3.11: Kapiler Elektroforez (CE)

1. CE Enstrümantasyon Kurulumu

1. CE cihazını ve bilgisayarı açın. Bilgisayar yazılımını kullanarak, ısınmasını sağlamak için UV analizi için ışık kaynağını açın. Bazı yazılımlarda, lambanın kullanıma hazır olduğuna dair bir gösterge bulunur (lamba simgesi renge döner).
2. Bir yöntem dosyası oluşturun. CE'yi çalıştırmak için önemli parametreleri ayarlayın. Bu analizde, kartuşun ve numune saklamanın sıcaklıkları 35 °C'dir. UV algılama için dalga boyu 214 nm'dir.
3. Bir zaman programı yazın. Program genellikle durulama adımlarından (analizden önce kılcal damarı temizlemek için), enjeksiyon adımlarından ve ardından bir elektroforez adımından oluşur. Durulama adımı için 20 psi basınç kullanarak 1 dakika boyunca 2 durulama gerçekleştirin. İlk durulama, kılcal duvardaki silanol gruplarının protondan arındırıldığından emin olmaya yardımcı olan NaOH ile yapılır. İkinci durulama, kılcal damarın tampon ile dengede bırakıldığından emin olmak için çalışma tamponu (burada 0.025 M borat tamponu) ile yapılır.
4. Enjeksiyon için, 5 s boyunca 0,5 psi'de basınçlı enjeksiyon kullanılır.
5. Elektroforez adımı için koşullar ayırma gerilimidir: 20 kV, süre: 5 dakika, normal polarite. Her adım için, hangi şişenin giriş ve hangi şişenin çıkış olduğunu da belirtin. Tüm parametreler girildikten sonra yöntemler dosyasını kaydedin.

2. Standartların ve Soda Numunelerinin Hazırlanması

1. Suda 500 ppm'lik aspartam, kafein ve benzoik asit stok çözeltileri yapın. Hacimsel bir şişe kullanarak her birinden 50 mL yapın.
2. 10 mL'lik hacimsel bir şişede 150 ppm aspartam, 150 ppm kafein ve 100 ppm benzoik asitten oluşan standart bir çözelti yapın.
3. 10 mL'lik hacimsel şişelerde 50 ppm, 100 ppm, 150 ppm ve 200 ppm'lik standart kafein çözeltileri yapın.

3. Örnekleri CE

1. Standartlar veya soda numuneleri içeren şişeleri numune şişesi tutucusuna yerleştirin. Hangi örneğin hangi yuvada olduğunu yazdığınızdan emin olun. İki yuvada borat çalışma tamponu ve 0.1 M NaOH durulama çözeltisi bulunur.
2. Yöntem dosyasına, ilk numune şişesinin hangi yuvada olduğunu girin.
3. Programın istediği tüm veri bilgilerini girdiğinizden emin olarak tek bir çalıştırma edinin.
4. Her numune için giriş şişesini değiştirerek veri toplamaya devam edin. Kombinasyon standardını, 3 konsantrasyon kafeini ve bir Pepsi ve diyet Pepsi örneğini çalıştırın.
5. Hedefi alete yerleştirin ve uygun aleti seçin.
6. Bilgisayardaki verileri analiz edin. Tepe noktalarını ve kaplama standartlarını ve gerçek örnekleri hesaplayın, böylece tepe noktalarını belirleyin. Kafein verileri için bir kalibrasyon eğrisi yapın.

Kılcal elektroforez veya CE, bir elektrik alanındaki molekülleri boyut ve yüke göre ayırmak için kimyasal analizde kullanılan bir tekniktir.

Kılcal Elektroforez, akan bir elektrolit çözeltisi içeren, kılcal damar adı verilen milimetre altı çaplı bir tüpte gerçekleştirilir. Numune kılcal damara enjekte edilir ve bir elektrik alanı uygulanır. Moleküller daha sonra yük, boyut ve çözücünün viskozitesinden etkilenen hızlarındaki farka göre ayrılır. CE, yüklü moleküllerin ayrılması için idealdir ve yüksek performanslı sıvı kromatografisinden daha yüksek bir çözünürlüğe sahiptir, bu da onu daha verimli ve hassas hale getirir.

