3.9: Yüksek Performanslı Sıvı Kromatografisi (HPLC)

1. Mobil Aşamanın Yapılması

1. Yaklaşık 1,5 L arıtılmış DI suya 400 mL asetonitril ekleyerek mobil fazı hazırlayın.
2. Bu çözeltiye dikkatlice 2.4 mL buzlu asetik asit ekleyin.
3. Çözeltiyi, arıtılmış DI su ile hacimsel bir şişede toplam 2.0 L hacme kadar seyreltin. Elde edilen çözeltinin pH'ı 2.8 ila 3.2 arasında olmalıdır.
4. Kalibre edilmiş bir dijital pH metre kullanarak damla damla @ sodyum hidroksit ekleyerek pH'ı 4,2'ye ayarlayın. PH 4.0'a ulaştığında çok yavaş ekleyin. Bunu başarmak için yaklaşık 50 damla almalıdır.
5. Çözeltinin gazını almak ve kromatografik kolonu tıkayabilecek katıları uzaklaştırmak için mobil fazı vakum altında 0,47 μm Naylon 66 membran filtreden süzün. Kolonun girişindeki sabit fazda bir boşluğa neden olabilecek veya dedektör hücresine girerek UV absorbansında kararsızlığa neden olabilecek bir kabarcık oluşmasını önlemek için mobil fazın gazından arındırılması önemlidir.

2. Bileşen Çözümlerinin Oluşturulması

Yapılması gereken üç bileşen kafein (0.8 mg/mL), potasyum benzoat (1.4 mg/mL) ve aspartamdır (L-aspartil-L-fenilalanin metil ester) (6.0 mg/mL). Bu konsantrasyonlar, aynı şekilde seyreltildikten sonra, standartları soda numunelerinde bulunan seviyelere getirir.

1. 500 mL'lik hacimsel bir şişeye 0,40 g kafein ekleyin, ardından DI su ile 500 mL işaretine kadar seyreltin.
2. 500 mL'lik hacimsel bir şişeye 0.70 g benzoat ekleyin, ardından DI su ile 500 mL işaretine kadar seyreltin.
3. 100 mL'lik hacimsel bir şişeye 0,60 g aspartam ekleyin, ardından DI su ile 100 mL işaretine kadar seyreltin. Depolama sırasında ayrışmayı önlemek için bu çözeltiyi buzdolabına koyun.

3. 7 Standart Çözümün Yapılması

Üç bileşenin tümünün farklı dağılım katsayıları vardır, bu da her birinin her iki faz ile nasıl etkileşime girdiğini etkiler. Dağılım katsayısı ne kadar büyük olursa, bileşen sabit fazda o kadar fazla zaman harcar ve bu da dedektöre ulaşmada daha uzun tutma sürelerine neden olur.

1. Tablo 1'deki tabloyu takip ederek, her bileşenin uygun miktarını 50 mL'lik hacimsel bir şişeye pipetleyin.
2. Stok çözeltilerinin her birini, mobil fazlı hacimsel şişeler üzerindeki 50 mL işaretine kadar seyreltin.
3. Her standart çözeltiyi bir numune rafındaki etiketli küçük şişelere dökün.
4. Numune raflarını, kalan çözeltilerle birlikte 50 mL hacimsel şişelerde bir buzdolabında saklayın.

4. HPLC sisteminin başlangıç ayarlarını kontrol etme

1. Atık hattının bir atık konteynerinde olduğunu ve mobil faza geri dönüştürülmediğini onaylayın.
2. Mobil fazın akış hızının 0,5 mL/dk olarak ayarlandığını doğrulayın. Bu, tüm tepe noktalarının 5 dakika içinde elüte olmasına izin verecek kadar yüksek ve güzel çözünürlüğe izin verecek kadar yavaştır.
3. Minimum ve maksimum basıncın ve akış hızının, solvent dağıtım sisteminin (pompa) ön panelinde doğru değerlere ayarlandığını doğrulayın.
   1. Minimum basınç ayarı: 250 psi (bu, bir sızıntı meydana gelirse pompayı kapatmak içindir).
   2. Maksimum basınç ayarı: 4.000 psi (bu, bir tıkanıklık oluşursa pompanın kırılmasını önlemek içindir).
4. Boşluğu ayarlamak için dedektörün ön panelindeki "sıfır"a basın (boş, saf mobil fazdır).
5. 100 μL'lik bir şırıngayı deiyonize su ile durulayın, ardından analiz edilecek çalışma standartlarından birinin birkaç hacmi ile durulayın ve şırıngayı bu çözelti ile doldurun. İlgilenilen her bir bileşenin tepe noktasını belirlemeye izin veren 3 tek bileşenli örnekle başlayın.

