Toplam Lipid Ekstraktının Kolon Kromatografisi ile Saflaştırılması

1. Malzemelerin Kurulumu ve Hazırlanması

1. Bir çözücü ekstraksiyon yöntemi (Sonication, Soxhlet veya Hızlandırılmış Çözücü Ekstraksiyonu (ASE)) kullanarak bir toplam lipit ekstraktı (TLE) elde edin.
2. Aşağıdakileri toplayın: yanmış borosilikat cam pipetler ve ampuller, silika jel, heksan, diklorometan (DCM) ve metanol.
   1. Bu malzemeler herhangi bir kimyasal perakendecisinden satın alınabilir. Reaktifler saf olmalı ve hidrokarbon içermemelidir.
3. Ayrıca yanmış cam yünü ve 4 mL borosilikat cam şişeler elde edin.
4. İşlem sırasında kolonu ve toplama şişelerini destekleyecek bir araca sahip olduğunuzdan emin olun. Örneğin, kelepçeli bir stand ve aşağılık bir raf. Birçok laboratuvar, birkaç sütun ve toplama şişesi tutan özel yapım raflar tasarlamıştır (Şekil 2). Bu, aynı anda birçok sütunun çalıştırılmasına izin verir.

2. Yöntemler

1. 4 mL'lik bir şişede kuru numune ile başlayın. Numune kuruduğunda ~ 10 mg'dan daha ağırsa, silika jel yalnızca sonlu bir organik madde kütlesi ile reaksiyona girebileceğinden, sonraki adımları gerçekleştirmeden önce bölünmesi gerekebilir.
2. Numuneyi az miktarda hekzan içinde süspanse edin. Bu, bu deneyde kullanılan üç çözücünün ilki ve en az polarıdır.
3. Şişenin içine yapışmış numune varsa, numuneleri 5 dakika boyunca sonikasyona tabi tutun.
4. Bir dizi temiz cımbız kullanarak bir pipetin üstüne az miktarda cam yünü yükleyin. Bir tıkaç oluşturmak için başka bir pipet kullanarak cam yününü yavaşça pipetin altına itin.
5. Silika jeli yaklaşık yarısı dolana kadar pipete dikkatlice aktarın.
6. Kolonun altına 4 mL'lik bir atık toplama şişesi yerleştirin.
7. Silika jeli pipette 3 hacim hekzan ile ıslatın. Bu, sütunu koşullandırır, hava kabarcıklarını giderir ve silika jeldeki yabancı maddeleri durular.
8. Son yıkama yapıldıktan sonra, atık toplama şişesini çıkarın ve apolar fraksiyonu toplamak için bir şişe ile değiştirin.
9. Heksan içindeki tüm numuneyi bir pipet kullanarak dikkatlice kolona aktarın. Numune şişesini küçük hacimlerde hekzan ile iki kez daha durulayın ve kolona aktarın. Numunenin aktarıldığı hekzanın tamamen silika jele batırılmasına izin verin. İşlem sırasında hiçbir zaman silika jel kurumamalıdır.
10. Kolonun altındaki toplama şişesi neredeyse dolana kadar (~ 4 mL) numunenin üstüne heksan eklemeye devam edin.
    1. Bir sonraki çözücüye başlamadan önce tüm hekzanın silika jele girmesine izin verin.
11. Orta polarite toplama şişesini kolonun altına yerleştirin.
12. Toplama şişesi neredeyse dolana kadar sütunun üstüne DCM ekleyin. Yine, bir sonraki çözücüye başlamadan önce tüm DCM'nin toplama şişesine girmesine izin verin.
13. Polar toplama şişesini sütunun altına yerleştirin.
14. Toplama aşağılığı neredeyse dolana kadar sütunun üstüne metanol ekleyin.