Kolon Kromatografisi
Kaynak: Dr. Jimmy Franco Laboratuvarı - Merrimack Koleji
Kolon kromatografisi, bileşikleri saflaştırmak için en kullanışlı tekniklerden biridir. Bu te…
1. Silika Jel Bulamacı
- Silika jeli bir Erlenmeyer şişesine dökün. Ambalaj malzemesinin ağırlığı, ayrılan numunenin ağırlığının kabaca 50 katı olmalıdır. Ayrılan bileşikler çok benzer Rf değerlerine sahipse, bu örnekte olduğu gibi numune başına daha fazla miktarda silika kullanılması gerekebilir.
- 50 mg numune (45 mg florenon ve 5 mg tetrafenilporfirin) izole edildiğinden, Erlenmeyer şişesine 10 g silika koyun.
- Çözücü sistemini (hekzan/diklorometan, p: 0) silika jeli içeren Erlenmeyer şişesine ekleyin. Tüm silika jelin iyi çözüldüğünden emin olmak için yeterli çözücü ekleyin. Silika çözünmez, ancak karışım çözüldüğünde görsel olarak fark edilir. Çözücü eklendikten sonra, tüm silikanın iyi çözüldüğünden emin olmak için Erlenmeyer şişesini döndürün.
2. Sütunun Hazırlanması
- Uygun boyuttaki sütunu seçin. Tipik olarak, sütun yaklaşık yarısına kadar silika jel bulamacı ile doldurulmalıdır. Saflaştırılan numune ne kadar büyükse, gereken kolon o kadar büyük olur.
- Sütunun altını bir parça cam yünü ile tıkayın. Uzun bir çubuk kullanarak, yünün, vananın hemen üzerindeki sütunun altına sıkıca oturduğundan emin olun.
- Yün sıkıca yerine oturduğunda, cam yününün üzerine ince bir kum tabakası uygulayın.
Not: Sütun, vananın üzerinde bir cam frit ile donatılmışsa, bu adım atlanmalıdır. - Clamp sütunu dikey konumda bir halka standına yerleştirin.
- Bir huni kullanarak, hazırlanan silika jel bulamacını yavaşça sütuna dökün. Bulamacı Erlenmeyer şişesinden kolona aktarmak için ek çözücü eklemeniz gerekebilir. Bir pipet kullanarak, kolonun kenarlarına yapışan silika jeli yıkayın.
- Silika jel kolona yerleşirken, silika jelin sıkıca paketlendiğinden ve hava kabarcıklarını dışladığından emin olmak için kolonun kenarlarına hafifçe vurun.
- Vanayı açın ve silika jel ve çözücü önü buluşmadan hemen öncesine kadar çözücünün temiz bir Erlenmeyer şişesine akmasına izin verin. Silika jel, prosedür tamamlanana kadar asla kurumaya gitmemelidir.
- Silika jelin üzerine ince bir kum tabakası yerleştirin (Şekil 1). Bir pipet kullanarak, kolonun kenarlarına yapışmış olabilecek kumu yıkayın.
- Kum kuruyana kadar herhangi bir ek çözücüyü boşaltın, ancak silika jel tabakasına kadar değil.
Şekil 1. Numunenin eklenmesinden önce bir kolon kromatografisi deneyi için uygun kurulum.
3. Örneği Sütuna Ekleme
- Numuneyi mümkün olan en az miktarda çözücü içinde çözün (silika jel bulamacını yapmak için kullanılan aynı çözücüyü kullanarak).
- Bir pipet kullanarak, numuneyi nazikçe sütunun üst kısmına ekleyin.
- Numune kolonun üst kısmına uygulandıktan sonra, vanayı açın ve çözücünün silika jel tabakasından değil, kum tabakasından akmasına izin verin. Kolonun kenarlarına yapışmış olabilecek herhangi bir numuneyi yıkamak için çok az miktarda çözücü kullanın. Bu ek çözücüyü kum tabakasından da boşaltın.
4. Numuneyi Sütundan Çıkarma
- Bir pipet kullanarak, kum tabakasını rahatsız etmeyecek şekilde çok nazikçe 4-5 mL çözücü ekleyin.
- Sütunun üstüne bir huni yerleştirin ve sütunun geri kalanını çok yavaş ve nazikçe çözücü ile doldurun.
