Fare Dalak gentleMACS Dissociator Tek Hücreli Cezalar hazırlanması

Bu video protokolünde, özel tüpler kullanarak dokuları mekanik olarak parçalayan ve canlı hücre süspansiyonları üreten otomatik bir masaüstü cihaz olan Gentle Max ile fare dalaklarının nasıl disosiye edileceğini göreceksiniz. Disosiyasyonun ardından dalaklar Max Pres ayırma filtreleri ile filtrelenir, santrifüj edilir ve ileri uygulamalar için süspanse edilir. Merhaba, ben Melanie mlu.

Almanya'daki BE Lab Park'ta bulunan Milton Biotech'te çalışan bir bilim insanıyım. Bugün size, bu GenX disosiyasyon kitini kullanarak fare dalağından tek hücre süspansiyonu hazırlamayı göstereceğim. GenX disosiyasyon işlemi, tek hücre süspansiyonunun oldukça kolay ve hızlı bir şekilde hazırlanmasını sağlar.

Öyleyse başlayalım. Zahmetli ve genellikle ağrılı olan manuel disosyasyonlardan kaçınmak için, gentle max di associator kontrollü ve tekrarlanabilir koşullar altında dokuların çok verimli bir şekilde disose edilmesini sağlar. Dokular, violet C tüpleri kullanılarak canlı tek hücre süspansiyonlarına nazikçe disose edilir.

C tüpü, kapağın merkezine doğru septumla kapatılmış bir açıklık sağlayarak, steriliteyi sürekli korurken tüpten pipetleme yapılmasına olanak tanır. Disosiye hücreleri süspanse etmek için uygun P-B-S-B-S-A-E-D-T-A tamponu kullanmanız gerekecektir. Tampon, bir birim BSA stok çözeltisinin, EDTA içeren 20 birim AutoMax çitleme çözeltisine eklenmesiyle hazırlanır.

Max Pres ayırma filtreleri kullanılarak, disosiye edilmiş doku örnekleri tüm hücre kümelerinden arındırılır; bu sayede başarılı bir maksimum ayırma ve ardından gelen analizler desteklenir. Prosedüre başlamak için, C tüpüne belirli bir hacimde tampon çözelti yükleriz. Dalak kütlesine göre, altı ila yedi haftalık dişi bir biyopsi faresinin sağlıklı dalağı yaklaşık 80 ila 120 miligram ağırlığındadır.

Bu kütlenin her bir veya iki dalak için üç mililitre tampon çözelti gerekir. Toplam hacmin 10 mililitreyi geçmemesine dikkat edin. Şimdi, disseke edilen dalağımızı üç mililitre tampon çözelti içeren C tüpüne ekleyebiliriz. Yaşlı hayvanlardan veya enfeksiyonu olan hayvanlardan alınan dalaklar genellikle daha büyüktür ve tampon çözelti içinde tartılmalıdır.

Tampon hacimleri buna göre ölçeklendirilmelidir, ancak yine de toplam hacim 10 mililitreyi geçmemelidir. Şimdi, C tüp kapağının sıkı olduğundan emin olun ve C tüpünü disosiyasyon cihazına takın. Kapak aşağıya bakacak şekilde, bir ila iki dalak için disosiyasyonu çalıştırın ve Program M spleen oh one'ı seçin. Programın tamamlanması 56 saniye sürecektir; dalak sayısı daha fazlaysa program M spleen oh four'u kullanın.

Bu program, 720 miligrama kadar dalak dokusu için kullanılabilir. Program tamamlandıktan sonra, doğal dalak dokusu bir PLE hücre süspansiyonuna ayrıştırılır; örneği tüpün dibinde toplamak için bunu kısa süre santrifüjleyin. Bu işlem, rotor ve statorun, C tüpünün dibinde toplanan tüm hücrelerden arındırılmasını sağlayacaktır.

Bin mikrolitrelik bir pipet kullanarak, C tüp kapağındaki septumla kapatılmış açıklıktan numuneyi çıkarıyoruz. Filtrasyon adımına başlamak için, disosiye edilmiş dokuyu pres ayırma filtresine veya 30 mikron gözenek boyutuna sahip bir süzgece uyguluyoruz. Süzgeç, bir ila iki dalak için 15 mililitrelik bir tüpe veya ikiden fazla dalak için 50 mililitrelik bir tüpe uygun olmalıdır.

Hücre süspansiyonunun geçmesine izin verin, ardından filtreyi beş mililitre tampon uygulayarak yıkayın. Şimdi, tüm sitleri bir dalak hücresi peleti şeklinde toplamak için hücre süspansiyonunun bulunduğu tüpü oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 300 Gs ile santrifüj edin. Ayrıştırılmış sitlerden oluşan bir pelet elde ettiğimize göre, süpernatantı aspire etmeli ve hücre peletini uygun miktarda dalak ayrıştırma tamponunda yeniden süspande etmeliyiz.

GentleMax kullanımı, MaxQuant ile yapılan akış sitometrisiyle kanıtlandığı üzere, yüksek oranlarda canlı PLE sitleri elde edilmesini sağlar. Örnekte sunulduğu gibi, ölü hücreler Propidyum iyodür ile boyanmıştır. İleri saçılım noktasal grafiği (forward side scattered dot plot), hazırlanmış SP sitlerini göstermektedir.Tamam.

Sizi, bu nazik X disosiyasyonunu kullanarak dalak dokusunun nasıl ayrıştırılacağı konusunda bilgilendirdim. Bu prosedürü uygularken, tampon miktarı numune boyutuna göre ayarlamanız ve doğru Gentle X programını seçmeniz önemlidir. Tamam, bu kadar.

Deneyinizde başarılar dileriz.