Bu video, kılcal elektroforezin temellerini tanıtacak ve bir alkolsüz içeceğin bileşimini belirleyerek kullanımını gösterecektir.

CE'de, bir elektrolit ile doldurulmuş bir kılcal damara bir elektrik alanı uygulanır. Elektrik alanı, kılcal girişte pozitif bir yüke ve çıkışta negatif bir yüke neden olur.

Elektrolit, elektrik alanı tarafından indüklenen kılcal damar içinde akar. Elektro-ozmotik akış olarak adlandırılan bu akış, negatif yüklü kılcal duvarlar boyunca pozitif yüklü tuz iyonlarından oluşan ayrı bir tabakanın hareketinden kaynaklanır.

Elektrik akımı kılcal damardan geçerken, duvar boyunca katyonlar negatif uca doğru hareket eder. Bu iyon akışı, merkezdeki çözeltiyi tüpün içinden çeker.

Numune molekülleri daha sonra kılcal damar içindeki hızlarına göre ayrılır. Elektroforetik hareketlilik olarak adlandırılan bu hız, moleküllerin yüküne ve boyutuna ve bir elektrik alanı tarafından ne kadar çekildiğine veya itildiğine bağlıdır.

Pozitif yüklü moleküller, çıkıştaki potansiyele daha fazla çekildikleri için kılcal damardan daha hızlı akarlar. Negatif yüklü moleküller, girişteki potansiyele daha fazla çekildikleri için çok daha yavaş akarlar. Nötr moleküller toplu akışla birlikte taşınır. Böylece, kılcal damardan çıkan moleküllerin sırası pozitif yüklü, nötr ve daha sonra negatif yüklüdür. Ek olarak, elektrolit akışı, sürtünme kuvvetleri nedeniyle daha küçük molekülleri daha büyük moleküllerden daha hızlı çeker.

Moleküller, kolondan çıkarken UV-Vis gibi bir dedektör tarafından kaydedilir ve elektroferogram adı verilen zamana karşı dedektör sinyal yoğunluğu grafiğinde görselleştirilir.

Elektroferogramlar bir dizi bilgi verebilir; bir numunede kaç farklı bileşik bulunduğu ve her bir maddenin miktarı gibi.

Artık kapiler elektroforezin kısa bir özetini gördüğünüze göre, laboratuvarda nasıl yapıldığına bir göz atalım.

İlk olarak, kılcal elektroforez aletini ve bilgisayarı açın. Ardından, ısınmasına izin vermek için UV dedektörünü açın.

Denemeyi çalıştırmak için parametreleri ayarlayın. İlk olarak, kartuş ve numune saklama sıcaklığını 35 ° C'ye ayarlayın. C ve 214 nm'ye kadar UV algılama için dalga boyu.

Ardından, iki durulama adımını ayarlayın. İlk durulama, kılcal duvardaki silanol gruplarının protonlanmasını sağlamak için sodyum hidroksit ile yapılır. İkinci durulama, kılcal damarı dengelemek için çalışan tampon kullanır. Ardından, numuneyi 5 saniye boyunca 0,5 psi'de enjekte edilecek şekilde ayarlayın.

Ayırma voltajını seçerek elektroforez adımını ayarlayın. Bu durumda, normal polariteyi kullanarak 5 dakika boyunca 20 kV kullanın, bu da elektrik alanının girişte pozitif ve çıkışta negatif olduğu anlamına gelir.

İlk olarak, suda milyonda 500 parça soda bileşenleri aspartam, kafein ve benzoik asitten oluşan 50 mL stok çözeltileri hazırlayın.

Stok çözeltilerinden 150 ppm aspartam, 150 ppm kafein ve 100 ppm benzoik asitten oluşan standart bir çözelti yapın.