5. Numuneyi manuel olarak enjekte etme ve veri toplama

1. Enjektör kolu yük konumundayken, septum portundan yavaşça 100 μL çözelti enjekte edin.
2. Veri toplama programının 300 saniye boyunca veri toplayacak şekilde ayarlandığını doğrulayın, bu da 3 tepe noktasının tümünün dedektörden geçmesi için yeterli zaman sağlar.
3. Denemeye başlamaya hazır olduğunuzda, enjektör kolunu enjeksiyon konumuna çevirin (numuneyi mobil faza enjekte eder) ve hemen bilgisayar veri toplama programında "Denemeyi Başlat"a tıklayın. 1-3 arası standartlar için, çalışma sırasında ekranda üç ardışık tepe noktasından yalnızca biri görünür (Şekil 1).
4. 300 saniye geçtikten sonra, veri toplama veri dosyasını kaydetmek için bir istem gönderir. Verileri uygun bir dosya adı altında kaydedin (, ör. , STD#1).
5. Bu bileşeni tanımlamak için kullanılan her denemenin zirve noktası için saniye cinsinden süreyi not edin.
6. Şırıngayı septumdan çıkarın ve ilk çalıştırmadan itibaren belirlenen kromatogram başına aynı süreyi kullanarak kalan çalışma standartlarının her biri için işlemi tekrarlayın.

Şekil 1. 3 bileşenin kromatogramı. Soldan sağa, bunlar kafein, aspartam ve benzoattır.

6. Diyet gazlı içecek örnekleri

Diyet Kola, Diyet Pepsi ve Kola Sıfır "bilinmeyenler" dir. Kabarcıklar HPLC sistemi için iyi olmadığı için karbonatlaşmadan kurtulmak için gece boyunca açık kaplarda bırakıldılar. Bu, numunelerdeki herhangi bir gazdan yeterince kurtulur.

1. Plastik bir şırıngaya yaklaşık 2 mL diyet soda çekin.
2. Filtre ucunu yerine çevirerek Luer-Lok aracılığıyla şırıngaya takın.
3. Şırıngadaki sıvıyı filtreden geçirin ve küçük bir cam şişeye itin. Bu, ayırma kolonunu potansiyel olarak tıkayabilecek istenmeyen partiküllerden kurtulur.
4. Her numuneyi eşit miktarda DI su ile seyreltin, böylece P saflıkta olurlar.
5. Numuneden 100 μL'yi numune döngüsüne enjekte edin ve standartlarla aynı parametrelerle denemeler yapın.

7. Hesaplamalar

1. Bileşen çözeltilerinin konsantrasyonlarından, 7 numune için yapılan seyreltmelere dayalı olarak standartlardaki tüm bileşenlerin konsantrasyonunu hesaplayın.
2. Her standart ve bilinmeyen numuneler için kromatogramlardaki tepe alanlarını, tepe yüksekliğinin 1/2 yükseklikteki genişlikle çarpımına eşit olan üçgen yöntemle belirleyin (Şekil 2). Her bir bileşenin kendi tepe noktasını göstermesi için geçen süreye bağlı olarak hangi tepe noktasının her bir bileşene karşılık geldiğini belirledikten sonra, bu tepe alanlarını bir bilgisayar elektronik tablosuna girin.
3. Her üç bileşen için de standartlarda tepe alanı ve konsantrasyon (mg/L) kalibrasyon eğrileri oluşturun.
4. Her kalibrasyon eğrisi için uygun olan en küçük kareleri belirleyin.
5. Numuneler için HPLC denemelerinden gösterilen tepe alanlarından diyet gazlı içeceklerdeki her bir bileşenin konsantrasyonunu hesaplayın. Diyet sodanın HPLC sistemine enjekte edilmeden önce 2 kat seyreltildiğini unutmayın.
6. Diyet gazlı içeceklerdeki her bir bileşenin mg / L cinsinden miktarını hesaplayın.
7. Sonuçlara dayanarak, 12 oz'luk bir soda kutusunda bulunan her bir bileşenin miligramını hesaplayın. 12 oz = 354.9 mL olduğunu varsayalım.

