ELISA Tahlilleri: Dolaylı, Sandviç ve Rekabetçi

1. Dolaylı ELISA

Dolaylı bir ELISA, birincil antijene özgü antikorun ikincil bir konjuge antikor tarafından tanındığı bir antikordur. Aşağıdaki protokol, influenza A virüsü (IAV) ile enfekte farelerin serum örneklerinin IAV'ye özgü IgG antikorunun varlığı açısından test edildiği dolaylı bir ELISA yönteminin bir örneğidir. Bu örneğin güçlü yönlerinden biri, tüm antikor izotiplerini veya spesifik izotiplerini (örneğin, IgG) tanıyan farklı ikincil antikorların kullanılabilmesidir.

Antijenin mikroplakaya kaplanması

1. 50 μL saflaştırılmış antijen (0.05M Tris-HCl tamponunda (pH 9.5) içinde 2 mg / mL saflaştırılmış A / PR / 8 İnfluenza A virüsü) pipetleyerek 96 oyuklu bir ELISA plakasının kuyularını saflaştırılmış antijen ile kaplayın.
2. Plakayı yapışkan bir kapakla örtün ve antijenin plakaya bağlanmasını sağlamak için gece boyunca 4 ° C'de inkübe edin.
3. İnkübasyon tamamlandıktan sonra, plakayı bir lavabonun üzerine hafifçe vurarak kaplama solüsyonunu çıkarın.

Engelleme

4. Kaplanmış kuyucuklarda kalan protein bağlama bölgelerini 200 μL bloke edici tampon ekleyerek bloke edin, burada kuyu başına 1X PBS'de% 5 eşek serumu kullanılır. Alternatif bloke edici reaktifler, PBS'de% 5 yağsız kuru süt veya BSA veya ikincil antikorun üretildiği bir hayvandan alınan normal serumu içerir.
5. Oda sıcaklığında en az 2 saat veya gece boyunca 4°C'de inkübe edin.
6. İnkübasyonun ardından, plakayı hafifçe vurarak bloke edici tamponu çıkarın ve ardından plakayı %1 Tween-20 içeren PBS ile yıkayın.

Primer antikor ile inkübasyon

7. 1X PBS kullanarak 1 ila 204.800 arasında bir seyreltme aralığı elde etmek için birincil antikoru içeren serum örneğinin seri bir seyreltmesini hazırlayın. Bunu yapmak için önce serumu 1:12.5 oranında seyreltin ve ardından 4X seyreltme gerçekleştirin (seyreltme aralığı - 1:12.5 ila 1:204.800).
8. Kuyucuklara 100 μL seri seyreltilmiş serum örneği ekleyin.
9. Plakayı yapışkan kapakla örtün ve oda sıcaklığında 1-2 saat inkübe edin.
10. İnkübasyonun ardından, plakayı bir lavabonun üzerine hafifçe vurun ve plakayı %1 Tween-20 içeren PBS ile yıkayın.

İkincil antikor ile inkübasyon

11. Bu deneyde her bir oyuğa 100 μL enzimle konjuge ikincil antikor, yaban turpu peroksidaz, HRP konjuge eşek anti-fare ikincil ekleyin.
12. Plakayı oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin.
13. İnkübasyonun ardından, plakayı bir lavabonun üzerine itin ve ardından plakayı %1 Tween-20 içeren PBS ile yıkayın.

Algılama

14. Her oyuğa 1 mg / mL konsantrasyonda 100 μL indikatör substratı (3,3 ',5,5'-tetrametilbenzidin (TMB)) ekleyin.
15. Plakayı alt tabaka ile oda sıcaklığında 5-10 dakika inkübe edin.
16. 10 dakika sonra 100 μL 2N Sülfürik asit (H₂SO₄) ekleyerek enzimatik reaksiyonu durdurun.
    Durdurma çözeltisini ekledikten sonraki 30 dakika içinde, kuyucukların emilimini belirlemek için 405 nm'de bir mikroplaka okuyucu kullanarak plakayı okuyun.

2. Sandviç ELISA

Bu ELISA versiyonunda, deneysel numune, her ikisi de aynı proteine özgü ancak farklı epitoplarda olan konjuge olmayan bir yakalama antikoru ile konjuge bir tespit antikoru arasında "sıkıştırılır". Aşağıdaki sandviç ELISA örneğinde, insan TNFα konsantrasyonu, bilinen bir standart, rekombinant insan TNFa'sının (75 pg / mL konsantrasyonda belirtilen) 2.5X seri seyreltmesinden oluşturulan standart bir eğri kullanılarak bilinmeyen bir numunede belirlendi.

Mikroplakaya karşı kaplama yakalama antikoru

1. Plakanın her bir oyuğuna 100 μL yakalama antikoru (1-10 μg / mL aralığı) ekleyerek 96 oyuklu bir ELISA plakasının kuyularını saflaştırılmış yakalama antikoru ile kaplayın.
2. Plakayı yapışkan bir plaka ile örtün ve gece boyunca 4°C'de inkübe edin.
3. İnkübasyondan sonra, plakayı bir lavabonun üzerine hafifçe vurarak kaplama solüsyonunu plakadan çıkarın.

Engelleme

4. Kuyucuklara 200 μL bloke edici solüsyon, PBS içeren %5 yağsız kuru süt ilave ederek antikor kaplı kuyucuklarda kalan protein bağlama bölgelerini bloke edin.
5. Oda sıcaklığında en az 2 saat veya gece boyunca 4°C'de inkübe edin.
6. İnkübasyonun ardından, plakayı hafifçe vurarak bloke edici tamponu çıkarın ve ardından plakayı %1 Tween-20 içeren PBS ile yıkayın.

