ELISPOT Testi: IFN-γ Salgılayan Splenositlerin Tespiti

1. Kurulum

Tamponlar ve Reaktifler

1. Kalsiyum veya magnezyum içermeyen steril fosfat tamponlu salin (PBS
2. Kaplama tamponu - steril PBS veya karbonat tamponu
3. Test seyreltici-PBS
'de %10 fetal sığır serumu (FBS)
4. Hücre kültürü ortamı - %10 FBS, penisilin / streptomisin ve L-glutamin içeren RPMI 1640
5. Yıkama tamponu - %0.05 Tween20
içeren PBS
6. Çift damıtılmış su (ddH₂O)
7. Tespit substratı - 10 mL DMF (N, N, Dimetilformamid) içinde 100 mg AEC (3-amino-9-etil-karbazol).

Ekipman

8. Laminer akış başlığı
9. Nemlendirilmiş inkübatör (37°C'ye ayarlanmış, %5 CO₂)
10. Otomatik ELISPOT Okuyucu veya diseksiyon mikroskobu

Malzemeler

11. ELISPOT plakaları
12. Steril ve steril olmayan rezervuarlar
13. Pipetleyiciler ve uçlar
14. Steril serolojik pipetler
15. Steril, konik polipropilen tüpler
16. Tabak yıkamak için iki sıkma şişesi

Tahlil Spesifik Reaktifler

17. Hücreler- birincil hücreler veya hücre hatları (burada, C57BL / 6 farelerinden alınan splenositler kullanıldı)
18. Uyarıcılar- mitojen veya antijen (burada, forbol 12-miristat 13-asetat (PMA, 50 ng/mL) ve iyonomisin (1 μM) kullanıldı)
19. Birincil antikor- biyotinile edilmiş anti-sitokin tespit edici antikor (test seyrelticisinde 2 μg/mL'ye seyreltilmiş)
20. İkincil antikor- streptavidin-yaban turpu peroksidaz (SAv-HRP)

2. Prosedür

Kaplama

1. Koşulları steril ve laminer bir akış başlığı içinde tutarak, saflaştırılmış anti-sitokin yakalama antikorunu steril kaplama tamponunda 0.5-4.0 μg / mL'lik bir nihai konsantrasyona seyreltin. (Not: IFN-γ ve IL-6 için 5 μg/mL kullanın).
2. Yakalama antikoru solüsyonunu 100 μL / kuyucuk ELISPOT plakasına aktarın.
3. Plakayı bir plaka kapağı ile örtün ve buharlaşmayı önlemek için kapatın.
4. Plakayı gece boyunca 4°C'de inkübe edin.

Engelleme

5. Ertesi gün, laminer akış başlığındaki ELISPOT plakasını ortaya çıkarın. Yakalama antikoru solüsyonunu her bir oyuktan çıkarmak için plakayı hızlı bir şekilde steril mendillerin üzerine ters çevirin.
6. Ardından, her bir oyuğa 200 μL hücre kültürü ortamı ekleyin. Bu adım, tahlil sırasında spesifik olmayan bağlanmayı engelleyecektir.
7. Plaka kapağını değiştirin ve plakayı 37°C'de 2 saat inkübe edin.

Hücrelerin Kaplanması ve Aktive Edilmesi

8. Plaka inkübe edilirken, hücre kültürü ortamında 50 ng / mL PMA ve 1 μM iyonomisin içeren 2X mitojen çözeltisi hazırlayın.
9. Ardından, hedef hücresel süspansiyonları 2 x 10⁶ hücre/mL stok konsantrasyonuna hazırlayın.
10. İnkübasyon tamamlandıktan sonra, plakayı laminer akış başlığının içindeki steril mendillere hızlı bir şekilde ters çevirerek hücre kültürü ortamını her bir kuyucuktan çıkarın.
11. Ardından, stok hücre süspansiyon çözeltisinin 2X seri seyreltmesini oluşturun. Bunu yapmak için, önce 200 μL hazırlanmış hücresel süspansiyon stok solüsyonunu ELISPOT plakasının üst sırasındaki kuyucuklara ekleyin.
12. Daha sonra, hücresel stok çözeltisi içeren sıraların altındaki plakanın sonraki beş sırasına 100 μL düz hücre kültürü ortamı ekleyin.
13. Bundan sonra, 100 μL hücresel süspansiyonu üst sıradan doğrudan aşağıdaki sıraya pipetleyerek 2X seri seyreltme gerçekleştirin. Hücrelerin eşit dağılımını sağlamak için bu çözeltiyi yukarı ve aşağı nazikçe pipetleyerek uygun şekilde karıştırıldığından emin olun.
14. Kalan dört satır için bu işlemi tekrarlayın.
15. Altıncı satırı yalnızca kültür ortamıyla bırakın. Deneysel kontrol görevi görecektir.
16. Daha sonra, plakanın ilk beş sırasının deneysel kuyucuklarına 100 μL hazırlanan mitojen çözeltisi ekleyin. Kontrol kuyucuklarına ve altıncı sıraya, mitojen içermeyen 100 μL hücre kültürü ortamı ekleyin.
17. Plaka kapağını değiştirin ve plakayı 37 ° C,% 5 CO₂ sıcaklıkta 20-48 saat inkübatörde inkübe edin. (Not: IL-2 ve TNF-α tespit etmek için tipik olarak 20-24 saat yeterliyken, IL-4 ve IFN-γ için 48 saat idealdir).

