Name: Elektrofizyoloji Deneyler Yapay Bilayers hazırlanması (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-10-31T00:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 38 s
Description: Öğrenin düz lipid çift katmanları hazırlama yöntemini iyon kanallarının elektrofizyolojik ölçümleri için. Bu protokol tek kanallı kayıtlar için güvenilir deneysel kurulum sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ziyaret ediniz <a href="http://springerprotocols.com/index.vm">Springer Protokolleri</a> yapay bilayers hazırlanması ve membran elastikiyet problama için gramicidin kanallarını kullanarak hakkında daha fazla bilgi için.

Yazarların beyan edecek herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

elektrofizyoloji deneyler yapay bilayers hazırlanması

Preparation of Artificial Bilayers for Electrophysiology Experiments

Düzlemsel çift katlı lipit katmanını da adlandırılan yapay çift katlı lipit katmanını, çalışma izin iyon iletken, iyi tanımlanmış bir ortamda kanal. Bu bilayers gibi membran-aktif peptidler, çift katlı lipid özelliklerinde değişiklik bilayeri kapsayan kanallarının işlevini nasıl değiştirdiğini iyon kanalları ya da soruşturma sulandırıldıktan karakterizasyonu gibi birçok farklı çalışmalar için de kullanılabilir. Burada, düzlemsel bilayeri oluşturmak için nasıl ve bilayeri küçük lekeler nasıl izole etmek ve aynı zamanda ikinci bir video gramicidin kanallarını kullanarak çift katlı lipid elastik özellikleri değişiklikleri belirlemek için bir prosedür ortaya koyacak göstermektedir. Ayrıca bilayeri odası hazırlamak için gerekli bireysel adımlar, elektrotlar ve nasıl bilayeri tek kanal ölçümleri için uygun olup olmadığını test etmek için ortaya koymaktadır.

Düzlemsel çift katlı lipit katmanını da adlandırılan yapay çift katlı lipit katmanını, çalışma izin iyon iletken, iyi tanımlanmış bir ortamda kanal. Burada, bilayeri odası hazırlamak için gerekli bireysel adımlar, elektrotlar ve nasıl bilayeri tek kanal ölçümleri için uygun olup olmadığını test etmek için ortaya koymaktadır.

Elektrofizyoloji Deneyler Yapay Bilayers hazırlanması

Yapay lipid çift tabakaları olarak da adlandırılan düzlemsel lipid çift tabakaları, iyon ileten kanalları iyi tanımlanmış bir ortamda incelemenize olanak tanır. Bu çift tabakalar...

