Flow Sitometri ve Floresanla Aktive Edilen Hücre Sınıflandırması (FACS): Splenik B Lenfositlerinin İzolasyonu

1. Hazırlık

1. Başlamadan önce laboratuvar eldivenleri ve uygun koruyucu giysiler giyin.
2. Tüm diseksiyon aletlerini önce bir deterjanla ve ardından p etanol ile sterilize edin ve ardından iyice kurulayın.
3. % 2 fetal buzağı serumu (FCS) içeren 50 mL Hank'in dengeli tuz çözeltisini (HBSS) hazırlayın.

2. Diseksiyon

1. Bir karbondioksit dağıtım sistemi kullanarak, fareyi hipoksi ile ötenazi yapın. Ötenazi fareyi sırtüstü pozisyonda bir diseksiyon plakasına sabitleyin ve makas ve forseps kullanarak uzunlamasına laparotomi yapın.
2. Forseps kullanarak, mide ve dalağı ortaya çıkarmak için bağırsakları ve mideyi karnın sağ tarafında hareket ettirin. Dalak mideye yapışıktır.
3. Forseps kullanarak, dalağı mideden dikkatlice ayırın ve 5 mL HBSS% 2 FCS içeren Petri kabına yerleştirin.

3. Bağışıklık Hücresi İzolasyonu

1. Dalağı aynı Petri kabının üzerine 40μm'lik bir hücre süzgecine yerleştirin. Dalağı aynı tabakta ayırmak için bir pistonla ezin.
2. Ayrışmış dalağı ve sıvıyı 15 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın.
3. Tüpü 370 x g'de 10°C'de 7 dakika santrifüjleyin ve peletten kaçınarak süpernatanı atın.
4. Eritrositleri parçalamak için peleti 2 mL potasyum asetat içinde yeniden süspanse edin. 2 dakika bekleyin ve ardından HBSS FCS kullanarak sesi 2 mL'ye kadar tamamlayın.
5. Tüpü 370 x g'de 10 ° C'de 7 dakika boyunca tekrar santrifüjleyin. Süpernatanı atın ve peleti 5 mL HBSS% 2 FCS içinde yeniden süspanse edin.
6. Bir tripan mavisi boyama testi kullanarak hücreleri sayın ve uygun hacimde HBSS% 2 FCS kullanarak nihai hücre konsantrasyonunu 10⁷ hücre / mL'ye ayarlayın.

4. Hücre Boyama

1. Hücre süspansiyonunun 200μL'sini 1 ila 6 arasında etiketlenmiş altı FACS tüpüne aktarın.
2. Tüpleri 370 x g sıcaklıkta 10°C'de 7 dakika santrifüjleyin ve peletten kaçınarak süpernatanı atın.
3. Daha sonra, Tablo 1'e göre 200μL HBSS% 2 FCS'ye uygun miktarda antikor ekleyerek altı yeni antikor karışımı hazırlayın.
4. Daha sonra, bu antikor karışımlarını karşılık gelen numaralı FACS tüplerine aktarın.
5. Antikorlarla karıştırılmış hücre süspansiyonlarını karanlıkta buz üzerinde 20 dakika inkübe edin.
6. Her tüpe 1 mL HBSS %2 FCS ekleyin ve ardından 370 x g'de 10°C'de 3 dakika boyunca tekrar santrifüjleyin.
7. Süpernatanı atın ve peleti 200μL HBSS %2 FCS'de yeniden süspanse edin.
8. Yeniden askıya alınan peletleri yeni FACS tüplerine aktarın.

Tablo 1: Antikorlar karışım bileşimi. Deney için altı adet 200μL HBSS + antikor karışımı hazırlandı. Karışım 1 PMT ayarı içindir, 2'den 5'e kadar olan karışımlar telafi ayarları içindir ve karışım 6 hücre sıralaması içindir.