Ardından, 50, 100, 150 ve 200 ppm'de 4 standart kafein çözeltisi yapın. Bu numuneler bir kalibrasyon eğrisi yapmak için kullanılacaktır. Daha fazla bilgi için, bu koleksiyonun kalibrasyon eğrileri hakkındaki videosuna bakın.

Son olarak, soda örneklerini nitrojen ile gazdan arındırarak hazırlayın. Soda numuneleri seyreltme yapılmadan analiz edilecektir.

Standart veya soda numuneleri içeren şişeleri şişe tutucusuna yerleştirin. Çalışma tamponunu ve sodyum hidroksit durulama solüsyonunu içeren şişeleri de numune tutucuya yerleştirin. Her birinin konumunu kaydettiğinizden emin olun.

CE cihaz yazılımında, hangi yuvaların iki durulama solüsyonunu ve ilk numune şişesini içerdiğini belirtin. Şimdi ilk örneği çalıştırın.

Ardından, giriş şişesini değiştirerek kombinasyon standardını, 4 konsantrasyon kafeini ve normal ve diyet soda örneğini çalıştırın.

Tüm çözümler ayrıldıktan sonra verileri analiz edin.

İlk olarak, soda numunelerindeki tepe noktalarını belirlemek için standartları kullanın. Diyet soda örneğinde gözlemlenen üç zirvenin standartlarla karşılaştırılması, diyet sodada kafein, aspartam ve benzoik asidin bulunduğunu göstermektedir. Normal soda örneğinde, sadece kafein zirvesi bulunur, ancak aspartam ve benzoik asit zirveleri yoktur.

Ardından, her bir kafein standart çözeltisi için tepe alanını hesaplayın ve bir kalibrasyon eğrisi yapın. Kafein için kalibrasyon eğrisi, her bir numunedeki kafein konsantrasyonunu hesaplamak için kullanılabilir.

Kapiler elektroforez, akademik ve endüstriyel ortamlarda birçok özel ayırma için kullanılır.

CE genellikle ilaç endüstrisi kalite kontrol testinin bir bileşeni olarak kullanılır. Küçük moleküller veya biyolojik olarak ilaçlar, herhangi bir yan ürün olup olmadığını görmek için kılcal elektroforezden geçirilebilir. Katlama protein yükünü etkileyebileceğinden, proteinlerin düzgün bir şekilde katlanıp katlanmadığını belirlemek için de kullanılabilir.

CE, DNA'yı ayırmak için de kullanılabilir. Araştırmacılar, bir mikro kuyu plakası ve çok sayıda kılcal damar dizisi kullanarak, burada gösterildiği gibi tek bir deneyin verimini artırabilirler. DNA fragmanları, 1 baz çiftine kadar bir çözünürlükle boyutlarına göre ayrıldı. Bu, potansiyel genetik hastalıkları teşhis etmek için kullanılan kopya sayısı varyantları gibi diğer parametrelerin belirlenmesinin yanı sıra DNA parçalarının dizilenmesini mümkün kılar.

Bir protein, kimyasal olarak farklı yerlere bağlanan çeşitli fonksiyonel gruplar tarafından değiştirilebilir. Aynı proteinin farklı kopyaları, her bir proteinin yükünü ve boyutunu değiştirecek farklı modifikasyonlarla değişebilir. Saflaştırılmış proteinleri bir kütle spektrometresine bağlı bir CE'den geçirmek, hangi modifikasyonların mevcut olduğuna bağlı olarak proteinleri ayırabilir ve ayrıca modifikasyonun türünü ve yerini belirleyebilir.

JoVE'nin kılcal elektroforez ile tanışma sürecini az önce izlediniz. Artık CE'nin molekülleri yük ve kütleye göre nasıl ayırdığını ve laboratuvarda CE üzerinde bir numunenin nasıl çalıştırılacağını anlamalısınız.

İzlediğiniz için teşekkürler!