Merhaba, ben New York City'deki Weill Cornell Tıp Fakültesi Fizyoloji ve Biyofizik Bölümü'nden Dr. Olaf Anderson. Merhaba, ben Dr. Olaf Anderson'ın laboratuvarında MD PhD öğrencisi olan Ruchi Kaur. Merhaba, benim adım John Kim.Ben bir araştırma teknisyeniyim. Bugün size düz lipid çift tabakalarda tek kanal deneyleri için nasıl hazırlık yapılacağını göstereceğiz. Size hazne hazırlığını ve Bilayer Punch elektrotlarının nasıl hazırlanacağını göstereceğiz.Ölçümleri gerçekleştirdiğimiz küçük membran alanlarını izole etmek için bir yöntem kullandık. Öyleyse başlayalım. Elektrofizyolojik düzeneğimiz şunlardan oluşmaktadır: mekanik titreşimleri en aza indirmek için hava süspansiyonlu bir titreşim önleyici masa, elektriksel gürültü, ses ve titreşime karşı koruma sağlayan bir Faraday kafesi ve bir stand.Çift tabakalı oda için, çift tabakalı odanın içine yerleştirildiği ve sıcaklık kontrolü sağlayan sirkülasyonlu bir su ceketi ile patch clamp amplifikatörünün kafa kısmını monte etmek için bir mikro manipülatör kullanıyoruz. Patch clamp amplifikatöründen gelen çıktıyı 500 hertz değerinde daha fazla filtrelemek için bir elektronik filtre ünitesi kullanılır. Akım geçişlerini görselleştirmek amacıyla, hem patch clamp amplifikatöründen hem de elektronik filtreden gelen akım sinyalini görüntülemek için bir osiloskop kullanılır.Son olarak, patch clamp sinyalini dijitalleştiren bir veri toplama sistemine sahip bir bilgisayara ihtiyacınız olacaktır. 20 kilohertz hızında, veri kaydı ve analizi için kurum içi geliştirilmiş bir yazılım kullanıyoruz. Tüm ekipmanlar işleme başlamadan 20 dakika önce açılır.Ardından, deneylerin gerçekleştirildiği hazne hazırlanacaktır. Hazne, yaklaşık 100 mikron kalınlığında ince bir Teflon tabakadan yapılmış ve elektrolit çözeltisi ile doldurulmuş bir septum aracılığıyla iki yarıya bölünmüştür. Bilayer, elektrolit çözeltileri arasında bağlantı sağlayan septumdaki deliğin üzerine oluşturulur.Delik çapı 1 ila 1,5 milimetre olmalıdır; sızdırmazlık malzemesi olarak vazelin kullanarak Teflon odacığın ön yarısına bir cam pencere yerleştirin, paslanmaz çelik vidaları bir metal destekten ve arka odacık yarısındaki dört delikten geçirin. Sızdırmazlık malzemesi olarak vazelin kullanarak, dairesel bir Teflon bölmeyi, monte edilen odacığın iki yarısı arasında kalacak şekilde yerleştirin.Bölmedeki deliğin merkezde olduğundan emin olun. Elektrolit bölmelerinin su sızdırmaz ve elektriksel olarak izole olmasını sağlamak için bölmenin her iki tarafına vazelin uygulayın. Vidaları haznenin ön yarısından ve ön metal destekten geçirmeye devam edin.Tüm bileşenlerin yerinde sıkıca durmasını sağlamak için düzeneği sıkın, ancak hazneyi temizlemek ve vazelini çıkarmak için çok fazla sıkmayın. Bir pastör pipeti yakılır, cilalanır ve dik açıyla bükülür. Pipetin ucunun pürüzsüz olacak şekilde cilalanması, camın veya Teflonun çizilmesini önlemeye yardımcı olur.Ardından, hazneyi kloroform ve metanolün ikiye bir karışımı veya fch çözeltisi ile temizleyin. Pipet kullanarak, fazla vazelini Teflon ve cama yaymadan fch çözeltisi ile uzaklaştırın. En az 10 hacim fch kullanın.Bu işlem tamamlandıktan sonra, bölmelere manyetik karıştırıcılar eklenir. Ardından bölme %95 ethanol ile temizlenir. Son olarak ise yüksek saflıkta su ile (distile su, UE su veya eşdeğeri) temizlik yapılır.Daha önce olduğu gibi, sıvıyı aspire etmek için alevle cilalanmış bir pipet kullanın. Son olarak, temizleme işlemini etanol ve su ile tekrarlayın. Ardından su, etanol ve fol ile işlemi tamamlayın.Şimdi, oda bölmesinin arka kısmına elektriksel bağlantı sağlayacak olan cam elektrot mikro pipeti hazırlayacağız; bunun için Sutter Instruments marka P 97 flaming brown mikro pipet çekicisini (puller) kullanarak, her biri keskin ve kısa bir konikliğe sahip iki mikro pipet oluşturacak şekilde cam kılcal boruyu çektik. Dış çapı 0.8 mm ve iç çapı 0.5 mm olan borosilikat camdan yapılmış kılcal borular kullanıyoruz. Cam kılcal boru, çekim işlemine hazırlık amacıyla çekiciye yerleştirilir ve sabitlenir.Tungsten filamentli elektrot polarlarında pipet çekme işlemiyle başarı sağlayamadığımız için polarlar platinle yapılmalıdır; sonraki birkaç adım platin filamentli bir mikro dövücü ile gerçekleştirilecektir. Mikro dövücüyü kullanmadan önce, filamentin camla iyi kaplandığından emin olmalısınız.Yumuşak soda-kireç camı veya sert borosilikat camı kullanabilirsiniz. Camın pürüzsüzce akması ve filamenti ince bir tabakayla homojen bir şekilde kaplaması için mikro fırındaki ısıyı ayarlamanız gerekecektir. Şimdi mikropipeti mikro fırına yerleştirin ve ucunu kırın.Bunu, filament üzerindeki cam kaplamayı nispeten düşük bir ısıda nazikçe yumuşatarak gerçekleştiriyoruz. Ardından, mikropipet ucunu filament üzerindeki cam kaplamaya doğru yavaşça hareket ettiriyoruz; böylece ikisi birlikte erir, filamentteki ısı kapatılır, filament geri çekilir ve pipet kırılır. Sonuçta, yaklaşık 30 mikron çapında, keskin ve düzgün bir açıklık elde etmiş oluruz.Tekrar mikro dövme cihazını kullanarak, mikro pipetin ucundan üç ila dört milimetre uzağa dik açılı bir büküm yapın, pipeti filamentin birkaç yüz mikron üzerine yerleştirin ve ardından filament kırmızıya dönene kadar ısıyı açın. Termal genleşme nedeniyle filament hareket edecektir. Daha sonra pipeti nazikçe filamentin üzerine indirin; böylece filament bükülecektir.Bükülme miktarını filamentin ısısıyla kontrol edersiniz. Bükülme yaklaşık 80 dereceye ulaştığında, pipeti hızla yukarı ve ileri doğru hareket ettirin. Bu işlem belirli bir koordinasyon gerektirir.Aynı ayarları kullanarak 90 derecelik bir büküm elde etmek istiyorsunuz. Mikro pipet ucunu alevle cilalayın, filamentin camla kaplı olduğundan emin olun. Şimdi pipet ucunu benzen içinde %10'luk tri oktil silan çözeltisi ile silanize ettik.Bu işlem, pipet yüzeyini hidrofobik hale getirerek membranla iyi etkileşime girmesini sağlar. Çözeltinin kılcal hareketle pipet içinde birkaç milimetre yukarı çekilmesine izin verin. Çözeltiyi mikro ocakta düşük ısıda buharlaştırın ve işlem tamamlanmış olacaktır.Şimdi size gümüş elektrodun nasıl hazırlanacağını göstereceğiz. Yaklaşık bir milimetre çapında, beş santimetre uzunluğunda bir gümüş tel parçası alın. Teli, iç çapı iki ila üç milimetre olacak şekilde üç ila dört kez sararak bir bobin haline getirin.Kalan kısmı, helise dik açı yapacak şekilde bükülen bir kuyruk olarak bırakın. Kuyruğu ve gümüş telin bitişiğindeki 5 ila 10 milimetrelik kısmı erimiş gümüş klorür ile kaplayın. Şimdi çift katman oluşturma çözeltisini hazırlayın.Bizim durumumuzda lipid, dekanda çözünmüş fosfatidilkolindir. Lipid, 150 µL'lik lipid ve kloroform karışımları halinde cam tüplerde -40 °C'de saklanır. Dondurucudan bir cam tüp alın, oda sıcaklığına gelmesini bekleyin ve kloroformu kuru bir nitrojen akımı altında evaporate edin.Bir kimyasal çeker ocakta, 50 µL end decane ekleyin ve vorteksleyin. Bilayer oluşturan çözelti ile bilayer'ı oluşturduğumuz deliği çevreleyen Teflon arasında iyi bir temas sağlamak için, deliğin etrafındaki Teflon bölmeyi yeniden boyuyoruz. İlk olarak, ateşle cilalanmış bir pastör pipetini fch ile temizleyin.Ardından temizlenen pipeti, lipidin pipet içinde yaklaşık bir milimetre yükselmesini sağlayarak endodekan içindeki %2,5 fosfolipide daldırın. Teflon bölmedeki deliğin üzerine film şeklinde bir damla lipid bırakın. Lipidin yaklaşık 10 ila 15 dakika boyunca kurumasına izin verin ve işlemi tekrarlayın.Merhaba.Böylece bugün size tek kanal deneyleri için lipid çift katmanlarının nasıl hazırlanacağını gösterdik. Eşlik eden videoda, küçük membran yamalarının nasıl izole edileceğini, tek kanal aktivitesinin nasıl kaydedileceğini, aktivitenin küçük moleküllerle nasıl modifiye edileceğini ve sonuçların nasıl analiz edileceğini göstereceğiz. Tamam, işte bu kadar.İzlediğiniz için teşekkürler. Deneyinizde başarılar dileriz.