- Vanayı açın ve çözücünün kolondan akmasına izin verin.
- Kolondan test tüplerine akarken mobil fazı toplamaya başlayın.
- Test tüpleri, sıralı bir şekilde bir test tüpü rafına yerleştirilmelidir.
- İstenen tüm bileşikler kolondan ayrılana kadar kolonun üstüne gerektiği kadar ek çözücü ekleyin.
5. Bileşenlerin Kurtarılması
- Bileşikler renkliyse, görsel olarak tanımlanabilirler. Bununla birlikte, bileşikler renksizse, ulta-görünür (UV) ışık (bileşikler konjugasyon içeriyorsa) veya uygun leke kullanılarak tanımlanmaları gerekecektir. Bileşiklerin saflığı, ince tabaka kromatografisi kullanılarak doğrulanabilir.
- İstenen bileşiği (bileşikleri) içeren test tüplerini tanımlayın.
- İstenen izole edilmiş bileşik(ler)i içeren tüm fraksiyonları önceden tartılmış yuvarlak tabanlı (RB) bir şişede birleştirin. İzole edilen her bileşik için bunu yapın.
- RB şişesini döner buharlaştırıcıya yerleştirerek çözücüyü buharlaştırın.
- Çözücünün tamamı çıkarıldıktan sonra, RB'yi kurutulmuş ürünle tartın ve bir verim elde etmek için RB'nin ilk ağırlığını çıkarın.
Kolon kromatografisi, bir çözeltideki bileşikleri ayırmak için kullanılan çok yönlü bir saflaştırma yöntemidir. Bir çözelti karışımı, bir çözücü tarafından, sabit faz adı verilen bir adsorban katı içeren bir kolon boyunca taşınır. Kombine çözücü ve numune karışımına mobil faz denir.
Mobil fazdaki moleküller, kimyasal özelliklerine ve durağan faza olan afinitelerine bağlı olarak kolon boyunca farklı oranlarda hareket eder. Böylece, her bileşik kolondan farklı bir zamanda çıkar. Bileşikler ayrıldıktan ve saflaştırıldıktan sonra, daha fazla işlenebilir veya dağıtıma hazır hale gelebilirler. Bu video, kolon kromatografisinin temellerini tanıtacak, ardından organik bileşiklerin saflaştırılması ile tekniği gösterecektir.
Kolon kromatografisinde, moleküller kolondan akarken sabit faza geri dönüşümlü olarak adsorbe olur ve böylece ilerlemelerini yavaşlatır. Sabit faz ile zayıf bir şekilde etkileşime giren bileşikler, kolondan çıkmak veya elute etmek için daha hızlıdır. Durağan faz ile güçlü bir şekilde etkileşime giren bileşiklerin elute edilmesi daha yavaştır. Sabit faz, silika jel veya alümina gibi adsorban bir toz veya jeldir. Silika jel ve alümina oldukça polardır, bu nedenle polar bileşikler ve çözücülerle güçlü bir şekilde etkileşime girerler ve polar olmayan moleküllerle zayıf bir şekilde etkileşime girerler. Sabit faz, çözücü ile bir bulamaç olarak kolona yüklenir ve daha sonra sabit faz boyunca akan çözücü ile paketlenir. Düzgün bir şekilde paketlendiğinde, sabit faz yukarıdan aşağıya homojendir ve bu düzensizliklerin neden olduğu düzensiz akış, bileşiklerin ayrılmasını engellediğinden, hava kabarcıkları veya kuru lekeler içermez. Çözücü veya eluent, tipik olarak bir rezervuardan sağlanan organik bir çözücüdür. Genel olarak, polar olmayan çözücüler sadece polar olmayan bileşikleri elüte ederken, polar çözücüler hem polar hem de polar olmayan bileşikleri elüte eder. Bir karışım önemli ölçüde farklı polaritelere sahip bileşikler içeriyorsa, ilgilenilen tüm bileşikleri elüte etmek için giderek daha polar hale gelen bir dizi çözücü kullanılabilir. Mobil faz akış hızı genellikle kolonun altındaki bir vana ile kontrol edilir. Bileşiklerin difüzyonunu önlemek için akıştaki duraklamalar minimumda tutulur. Elüat adı verilen kolondan ayrılan mobil faz, bileşiklerin ayrılmasını korumak için fraksiyonlar halinde toplanır. Artık kolon kromatografisinin ilkelerini anladığınıza göre, organik bileşiklerin bir karışımının saflaştırılması için bir prosedürden geçelim.
