1. Hazırlık
2. Diseksiyon
3. Bağışıklık hücresi izolasyonu
4. Bağışıklık hücrelerinin manyetik etiketlemesi
| Karışım | Etiketleme reaktifleri | Seyreltme |
| 1 | Anti-CD3 biyotinile antikor | 1/400 (HBSS %2 FCS'de) |
| 2 | Streptavidin birleştirilmiş boncuklar | 1/5 (HBSS %2 FCS'de) |
| 3 | Anti-CD3 BV421 | 1/200 (HBSS %2 FCS'de) |
Tablo 1: Antikorlar karışım bileşimi. Manyetik ayırma için karışım 1 ve 2 kullanılır. Karışım 3, manyetik ayırmadan sonra hücre zenginleşmesini değerlendirmek için kullanılır.
5. CD3 Pozitif Hücrelerin Manyetik Ayrılması
6. Akış Sitometrisi ile Hedef Hücre Zenginleştirmesinin Değerlendirilmesi
7. Veri Analizi
Kaynak: Meunier Sylvain1,2,3, Perchet Thibaut1,2,3, Sophie Novault4, Rachel Golub1,2,3
1 Lenfopoez Ünitesi, İmmünoloji Anabilim Dalı, Pasteur Enstitüs…
1. Hazırlık
2. Diseksiyon
3. Bağışıklık hücresi izolasyonu
4. Bağışıklık hücrelerinin manyetik etiketlemesi
| Karışım | Etiketleme reaktifleri | Seyreltme |
| 1 | Anti-CD3 biyotinile antikor | 1/400 (HBSS %2 FCS'de) |
| 2 | Streptavidin birleştirilmiş boncuklar | 1/5 (HBSS %2 FCS'de) |
| 3 | Anti-CD3 BV421 | 1/200 (HBSS %2 FCS'de) |
Tablo 1: Antikorlar karışım bileşimi. Manyetik ayırma için karışım 1 ve 2 kullanılır. Karışım 3, manyetik ayırmadan sonra hücre zenginleşmesini değerlendirmek için kullanılır.
5. CD3 Pozitif Hücrelerin Manyetik Ayrılması
6. Akış Sitometrisi ile Hedef Hücre Zenginleştirmesinin Değerlendirilmesi
7. Veri Analizi
Manyetik olarak aktive edilmiş hücre sıralama veya MACS, araştırmacıların hücreleri yüzeylerinde ifade edilen belirli epitoplara göre ayırmalarına olanak tanıyan bir tekniktir.
İşlem tipik olarak timus gibi bir organ veya dokunun çıkarılmasıyla başlar. Daha sonra hücreler, doku tek hücrelere ayrılana kadar, genellikle ezme yoluyla mekanik olarak ayrılır. İstenmeyen hücreler bu aşamada kimyasalların eklenmesiyle uzaklaştırılabilir. Örneğin, istenmeyen eritrositleri parçalamak için amonyum-klorür-potasyum veya ACK tamponu kullanılabilir.
Daha sonra, süspansiyona biyotin adı verilen bir moleküle konjuge edilmiş bir antikor eklenir ve bu kompleksler hedef hücrelerin yüzeyinin epitoplarına bağlanır. Biyotin, streptavidin adı verilen başka bir molekül için yüksek bir afiniteye sahiptir. Bir sonraki adımda, manyetik boncuklara kaynaşmış streptavidin molekülleri, antikor işaretli hücrelere eklenir. Biyotin ve streptavidin temas ettiğinde sıkıca bağlanırlar. Sonuç, ilgilenilen hücrelerin manyetik boncuklarla kaplanmasıdır. Bu kompleks bazen sandviç olarak adlandırılır. Bu durumda, alttaki hücre zarı üzerindeki CD3, daha sonra anti-CD3 biotine konjuge hale getirilmiş ve son olarak streptavidin manyetik boncuklara konjuge edilmiştir.
