ELISPOT Testi: IFN-γ Salgılayan Splenositlerin Tespiti

Enzime bağlı İmmünospot veya ELISPOT testi, bir patojene veya hücre hasarına karşı bağışıklık tepkisini analiz etmek için bir yöntemdir. Salgıladıkları spesifik proteinleri tespit ederek farklı bağışıklık hücrelerinin aktivasyonunun ölçülmesine izin verir. Örneğin, ELISPOT, salgılanan sitokinleri tespit ederek yabancı bir antijene maruz kaldığında T hücresi tepkilerini ölçmek için yaygın olarak kullanılır.

Sitokin bazlı bir ELISPOT testi için işlem, hedef sitokine özgü bir yakalama antikoru ile bir ELISPOT mikroplakasının kaplanmasıyla başlar. Antikor kaplamasından sonra, T hücreleri oyuklara eklenir ve örneğin anti-CD3 antikoru gibi harici bir ajan tarafından uyarılır. Hücreler daha sonra, yakalama antikoru tarafından hemen hareketsiz hale getirilen hedef sitokini salgılar. Protein, canlı hücrelerden salgılandıktan hemen sonra, seyreltme veya bozunma olmadan yakalandığından, bu test yüksek bir doğruluğa sahiptir. Hedef sitokin immobilize edildikten sonra, yakalanan sitokine de bağlanan bir tespit antikoru eklenir.

ELISPOT tekniği, spesifik antikor üretimlerini analiz ederek bir enfeksiyon veya aşılamadan sonra bellek B hücrelerini ölçmek için de kullanılabilir. Antikor bazlı bir ELISPOT'ta, antijenin plakaya bağlanacağı yakalama aşaması için veya antijenin yakalama sonrası hedef antikoru tespit ettiği tespit adımında bir antikor yerine spesifik bir antijen kullanılır. İşlemin tüm varyasyonlarında, T hücreleri veya B hücreleri için, tespit antikoru veya antijeni biyotinile edilir, bu da yaban turpu peroksidaz gibi streptavidin konjuge bir tespit enzimine bağlanmasına izin verir. Daha sonra, peroksidazın substratı olan AEC'nin eklenmesi üzerine koyu, çözünmeyen bir çökelti üretilir. Bu çökelti, yakalanan proteinin yerini işaretler ve her salgı hücresi, bir ELISPOT okuyucu veya mikroskop kullanılarak ölçülebilen görünür bir nokta ile sonuçlanır. Lekelerin boyutu, her hücreden salgılanan protein miktarının göreceli bir tahminidir. Bu test, salgı hücrelerinin nispeten küçük alt popülasyonlarında bile, tek hücrelerden gelen bağışıklık tepkilerini tespit edebilir ve bu da onu hücresel düzeyde bağışıklık tepkilerini incelemek için yararlı hale getirir.

Bu videoda, bir ELISPOT testinin nasıl gerçekleştirileceğini öğrenecek ve ardından salgı hücrelerini temsil eden noktaların miktarını belirleyeceksiniz.

Deney boyunca, laminer akış başlığında çalışarak ve eldiven giyerek steril koşulları sağlayın.

Bu protokoldeki tüm hesaplamalar, 96 oyuklu bir plaka için gereken hacme dayanmaktadır.

İlk olarak, anti-sitokin yakalama antikorunu seyreltin. Bunu yapmak için, 10 mililitre tamponu steril 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarın. Daha sonra, mililitre başına bir mikrogram nihai konsantrasyona sahip bir çözelti oluşturmak için tampona mililitre başına bir miligram 10 mikrolitre monoklonal antikor eklemek için bir pipet kullanın. Daha sonra, yakalama antikoru çözeltisini steril bir rezervuara dökün ve çok kanallı bir pipet kullanarak, 96 oyuklu bir ELISPOT plakasının her bir oyuğuna 100 mikrolitre dağıtın.