preparation-of-artificial-bilayers-for-electrophysiology-experiments

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Desteklenen düzlemsel bilayers immünolojik sinaps moleküler etkileşimleri modellemek için kullanılabilir güçlü araçlardır. Burada, lipid bilyer üst broşür sinaps oluşumunu modüle ve sinaps oluşumu TIRF mikroskobu kullanarak görselleştirmek için bilinen hücre adezyon proteinleri demirleme için yöntemler göstermektedir.

İmmünolojik Sinapslar ve Kinapse Eğitim Oluşumu için desteklenen Düzlemsel Bilayers

Membran protein fonksiyonu, hücre zarı lipid bileşimi tarafından düzenlenir. Bu video-makale nasıl değişmiş membran özellikleri gazetecilere olarak çift katlı yama elektrotlar, hem de nasıl kullanılacağı gibi gramicidin kanallarını kullanarak bir yama oluşturmak için ayrıntıları.

Çift katlı Elastik Özellikleri İzleme Değişiklikler için Tek Molekül Yöntemleri

Lipid membranlar bir prototip voltaj kapılı potasyum kanalı tam sulandırılması için prosedürler açıklanmıştır. Sulandırılmış kanallar biyokimyasal testler, elektrik kayıtları, ligand ve tarama elektron kristalografik çalışmalar için uygundur. Bu yöntemler, başka zar proteinlerinin yapısal ve fonksiyonel çalışmalar için genel uygulamalar olabilir.

