$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Sabunlaştırma, yağ asidi metil esterlerini karmaşık bir organik karışımdan uzaklaştırmak için yaygın olarak kullanılan bir tekniktir.
Karmaşık organik numuneler genellikle tek tek bileşenlerin nispi konsantrasyonlarını belirlemek için kullanılan gaz kromatografisi ile analiz edilir.
Bununla birlikte, boyut ve yapı bakımından benzer olan bileşikler, cihaz tarafından ayırt edilemez ve sonuçları çarpıtır. Bu nedenle, doğru sonuçlar elde etmek için örtüşen sinyaller üreten istenmeyen bileşiklerin uzaklaştırılması gerekir.
Bu video, paleoklimatoloji için alkenonları saflaştırmak için sabunlaştırmanın kullanımını kapsar. Karmaşık biyobelirteç numunelerinin saflaştırılmasını detaylandıran bir serinin ilkidir. Prosedürün yanı sıra tekniğin diğer bazı kullanımlarını da kapsayacaktır.
Alkenonlar olarak adlandırılan çoklu doymamış uzun zincirli alkil ketonların, geçmiş deniz yüzeyi sıcaklığı hakkında yararlı bilgiler sağladığı gösterilmiştir.
Bununla birlikte, alkenon üreten organizmalar genellikle alkenoatlar adı verilen, boyut ve kimyasal yapı bakımından benzer yağ asidi metil esterleri oluşturur. Bu benzerlikler nedeniyle, doğru bir analiz elde edilmeden önce alkenoların çıkarılması gerekir.
Sabunlaşma, bu moleküllerin birlikte elüsyonunu önlemek için kullanılan yaygın bir tekniktir. Sabunlaştırma, bir esterin moleküler bağını bölmek için su kullanır. Alkenoatın kalbindeki karbona bir baz bağlanır. Bu ekleme reaksiyonu kararsız bir ara ürün oluşturur ve alkoksit dışarı atılır.
Yeni oluşan asitten gelen hidrojen, dışarı atılan alkokside hareket eder ve elde edilen karboksilat anyonu, bazdan gelen katyon ile iyonik bir bağ oluşturur. Sonuç, bir alkol ve bir yağ asidi tuzudur. Güçlü bir asit eklemek, karboksilik asidi yeniden üretecektir. Bu noktada, rahatsız edici alkenoat, artık ilgilenilen alkenon ile birlikte hareket etmeyen bir forma dönüştürülmüştür.
Artık organik bir karışımı saflaştırmak için sabunlaştırmanın nasıl kullanılabileceğini anladığınıza göre, işleme başlamaya hazırsınız.
İlk olarak, bir çözücü ekstraksiyon yöntemi kullanılarak elde edilen kurutulmuş bir toplam lipit ekstraktı - veya TLE - elde edin. Ardından, sabunlaştırma çözeltilerini metin protokolünde belirtildiği gibi hazırlayın. Tüm bileşenlerin saf olduğundan ve hidrokarbon içermediğinden emin olun. Çözeltiler hazırlandıktan sonra, kurutulmuş TLE'yi 60 mL'lik bir borosilikat cam şişeye ekleyin. 2 mL 2 normal potasyum hidroksit ekleyin ve şişeyi kapatın. Ardından, şişeyi 60 ° C'ye ısıtın. Ester bağını parçalamak için 2,5 saat C. Bu tamamlandığında, numunenin oda sıcaklığına soğumasını bekleyin. Numune soğuduktan sonra, şişeye 2 mL% 5 sodyum klorür çözeltisi ekleyin. Şişeyi kapatın ve kısa bir süre çalkalayın. pH 2'ye ulaşılana kadar damla damla 6 N hidroklorik asit ekleyin - test etmek için pH kağıdı kullanın. Bu asidin eklenmesi, nihai ürünü - kararlı karboksilik asidi oluşturmak için karboksilat anyonunu protonlayacaktır.