Prosedüre başlamak için, ekipmanı metinde belirtildiği gibi edinin. Her bileşiğin izole edilmesi için yuvarlak tabanlı bir şişeyi tartın ve kütleyi kaydedin. Daha sonra, numuneyi tartın ve gereken minimum çözücü hacminde çözün. Uygun çözücü, ince tabaka kromatografisi kullanılarak önceden belirlenmelidir. Rf değeri 0.2?0.3 arasında olmalıdır. Ardından, numunenin kuru ağırlığına ve TLC ön taramasına dayalı olarak ilgilenilen bileşiklerin migrasyon mesafesindeki farka bağlı olarak sabit faz için gerekli olan silika jel miktarını belirleyin. Uygun miktarda silika jeli bir Erlenmeyer şişesine dökün. Bulamaç yarı saydam olana ve şişe döndürüldüğünde serbestçe hareket edene kadar çözücüyü silika jele ekleyin. Ardından, silika jelin yarıya kadar dolduracağı kadar büyük bir sütun seçin. Sütunda cam frit yoksa, sütuna cam yünü yerleştirin ve uzun bir çubukla dibe sıkıca bastırın. Silikanın cam yününden geçmesini önlemek için cam yününü yaklaşık 2 cm kumla örtün. Bir çeker ocakta, kolonu bir halka standına kelepçeleyin ve aşağıda test tüplerini yerleştirmek için yeterli boşluk bırakın.
Sütuna bir huni yerleştirin ve musluğun kapalı olduğundan emin olun. Bulamacı kolona dökün, bulamaç çökerken hava kabarcıklarını dışlamak için yanlara hafifçe vurun. Tüm jeli kolona aktarmak için huniyi, şişeyi ve kolonun duvarlarını çözücü ile durulayın.
Sütunun altına bir Erlenmeyer şişesi yerleştirin. Vanayı açın ve solvent seviyesi silika jelin hemen üzerine gelene kadar solventin şişeye akmasına izin verin ve ardından vanayı kapatın. Jelin üzerine yaklaşık 2 cm kum dökün. Kolonun kenarlarına yapışan kumu çözücü ile nazikçe durulayın. Çözücüyü gerektiği gibi boşaltın, böylece kum çoğunlukla kuru olur, ancak silika tamamen kapalı kalır.
Ayırma işlemini başlatmak için, kumu rahatsız etmeden numuneyi sütuna ekleyin. Kolon duvarlarına yapışan herhangi bir numuneyi durulamak ve numune kabını durulamak için küçük porsiyonlarda çözücü kullanın. Seviye silikanın hemen üzerine gelene kadar çözücüyü dikkatlice boşaltın. Ardından, bir pipetle kum tabakasını bozmadan nazikçe 4-5 mL çözücü ekleyin. Sütuna bir huni yerleştirin ve yavaşça çözücü ile doldurun. Şişeyi çıkarın ve etiketli bir test tüpü ile değiştirin. İlk test tüpü yerindeyken, vanayı açın ve test tüpü neredeyse dolana kadar elüatı toplayın.
İstenen tüm bileşikler ayrıştırılana kadar fraksiyonları toplamaya devam edin, etiketli test tüplerinden sırayla ilerleyin. Bitirdiğinizde, vanayı kapatın.
İzole edilen her bileşik için, saf fraksiyonları önceden tartılmış yuvarlak tabanlı bir şişede birleştirin. Çözücüyü döner bir buharlaştırıcıdaki şişeden çıkarın ve ardından kuru bileşiği içeren yuvarlak tabanlı şişeyi tartın. Daha fazla bilgi için, bu koleksiyonun döner buharlaşma hakkındaki videosuna bakın.
Bu numune, tetrafenilporfirin veya TPP ve florenonun bir karışımını içeriyordu. Önce koyu kırmızımsı-mor TPP, ardından sarı florenon çıkarıldı. İzole edilen her bir bileşiğin saflığı NMR spektroskopisi ile doğrulandı.
Kolon kromatografisi, çeşitli bilimsel alanlarda saflaştırma ve analizde kullanılmaktadır.