Şekil 2. Bir eğrinin çarpılacak olan tepe yüksekliği ve genişliğinin temel bir örneği (tepe yüksekliği çarpı 1/2 yükseklikte genişlik).

Yüksek performanslı sıvı kromatografisi veya HPLC, bir sıvı karışımın bileşenlerini sabit bir faz ile farklı etkileşimlerine göre ayıran çok yönlü bir tekniktir.

HPLC, kolon kromatografisinin bir uyarlamasıdır. Kolon kromatografisinde, bir kolon sabit faz adı verilen mikro ölçekli boncuklarla doldurulur. Sabit faz boncukları, boncuk ile sıvı veya mobil fazda bulunan bir karışımın bileşenleri arasında bir etkileşimi indükleyen kimyasal gruplarla işlevselleştirilir. Karışım kolondan akarken, bileşenler sabit faz ile farklı şekilde etkileşime girer.

HPLC'de kolon kromatografisi, klasik kolon kromatografisine göre daha yüksek bir akış hızında ve dolayısıyla daha yüksek basınçta gerçekleştirilir. Bu, daha büyük bir yüzey alanı / hacim oranına sahip daha küçük sabit faz boncuklarının kullanılmasını sağlar, bu da sabit faz ile mobil fazdaki bileşenlerin etkileşimini büyük ölçüde artırır.

Bu video, çeşitli diyet gazlı içeceklerin bileşenlerinin ayrılmasını göstererek HPLC'nin çalışmasının temellerini tanıtacaktır.

Laboratuvarda kullanılan iki tür HPLC vardır: analitik ve hazırlayıcı. Analitik HPLC'de, cihaz küçük bir hacmin bileşenlerini tanımlamak için kullanılır ve analiz edilen numune daha sonra atık olarak atılır. Hazırlayıcı HPLC'de, cihaz bir karışımı saflaştırmak için kullanılır ve her bir bileşenin istenen bir miktarı fraksiyonlar halinde toplanır.

HPLC enstrümantasyonu bir dizi basit bileşenden oluşur. İlk olarak, solvent rezervuarlarında tutulan mobil faz, sabit bir akış hızında bir veya daha fazla pompa tarafından sisteme pompalanır. Numune, numune enjektörü tarafından mobil faz akışına enjekte edilir. Mobil faz ile seyreltilen numune, daha sonra numunenin bileşenlerinin ayrıldığı HPLC kolonuna iletilir. Bileşenler daha sonra dedektör tarafından analiz edilir ve daha sonra kullanılmak üzere fraksiyonlar halinde kaydedilir veya bir atık şişesine aktarılır.

HPLC sütunu, sistemin temel bileşenidir. Mikro ölçekli sabit faz boncukları veya kromatografi reçinesi ile paketlenmiş metal veya plastik bir silindirden oluşur. Numune karışımı, paketlenmiş parçacık yatağından sabit bir akış hızında akar ve her bileşen, akarken sabit faz ile etkileşime girer.

Bileşikler durağan faz ile farklı şekilde etkileşime girer ve bu nedenle kolonun uzunluğu boyunca dedektöre farklı bir hızda hareket eder. Bir bileşenin sütundan çıkması veya yükselmesi için gereken süreye bekletme süresi denir. Sonuç, alıkonma süresine karşı yoğunluğun bir grafiği veya bir kromatogramdır. Bekletme süresi, bileşeni tanımlamak için kullanılır. Tepe boyutu, özellikle tepe noktasının altındaki alan, ilk çözeltideki bileşiğin miktarını ölçmek için kullanılır.

Sabit faz seçimi, numune karışımındaki bileşenlerin özelliklerine bağlıdır. En yaygın olarak kullanılan sabit faz, mikro ölçekli boncuklar oluşturan ve yeterli paketleme yoğunluğuna ulaşan inert polar olmayan bir malzeme oldukları için silika boncuklardır. En yaygın HPLC türü, hidrofobik bir sabit faz kullanan, tipik olarak boncukların yüzeyine bağlanmış C18 zincirlerine sahip silika boncuklar kullanan ters fazlı kromatografidir. Bileşenler, azalan polarite sırasına göre ayrıştırılır.

Ters faz kromatografisinde kullanılan mobil faz tipik olarak su ve asetonitril gibi organik bir çözücü karışımıdır. Numuneye bağlı olarak, mobil faz, izokratik mod olarak bilinen sabit bir su ve organik çözücü oranı olarak kalabilir. Bununla birlikte, bu, yüksek su içeriği durumunda geniş zirvelere veya yüksek organik içerik durumunda üst üste binen zirvelere yol açabilir.