Artık asitleştirilmiş çözelti ester içermediğine göre, 5 mL heksan ekleyin. Organik bileşikleri sudan çıkarmak için kapağı kapatın ve 5 saniye kuvvetlice çalkalayın. Organik ve sulu fazlar tamamen ayrılana kadar çözeltinin dinlenmesine izin verin. Tuzlar, iyonlar ve reaksiyona girmemiş hidroklorik asit sulu fazda kalırken, organik bileşikler hekzana ayrılacaktır. Fazlar tamamen ayrıldıktan sonra, bir pipet kullanarak hekzanın yaklaşık% 75'ini çıkarın ve 40 mL'lik başka bir şişeye dağıtın. Bu ekstraksiyon işlemini iki kez daha tekrarlayın ve her seferinde 5 mL heksan ekleyin. Bu tamamlandıktan sonra, kalan sulu çözeltiyi uygun bir atık kabına atın. Taze sabunlaştırılmış organik fazı içeren şişeyi etiketleyin. Üretilen karboksilik asitler, daha fazla saflaştırma yapılmadan alkenon analizi için yaygın olarak kullanılan aletlere enjekte edilemez. Bir gaz kromatografına enjekte edilen karboksilik asitler, girişleri, giriş astarlarını ve sütunların ön ucunu hızla biriktirir ve bozar. Bu asitleri uzaklaştırmak için numunenin önce başka bir saflaştırma tekniğinden geçmesi gerekir: kolon kromatografisi ile ayırma.
Sabunlaştırma, organik moleküllerin ekstraksiyonu ve saflaştırılmasında çeşitli uygulamalara sahiptir.
Sabunlaştırma sadece biyobelirteçleri ayırmak için değil, aynı zamanda ticari ürünlerde kullanılmak üzere tek tek bileşenleri çıkarmak için de kullanılabilir. Bu örnekte, tütün ağacından elde edilen bileşikler -? Nicotiana glauca?- yakıt, ısı ve bir dizi kimyasal bileşik gibi çok çeşitli biyo-bazlı ürünler için hammadde olarak potansiyellerini araştırmak üzere izole edildi ve analiz edildi.
Yapraklar önce homojenize edildi, ardından ilgilenilen molekülleri konsantre etmek için santrifüjlendi. Konsantre bitki materyali daha sonra sabunlaştırıldı. Ekstrakte edilen materyal, tipik olarak bitkilerde bulunan bir E vitamini bileşikleri ailesi olan tokoferol konsantrasyonunu belirlemek için sıvı kromatografi-kütle spektrometresi ile analiz edildi.
Ekstrakte edilen materyal ayrıca orijinal bileşimine in vitro olarak yeniden oluşturulabilir. Bu örnekte, ıspanak bitkilerinden karotenoidleri çıkarmak için sabunlaştırma kullanıldı, daha sonra in vitro olarak yeniden oluşturulacak. Ispanak önce homojenize edildi, ardından pigment moleküllerini hasat etmek için santrifüjlendi. Bu moleküller daha sonra bir ayırıcı huni içinde bir potasyum hidroksit çözeltisi içinde süspanse edildi ve sabunlaşma başlatıldı. Sabunlaşmış karotenoidler, toplanan ve kurutulan bir eter tabakasına ayrıldı. Bir dizi çözelti tamponu kullanılarak, karotenoidler - ve diğer pigmentasyon molekülleri - daha sonra in vitro olarak yeniden oluşturuldu. Bu saflaştırma, benzer şekilde yapılandırılmış organik bileşiklerin müdahalesi olmadan bu pigmentlerin analizine izin verdi.
Esterleri hidrolize etme kabiliyeti nedeniyle, sabunlaştırma, aksi takdirde makromoleküllere bağlı olan bileşikleri "serbest bırakmak" için kullanılabilir. Bu örnekte, etil 4-florobenzoatı potasyum4-florobenzoatın karboksilik asit tuzuna dönüştürmek için susuz bir sabunlaştırma aşaması kullanılır. Sabunlaştırma yoluyla bu korumanın kesilmesi, ham SFB'nin üretilmesine izin verir - molekül "sıkışmış" kalsaydı mümkün olmayacak bir reaksiyon.
JoVE'nin Uk'37 numunelerinin sabunlaştırma yoluyla saflaştırılmasına girişini az önce izlediniz. Artık sabunlaştırmanın nasıl çalıştığını ve toplam lipit ekstraktındaki alkenonları saflaştırmak için nasıl kullanılacağını anlamalısınız. Daha sonraki videolarda daha fazla saflaştırma işlemi gösterilecektir.
İzlediğiniz için teşekkürler!