Bu etiketli hücreler şimdi, yerçekimi tarafından desteklenen, hücrelerin bir mıknatıs tarafından yavaşça geçmesine izin veren bir matris içeren bir sütuna yerleştirilebilir. Bunu yaparken, manyetik boncuk etiketli hücreler mıknatısa en yakın tüpün kenarına yapışacak, etiketlenmemiş hücreler ise aşağıdaki bir toplama tüpüne devam edecektir. Daha sonra, etiketli hücreler, mıknatısı çıkararak, bir eluent çözeltisi ekleyerek ve bunları kolondan dışarı atmak ve yeni bir toplama tüpüne atmak için bir piston ile hafif bir basınç uygulayarak kolondan çıkarılabilir. Sonuç olarak, bu işlem ilgilenilen hücrelerin %60 ila 98 oranında geri alınmasına izin verir.
Bu prosedürde, timik lökositleri bir fareden izole edeceğiz ve FACS kullanarak sıralamanın verimliliğini doğrulamadan önce CD3 pozitif T hücrelerini ayırmak için MACS kullanacağız.
Başlamak için, laboratuvar önlüğü ve eldiven de dahil olmak üzere uygun koruyucu ekipmanı giyin. Daha sonra, bir çift diseksiyon makası ve forseps% 70 etanol ile yıkayın ve temiz bir kağıt havluyla kurulayın. Daha sonra dört mililitre FCS'yi 196 mililitre HBSS ile karıştırarak 200 mililitre HBSS% 2 fetal buzağı serumu veya FCS hazırlayın.
Ötenazi yapılmış bir fareyi bir diseksiyon plakasına sırtüstü pozisyonda sabitleyin. Makas ve forseps kullanarak, göğüs boşluğuna erişmek için uzunlamasına bir laparotomi yapın. İlk olarak, kalbin üzerinde bulunan timusa erişmek için kalbi çıkarın. Ardından iki beyaz lobdan oluşan timusu tanımlayın. Forseps kullanarak, timusu dikkatlice ayırın ve beş mililitre HBSS% 2 FCS içeren bir Petri kabına yerleştirin.
Bağışıklık hücrelerini izole etmek için önce timusu Petri kabındaki 40 mikrometrelik bir hücre süzgecine yerleştirin. Dokuyu tabağa ayırmak için bir pistonla ezin. Bundan sonra, yapışan hücreleri geri kazanmak için pistonu ve süzgeci HBSS %2 FCS ile durulayın. Daha sonra, ayrışmış timus hücrelerini ve sıvıyı Petri kabından 15 mililitrelik bir santrifüj tüpüne pipetleyin. Petri kabını beş mililitre HBSS% 2 FCS ile yıkayın ve bu yıkama solüsyonunu da 15 mililitrelik santrifüj tüpüne aktarın.
Daha sonra, tüpü 20 santigrat derecede yedi dakika boyunca 370 kez g'de santrifüjleyin. Süpernatanı atın ve eritrositleri parçalamak için peleti iki mililitre ACK parçalama tamponunda yeniden süspanse edin. Tezgah üstünde oda sıcaklığında iki dakika inkübe edin. Ardından, HBSS% 2 FCS ile hacmi 14 mililitreye getirin. Tüpü 370 kez g'de 20 santigrat derecede yedi dakika santrifüjleyin. Daha sonra, süpernatanı atın ve hücreleri beş mililitre HBSS% 2 FCS'de yeniden süspanse edin.
B lenfositlerinin FACS izolasyonu için protokolde gösterildiği gibi bir Malassez lamı kullanarak hücre konsantrasyonunu tahmin edin ve hücre konsantrasyonunu HBSS% 2 FCS ile mililitrede 10 ila yedinci hücreye ayarlayın.
500 mikrolitre hücre çözeltisini iki FACS tüpüne aktarın. Bir tüpü zenginleştirilmemiş T hücrelerini ve diğer tüpü zenginleştirilmiş T hücrelerini etiketleyin, bunlar manyetik etiketleme kullanılarak ayrılacaktır.