Mobil faz oranı, bir mobil faz gradyanı oluşturmak için ayırma sırasında doğrusal veya kademeli olarak da değiştirilebilir. Bir gradyan elüsyon, daha az polar bileşenlerin tepe genişlemesini önleyebilir, böylece ayrılmayı iyileştirebilir ve elüsyon süresini kısaltabilir.

Artık HPLC'nin temelleri ana hatlarıyla belirtildiğine göre, HPLC tekniği laboratuvarda gösterilecektir. Bu deneyde, HPLC, diyet sodanın üç ortak bileşenini ayırmak ve ölçmek için kullanılacaktır.

İlk olarak, mobil fazı hazırlamak için 1,5 L arıtılmış deiyonize suya 400 mL asetonitril ekleyin. Sonra dikkatlice 2.4 mL buzlu asetik asit ekleyin. Çözeltiyi toplam 2 L hacme kadar seyreltin. Elde edilen çözeltinin pH'ı 2.8 ile 3.2 arasında olmalıdır.

Kalibre edilmiş bir pH metre kullanarak karıştırma çözeltisine damla damla %40 NaOH ekleyerek pH'ı 4,2'ye ayarlayın.

Çözeltinin gazını almak ve kolonu tıkayabilecek katıları gidermek için mobil fazı vakum altında 0,47 μ'lik bir membran filtreden süzün. Kabarcıklar sabit fazda boşluklara neden olabileceğinden veya dedektör hücresine doğru ilerleyerek ölçümlerde kararsızlığa neden olabileceğinden, çözeltinin gazının alınması önemlidir.

Diyet gazlı içeceklerin üç tipik bileşeni olan kafein, benzoat ve aspartamdan oluşan üç bileşenli çözeltiler hazırlayın. Bu bileşen çözümleri daha sonra bilinmeyenleri belirlemek için kullanılacak standart çözümleri hazırlamak için kullanılır. 500 mL kafein ve benzoat çözeltileri hazırlayın.

100 mL aspartam bileşen çözeltisi hazırlayın. Ayrışmayı önlemek için kullanılmadığı zaman çözeltiyi buzdolabında saklayın.

Ardından, her biri farklı konsantrasyonlarda kafein, benzoat ve aspartam içeren 7 standart çözelti hazırlayın. Her bir bileşenin uygun miktarını hacimsel bir şişeye pipetleyin ve mobil faz ile 50 mL işaretine kadar seyreltin.

İlk 3 çözümün her biri, en yüksek tanımlamayı sağlamak için bir bileşen içerir. Diğer 4 çözelti, tepe yüksekliğini konsantrasyonla ilişkilendirmek için 3 bileşenin tümünün bir dizi konsantrasyonunu içerir.

Her standart çözeltiyi bir numune rafındaki etiketli bir şişeye dökün. Numune rafını numunelerle ve kalan solüsyonlarla birlikte buzdolabında saklayın.

İlk olarak, mobil fazı ve atık konteynerlerini kurun. Atık hatlarının bir atık konteynerine beslendiğinden ve mobil faza geri dönüştürülmediğinden emin olun. Giriş mobil faz hattının mobil faz kabına beslendiğinden emin olun.

Mobil fazın akış hızının 0,5 mL/dk olarak ayarlandığını doğrulayın. Bu akış hızı, tüm bileşenlerin 5 dakika içinde elüte olmasını sağlar, ancak tek tek tepe noktalarının çözünürlüğünü sağlamak için yeterince yavaştır.

Ardından, solvent dağıtım sistemi üzerindeki minimum ve maksimum basınçları doğrulayın. Bu ayarlar, sırasıyla bir sızıntı veya tıkanma durumunda pompayı kapatır.

Boşluğu ayarlamak için dedektörlerin ön panelindeki "sıfır" düğmesine basın. 100-? L deiyonize su ile şırınga, daha sonra 7 çalışma standartlarından 1'inin birkaç hacmi ile. Sonra şırıngayı bu çözelti ile doldurun. Her bir bileşenin tepe noktasını belirlemek için 3 tek bileşenli örnekle başlayın.

Ardından, enjektör kolunu yük konumuna getirerek çözeltiyi manuel olarak enjekte edin. Yavaşça 100 enjekte edin? Septum portundan L çözelti.

