Kolon Kromatografisi

1. Silika Jel Bulamacı

1. Silika jeli bir Erlenmeyer şişesine dökün. Ambalaj malzemesinin ağırlığı, ayrılan numunenin ağırlığının kabaca 50 katı olmalıdır. Ayrılan bileşikler çok benzer R_f değerlerine sahipse, bu örnekte olduğu gibi numune başına daha fazla miktarda silika kullanılması gerekebilir.
   1. 50 mg numune (45 mg florenon ve 5 mg tetrafenilporfirin) izole edildiğinden, Erlenmeyer şişesine 10 g silika koyun.
2. Çözücü sistemini (hekzan/diklorometan, p: 0) silika jeli içeren Erlenmeyer şişesine ekleyin. Tüm silika jelin iyi çözüldüğünden emin olmak için yeterli çözücü ekleyin. Silika çözünmez, ancak karışım çözüldüğünde görsel olarak fark edilir. Çözücü eklendikten sonra, tüm silikanın iyi çözüldüğünden emin olmak için Erlenmeyer şişesini döndürün.

2. Sütunun Hazırlanması

1. Uygun boyuttaki sütunu seçin. Tipik olarak, sütun yaklaşık yarısına kadar silika jel bulamacı ile doldurulmalıdır. Saflaştırılan numune ne kadar büyükse, gereken kolon o kadar büyük olur.
2. Sütunun altını bir parça cam yünü ile tıkayın. Uzun bir çubuk kullanarak, yünün, vananın hemen üzerindeki sütunun altına sıkıca oturduğundan emin olun.
3. Yün sıkıca yerine oturduğunda, cam yününün üzerine ince bir kum tabakası uygulayın.
   Not: Sütun, vananın üzerinde bir cam frit ile donatılmışsa, bu adım atlanmalıdır.
4. Clamp sütunu dikey konumda bir halka standına yerleştirin.
5. Bir huni kullanarak, hazırlanan silika jel bulamacını yavaşça sütuna dökün. Bulamacı Erlenmeyer şişesinden kolona aktarmak için ek çözücü eklemeniz gerekebilir. Bir pipet kullanarak, kolonun kenarlarına yapışan silika jeli yıkayın.
   1. Silika jel kolona yerleşirken, silika jelin sıkıca paketlendiğinden ve hava kabarcıklarını dışladığından emin olmak için kolonun kenarlarına hafifçe vurun.
6. Vanayı açın ve silika jel ve çözücü önü buluşmadan hemen öncesine kadar çözücünün temiz bir Erlenmeyer şişesine akmasına izin verin. Silika jel, prosedür tamamlanana kadar asla kurumaya gitmemelidir.
7. Silika jelin üzerine ince bir kum tabakası yerleştirin (Şekil 1). Bir pipet kullanarak, kolonun kenarlarına yapışmış olabilecek kumu yıkayın.
8. Kum kuruyana kadar herhangi bir ek çözücüyü boşaltın, ancak silika jel tabakasına kadar değil.

Şekil 1. Numunenin eklenmesinden önce bir kolon kromatografisi deneyi için uygun kurulum.

3. Örneği Sütuna Ekleme

1. Numuneyi mümkün olan en az miktarda çözücü içinde çözün (silika jel bulamacını yapmak için kullanılan aynı çözücüyü kullanarak).
2. Bir pipet kullanarak, numuneyi nazikçe sütunun üst kısmına ekleyin.
3. Numune kolonun üst kısmına uygulandıktan sonra, vanayı açın ve çözücünün silika jel tabakasından değil, kum tabakasından akmasına izin verin. Kolonun kenarlarına yapışmış olabilecek herhangi bir numuneyi yıkamak için çok az miktarda çözücü kullanın. Bu ek çözücüyü kum tabakasından da boşaltın.

4. Numuneyi Sütundan Çıkarma

1. Bir pipet kullanarak, kum tabakasını rahatsız etmeyecek şekilde çok nazikçe 4-5 mL çözücü ekleyin.
2. Sütunun üstüne bir huni yerleştirin ve sütunun geri kalanını çok yavaş ve nazikçe çözücü ile doldurun.
3. Vanayı açın ve çözücünün kolondan akmasına izin verin.
4. Kolondan test tüplerine akarken mobil fazı toplamaya başlayın.
   1. Test tüpleri, sıralı bir şekilde bir test tüpü rafına yerleştirilmelidir.
5. İstenen tüm bileşikler kolondan ayrılana kadar kolonun üstüne gerektiği kadar ek çözücü ekleyin.

5. Bileşenlerin Kurtarılması

1. Bileşikler renkliyse, görsel olarak tanımlanabilirler. Bununla birlikte, bileşikler renksizse, ulta-görünür (UV) ışık (bileşikler konjugasyon içeriyorsa) veya uygun leke kullanılarak tanımlanmaları gerekecektir. Bileşiklerin saflığı, ince tabaka kromatografisi kullanılarak doğrulanabilir.
2. İstenen bileşiği (bileşikleri) içeren test tüplerini tanımlayın.
3. İstenen izole edilmiş bileşik(ler)i içeren tüm fraksiyonları önceden tartılmış yuvarlak tabanlı (RB) bir şişede birleştirin. İzole edilen her bileşik için bunu yapın.
4. RB şişesini döner buharlaştırıcıya yerleştirerek çözücüyü buharlaştırın.
5. Çözücünün tamamı çıkarıldıktan sonra, RB'yi kurutulmuş ürünle tartın ve bir verim elde etmek için RB'nin ilk ağırlığını çıkarın.