Kan Alma I

Kan alma, fareleri ve sıçanları içeren çeşitli araştırma çalışmaları için ortak bir gerekliliktir. Bu hayvanlarda kan alma yönteminin seçimi, ihtiyaç duyulan kan hacmi, numune alma sıklığı, kanı alınacak hayvanın sağlık durumu ve teknisyenin beceri düzeyi gibi birçok faktöre bağlıdır.

Burada, bu hususları gözden geçireceğiz ve retro-orbital göz kanaması, kuyruk keskin nişancıları ve çentiklerin yanı sıra intrakardiyak kan alma dahil olmak üzere kan alma prosedürlerini özetleyeceğiz. Diğer yöntemler için bu serinin ikinci videosuna bakın.

Kan alma protokollerini incelemeden önce, numune tipi, iğne seçimi ve toplanabilecek maksimum kan hacmi dahil olmak üzere bazı genel hususları gözden geçirelim. Bir fare veya sıçandan kan almadan önce, gerekli kan örneğinin türü belirlenmelidir. Deneysel prosedürler tam kan, plazma veya serum gerektirebilir.

Tam kan toplanıyorsa, pıhtılaşmayı önlemek için numuneye bir antikoagülan eklenmelidir. Yaygın olarak kullanılan antikoagülanlar arasında EDTA olarak kısaltılan heparin, sodyum sitrat ve etilendiamin tetraasetik asit bulunur. Antikoagülanlar, yüzeyleri kaplamak için doğrudan şırıngaya yüklenebilir. Bu, kan alınırken antikoagülanın doğrudan temasına izin vererek pıhtılaşmanın önlenmesine yardımcı olur. Kemirgen kanı hızlı bir şekilde pıhtılaştığından, antikoagülanın kana doğru oranının kullanılması önemlidir. Plazma toplama, tam kanın antikoagülan ile santrifüjlenmesini gerektirir. Dönüşü takiben, WBC ve trombosit tabakasının üzerindeki yarı saydam sıvı plazmadır. Fibrinojen ve diğer pıhtılaşma faktörlerini içerir. Öte yandan, antikoagülanlar olmadan tam kan örneğinden serum toplanır. Ve numune pıhtılaştığı için, en üst oyuncu olan serum, fibrinojen veya diğer pıhtılaşma faktörlerini içermez.

İğne seçimi, hayvanın büyüklüğüne ve damar delinmesinin yapıldığı yere bağlıdır. Genel olarak, büyük delikli iğneler kan hücrelerine daha az zarar verir ve daha hızlı kan toplanmasını sağlar; ancak damar hasarına neden olma olasılığı daha yüksektir. İğne uzunluğu da dikkate alınmalıdır. Bir iğne çok uzunsa, kullanımı garip olabilir veya iğne içindeyken kan pıhtılaşmaya başlayabilir. Boyut seçenekleri 18 ila 29 gauge ve 0,5 ila 1,5 inç uzunluk arasında değişir. Her yöntem için uygun iğne boyutu prosedürler bölümünde tartışılacaktır.

Son olarak, kemirgenlerin küçük boyutu nedeniyle, tek bir kan alımından toplanabilecek maksimum miktarda kan vardır ve bu da organizmaya ciddi zarar vermez. Kan alımı, sıvı replasmanı olmadan veya sıvı replasmanı ile olabilir - genellikle% 0.9 fizyolojik salin kullanılarak yapılır. Her durumda üst sınır, aşağıdaki metin protokolünde listelenmiştir. Ayrıca, bazı deneyler birden fazla numune toplanmasını gerektirir ve bu gibi durumlarda sıvı replasmanı ile birlikte hayvanın da kan hücrelerini yenilemek için zamana ihtiyacı olacaktır. Yine seri tahsilat sırasında tahsil edilebilecek maksimum tutar bulunmakta olup, üst limitler aşağıdaki protokolde listelenmiştir.

Bazı genel hususları gözden geçirdikten sonra, bilim adamları tarafından göze yakın damarlardan küçük hacimler toplamak için kullanılan bir teknik olan retro-orbital kanama ile başlayarak belirli kan alma tekniklerine geçelim. Orbital alanın anatomik yapısının fare ve sıçan arasında farklı olduğuna dikkat edin. Sıçanlar, gözün arkasına akan bir damar pleksusuna sahipken, farenin retro orbital sinüs oluşturan bir damar koleksiyonu vardır, bu da farelerde bu prosedürün gerçekleştirilmesini kolaylaştırır.

