3.5: Ultraviyole-Görünür (UV-Vis) Spektroskopisi

1. Spektrometreyi kalibre edin

1. UV-Vis spektrometresini açın ve lambaları stabilize etmek için uygun bir süre (yaklaşık 20 dakika) ısınmasına izin verin.
2. Numune için bir küveti çözücü ile doldurun ve dışının temiz olduğundan emin olun. Bu, bir boşluk görevi görecek ve çözücü tarafından saçılma veya emilim nedeniyle hafif kayıpların hesaba katılmasına yardımcı olacaktır.
3. Küveti spektrometreye yerleştirin. Küveti düzgün bir şekilde hizaladığınızdan emin olun, çünkü küvetin genellikle taşıma amaçlı (yivli olabilir) ve ışık yayması amaçlanmayan iki tarafı vardır.
4. Boşluk için bir okuma yapın. Absorbans minimum olmalıdır, ancak herhangi bir absorbans gelecekteki numunelerden çıkarılmalıdır. Bazı araçlar boş verileri saklayabilir ve çıkarma işlemini otomatik olarak gerçekleştirebilir.

2. Bir Absorbans Spektrumu Gerçekleştirin

1. Küveti numune ile doldurun. Aktarımın kantitatif olduğundan emin olmak için, küveti numune ile iki kez durulayın ve ardından yaklaşık 3/4 oranında doldurun. Dış kısımda parmak izi vb. olmadığından emin olun.
2. Küveti spektrometreye doğru yönde yerleştirin.
3. Ortam ışığını önlemek için küvetin üzerini örtün.
4. Cihazın farklı dalga boylarını taramasına ve absorbansı toplamasına izin vererek bir absorbans spektrumu toplayın. Dalga boyu aralığı, belirli numune hakkındaki bilgilerle ayarlanabilir, ancak 200-800 nm aralığı standarttır. Bir diyot dizisi cihazı, tek bir çalışmada tüm bir absorbans spektrumunu toplayabilir.
5. Toplanan absorbans spektrumundan absorbans maksimumunu belirleyin (λ_max). λ_max cinsinden bir hata tahmini elde etmek için spektrum toplamayı tekrarlayın.
6. Bir kalibrasyon eğrisi oluşturmak için, çeşitli farklı konsantrasyon numunelerinin UV-Vis spektrumunu toplayın. Spektrometreler genellikle doğrusal aralıkta sınırlıdır ve 1.5'ten daha büyük bir absorbans değerini ölçemez. Numune için absorbans değerleri cihazın doğrusal aralığının dışındaysa, doğrusal aralıktaki değerleri elde etmek için numuneyi seyreltin.

3. UV-Vis Spektroskopisi ile Kinetik Deneyler

1. UV-Vis, zaman içinde absorbanstaki değişimi inceleyerek kinetik deneyler için kullanılabilir. Bir kinetik deney için, numunenin ilk okumasını yapın.
2. Kimyasal reaksiyonu başlatmak için reaktifi hızla ekleyin.
3. Numune ile karıştırmak için iyice karıştırın. Küçük bir miktar eklenirse, bu bir küvette yapılabilir. Alternatif olarak, reaktifi numune ile karıştırın ve ölçüm için hızlı bir şekilde bir küvete biraz dökün.
4. Zaman içinde ilgilenilen analit için λ_max absorbansını ölçün. Ölçülen reaktifin kullanılması (yani absorbans artıyor çünkü absorbe edilecek daha az reaktif var), o zaman bozunma reaksiyonun sırasını gösterecektir.
5. Bir kalibrasyon eğrisi kullanarak, absorbans değerini konsantrasyona dönüştürerek analit konsantrasyonunun zamana karşı bir grafiğini yapın. Oradan, bu grafik reaksiyon hızı sabitlerini belirlemek için uygun denklemlerle uyumlu hale getirilebilir.

Ultraviyole görünür veya UV-Vis spektroskopisi, laboratuvardaki en popüler analitik tekniklerden biridir.

UV-Vis spektroskopisinde ışık, UV veya görünür spektrumda belirli bir dalga boyunda bir numuneden geçirilir. Numune ışığın bir kısmını emerse, ışığın tamamı geçmeyecek veya iletilmeyecektir. İletim, iletilen ışığın yoğunluğunun gelen ışığa oranıdır ve absorpsiyon ile ilişkilidir. Absorbans, bir numunenin konsantrasyonunu elde etmek için kantitatif bir şekilde kullanılabilir. Ayrıca, absorbans spektrumu adı verilen bir dalga boyu aralığında ölçülen absorbansı yayınlanan verilerle eşleştirerek bir bileşiği tanımlamak için kalitatif bir şekilde de kullanılabilir. Bu videoda UV-Vis spektroskopisi tanıtılacak ve laboratuvarda numune konsantrasyonu ve reaksiyon kinetiğinin belirlenmesinde kullanımı gösterilecektir.