Plakayı bir plaka kapağıyla örtün, buharlaşmayı önlemek için kapatın ve gece boyunca dört santigrat derecede inkübe edin. Ertesi gün, laminer akış başlığındaki ELISPOT plakasını ortaya çıkarın. Yakalama antikoru solüsyonunu her bir oyuktan çıkarmak için plakayı hızlı bir şekilde steril mendillerin üzerine ters çevirin. Ardından, her bir oyuğa 200 mikrolitre hücre kültürü ortamı eklemek için çok kanallı bir pipet kullanın. Bu adım, tahlil sırasında spesifik olmayan bağlanmayı engelleyecektir. Plaka kapağını değiştirin ve 37 santigrat derece inkübatörde iki saat inkübe edin.

Plaka inkübe edilirken, mililitre PMA ve bir mikromolar iyonomisin başına 15 nanogramlık bir nihai konsantrasyon elde etmek için 10 mililitre hücre kültürü ortamına bir mikrolitre PMA ve 20 mikrolitre iyonomisin ekleyerek 2X mitojen çözeltisi hazırlayın.

Fare splenositlerinin hücresel süspansiyonları da bu sırada steril bir başlıkta hazırlanmalıdır. Bir mikroskop ve hemositometre kullanarak, hücrelerin konsantrasyonunu ölçün ve mililitrede iki milyon hücre stok konsantrasyonuna ulaşılana kadar toplam hacmi ayarlayın.

İnkübasyon tamamlandıktan sonra, hücre kültürü ortamını her bir oyuktan çıkarmak için plakayı hızlı bir şekilde steril mendiller üzerine ters çevirin. Daha sonra, hazırlanan hücresel süspansiyon stok çözeltisinden 200 mikrolitreyi ELISPOT plakasının üst sırasındaki kuyucuklara ekleyin. Deneyi üç kopya halinde ayarlayın, böylece test edilen her hücre tipi üç gruplandırılmış sütundan oluşan bir kümede kaplanacaktır. Bunun altına, plakanın sonraki beş sırasına, hücresel stok çözeltisi içeren sıraların altına 100 mikrolitre düz hücre kültürü ortamı ekleyin.

Ardından, 100 mikrolitre hücre süspansiyonunu üst sıradan doğrudan aşağıdaki sıraya pipetleyerek seri bir seyreltme gerçekleştirin ve hücreleri eşit şekilde dağıtmak için çözeltiyi hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyin. Kalan sıralar için bu işlemi tekrarlayın, her adımda bir önceki satırdan aşağıdaki satıra 100 mikrolitre hareket ettirin ve beşinci sıra seri olarak seyreltilene kadar devam edin. Altıncı sırayı, kontrol görevi görmesi için yalnızca hücre kültürü ortamıyla bırakın. Plakanın deneysel oyuklarındaki hücreleri uyarmak için, bir ila beş arasındaki sıraların her bir oyuğundaki hücresel süspansiyonlara 100 mikrolitre hazırlanmış mitojen çözeltisi ekleyin. Kontrol görevi görecek olan altıncı sırayı uyarılmadan bıraktığınızdan emin olun. Kapağı değiştirin ve plakayı 37 santigrat derece ve %5 CO2'de 24 ila 48 saat inkübe edin.

Seyreltilmiş biyotinile edilmiş anti-sitokin tespit edici antikoru hazırlayın. İlk olarak, 45 mililitre PBS'ye 5 mililitre% 10 fetal sığır serumu ekleyerek 50 mililitre tahlil seyreltici hazırlayın. Daha sonra, tespit edici antikoru, tahlil seyrelticisinde mililitre başına 2 mikrogramlık bir konsantrasyona seyreltin. Ayrıca, bu sırada 20 ila 25 mililitre yıkama tamponu hazırlayın,% 0.05 Tween-20 ve PBS'yi karıştırarak.

