Çift katlı Elastik Özellikleri İzleme Değişiklikler için Tek Molekül Yöntemleri

Merhaba, ben New York City'deki Weill Cornell Medical College Fizyoloji ve Biyofizik Bölümü'nden Dr. Ola Anderson. Benim adım Olson. Olive Anderson'ın laboratuvarında hesaplamalı biyotıp öğrencisiyim.

Ben de Anderson laboratuvarından araştırma teknisyeni Shail Collingwood. Bugün size bir plan, bir biyotabaka oluşturmayı, Biolayer Punch elektrot kullanarak küçük bir membran izole etmeyi, tek kanal aktivitesini kaydetmeyi ve sonuçları nasıl analiz edeceğinizi, böylece Gramin kanallarını lipid B tabakası özelliklerinin probları olarak nasıl kullanacağınızı göstereceğiz. Önceki bir videoda, bu deneylere nasıl hazırlanacağınızı göstermiştik.

Kullandığımız hazneyi nasıl hazırlayacağınızı ve kanal aktivitesini kaydettiğimiz küçük membran tabakasını izole etmek için kullandığımız Bilayer punch elektrodunu nasıl hazırlayacağınızı gösterdik. Öyleyse, bilayer deneyleri için kurulum yapmaya başlamak üzere bazı bilayer'lar hazırlayalım; önceden boyanmış haznenin her bir bölmesine sıcaklığı dengelenmiş elektrolit çözeltisinden 2.5 mils ekleyin. Genellikle kullandığımız çözelti, 1 molar sodyum klorür artı 10 millimolar'dır.

Parçayı pH yediye tamponlayın, mikroskobu ve ışık kaynağını, Teflon'daki delik görüş alanınızın merkezinde olacak ve parlak bir şekilde aydınlatılacak şekilde ayarlayın. Cam mikro pipeti bir mikro elektrot tutucuya yerleştirin. Bir şırıngayı, bir parça tigon tüp ile tutucuya bağlayın.

Elektrot tutucudaki pipeti emerek doldurun. Elektrot tutucudaki gümüş pelet ile pipet ucu arasındaki elektriksel bağlantıyı koparabileceği için hava kabarcığı oluşmamasına dikkat edin. Vidaya az miktarda vazelin uygulayın, ardından vidayı mikro elektrot tutucuya yerleştirin.

Vazelin, hava sızdırmaz bir sızdırmazlık sağlamaya yardımcı olur. Elektrot tutucuyu Faraday kafesi içindeki patch clamp başlık ünitesine takın. Mikropipet ucunu, Teflon bölmedeki deliğin merkezinde ve hemen arkasında olacak şekilde konumlandırın.

Sarmal halindeki gümüş elektrodu ön hazneye yerleştirin. Modelleme kili ile sabitleyin ve voltaj komut devresine bağlayın. Son olarak, elektrotları dengeleyin.

Bu durum kritiktir çünkü öndeki elektrot ile mikro elektrot tutucudaki elektrodun yarı hücre potansiyelleri biraz farklı olabilir. Yarı hücre potansiyeli, gümüş metal ile elektrot ve gümüş klorür kaplamanın bitişiğindeki elektrolit çözelti arasındaki farktır. İki bölme arasında akan akım, patch clamp üzerinde -200 ile +200 picoamp arasında dalgalanacak şekilde manuel ofseti ayarlayarak elektrotları dengeleyin.

Ofset potansiyeli zamanla değişecektir, bu nedenle lipid çift katmanlı membran oluşturmak için deney boyunca düzenli aralıklarla elektrotları dengeleyin. Ateşte uçları düzeltilmiş bir past pipeti, beraberindeki videoda açıklandığı şekilde fch çözeltisi ile temizleyin. Temizlenen pipeti lipid kaplama çözeltisine daldırın ve çözeltinin pipet içinde yaklaşık bir milimetre yükselmesini sağlayın.

Pipet ucunu Teflon bölmedeki deliğin hemen önüne yerleştirin ve lipid çözeltisinden bir damlayı deliğin üzerine nazikçe sürün. İşlem başarılı olduğunda, deliğin üzerinde parlak renkli bir lipid kabarcığı oluşur ve bu kabarcık, Teflon bölmeye tutunan Taurus veya donut şeklinde bir lipid yapısıyla bağlanır. Membranın incelmesini bekleyin; bu işlem, membran boyunca 100 ila 200 milivolt potansiyel uygulanarak kolaylaştırılabilir.