Bir foton bir moleküle çarptığında ve emildiğinde, molekül temel durumundan daha yüksek bir enerji durumuna terfi eder. İkisi arasındaki enerji farkı bant aralığıdır. Fotonun emilmesi için fotonun enerjisinin bant aralığıyla tam olarak eşleşmesi gerekir. Kimyasal yapı bant aralığını belirler; bu nedenle moleküllerin her biri benzersiz absorbans spektrumlarına sahiptir.

Absorbans, absorbansın molar zayıflama katsayısı ile yol uzunluğu ve konsantrasyonuna eşit olduğunu belirten Beer Yasasını takip eder. Molar zayıflama katsayısı, tek bir bileşiğin belirli bir dalga boyundaki ışığı emme yeteneği ile ilgilidir. Yol uzunluğu, standart küvetler için tipik olarak 1 cm olan numune boyunca ışığın kat ettiği mesafeyi ifade eder. Bira yasası, emicilik biliniyorsa numune konsantrasyonunu hesaplamak için kullanılabilir veya bir kalibrasyon eğrisi kullanılabilir.

UV-Vis genellikle genel bir teknik olarak adlandırılır, çünkü çoğu molekül UV görünür dalga boyu aralığındaki ışığı emer. UV aralığı 100 × 400 nm arasında değişir ve görünür spektrum 400 × 700 nm arasında değişir. Bununla birlikte, çoğu spektrofotometre 100×200 nm derin UV aralığında çalışmaz, çünkü bu aralıktaki ışık kaynakları pahalıdır. Çoğu UV-Vis spektrofotometresi, UV aralığı için 170×375 nm'den ışık üreten bir döteryum lambası ve görünür aralık için 350×2.500 nm'den ışık üreten bir tungsten filamanlı lamba kullanır.

Işık kaynağı genellikle geniş dalga boyu aralıklarına sahip bir lamba olduğundan, spesifik absorbans dalga boyu filtreler veya bir monokromatör kullanılarak seçilir. Monokromatörü, ışığın dalga boylarını uzamsal olarak ayıran ve ardından istenen dalga boyunun olduğu yere bir çıkış yarığı yerleştiren bir cihazdır. Monokromatör, tüm bir absorbans spektrumu sağlamak için bir dalga boyu aralığında taranabilir. Bu, tekniği çok çeşitli molekülleri ölçmek ve tanımlamak için kullanışlı hale getirir.

UV-Vis spektroskopisinin temelleri ana hatlarıyla belirtildiğine göre, laboratuvarda basit bir UV-Vis deneyine bir göz atalım.

Ölçüme başlamadan önce spektrofotometreyi açın ve lambaları stabilize etmek için uygun bir süre ısınmasına izin verin.

Temiz bir küveti numune çözücüsüyle doldurarak bir boşluk hazırlayın ve ardından parmak izlerini gidermek için dışını tüy bırakmayan kağıtla silin.

Küvetin, kiriş yolunun dışındaki yivli taraflarla düzgün şekilde hizalandığından emin olun ve spektrofotometreye yerleştirin. Ortam ışığının sisteme girmesini önlemek için kapağı sabitleyin.

Boşluğun absorbansını bir dalga boyunda veya bir dalga boyu aralığında ölçün. Numunenin absorbansından çıkarılması gerektiğinden, absorbansı kaydedin veya kaydedin.

Ardından, boşluğu atın ve küveti numune ile iki kez durulayın. Ardından, küveti yaklaşık olarak doldurun ? örnek ile dolu. Temiz olduğundan ve parmak izi içermediğinden emin olmak için küvetin dışını tekrar silin.

Küveti spektrofotometreye doğru yönde yerleştirin ve kapağı sabitleyin.

Boşlukla aynı dalga boyunda veya dalga boyu aralığında bir absorbans ölçümü veya spektrumu toplayın. Cihaz bunu otomatik olarak yapmazsa, boş spektrumu veya ölçümü çıkarın.

Toplanan absorbans spektrumundan, absorbans maksimumunu veya ?maks.