Test örnekleri içeren antijen ekleyin

7. Kuyucuklara 100 μL test numunesi ekleyin. Plakayı yapışkan bir kapakla kapatın.
8. Oda sıcaklığında 1-2 saat veya gece boyunca 4°C'de inkübe edin.
9. İnkübasyondan sonra, plakayı lavabonun üzerine hafifçe vurarak numuneleri çıkarın ve ardından kuyucukları %1 Tween-20 içeren 200 μL 1X PBS ile yıkayın.

Enzim konjuge tespit antikoru ekle

10. Önceden optimize edilmiş bir konsantrasyonda kuyucuklara 100 μL enzim konjuge tespit antikoru ekleyin.
11. Plakayı yapışkan bir kapakla kapatın ve oda sıcaklığında 2 saat inkübe edin.
12. Plakayı bir lavabonun üzerine iterek bağlanmamış tespit antikorunu çıkarın ve kuyucukları %1 Tween-20 içeren 200 μL 1X PBS ile yıkayın.

Algılama

13. 1 mg/mL konsantrasyonda 100 μL indikatör substratı ekleyin. Herhangi bir bağlı enzim konjuge tespit antikoru, substratı saptanabilir bir sinyale dönüştürecektir.
14. Plakayı oda sıcaklığında 5-10 dakika inkübe edin.
15. 5-10 dk sonra kuyucuklara 100 μL 2N H₂SO₄ ekleyerek enzimatik reaksiyonu durdurun. Durdurma çözeltisini ekledikten sonraki 30 dakika içinde, kuyucukların emilimini belirlemek için bir mikroplaka okuyucu kullanarak plakayı okuyun.

3. Rekabetçi ELISA

Rekabetçi bir ELISA'nın adımları, dolaylı ve sandviç ELISA'da kullanılanlardan farklıdır, temel fark, örnek antijen ile "eklenti" antijen arasındaki rekabetçi bağlanma adımıdır. Örnek antijen, etiketlenmemiş primer antikor ile inkübe edilir. Bu antikor-antijen kompleksleri daha sonra aynı antijen ile önceden kaplanmış olan ELISA plakasına eklenir. Bir inkübasyon periyodundan sonra, herhangi bir bağlanmamış antikor yıkanır. Kuyucuktaki antijeni bağlamak için mevcut olan serbest antikor miktarı ile orijinal numunedeki antijen miktarı arasında ters bir korelasyon vardır. Örneğin, bol miktarda antijen içeren bir numune, daha fazla antijen-birincil antikor kompleksine sahip olacak ve ELISA plakasına bağlanmak için çok az bağlanmamış antikor bırakacaktır. Birincil antikora özgü enzim konjuge bir ikincil antikor daha sonra kuyucuklara eklenir, ardından substrat gelir.

Antijenin mikroplakaya kaplanması

1. 96 oyuklu bir ELISA plakasının kuyularını 1-10 μg / mL konsantrasyonda 100 μL saflaştırılmış antijen ile kaplayın.
2. Plakayı yapışkan bir plaka ile örtün ve plakayı gece boyunca 4°C'de inkübe edin.
3. İnkübasyonun ardından, plakayı bir lavabonun üzerine hafifçe vurarak bağlanmamış antijen çözeltisini kuyucuklardan çıkarın.

Engelleme

4. Her bir oyuğa 200 μL bloke edici tampon ekleyerek kaplanmış kuyucuklarda kalan protein bağlama bölgelerini bloke edin, bu ya %5 yağsız kuru süt ya da PBS'de BSA olabilir.
5. Plakayı oda sıcaklığında en az 2 saat veya gece boyunca 4°C'de inkübe edin.

Primer antikor

ile inkübasyon örneği (antijen)

6. Kuyucukları bloke ederken, tahlildeki her bir kuyucuk için 150 μL örnek antijen ve 150 μL primer antikor karıştırarak antijen-antikor karışımını hazırlayın.
7. Bu karışımı 37°C'de 1 saat inkübe edin.

Antijen-antikor karışımını kuyuya ekleyin

8. Şimdi, plakayı bir lavabonun üzerine iterek blokaj tamponunu kuyulardan çıkarın.
9. Ardından, kuyuları Tween-20 içeren 1X PBS ile yıkayın.
10. 100 μL örnek antijen-primer antikor karışımı ekleyin.
11. Plakayı 37°C'de 1 saat inkübe edin.
12. Plakayı bir lavabonun üzerine iterek numune karışımını çıkarın.
13. Ardından, herhangi bir bağlanmamış antikoru çıkarmak için% 1 Tween-20 içeren 1X PBS ile kuyuları yıkayın.

İkincil antikoru ekleyin

14. Her bir oyuğa 100 μL enzim konjuge ikincil antikor, bu durumda AP konjuge antikor ekleyin.
15. Plakayı 37°C'de 1 saat inkübe edin.
16. İnkübasyondan sonra, plakayı %1 Tween-20 içeren 1X PBS ile yıkayın.

Algılama

17. Her oyuğa 100 μL substrat çözeltisi ekleyin.
18. 5-10 dakika bekleyin.
19. 10 dakika sonra kuyucuklara 100 μL 2N sülfürik asit ilave ederek enzimatik reaksiyonu durdurun. Ardından, durdurma solüsyonunu ekledikten sonraki 30 dakika içinde bir mikroplaka okuyucudaki absorbansı ölçün