Kan almak için bir tüp alarak başlayın. 50-75 mikrolitre kapasiteli mikro hematokrit tüpleri tercih edilir. Çalışma yüzeyine birkaç kağıt havlu veya diğer yalıtım malzemeleri yerleştirin. Bu, işlem sırasında hayvanın vücut ısısını korumak içindir. Şimdi izofluran gibi bir inhalasyon anesteziki kullanarak hayvanı uyuşturun. Hayvan tamamen uyuşturulduktan sonra, onu odadan çıkarın ve yanal yaslanma pozisyonunda olan tarafına yerleştirin. Ardından, başın üstüne ve çene çizgisi boyunca bir parmağınızı yerleştirin ve göz çıkıntısını indüklemek için cildi geriye ve aşağı çekin. Asfiksi nedeniyle ölüme neden olabileceğinden trakeaya baskı uygulamaktan kaçının. Daha sonra, mikro-hematokrit tüpünü gözün medial kantusuna yerleştirin ve burun düzleminden 30 ila 45 derecelik bir açıyla kaudal olarak yönlendirin. Tüpü hafifçe döndürürken basınç uygulayın. Bu, konjonktival zarları kesecek ve oküler pleksus veya sinüsü yırtacaktır. Kan, kılcal hareket ile hematokrit tüpüne akacaktır. Tüpü, oküler boşluğun arkasındaki kemiğe çarpacak kadar derine itmekten kaçının. Kan akmaya başladığında, gözü çıkıntılı tutmak için basıncı koruyun. Kanamayı durdurmak için cildi serbest bırakın ve gözün normal konumuna dönmesine izin verin. Hemostazı teşvik etmek için baskı uygulayın. Tekrarlanan numune toplama için, kanamalar arasında en az 10 gün bekleyin. Bu, dokulara iyileşmesi için biraz zaman sağlar.

Retroorbital kanama yaygın bir prosedür olmasına rağmen, insancıllığı konusunda birçok endişe vardır. Bunlar, hematokrit tüpünün aşırı hareketine bağlı şişmeyi içerir. Bu da göz küresinin dışarı çıkmasına ve göz kapağının kapanmasını engelleyerek korneanın kurumasına, hasara ve ağrıya neden olabilir, bu da kaşımayı ve kendini yaralamayı tetikleyebilir. Hematokrit tüpünün yanlış yerleştirilmesi optik siniri keserek körlüğe neden olabilir. Diğer bir olası komplikasyon, gözün yörüngeden çıkmaya zorlanarak göz kapaklarının göz küresinin arkasına düşmesine izin vermesidir. Ayrıca, kırılgan yörünge kemiklerinin kırılması, göz küresinin nüfuz ederek vitreus mizahının kaybına neden olması veya gözün arkasında aşırı ağrıya neden olabilecek bir hematom oluşumundan kaynaklanan sorunlar ortaya çıkabilir. Tüm bu endişelere rağmen, yetenekli bir teknisyen prosedürü gerçekleştirirse ve hayvan tamamen anestezi altına alınırsa, retro-orbital kanama kemirgenlerde etkili bir kan alma yöntemidir.

Şimdi, küçük hacimli seri örneklerin toplanmasına izin veren kuyruk kanaması ile ilgili hususları ve prosedürleri gözden geçirelim. Bu prosedür için gerekli ekipman steril bir 11 numara neşter içerir. Makas kullanılmamalıdır çünkü makasla yapılan kesim kırıcıdır, bu da pıhtılaşmayı teşvik edebilir ve kan akışını azaltabilir. Diğer aletler, hayvanın kuyruğuna erişime izin veren bir kısıtlama borusudur; emici kağıt havlular; toplama veya hematokrit tüpleri ve styptic toz - hemostaza yardımcı olmak için.

Hayvanı emniyet borusuna sabitleyerek başlayın. Ardından, kalıntıları temizlemek ve hafif vazodilatasyona neden olmak için kuyruğu ılık suyla silin. Sıcak su KULLANMAYIN. Kuyruğu uzatın ve neşter bıçağıyla hematokrit veya toplama tüpleri kullanarak kanı toplamak için kuyruğun en ucunu kesin. Kan akışını teşvik etmek için kuyruk kıçından uca okşanabilir veya "sağılabilir". Ancak bu, numunenin kalitesini düşürecektir.