Numunedeki analit miktarını ölçmek için, bilinen bir dizi analit konsantrasyonu kullanarak bir kalibrasyon eğrisi oluşturun. Bir kalibrasyon eğrisinin nasıl oluşturulacağı ve kullanılacağı hakkında daha fazla bilgi için lütfen bu koleksiyonun "Kalibrasyon Eğrileri" videosunu izleyin.

Absorbans ölçümü, reaksiyon boyunca bir bileşik konsantrasyonundaki artışı veya azalmayı ölçerek reaksiyon kinetiğini hesaplamak için de kullanılabilir. Numunenin, bu durumda mavi boyanın, reaksiyondan önceki maksimum absorbansta ilk okumasını alarak başlayın.

Daha sonra, kimyasal reaksiyonu başlatmak için reaktifi, bu durumda ağartıcıyı hızlı bir şekilde ekleyin. Numune ile karışması için iyice karıştırın.

Absorbansı zaman içinde maksimum absorbansta ölçün.

Mavi boya numunesinin ilk absorbans spektrumu gösterilmiştir. Arka plan renkleri, görünür spektrumdaki ışığın renklerini gösterir. Mavi boya, yaklaşık 630 nm'de maksimum emiciliğe sahiptir.

Mavi boya ve ağartıcı arasındaki reaksiyonun kinetiği zaman içinde ölçüldü. Mavi boyanın emilimi, ağartıcı ile reaksiyona girdiği için zamanla azalır. Absorbans, 300 saniye sonra sıfıra yaklaşır, bu da reaksiyonun tamamlanmaya yaklaştığını gösterir. Kinetik ve reaksiyonlar hakkında daha fazla bilgi için lütfen JoVE Science Education "Reaksiyon Hızı Yasaları" videosunu izleyin.

UV-Vis spektroskopisi, bir numuneyi tanımlamak veya miktarını belirlemek için birçok farklı araştırma alanında yoğun olarak kullanılmaktadır.

Örneğin, UV-Vis spektroskopisi, bir numunedeki protein miktarını ölçmek için biyolojik alanlarda yoğun olarak kullanılır. Bir Bradford testi genellikle bir boya yardımıyla proteinleri ölçmek için kullanılır. İlk olarak, tipik olarak Sığır Serum Albümini veya BSA kullanılarak bilinen protein konsantrasyonlarının bir kalibrasyon eğrisi hazırlanır. Daha sonra standartların her birine ve numuneye Coomassie mavisi lekesi eklenir. Protein-boya kompleksinin emilimi daha sonra 595 nm'de ölçülür.

Alternatif olarak, proteinler doğrudan 280 nm'deki absorbansları ile ölçülebilir. Bu örnekte, protein konsantrasyonu ultra düşük hacimli bir spektrofotometre kullanılarak ölçülmüştür. Birçok protein için, 1'lik bir absorbans, 1 mg / mL'lik bir konsantrasyonla ilişkilidir.

UV-Vis spektroskopisi, bir hücre kültüründeki bakteri hücrelerinin miktarını ölçmek için de kullanılır. Bu ölçüm için, absorbans veya optik yoğunluk 600 nm'de ölçülür. Tipik olarak, 1'lik bir OD600 ölçümü, mL başına 8 x 108 bakteri hücresinin varlığını gösterir. Kültür büyümesi boyunca hücre yoğunluğunun ölçülmesi, bakteri büyüme eğrisinin belirlenmesini sağlar ve bir kültürün üstel büyüme aşamasında olduğunu belirlemeye yardımcı olabilir.

Azot oksit ve azot dioksit veya NOx, otomobil egzozunun bir yan ürünüdür ve zararlı troposferik ozon oluşturduğu için çevreye zararlı olabilir. NOx, bir sülfanilik asit ve naftil-etilendiamin çözeltisi ile reaksiyona sokularak ölçülebilir. Elde edilen çözelti, yoğunluğu doğrudan NOx konsantrasyonu ile ilişkili olan pembe renkli bir azo boya molekülüdür. Bu konsantrasyon daha sonra bir UV-Vis spektrofotometresi kullanılarak belirlenebilir.

JoVE'nin UV görünür spektroskopisine girişini yeni izlediniz. Artık UV-Vis işleminin temellerini, UV-Vis kullanarak bir numunenin nasıl ölçüleceğini ve absorbansın numune konsantrasyonu ile nasıl ilişkilendirileceğini anlamanız gerekir.

İzlediğiniz için teşekkürler!