Veri toplama programının 300 saniye boyunca veri toplayacak şekilde ayarlandığını doğrulayın, bu da 3 tepe noktasının tümünün dedektörden geçmesi için yeterli zaman sağlar. Denemeye başlamaya hazır olduğunuzda, numuneyi mobil faza enjekte etmek için enjektör kolunu enjeksiyon konumuna çevirin. Hemen, veri toplama programında "Denemeyi Başlat" ı tıklayın. Tarama tamamlandığında, 7 standart çözümün her biri için işlemi tekrarlayın. İlk 3 standardın her biri için, 3 tepe noktasından yalnızca biri görünür. Bileşeni tanımlamak için kullanılan tepe noktasının konumuna dikkat edin.

3 diyet soda örneği seçin ve karbonatlaşmayı gidermek için gece boyunca açık kaplarda bekletin.

Gece boyunca gaz giderme işleminden sonra, her diyet sodadan yaklaşık 3 mL'yi plastik bir şırıngaya çekin. Daha sonra, şırıngaya bir filtre ucu takın ve katı partikülleri gidermek için sodayı filtreden bir cam şişeye itin.

Soda konsantrasyonunu yarı yarıya azaltmak için her numunenin 2 mL'sini 2 mL mobil faz ile seyreltin.

100 çizin ? Soda örneklerinden birinin L'sini bir şırıngaya koyun ve örnek döngüsüne enjekte edin. Denemeyi standart çözümlerle aynı parametrelerle çalıştırın. Her soda örneği için tekrarlayın.

İlk olarak, standart numunelerin tepe alanlarını bilinen konsantrasyonlarla ilişkilendirin. Bunu yapmak için, üçgen yöntemi kullanarak her standart numune için kromatograflardaki tepe alanlarını belirleyin. Genişlik yüksekliğin yarısı kadar olacak şekilde en yüksek yükseklik sürelerini hesaplayın ve bu değeri tepe alanı olarak kullanın.

Tepe alanını ve bilinen konsantrasyonları kullanarak her bileşen için bir kalibrasyon eğrisi oluşturun ve her kalibrasyon eğrisi için uygun olan en küçük kareleri belirleyin.

Diyet gazlı içeceklerdeki her bir bileşenin konsantrasyonunu en yüksek bölgelerden hesaplayın. Gazlı içeceklerin tümünün HPLC'ye enjeksiyondan önce 2 kat seyreltildiğini unutmayın. Bu sonuçlara dayanarak, 12 oz'luk bir soda kutusundaki her bir bileşenin mg'ını hesaplayın.

Şaşırtıcı olmayan bir şekilde, test edilen 3 gazlı içeceğin tümü kabaca aynı miktarda koruyucu benzoat içeriyordu. Bununla birlikte, kola ürünleri daha fazla kafein içeriyordu. Tüm bileşenler için hesaplanan değerler, üreticiler tarafından bildirilen değerlerle iyi bir şekilde ilişkilendirildi.

HPLC, çok çeşitli analizlerde kullanılan çok yönlü bir cihazdır.

HPLC genellikle peptit moleküllerini saflaştırmak için kullanılır. Bu örnekte, transmembran peptit kompleksleri hazırlandı ve daha sonra proteinleri disülfid bağları ile oksidatif çapraz bağlayarak stabilize edildi.

Proteinler daha sonra formik asit içinde çözüldü ve ters fazlı HPLC kullanılarak saflaştırıldı. Numune daha sonra iki çözücünün doğrusal bir gradyanı kullanılarak ayrıştırıldı ve saflık kütle spektrometresi ile doğrulandı.

HPLC, laboratuvarda sentezlenen organik bileşikleri tanımlamak için de kullanılabilir. Miller-Urey deneyinde, ilkel dünyadaki organik bileşiklerin abiyotik sentezi incelendi. Metan ve amonyak gibi ilkel gazlar, erken okyanusları simüle eden su içeren bir şişeye verildi. Daha sonra ilkel dünyadaki şimşekleri taklit ederek elektrik deşarjı uygulandı.

Su daha sonra kütle spektrometresi ile birleştirilmiş HPLC kullanılarak analiz edildi ve bilinen amino asit standartlarıyla karşılaştırıldı. Bu deneyde 23 amino asit sentezlendi ve tanımlandı.

JoVE'nin HPLC'ye girişini yeni izlediniz. Artık cihazı çalıştırmanın ve elde edilen verileri analiz etmenin temellerini anlamanız gerekir.

İzlediğiniz için teşekkürler!