Yapısal ve İşlevsel Araştırmalar için Lipid Membranlar bir Kv Kanal Sulandırma

Bakteriyel mechanosensitive kanallar biyomoleküler cihazlarda mekanoelektriksel dönüştürücüler olarak kullanılabilir. Damlacık arayüz bilayers (Dıb'leri), bu tür cihazlara hücre ilham yapı blokları, birleştirmek ve mechanosensitive kanallar teşvik etmek, yeni platformlar temsil etmektedir. Burada, biz, Dıb'leri oluşturan mekanik stimülasyonu altında mechanosensitive kanalların çalışma izin yeni bir mikropipet tabanlı bir yöntem göstermektedir.

Çok fonksiyonlu, Damlacık Arayüz Bilayers Bakteriyel Mechanosensitive İyon Kanallarının Kuruluş Ve Uyarım için Yöntemi Mikropipet tabanlı

Bir depolanabilir, taşınabilir lipit iki katmanlı oluşum sistemi göstermektedir. Dondurulmuş bir membran ön-madde çevre sıcaklığına getirildiğinde bir lipid iki-tabakalı zar üzerinden% 80 başarı oranı ile 1 saat içinde oluşturulabilmektedir. Bu sistem iyon kanalları ile ilişkili zahmetli süreçler ve uzmanlık azaltacaktır.

Bir polidimetilsiloksan İnce Film Kullanarak Otomatik çift katlı lipid Membran Oluşumu

Burada, bir kişi kabarcık bilayer yöntemiyle lipid bilayers oluşumu için bir iletişim kuralı mevcut. Mademki bir monolayer su-yağ arayüzü oluşan organik bir çözücü içine su balonu patladı. İki pipetler bir bilayer oluşturmak için ve baloncuklar sabitlemek için manipüle edilir.

Lipid Bilayer deneyler ile iletişim balonu Bilayers yama-Clampers için

Yumuşak, düşük güçte, benzer kompozisyon, yapısı ve biyo-sinapslarda mekanizmaları geçiş biyomoleküler memristors kaldıraç. Burada sunulan bir araya getiren ve biyomoleküler memristors karakterize için bir protokol lipid bilayers Su damlacıkları yağı arasında oluşan yalıtım elde edilir. Gerilim-harekete geçirmek alamethicin peptidler sonuçlarında memristive iyonik gürültülerinden membran arasında birleşme.

Derleme ve biyomoleküler iyon kanal katkılı Lipid membranlar oluşan Memristors karakterizasyonu

Bu protokol, yüksek erime sıcaklıklarına sahip lipitler için lipid monolayer montajını ve damlacık arayüzü bilayer oluşumunu teşvik etmek için geri bildirim sıcaklığı kontrollü bir ısıtma sisteminin kullanımını ve membrandaki sıcaklık odaklı değişiklikleri karakterize etmek için kapasitans ölçümlerini detaylandırıyor.

Damlacık Arayüzü Bilayer'in Sıcaklık Kontrollü Montajı ve Karakterizasyonu

Bu protokolde tek lipid ve multi-lipid vesicles, desteklenen lipid bilayerler ve askıda lipid bilayerleri taklit eden hücre oluşumu açıklanmaktadır. Bu in vitro modeller çeşitli lipit tiplerini içerecek şekilde uyarlanabilir ve çeşitli molekül ve makromolekül etkileşimlerini araştırmak için kullanılabilir.

Moleküler Etkileşimlerin Çalışması için Desteklenen ve Askıya Alınan Lipid Bilayer Modellerinin Hücre Taklit Montajı

Burada, tek moleküllü toplam iç yansıma floresan (smTIRF) mikroskobu kullanılarak yapay kalabalık lipit membranları üzerindeki tek moleküllerin bağlanma, hareketlilik ve montajını gerçekleştirmek ve analiz etmek için bir protokol sunulmaktadır.

Tek Moleküllü Difüzyon ve Polimer Kalabalık Lipid Membranlara Montaj

Gramicidin A-doped damlacık arayüz çift katmanlarını bir yere toplamak, elektriksel olarak uyarmak ve analiz etmek için deneysel bir protokol sunulur. Lipid-protein yapı-fonksiyon ilişkileri, membran alanı, iyonik akı ve tek kanal iletkenliğindeki değişiklikler ölçülerek ve bu yanıtların, elektriksel sinapslardan ilham alan bir membran modelinde iyonik iletkenlikteki plastisite benzeri değişikliklerle ilişkilendirilmesiyle nicelendirilir.

Damlacık Arayüz Bilayerları Kullanarak Lipid-Protein Zar Yapı-Fonksiyon Karakterizasyonu

Öğrenin düz lipid çift katmanları hazırlama yöntemini iyon kanallarının elektrofizyolojik ölçümleri için. Bu protokol tek kanallı kayıtlar için güvenilir deneysel kurulum sağlar.

Elektrofizyoloji Deneyler Yapay Bilayers hazırlanması

Daha fazla video keşfet