Cam mikro pipet ucunu Taurus'a yerleştirin ve pipet ile çift katman arasında daha iyi bir sızdırmazlık sağlamak için birkaç dakika bekletin. Bu noktada, cam bir mikro pipet kullanarak bir membran yaması izole etmeye hazırsınız. Şimdi membranı gramin ile doplayın.

Bu gramin çözeltisi, 1 nanomolar ile 10 nanomolar arasına seyreltilmiş 1 mikromolar'lık bir stoktan hazırlanmıştır. Dimetil sülfoksitte, genellikle seyreltinin 1 ila 10 mikrolitresi, nihai konsantrasyon pikoMolar aralığında olacak şekilde membranın her iki tarafına eklenir. Çözeltiyi yaklaşık iki dakika boyunca karıştırmak için manyetik karıştırıcı çubukları kullanın ve tek kanal aktivitesini kaydetmek için yeni bir küçük membran oluşturmadan önce 10 dakika daha bekleyin.

Bu bekleme süresi, graminin membrana dahil olmasına olanak tanır. Voltaj uygulayarak kanal aktivitesini kontrol edin. Genel olarak, saniyede yaklaşık bir kanal olayı olması istenir.

Kanallar, membran akımındaki ayrı yukarı ve aşağı yönlü değişimler olarak görülür. Artık asıl deneye başlamaya hazırsınız. İlk olarak, kontrol akım izlerini kaydedin.

Elektrodu daha önce gösterildiği gibi dengeleyin, beraberindeki videoda tarif edildiği şekilde küçük bir membran veya yama oluşturun. Pozitif 200 millivolt uygulayın ve tek kanal aktivitesini kaydedin. 100 ile 200 arasında tek kanal akım geçişi toplamalısınız.

Bu adımı negatif 200 millivolt ile tekrarlayın. Pipet ucu aracılığıyla elektroliti dışarı iterek yamayı (patch) bozun. Naylon vidayı kullanarak elektrotları yeniden dengeleyin, pipeti arka hazneye geri çekin, fazla lipidi dışarı üfleyin ve yeni bir yama oluşturun.

Diğer potansiyellerde kayıt almak için bu adımları tekrarlayabilirsiniz. Artık bilayers modifikasyonundaki deneysel akım izlerini kaydetmeye hazırsınız. Bu durumda, membranın her iki tarafına antidepresan fluoksetin eklenmiştir.

Fluoksetin stok çözeltisi DMSO içinde 25 millimolar olacak şekilde seyreltilmelidir. Kamaradaki konsantrasyonun 50 micromolar olması için bu çözeltiden beş mikrolitre ekleyin; DMSO, çift katman özelliklerini etkileyebilir. Bu nedenle, çözeltideki DMSO miktarını 25 mikrolitre %1 veya 150 millimolar ile sınırlandırmak önemlidir.

Beş dakika boyunca karıştırın ve modifiyenin sulu çözelti ile membran arasında dengeye gelmesi için 10 dakika bekleyin. Şimdi, modifiyen varlığında kanal aktivitesini daha önce açıklandığı şekilde kaydedin. Modifiyenin artan konsantrasyonlarında kanal aktivitesini kaydetmek için bu adımları tekrarlayın.

Kanal ömürlerini ve ortaya çıkış hızlarını nicelleştirerek çift katmanlı yapıdaki değişimler hakkında birçok bilgi ediniriz. Böyle bir analiz gerçekleştirmek için kanal oluşumunu ve yok oluşunu tespit etmemiz gerekir. Burada, bilgisayarın akımdaki hızlı değişimleri belirlemek için birinci türevi hesapladığı ve bunları kanal olayları olarak işaretlediği geçiş tabanlı bir algoritma kullanıyoruz.

Kanal ömürlerini geçiş öncesi ve sonrası belirlememize yardımcı olmak için olaylar bir zaman serisi olarak saklanır. Akım seviyeleri de saklanarak deney devam ederken kanal genliklerini belirlememize yardımcı olur. Bilgisayar, akım geçişlerinin izlenmesini sağlayan bir akım geçiş genliği histogramı oluşturur.

Ayrıca bu işlem, deneyin kalitesini değerlendirmenize olanak tanır. Eğer mevcut geçiş genlikleri geniş bir şekilde dağılıyorsa, sorun var demektir. Histogram dar ise, iyi gidiyorsunuzdur.

200'den fazla geçiş olayı biriktirdiğinizde, ana pikteki geçişler için ortalama akımı ve standart sapmayı hesaplayın. Kanal görünme oranını, mevcut geçiş genliği histogramındaki geçiş sayısını gözlem süresine bölerek kolayca tahmin edebilirsiniz. Bir kanalın histogramda bir kez göründüğünde ve bir kez kaybolduğunda olmak üzere iki kez sayıldığını hatırlayarak sonucu ikiye bölmeyi unutmayın.

Kanal ömür dağılımlarını elde etmek için geçiş olaylarının zaman serisini analiz edin. Herhangi bir zamanda birden fazla iletken kanalın bulunmadığı mevcut izlerde ömürlerin belirlenmesi oldukça kolaydır. Bu durumda bilgisayar, her bir geçişin bir kanal ortaya çıkışı mı yoksa kayboluşu mu olduğunu tespit eder ve bir kayboluş olayı yalnızca kendisinden önceki ortaya çıkış olayına ait olabilir.

İki geçiş arasındaki süre kanal ömrüdür. Kanal geçişlerinin ayırt edilemeyecek kadar yakın olduğu durumlarda, ortaya çıkış ve kayboluşları manuel olarak atamanız gerekir. İki veya daha fazla kanalın eş zamanlı olarak ilettiği durumlarda, hangi kanal kayboluşunun hangi kanal ortaya çıkışına ait olduğunu bilemeyeceğiniz için atama işlemi daha karmaşıktır.

Bu nedenle, kanal aktivitesinin düşük olması tercih edilir. Görünme olaylarını kaybolma olaylarıyla eşleştirmek için bir rastgele sayı üreteci kullanarak atama problemini çözebilirsiniz. Böylece, bir dizi kanal ömrü elde etmiş olursunuz.

Bu veri, önce bir yaşam süresi histogramına, ardından bir sağkalım grafiğine dönüştürülür; doğrusal olmayan en küçük kareler eğri uydurma yöntemini kullanarak sağkalım grafiğine tekil bir eksponansiyel dağılım uydurularak ortalama yaşam süresi belirlenir ve büyük membranın kırılmadığı deneyler gerçekleştirilir. Bilayer modifikasyonu eklendiğinde, kanal belirme hızları üzerindeki etki karşılaştırılabilir. Büyük membran kırılırsa böyle bir karşılaştırma uygun değildir; membran protein fonksiyonu, hücre membranı lipid kompozisyonu tarafından düzenlenir.

Bu düzenleme, spesifik lipid protein etkileşimleri ile lipid çift katmanı ve membran proteinleri arasındaki daha genel etkileşimlerin bir kombinasyonundan kaynaklanmaktadır. Bu etkileşimler, özellikle farmakolojik araştırmalarda büyük önem taşımaktadır. Piyasadaki mevcut birçok ilaç, lipid çift katmanı özelliklerini değiştirebilen amfifilik özelliklere sahiptir ve bu durum sonuç olarak membran protein fonksiyonunun değişmesine yol açabilmektedir.

Gramin kanalları, amfifillerin lipid çift katman özelliklerini değiştirip değiştiremediğini raporlamak için moleküler kuvvet transduserleri olarak kullanılabilir. Ömür süresindeki ve görünme hızındaki değişimlerin modifikasyon konsantrasyonuna bağlı olarak grafiğe dökülmesi, çift katman özelliklerindeki değişiklikler hakkında bilgi sağlar.

Artan frekans, çift katmanın Gram alanı ve dimerizasyona uyum sağlamak için daha kolay deforme olduğu anlamına gelir. Artan ömür ise, kanal oluşumuyla ilişkili çift katman deformasyonunun enerji açısından o kadar maliyetli olmadığını gösterir. Bir modifikatör, membran elastisitesini artırarak veya eğriliği etkileyerek frekansı ve ömrü artırabilir.

Küçük moleküllerin elastik çift katman özelliklerini değiştirip değiştirmediğini kontrol etmek için kromo kanalların nasıl kullanılacağını göstermiş olduk. Şimdilik bu kadar. İzlediğiniz için teşekkürler.

Deneylerinizde başarılar dileriz.