Kuluçka tamamlandıktan sonra, plakanın kapağını açın ve tüm sıvıyı kuyulardan çıkarmak için hızlı bir şekilde ters çevirin. Her kuyucuğa yaklaşık 200 mikrolitre yıkama tamponu ekleyerek plakayı yıkayın. Plakayı hızlı bir şekilde ters çevirerek ve bir lavabonun üzerine hafifçe vurarak bu sıvıyı dışarı atın. Toplam beş yıkama için bu işlemi dört kez daha tekrarlayın. Daha sonra, her bir oyuğa 100 mikrolitre seyreltilmiş tespit antikor çözeltisi ekleyin, kapağı değiştirin ve oda sıcaklığında iki saat inkübe edin. İnkübasyondan sonra, plakayı lavabonun üzerine ters çevirerek ve hafifçe vurarak tespit antikor çözeltisini plakanın kuyularından dışarı atın.

Daha önce olduğu gibi, plakayı yıkama tamponu ile beş kez yıkayın ve her yıkama arasında sıvıyı dışarı atın. Son yıkamadan sonra, streptavid-yaban turpu peroksidaz çözeltisini üreticinin talimatlarına göre seyrelterek hazırlayın. Daha sonra, plakanın kuyuları boşken, her bir oyuğa 100 mikrolitre seyreltilmiş streptavidin-yaban turpu peroksidaz çözeltisi ekleyin. Kapağı tekrar tabağa yerleştirin ve oda sıcaklığında iki saat inkübe edin.

İnkübasyondan sonra, kullanımdan en fazla 15 dakika önce, önceden hazırlanmış AEC substrat çözeltisini etkinleştirin. Kuyucukların içindekileri atın ve plakayı daha önce olduğu gibi beş kez yıkama tamponu ile yıkayın. Ardından, hemen her bir oyuğa 100 mikrolitre hazırlanmış AEC substrat çözeltisi ekleyin. Spot gelişimini izlerken plakayı yaklaşık 10 ila 20 dakika gelişmesi için oda sıcaklığında bırakın. Bu lekeler, kuyuların yüzeyinde küçük, koyu renkli daireler olarak görünecektir. Ardından, plakayı suyla durulamak ve lavabonun üzerine hafifçe vurmak suretiyle reaksiyonu durdurun. Plakayı kağıt havluların üzerine kurulayın ve gece boyunca veya tamamen kuruyana kadar kurumaya bırakın. Plakanın altındaki plastik tepsinin çıkarılması kurutmayı kolaylaştıracaktır. Kuruduktan sonra, lekeler otomatik bir plaka okuyucu ile sayılmaya hazır hale gelir.

Burada CTL ImmunoSpot okuyucu kullanılır, ancak bu protokol herhangi bir okuyucu için uyarlanabilir. Ardından, CTL programını açın ve Tarama Sayısı'na tıklayın. Tepsinin makineden uzaması için çıkarma düğmesine basın. Ardından plastik adaptörü çıkarın ve ELISPOT plakası ve adaptör üzerindeki A sırasını hizalayın. Kaydedilecek dosya için bir dosya adı ve konumu seçin ve plakayı ve adaptörü tepsiye yükleyin. Yazılıma yükle'ye tıklayın ve makinenin yan tarafındaki kapıyı kapatın. Ardından, Saydıktan Sonra Başlat'a basın. Dosyanın kaydedildiğinden emin olun ve ardından verileri analiz etmek ve nokta sayısını saymak için Kalite Kontrol QC yazılımını açın. Bu verileri bir Excel dosyası olarak dışa aktarın. Analiz tamamlandıktan sonra, plakayı almak için Çıkar'a tıklayın.

Bu deneyde, vahşi tip ve tümör taşıyan farelerden alınan hücreler kaplandı ve IFN gama için analiz edildi. Hücre konsantrasyonunun azalmasıyla leke sayısının azaldığına dikkat edin. Tipik olarak, ELISPOT verileri, kaplanan hücre sayısı başına nokta sayısı sayısı olarak sunulur. Bu örnekte, noktaların sayısı, her bir ilgili hücresel konsantrasyon x ekseninde listelenecek şekilde bir çubuk grafikte görüntülendi. Nokta sayısının, belirli bir popülasyondaki toplam hücre sayısı başına etkinleştirilmiş hücre sayısını gösterdiğine dikkat edin.