Kanamayı durdurmak için kuyruk ucuna bir gazlı bezle baskı uygulayın. Styptic toz, hemostaz elde etmek için kullanılabilir. Hemostaz elde edildiğinden emin olmak için hayvanları her 5 ila 10 dakikada bir kontrol edin, bu da tekrarlanan örneklemeden sonra gecikebilir. Bir kuyruk parçasından toplanan numune, doku ürünü kontaminasyonu ile birlikte hem arteriyel hem de venöz kan içerebilir. Bununla birlikte, kan toplama için bu prosedür, kuyruğun sonundaki orijinal kesimin kabuğunu veya pıhtısını bozarak seri toplamalara izin verir.

Kuyruk parçasına alternatif bir kan alma yöntemi, nispeten daha az invaziv olan kuyruk damarı çentiktir. Bunun için, aynı neşter bıçağını kullanarak, doğrudan yan kuyruk damarı üzerinde, sağrıdan olan mesafenin yaklaşık üçte ikisi kadar küçük bir kesim yapın. Kuyruk makaslarında olduğu gibi, kan toplama veya hematokrit tüplerinde toplanabilir. Ve bölgeye baskı uygulayarak ve hayvanı her 5-10 dakikada bir tekrar kontrol ederek hemostazı sağlamak zorunludur. Bununla birlikte, kuyruk makasında olduğu gibi, numuneler doku ürünleri ile kontamine olabilir.

Genellikle, intrakardiyak kanama veya kaudal vena kava yoluyla kan kaybı yoluyla gerçekleştirilen, hayatta kalmayan büyük bir kan örneği gerektiren çalışmalar.

Farelerde intrakardiyak yöntem için, 22-25 gauge 1 inçlik bir iğne ile 3 cc'lik bir şırıngaya ihtiyacınız vardır. Ve sıçanlar için, 18 gauge 1.5 inç iğneli 10-12 cc'lik bir şırınga tercih edilir. Bu ihtiyaçların ve şırıngaların neden ideal olduğunu anlamak için aşağıdaki protokole bakın.

Hayvanı karbondioksit kullanarak ötenazi yaparak başlayın. Ötenaziyi takiben, kemirgeni vücut dikey olarak asılı olacak şekilde ensesinden tutun. Bu kısıtlama, kalbin sapmasını veya göğsün bükülmesini önlemek için vücudun düz olması gerektiğinden çok önemlidir. Kalbin yaklaşık olarak dirsek seviyesinde bulunduğunu unutmayın. Yerleştirme tarafı, ksifoidin hemen solundaki çentikte, omurgaya paralel ve kaburgaların altındadır.

İğneyi göğsün içine eğin ve kalbi delin. Şırınga ile hafif bir geri basınç uygulayın. İğne kalbin içindeyse, kan şırıngaya akacaktır. Ek geri basınç eklemeden önce kanın namluyu doldurmasını bekleyin. Toplam kan hacminin yaklaşık yarısı, kardiyak ponksiyon ile bir fare veya sıçandan toplanabilir. Bu, ortalama bir fareden yaklaşık 1 mL kana ve ortalama bir sıçandan yaklaşık 10 mL kana eşdeğerdir

Alternatif bir pozisyon, yanal yaklaşımı kullanırken dorsal yaslanmadır. Bu durumda, iğneyi hayvanın sol tarafındaki kaburgaların arasına yerleştirin. Giriş noktası, göğüs duvarındaki dirsek noktasına karşı ölçülür. İğneyi, göğüs duvarının ortasındaki bir noktada masanın düzlemine dik olarak eğim verecek şekilde yerleştirin. Şırınga ile hafif bir geri basınç uygulayın. İğne kalbin içindeyse, kan şırıngaya akacaktır. Yine, ek geri basınç eklemeden önce kanın namluyu doldurmasını bekleyin. Her iki pozisyonda da, aşırı geri basıncın kalbi çökertebileceğini, iğne eğimini tıkayabileceğini ve şırıngaya kan akışını durdurabileceğini unutmayın.

Kardiyak kan toplamanın bir başka yöntemi de kaudal vena kava'dır. Bu prosedür için gerekli ekipman, doğru boyutta bir iğne takılı uygun bir şırıngadır; karın boşluğunu açmak için makaslar, küçük atravmatik başparmak forseps ve gazlı bez süngeri. Bu teknik, hayvanın derin bir şekilde uyuşturulmasını ve prosedür boyunca anestezi altında tutulmasını gerektirir. CO2 narkozu bir seçenek değildir, çünkü bu işlem için hayvan kalbinin atıyor olması gerekir. Hayvanı sırt yaslanma pozisyonuna getirin ve uzuvları platforma sabitleyin. Uzuvlar vücuttan uzağa uzatılmalıdır.