5. FACS Kalibrasyonu

1. İlk olarak, sıralayıcıyı açın ve "Fluidics Startup."
işlemini gerçekleştirin
2. Akışı açın ve ardından akışın stabilize olması için 15 dakika bekleyin.
3. Müstakil damla oluşumu elde etmek için akışın genliğini ayarlayın. Ardından genlik ayarını tamamlamak için "Sweet Spot" öğesine tıklayın.
4. Nötr yoğunluk (N.D.) filtresini - 1.0 koyun ve sitometre kurulumu ve takibi anlamına gelen "CST" arayüzünü açın.
5. Günlük kalite kontrolünü gerçekleştirmek için önce CST boncuklarını üreticinin talimatlarına göre FACS ortamı ile seyreltin ve ardından CST kontrolünü gerçekleştirin.
6. CST kontrolü tamamlandıktan sonra, ND 1.0 filtresini sitometre üzerindeki ND 2.0 filtresiyle değiştirin.
7. Ardından, üreticinin talimatlarını izleyerek düşme gecikmeli boncukları FACS ortamında seyreltin ve ardından FACS'a yükleyin.
8. Doğru sıralamayı sağlamak için Drop Delay-
   1. Önce "Voltage" ve ardından "Optik Filtre" seçeneğine tıklayın. Sağ kadran 0'e eşit olmalıdır. Gerekirse, sağ kadranda 0 elde etmek için sitometre üzerindeki kırmızı lazer vidasını sola veya sağa ayarlayın.
   2. Ardından, akışın toplama tüpüne düştüğünden emin olmak için bir test sıralaması yapın. Bunu yapmak için "Atık Çekmecesi" üzerine tıklayın ve "Test Sıralaması" başlatın. Yan akışların toplama tüplerine düştüğünü kontrol edin. Yapmazlarsa, yapana kadar voltajı ayarlayın.
   3. Deneysel şablona gidin. Ardından, "Accudrop Drop Delay" deneyini açın ve "Sıralama Düzeni" seçeneğine tıklayın.
   4. Saniyede 1000 ila 3000 olay elde etmek için akış hızını değiştirin.
   5. "Voltage" ve ardından "Optical Filter" öğesine tıklayın. Sol kadran 0'a ve sağ kadran 100'e eşit olmalıdır.
   6. "Sort Layout" penceresinde "Sort" üzerine tıklayın ve ardından "Cancel" seçeneğine tıklayın. Sol kadran 100'e ve sağ kadran 0'a eşit olmalıdır. Sol kadran 95'ten küçükse, otomatik olarak ayarlamak için "Otomatik Gecikme" seçeneğine tıklayın.

6. Akış Sitometrisi ve Saflık Kontrolü

1. Hücre morfolojisini ve florokromların negatif tepe noktalarını tanımlamak için tüp 1 (boyanmamış hücreler) ile başlayarak akış sitometrisine başlayın. İleri ve yan saçılımı ayarlayın ve her bir floresan parametresinin voltajlarını tanımlayın. Her nokta grafiğindeki ızgaraları kullanarak negatif popülasyonu ilk on yıla yerleştirin.
2. Ardından, sitometreye tüp 2'yi (tek renk kontrolü) yükleyin. Negatif ve pozitif popülasyon medyanları hizalanana kadar spektral örtüşmeyi ayarlayın veya otomatik hesaplama yazılımını kullanın. Sinyali ölçekte tutmak önemlidir. Kompanzasyon kontrolleri, deneysel florokromlar ve dedektör ayarlarıyla eşleşmelidir. 10.000 olay kaydedin.
3. Bu adımları tüp 3, 4 ve 5 (diğer tek renk kontrolleri) ile tekrarlayın.
4. Ardından, tüp 6'yı (çok lekeli hücreler) yükleyin ve belirli bir geçit stratejisi kullanarak ilgilenilen hücre popülasyonlarını tanımlayın.
5. Sıralama Düzeni penceresinde, ilgilendiğiniz hücre popülasyonunu seçin. "Target Events" içinde hücre eşiğini ve "Precision" içinde duyarlık düzeyini seçin. Burada sadece bir popülasyon sıralanmaktadır, ancak aynı anda dört farklı popülasyon sıralanabilir.
6. Hazır olduktan sonra "Sort" ve "OK" tıklayın, ardından hücre sıralamasını bekleyin.
7. Hücre tasnifi tamamlandıktan sonra, önce 10μL sıralanmış hücreleri 90 mikrolitre HBSS %2 FCS içeren yeni bir FACS tüpüne pipetleyerek saflık kontrolü gerçekleştirin.
8. Ardından, tüpü sitometreye yükleyin. Geçit stratejisinin amaçlandığı gibi çalıştığını doğrulamak için hücrelerin fenotiplerini kaydedin ve analiz edin.

7. Veri Analizi

1. 'FlowJo' yazılımını açın ve her tüp için dosyaları "All sample" penceresine sürükleyin.
2. Yeni bir pencerede açmak için bir dosyaya çift tıklayın.
3. "Polygon" üzerine tıklayın ve daha önce kullanılan geçit stratejisini yeniden oluşturun.
4. Adımları diğer tüm dosyalarla tekrarlayın.
5. Nokta grafiklerini görselleştirmek için "Layout editor" üzerine tıklayın ve mizanpaj editörü sekmesindeki tüp 6 ve saflık kontrolünden ilgilenilen popülasyonları sürükleyin. Hücreler yalnızca saflık kontrolüyle ilgilenen popülasyonda görünmelidir (bkz. Şekil 2).
6. Sıralanan hücrelerdeki B lenfositlerinin saflığını kontrol etmek için "Table editor" üzerine tıklayın. Tüp 6'dan B lenfosit popülasyonunu sürükleyin ve tabloda saflık kontrolünü yapın.
7. "Statistic" menüsünde, bu hücre popülasyonunun saflığını test etmek için CD45⁺ hücrelerinin frekansını seçin, ardından "Tablo oluştur" seçeneğine tıklayın.
8. Parametre değerleri yeni bir tabloda görünür. Saflık kontrol penceresinde, CD45⁺