Zenginleştirilmiş T hücreleri tüpünü 20 santigrat derecede üç dakika boyunca 370 kez g'de santrifüjleyin. Süpernatanı atın ve peleti, HBSS% 2 FCS'de 400'de bir oranında seyreltilmiş 250 mikrolitre biyotin bağlantılı anti CD3 antikoru içinde yeniden süspanse edin. Hücreleri buz üzerinde ve karanlıkta 20 dakika inkübe edin. Tüplere üç mililitre HBSS% 2 FCS ekleyin ve 20 santigrat derecede üç dakika boyunca 370 kez g'de tekrar santrifüjleyin. Süpernatanı atın ve peleti, HBSS% 2 FCS'de beşte bir oranında seyreltilmiş 250 mikrolitre streptavidin bağlı boncuklarda yeniden süspanse edin. Hücre ve boncuk karışımını buz üzerinde 20 dakika inkübe edin. Daha sonra, tüpe üç mililitre HBSS% 2 FCS ekleyin, karıştırmak için yukarı ve aşağı pipetleyin ve 20 santigrat derecede üç dakika boyunca 370 kez g'de tekrar santrifüjleyin. Peleti iki mililitre HBSS% 2 FCS içinde yeniden süspanse edin.
Sütunu mıknatısın üzerine yerleştirin ve sistemi nemlendirmek için üç mililitre HBSS %2 FCS ekleyin. Ardından, lekeli hücreleri sütuna pipetleyin. Hücre süspansiyonu kolondan geçtikten sonra, kolonu üç mililitre HBSS% 2 FCS ile üç kez yıkayın. Ardından, sütunu mıknatıstan çıkarın ve 15 mililitrelik bir tüpe yerleştirin. Hedef hücreleri elüte etmek için, kolona beş mililitre HBSS% 2 FCS ekleyin ve kolonu bir pistonla yıkayın. Bu adımı beş mililitre başka bir HBSS% 2 FCS ile tekrarlayın.
Hedef hücre izolasyonunun etkinliğini değerlendirmek için, önce 500 mikrolitre ayrıştırılmış hücre süspansiyonunu bir FACS tüpüne aktarın ve zenginleştirilmiş T hücreleri olarak etiketleyin. Daha sonra, hem zenginleştirilmiş hem de zenginleştirilmemiş tüpleri 370 kez g'de 20 santigrat derecede yedi dakika boyunca santrifüjleyin. Süpernatanı atın, ardından her iki tüpe de HBSS% 2 FCS'de 200'de bir oranında seyreltilmiş 100 mikrolitre floresan antikor ekleyin. Hücreleri buz üzerinde ve karanlıkta 20 dakika inkübe edin. Daha sonra, tüplere üç mililitre HBSS% 2 FCS ekleyin ve bunları 20 santigrat derecede üç dakika boyunca 370 kez g'de santrifüjleyin. Süpernatanı atın, ardından peletleri 250 mikrolitre HBSS% 2 FCS içinde yeniden süspanse edin. Şimdi, FACS protokolünde gösterildiği gibi akış sitometrisini kullanarak CD3 pozitif hücre zenginleştirme oranını değerlendirin.
Şimdi, fare timusundan izole edilen tüm timositler arasında CD3 pozitif lenfositlerin sıklığını belirleyeceğiz. Başlamak için FlowJo simgesine çift tıklayın ve tüm örnek penceresindeki her tüp için dosyaları sürükleyin. Ardından, bu örnekten kaydedilen hücreleri, x ekseninde ileri saçılmayı, FSCA'yı ve y ekseninde yan saçılmayı, SSCA'yı görüntüleyen bir nokta grafiğinde görüntülemek için zenginleştirilmiş T hücreleri dosyasına çift tıklayın.
Lenfosit popülasyonlarını daire içine almak için çokgene tıklayın. Ardından, yeni bir pencere oluşturmak için daire içine alınmış popülasyona çift tıklayın. Y ekseninde FSC-W'yi ve x ekseninde FSC-A'yı seçin ve FSA-W negatif hücreleri daire içine alın. Alt popülasyon tanımlama penceresinde, hücre popülasyonunuzu Tek Hücreler olarak adlandırın. Ardından, alt nüfus tanımlama penceresinde Tamam'a tıklayın, ardından yeni bir pencere oluşturmak için daire içine alınmış nüfusa çift tıklayın. Y ekseninde CD3'ü seçin ve CD3 pozitif hücreleri daire içine alın. Alt popülasyon tanımlama penceresinde, hücre popülasyonunuzu T hücreleri olarak adlandırın. Zenginleştirilmemiş T hücreleri dosyasıyla bu işlemi tekrarlayın. Hücre popülasyonunuzu görselleştirmek için Düzen Düzenleyici'ye tıklayın ve zenginleştirilmiş T hücreleri ve zenginleştirilmemiş T hücreleri dosyalarından T hücresi popülasyonunu sekmeye sürükleyin.