Yüksek performanslı sıvı kromatografisi veya HPLC, bileşikler arasında mükemmel ayrım sağlayan ve radyoaktif işaretli moleküller için radyasyon dedektörü gibi özel dedektörleri içerebilen bir kolon kromatografisi şeklidir. HPLC kullanılarak, radyoaktif işaretli bir fosfolipid, karışımın küçük bir yüzdesini oluştursa bile, diğerlerinin karışımından kolayca izole edilebilir. Bu bilgi, birçok önemli biyomolekülün üretimini, düzenlenmesini ve işlevlerini aydınlatmaya yardımcı olabilir.
Flaş kromatografisi, mobil fazın tek başına yerçekimi akışı yerine hava veya gaz basıncı altında kolon boyunca hareket ettiği bir kolon kromatografisi çeşididir.
Bu, daha iyi ayırma için difüzyonu en aza indirerek daha hızlı bir akış hızı oluşturur. İstenen bileşik, ince tabaka kromatografisi ile gösterildiği gibi birkaç saf, konsantre fraksiyonda toplanır ve bu da mükemmel saflaştırma sonrası verim ve saflık ile sonuçlanır.
Normal kolon aparatı, küçük hacimleri ayırmak için uygun değildir, ancak bazı karışımlar HPLC gibi özel tekniklerle uyumlu değildir. Küçük ölçekli saflaştırma, küçük ölçekli flaş kromatografisi için kullanılan bir pipet ampulü ile cam pipet kolonları ile gerçekleştirilir. Bu, özellikle özel saflaştırma teknikleri için bir numune hazırlarken veya büyük ölçekli saflaştırmayı takiben son adım olarak kullanışlıdır.
JoVE'nin kolon kromatografisine girişini yeni izlediniz. Artık kolon kromatografisinin ilkelerine, silika jel kolon kromatografisi için bir prosedüre ve tekniğin bazı uygulamalarına aşina olmalısınız.
İzlediğiniz için teşekkürler!
View the full transcript and gain access to JoVE Science Education videos
Q1: What is the mobile phase in column chromatography?
The mobile phase is the combined solvent and sample mixture that flows through the column. It carries the dissolved compounds through the stationary phase, allowing separation based on how strongly each molecule interacts with the adsorbent. The solvent used is typically an organic solvent selected based on the polarity of compounds being purified.
Q2: Why do different compounds elute at different times in column chromatography?
Compounds elute at different rates because they interact differently with the stationary phase. Molecules that bind weakly to the adsorbent exit the column quickly, while those with strong interactions elute more slowly. This differential adsorption, based on chemical properties and polarity, enables separation of the mixture into pure fractions.
Q3: What are the most common stationary phases used in column chromatography?
Silica gel and alumina are the two most commonly used stationary phases. Both are highly polar adsorbents that interact strongly with polar compounds and solvents, but weakly with nonpolar molecules. These materials are packed into the column as a slurry and must be properly compacted to ensure homogeneous packing without air bubbles or dry patches.
Q4: How do you prepare the stationary phase before starting column chromatography?
The stationary phase is prepared by mixing the adsorbent powder with solvent to create a slurry that is translucent and moves freely. This slurry is poured into the column and packed by flowing solvent through it. Proper packing ensures the stationary phase is homogeneous from top to bottom with no air bubbles, which is critical for effective separation.
Q5: What role does solvent polarity play in selecting the mobile phase?
Solvent polarity determines which compounds will elute from the column. Nonpolar solvents only elute nonpolar compounds, while polar solvents elute both polar and nonpolar compounds. For mixtures with significantly different polarities, a series of increasingly polar solvents may be used sequentially to elute all compounds of interest.
Q6: How is thin layer chromatography used to prepare for column chromatography?
Thin layer chromatography is used as pre-screening to determine the appropriate solvent and predict separation success. The Rf value should be between 0.2 and 0.3 to ensure good separation. This information helps determine the amount of silica gel needed and guides the selection of the mobile phase solvent for the column.
Q7: What happens after fractions are collected in column chromatography?
Pure fractions are combined in a pre-weighed flask, and the solvent is removed using rotary evaporation to yield the isolated dry compound. The flask is then weighed to determine the mass of purified product. The purity of isolated compounds can be confirmed using analytical techniques such as nuclear magnetic resonance spectroscopy.