Şimdi cildi forseps ile kaldırın ve kadınlarda pelvisin hemen üzerindeki deriden küçük bir enine kesim yapmak için makas kullanın veya erkeklerde prepus. Daha sonra, makasın ucunu kesime yerleştirin ve deriden pelvis veya prepustan ksifoide kadar orta hat kesisi yapın. Cilt yanal olarak yansıtılırken, kası kaldırın ve cilt kesiğinin hemen üzerinde, kas boyunca küçük bir enine kesim yapın.

Makasın ucunu karın içine yerleştirin ve kasın içinden ksifoide orta hat insizyonu yapın. Herhangi bir organın kesilmesini önlemek için makas ucunu yukarı doğru eğdiğinizden emin olun. Her iki taraftaki kaburgaların eğrisi boyunca enine kesin. Karaciğeri delmemeye dikkat edin. Posterior vena kava'yı ortaya çıkarmak için bağırsakları yavaşça hayvanın soluna doğru hareket ettirin. Karaciğerin üzerine bir gazlı bez yerleştirin ve işaret ve orta parmaklarınızı üzerine koyun. Diğer elinizle iğneyi yerleştirin, böbrek damarlarının birleşim yeri ile iliak bifurkasyon arasında ortada, vena kavaya eğim verin. Karaciğere baskı uygularken kanı yavaşça çekin.

Damarın yırtılmasına neden olabileceğinden el hareketinden kaçının. Ayrıca, çok hızlı kan çekilmesi, damarın eğim üzerine çökmesine neden olarak açıklığı tıkayabilir ve kan alımını önleyebilir. Bu tekniğin temel avantajı, iğne deriden geçmediği için steril bir numune toplama yeteneğidir.

Son olarak, bu kan alma tekniklerinin bazı uygulamalarına bakalım. İmmüno-onkoloji gelişmekte olan bir alandır ve bu alandaki araştırmacılar genellikle kanser gelişiminin farklı aşamalarında bağışıklık hücrelerini incelemek için kan toplama işlemi yaparlar. Örneğin, burada araştırmacılar, tümör aşılanmasını on, yirmi ve otuz gün sonra nötrofilleri izole etmek ve ölçmek için kanser taşıyan farelerden kardiyak kan topladılar.

Öte yandan, kan bileşimi de fizyologlar tarafından sıklıkla incelenir. Bu çalışmada olduğu gibi, araştırmacılar diyabetik hayvanlarda böbrek fonksiyonlarını değerlendirmekle ilgilendiler. Bunu yapmak için, bu bilim adamları önce bir diyabet hayvan modeline bir boya enjekte ettiler. Daha sonra, kandaki boya konsantrasyonunu değerlendirmek için birkaç zaman noktasında kan toplamak için kuyruk kesme yöntemini kullandılar, bu da sonuçta diyabet indüksiyonunu takiben böbrek fonksiyonundaki farkı vurgulayan glomerüler filtrasyon oranını hesaplamak için kullanıldı.

Son olarak, kök hücre araştırmacıları, donör hücrelerin alıcının sistemine dahil edilmesinin başarısını değerlendirmek için kan örneklerini kullanır. Burada, araştırmacılar ilk olarak bir erkek fareden alınan kemik iliği hücrelerini, kuyruk damarı enjeksiyonu yoluyla vahşi bir tür ve genetiği değiştirilmiş dişi hayvana naklettiler. Daha sonra, polimeraz zincir reaksiyonu kullanarak kan hücrelerinin genomik DNA'sını incelemek için alıcı farenin retro orbital sinüsünden kan topladılar. Bu, iki hayvan türünde donör hücrelerin aşılama yüzdesini sağladı.

JoVE'nin kan alma teknikleriyle ilgili ilk bölümünü az önce izlediniz. Laboratuvar hayvanlarında yaygın olarak kullanılan diğer kan alma tekniklerinin nasıl uygulanacağını gözden geçirmek için lütfen serideki bir sonraki videoyu izleyin. Her zaman olduğu gibi, izlediğiniz için teşekkürler!