High pressure simultaneously keeps the solvent from volatizing, or evaporating, during extraction. This combination of elevated temperature and pressure allows the ASE method to efficiently extract organic compounds while maintaining solvent integrity throughout the procedure.
Q3: What materials are used to prepare samples for accelerated solvent extraction?
Samples are loaded into steel cells with combusted glass fiber filters placed above and below the sediment material. A dispersant such as diatomaceous earth or sand is added to fill the cell and improve solvent contact. End caps seal the cell, and collection vials receive the extracted material. All glassware and filters are combusted to remove organic contaminants before use.
Q4: What is the difference between a total lipid extract and kerogen in ASE?
A total lipid extract is the organic material dissolved by the solvent and collected in the vial after accelerated solvent extraction. Kerogen is the non-extractable organic material that remains in the sample cell after extraction. The residue left behind comprises both non-organic material and kerogen, representing compounds that are not solvent-extractable.
Q5: How can accelerated solvent extraction be used for food safety testing?
Accelerated solvent extraction can extract organochlorine pesticides and other residues from food samples like fruits and vegetables. ASE determines the types and levels of pesticide contamination present, helping regulatory and industrial facilities verify whether produce is safe for human or animal consumption. For example, dieldrin levels must remain within 0 to 0.1 parts per million depending on the product.
Q6: What role do biomarkers play in paleoclimate reconstruction?
Biomarkers like glycerol-dialkyl glycerol-tetraethers (GDGTs) are produced by archaea and bacteria and change predictably in response to air or water temperature. The distribution of these biomarkers in sediment sequences of known age allows scientists to reconstruct past temperature changes on decadal to millennial timescales. This paleoclimate data requires rapid analysis of hundreds or thousands of samples, making accelerated solvent extraction essential.
Q7: What happens to the extracted biomarkers after accelerated solvent extraction?
After accelerated solvent extraction, the total lipid extract containing biomarkers must be purified before analysis. The purification process removes unwanted compounds and concentrates the target biomarkers. Purification of a total lipid extract with column chromatography is a common next step in preparing samples for detailed chemical and paleoclimate analysis.