CD3 pozitif lenfositleri temsil eden nokta grafikleri görünecektir. CD3 pozitif hücreler sadece CD3 pozitif zenginleştirilmiş tüpte ilgilenilen popülasyonda görünmelidir. Sıralanmış hücrelerde CD3 pozitif lenfositlerin zenginleşmesini değerlendirmek için, Tablo Düzenleyici'ye tıklayın ve ardından zenginleştirilmiş T hücrelerinden ve zenginleştirilmemiş T hücreleri dosyalarından T hücreleri popülasyonunu tabloya sürükleyin. İstatistik menüsünde, tüm lenfositlerdeki CD3 pozitif hücrelerin yüzdesini kontrol etmek için Lenfosit Hücrelerinin Sıklığı'nı seçin. Ardından, Tablo Oluştur'a tıklayın. Parametre değerleri yeni bir tabloda görünür. Zenginleştirilmiş T hücreleri için, CD3 pozitif hücrelerin sıklığı yaklaşık% 80 veya üzerinde olmalıdır.
View the full transcript and gain access to JoVE Science Education videos
Q1: What is magnetic-activated cell sorting and how does it separate cells?
Magnetic-activated cell sorting, or MACS, is a technique that separates cells based on specific epitopes expressed on their surfaces. Antibodies conjugated to biotin bind target cells, then streptavidin-coupled magnetic beads attach to the biotin. Labeled cells stick to a magnet in a column while unlabeled cells pass through, achieving 60 to 98% retrieval of target cells.
Q2: How does the biotin-streptavidin interaction work in MACS?
Biotin, attached to antibodies targeting specific cell surface markers, has high affinity for streptavidin molecules fused to magnetic beads. When biotin and streptavidin come into contact, they bind tightly, coating target cells with magnetic beads. This sandwich complex of cell surface marker, antibody, and magnetic bead enables magnetic capture and separation.
Q3: What steps are involved in preparing thymic tissue for MACS isolation?
The thymus is extracted and mechanically dissociated into single cells using a cell strainer and plunger. Unwanted erythrocytes are lysed using ACK buffer. Cells are then centrifuged and resuspended in HBSS with fetal calf serum. Cell concentration is adjusted to 10 to the seventh cells per milliliter before magnetic labeling with anti-CD3 antibodies.
Q4: How are CD3-positive T cells labeled and captured during MACS?
Cells are incubated with biotin-coupled anti-CD3 antibodies on ice for 20 minutes, then washed. Streptavidin-coupled magnetic beads are added and incubated for 20 minutes. The labeled cell suspension is pipetted into a column positioned on a magnet, where CD3-positive cells adhere while unlabeled cells flow through into a collection tube.
Q5: What is the purpose of using a column in the MACS separation process?
The column contains a non-magnetic matrix that lengthens the path cells travel through the system. This slows cell flow, allowing more time for magnetic beads to capture target cells efficiently. The column improves separation efficiency and increases the percentage of recovered cells compared to direct magnetic separation without a column.
Q6: How is the enrichment efficiency of CD3-positive T cells verified after MACS?
Enriched and non-enriched cell samples are stained with fluorescent anti-CD3 antibodies and analyzed using flow cytometry. Dot plots display CD3-positive lymphocytes, which should appear predominantly in the enriched sample. The frequency of CD3-positive cells among all lymphocytes is calculated, with enriched T-cells typically showing 80% or above CD3-positive cells.
Q7: What are the differences between positive and negative magnetic sorting?
In positive sorting, cells of interest are captured using magnetic beads coupled to antibodies targeting desired surface markers. In negative sorting, unwanted cells are removed by capturing them with magnetic beads carrying appropriate antibodies. Both approaches use the same MACS principle but differ in which cell population is retained versus discarded.
Chapters in this video
0:03
Concepts
2:33
Preparation of Materials and Dissection
3:39
Immune Cell Isolation
5:22
Magnetic Labeling of Immune Cells
6:59
Magnetic Separation of CD3-Positive Cells
7:48
Evaluation of Target-Cell Enrichment by Flow Cytometry
9:00
Data Analysis
Videos from this collection: