İyon Değişim Kromatografisi
Kaynak: Dr. B. Jill Venton'un Laboratuvarı - Virginia Üniversitesi
İyon değişim kromatografisi, analitleri yüke göre ayıran bir kromatografi türüdür.…
1. Numunenin ve sütunun hazırlanması
- Bu gösteride, 2 proteinden oluşan bir karışım bir katyon değişim sütunu üzerinde ayrılacaktır: hemoglobin ve sitokrom C. Protein örneğine 0.2 mL dengeleme tamponu (pH 8.1) ekleyin ve iyice karıştırmak için girdap yapın. Köpüğü çıkarmak için 2 dakika santrifüjleyin.
- Reçinenin çökmesine izin vermek için katyon değişim kolonunu 5 dakika boyunca bir test tüpüne yerleştirin. Dik olduğundan emin olmak için test tüpünü kolonla birlikte bir halka standına sıkıştırın.
- Sütunun üst kapağını ve ardından alt kapağını açın. Kolondaki tamponun yerçekimi altında test tüpüne damlamasına izin verin.
- Kolonu iki kez bir kolon hacmi (bu durumda kolon hacmi 0,3 mL'dir) dengeleme tamponu ile yıkayın. İkinci kolon hacmini eklemeden önce ilk kolon hacminin (0.3 mL) dengeleme tamponunun atık şişeye damlamasına izin verin. Bu adım, sütunun dengeleme tamponu ile dengelenmesini sağlar. Reçineyi rahatsız etmemek için bu adımda dengeleme tamponunu yavaşça ekleyin.
2. Bir protein örneğini bir katyon değişim sütunundan geçirme
- Kolonu "Unbound 1" etiketli 2 mL'lik bir santrifüj tüpüne koyun. 0.1 mL protein örneğini dikkatlice kolonun üstüne yükleyin.
- Numune kolonun üstüne yüklendikten sonra, tamponu kolonun üstüne ekleyerek ve tamamen damlamasına izin vererek 0,3 mL dengeleme tamponu ile yıkayın. Bu adımı 4 kez tekrarlayın (toplam 5 yıkama için) ve her yıkamayı ayrı bir 2 mL santrifüj tüpünde toplayın. Tüpleri "Bağlanmamış 1-5" olarak etiketleyin.
- Son 2 yıkama için, tüm bağlanmamış türlerin kolondan çıktığından emin olmak için 1.000 x g'da 10 saniye santrifüjleyin. Kolona bağlanan herhangi bir numune bu yıkamalarda olmamalıdır, ancak bağlanmayan numune tutulmadan yıkanacaktır. Santrifüjleme, bağlanmamış malzemeleri kolondan yıkamak için daha fazla kuvvet sağlar.
- Kolonu "Bound 1" etiketli yeni bir 2 mL'lik santrifüj toplama tüpüne koyun. Kolonun üzerine 0.3 mL elüsyon tamponu (yüksek tuz, pH 5.5) koyun. Elde edilen eluenti 1.000 x g'da 10 saniye boyunca santrifüjleyin.
- Kolonu yeni bir santrifüj tüpüne yerleştirerek, 0,3 mL ekleyerek ve 10 saniye santrifüjleyerek elüsyon adımını 2 kez daha tekrarlayın. Bunları "Bound 2 ve 3" olarak etiketleyin.
- Kesirlerle ilgili herhangi bir renk değişikliğini veya gözlemi kaydedin. Hemoglobin, kırmızımsı kahverengi görünen renkli bir proteindir, sitokrom C ise kırmızımsı renklidir.
3. Sonuçlar: Hemoglobin ve Sitokrom C
katyon değişimi- Sitokrom C'nin pI'si 10.5 ve hemoglobinin pI'si 6.8'dir. Bu nedenle, bir pH 8.1 dengeleme tamponu kullanıldığında, hemoglobin negatif yüklü olduğu için kolona bağlanmaz. Sitokrom C bu pH'ta pozitif yüklüdür ve pH < pI olduğu için kolona bağlanır.
- Hemoglobin, kolona bağlı olmadığı için bağlanmamış fraksiyonlarda görülür.
- Sitokrom C, katyon değişim kolonuna bağlı olduğu için bağlı fraksiyonlarda gözlenir.
Şekil 1. Bağlanmamış fraksiyonun (hemoglobin) ve bağlı fraksiyonun (sitokrom C) resmi.
İyon değişim kromatografisi, yüklü bileşiklerin, özellikle büyük biyomoleküllerin ayrılmasında ve izolasyonunda yaygın olarak kullanılmaktadır.
Bu tip sıvı kromatografisi, reçine adı verilen paketlenmiş sabit fazlı boncuklardan oluşan bir sütun kullanır. Teknik, analitleri yüklü reçine ile olan afinitelerine göre ayırır.
Bu tekniğin iki ana türü vardır. Katyon değişim kromatografisinde, pozitif yüklü analitleri bağlamak için negatif yüklü reçine kullanılır. Benzer şekilde, anyon değişiminde, negatif yüklü analitler pozitif yüklü reçineye bağlanır. Bağlanmamış bileşikler kolon boyunca yıkanır ve analit daha sonra ayrı bir kapta toplanabilir.
Bu video, iyon değişim kromatografisinin temellerini tanıtacak ve laboratuvarda bir protein karışımını ayırarak tekniği gösterecektir.
Sabit faz, başarılı bir separasyon için önemli bir bileşendir. Güçlü katyon değişim reçineleri tipik olarak sülfonik asit gibi güçlü asit fonksiyonel gruplarına sahiptir. Zayıf katyon değişim reçineleri, karboksilik asitler gibi zayıf gruplara sahiptir.
Benzer şekilde, güçlü anyon değiştirici reçineler, kuaterner aminler gibi güçlü bazlar kullanırken, zayıf anyon değiştirici reçineler ikincil veya üçüncül aminler kullanır. Reçine seçimi, numune karışımının özelliklerine ve ilgilenilen analite bağlı olacaktır.
Topluca mobil faz olarak adlandırılan kullanılan tamponlar da özellikle pH açısından ayırma için önemlidir. Proteinler için pH, izoelektrik noktasına veya pI'ye göre seçilir. Proteinin pI'sine eşit bir pH'da, protein nötrdür. PI'nin üzerinde net bir negatif yüke sahip olurken, pI'nin altında net bir pozitif yüke sahip olacaktır. Tampon pH'ı, proteinin uygun şekilde yüklenmesi ve sabit faza bağlanabilmesi için seçilmelidir.
İyon değişim kromatografisi genellikle dört aşamalı bir işlemdir. İlk olarak, anyon veya katyon değiştirici reçine içeren paketlenmiş bir kolon, tampon kullanılarak dengelenir. Anyon değişim kolonları için bu, reçinenin protonlanmasını ve pozitif yüklü olmasını sağlamayı içerir.
Ardından, numune sütuna yüklenir. Yüklü türler reçine ile etkileşimler için numune ile rekabet edebileceğinden, tamponun düşük iletkenliğe sahip olması gerekir. Zıt yüklü bileşikler reçineye bağlanır. Yüklü olmayan veya aynı yükü taşıyan moleküller bağlanmadan kalır.
Üçüncü adımda, bağlanmamış bileşenleri sütundan çıkarmak için sütun ek tamponla yıkanır ve bağlı bileşenleri geride bırakır.
Son olarak, dördüncü adım, bağlı analitin elütüsüdür. Bu, ya tuz konsantrasyonunun kademeli olarak arttırıldığı bir tuz gradyanı kullanılarak ya da yüksek bir tuz elüsyon tamponu kullanılarak gerçekleştirilir.
Düşük tuz, reçineye olan iyonik bağlarını en kolay şekilde bozacağından, zayıf bağlı moleküller önce ayrıştırılacaktır. Daha güçlü bir şekilde bağlanan bileşikler, daha yüksek tuz konsantrasyonları ile elüte olacaktır.
Artık iyon değişim kromatografisinin temelleri ana hatlarıyla belirtildiğine göre, iki proteinin ayrılmasında kullanımına bir göz atalım.
İlk olarak, protein karışımını ayırmaya hazırlamak için 0.2 mL bağlayıcı tampon ekleyin ve iyice karıştırmak için girdap yapın. Ardından, köpüğü çıkarmak için karışımı santrifüjleyin. Katyon değişim kolonunu hazırlamak için, bir halka standına dikey olarak sıkıştırın ve reçinenin oturmasına izin verin.
Sütunun üst kapağını ve ardından alt kapağını açın. Tamponun yerçekimi altında aşağıdaki bir tüpe damlamasına izin verin.
Sütunu hazırlamak için, bu durumda 0.3 mL'lik bir sütun hacmi tamponu yükleyerek dengeleyin. Tamponun kolondan bir atık şişesine damlamasına izin verin. Bir sütun hacminde arabellekten çıktıktan sonra, dengeleme adımını tekrarlayın.
Deneyi çalıştırmak için, sütunun altına "Bağlanmamış 2" etiketli 1 mL'lik bir santrifüj tüpü yerleştirin. 0.1 mL protein örneğini dikkatlice kolonun üstüne yükleyin.
Numune yüklendikten sonra, sütun hacminde bir tamponla yıkayın ve tamamen akmasına izin verin. Toplam 5 yıkama için tekrarlayın. Her yıkamayı "Bağlanmamış 1" ila "5" olarak etiketlenmiş kendi tüpünde toplayın. Son 2 yıkama için, tüm bağlanmamış türlerin sütunu yıkadığından emin olmak için sütunu 10 saniye santrifüjleyin. Kolonu yeni bir 2 mL'lik santrifüj toplama tüpüne koyun ve "Bound 1" olarak etiketleyin. Sütunun üstüne 1 sütun hacminde elüsyon tamponu yükleyin. 1.000 x g'da 10 saniye santrifüjleyin.
Bağlı analitin toplanmasını sağlamak için elüsyon adımını 2 kez daha tekrarlayın. Tüpleri "Bound 2" ve "3" olarak etiketleyin. Kesirlerle ilgili herhangi bir renk değişikliğini veya gözlemi kaydedin.
Bu örnekte hemoglobin ve sitokrom C birbirinden ayrılmıştır. Hemoglobinin pI'si 6.8 iken, sitokrom C'nin pI'si 10.5'tir. PH 8.1 tamponunda, hemoglobin negatif yüklüdür ve kolona bağlanmaz. Tersine, sitokrom C, pH 8.1'de pozitif olarak yüklenir ve kolona bağlanır.
Bağlanmamış fraksiyonlarda kahverengimsi renkli bir protein olan hemoglobin bulunurken, bağlı fraksiyonda kırmızımsı renkli bir protein olan sitokrom C gözlendi.
Her biri bir karışımın bileşenlerini ayırmak için farklı yeteneklere sahip birçok sıvı kromatografisi biçimi vardır.
Bu örnekte, tek ve çift sarmallı DNA karışımını ayırmak için kolon kromatografisi kullanıldı. Hidroksiapatit veya HA, pozitif yüklü kalsiyum iyonları nedeniyle yaygın olarak sabit bir faz olarak kullanılan kristalli bir kalsiyum fosfat formudur. Bu durumda, HA kolonu, DNA'nın negatif yüklü omurgasına bağlanabildiği için DNA'nın ayrılması için idealdi.
Proteinleri ayırmak için sıklıkla kullanılan başka bir kolon kromatografisi biçimi, hareketsizleştirilmiş metal afinite kromatografisi veya IMAC'dir. IMAC'da, durağan faz, ilgilenilen protein üzerindeki bir histidin etiketine bağlanan bir metal iyonu olan bir ligand'a sahiptir.
Karışımın diğer tüm bileşenleri kolondan çıkar. Protein daha sonra histidine benzer bir yapıya sahip olan ve metal iyonu ile daha güçlü bir şekilde bağlanan bir imidazol çözeltisi ile ayrıştırılır.
Kolon kromatografisinin yaygın bir uygulaması, yüksek performanslı sıvı kromatografisi veya HPLC'dir. HPLC, analitik kimyada bir karışımdaki biyolojik ve biyolojik olmayan bileşiklerin hem tanımlanması hem de ayrılması için yaygın olarak kullanılmaktadır.
HPLC, otomatik olması ve çok yüksek basınçlarda çalıştırılması dışında bu videoda gösterilen kolon kromatografisine benzer. Bu, daha yüksek yüzey alanı / hacim oranına sahip daha küçük sabit fazlı boncukların kullanılmasını sağlar. Böylece, sabit faz ile mobil fazdaki bileşenler arasında gelişmiş etkileşimler mümkündür.
JoVE'nin iyon değişim kromatografisine girişini izlediniz. Artık arkasındaki kavramları, ilgili 4 adımı ve bazı ilgili teknikleri anlamalısınız.
İzlediğiniz için teşekkürler!
View the full transcript and gain access to JoVE Science Education videos
Q1: What is the difference between cation-exchange and anion-exchange chromatography?
Cation-exchange chromatography uses negatively-charged resin to bind positively-charged analytes, while anion-exchange chromatography uses positively-charged resin to bind negatively-charged analytes. The choice depends on the charge properties of your sample mixture and the analyte of interest. Selection of the appropriate resin type is critical for successful separation.
Q2: How does pH affect protein binding in ion-exchange chromatography?
Protein charge depends on pH relative to its isoelectric point (pI). At pH equal to the pI, the protein is neutral and won't bind. Above the pI, proteins are negatively charged; below it, they are positively charged. Buffer pH must be selected so the protein has the correct charge to bind to the resin effectively.
Q3: What are the four main steps in an ion-exchange chromatography procedure?
First, equilibrate the column with buffer to charge the resin. Second, load the sample in low-conductivity buffer so analytes bind based on charge. Third, wash with buffer to remove unbound components. Fourth, elute bound analytes using a salt gradient or high-salt buffer to recover the purified sample.
Q4: Why does salt concentration matter during elution in ion-exchange chromatography?
Salt ions compete with analytes for binding sites on the resin. Weakly bound molecules elute first at low salt concentrations, while strongly bound compounds require higher salt concentrations to disrupt ionic interactions and elute from the column. This allows selective recovery of analytes based on binding strength.
Q5: What types of resin are used in strong versus weak ion-exchange chromatography?
Strong cation-exchange resins feature sulfonic acid groups, while weak cation-exchange resins use carboxylic acids. Strong anion-exchange resins utilize quaternary amines, and weak anion-exchange resins use secondary or tertiary amines. Selection depends on sample properties and the desired separation outcome for your analyte.
Q6: How does ion-exchange chromatography compare to other separation techniques?
Ion-exchange chromatography separates based on charge and is more general than affinity chromatography, which requires specific antibodies for each analyte. Unlike high-performance liquid chromatography, which operates at high pressures with automated systems, ion-exchange uses gravity-driven flow and can be adapted for many proteins with different eluting conditions.
Q7: What is the role of buffer conductivity when loading samples onto an ion-exchange column?
Low-conductivity buffer is essential during sample loading because high salt concentrations cause charged species to compete with the sample for interactions with the resin. This competition reduces binding efficiency and separation quality, so the loading buffer must have minimal salt content to maximize analyte capture on the column.