Algılama

Birincil antikor

18. Biyotinile anti-sitokin tespit edici antikoru tahlil seyrelticisinde 2 μg / mL'lik bir konsantrasyona hazırlayın.
19. PBS'de% 0.05 Tween-20 karıştırarak bu sırada 20-25 mL yıkama tamponu hazırlayın.
20. Kuluçka tamamlandıktan sonra, plakanın kapağını açın ve tüm sıvıyı kuyucuklardan çıkarmak için hızlı bir şekilde bir lavabonun üzerinde ters çevirin. (Not: Bu noktadan sonra plakanın artık steril tutulmasına gerek yoktur).
21. Ardından, her bir kuyucuğa ~ 200 μL yıkama tamponu ekleyerek plakayı yıkayın. Plakayı hızlı bir şekilde ters çevirerek ve bir lavabonun üzerine hafifçe vurarak bu sıvıyı dışarı atın. Bu işlemi toplam beş yıkama için tekrarlayın.
22. Daha sonra, her bir oyuğa 100 μL seyreltilmiş biyotinile edilmiş anti-sitokin tespit edici antikor çözeltisi ekleyin. Oda sıcaklığında 2 saat oda sıcaklığında veya gece boyunca 4°C'de inkübe edin.

İkincil antikor

23. İnkübasyon tamamlandıktan sonra, plakayı ters çevirerek ve lavabonun üzerine hafifçe vurarak tespit antikorunu dışarı atın.
24. Daha önce olduğu gibi, plakayı ~ 200 μL yıkama tamponu ile 5 kez yıkayın ve her yıkama arasında sıvıyı dışarı atın.
25. Daha sonra, her bir oyuğa 100 μL seyreltilmiş streptavidin-yaban turpu peroksidaz çözeltisi ekleyin (tahlil seyrelticisinde önceden belirlenmiş optimal konsantrasyonuna seyreltilmiş).
26. Plaka kapağını değiştirin ve oda sıcaklığında 37°C'de 1,5-2 saat inkübe edin.

Substrat

27. İnkübasyondan sonra, kullanımdan en fazla 15 dakika önce, önce üreticinin talimatlarına göre AEC substrat çözeltisini etkinleştirin.
28. Daha sonra, kuyucukların içeriğini atın ve plakayı daha önce olduğu gibi beş kez yıkama tamponu ile yıkayın.
29. Ardından, her bir oyuğa hemen 100 μL hazırlanmış AEC substrat çözeltisi ekleyin.
30. Spot gelişimini izlerken plakayı oda sıcaklığında ~ 10-20 dakika inkübe edin.
31. Plakayı suyla durulayarak ve plakayı lavabonun üzerine hafifçe vurarak reaksiyonu durdurun.
32. Plakayı kağıt havluların üzerine kurulayın ve plakanın gece boyunca veya tamamen kuruyana kadar kurumasını bekleyin. Plakanın altındaki plastik tepsinin çıkarılması kurutmayı kolaylaştıracaktır.

3. Veri Toplama ve Analizi

1. Kuruduktan sonra, lekeler otomatik bir plaka okuyucu ile sayılmaya hazır hale gelir. Burada CTL İmmünospot okuyucu kullanılır, ancak bu protokol herhangi bir okuyucu için uyarlanabilir.
2. Önce cihazı, ardından bilgisayarı açın. Ardından, CTL programını açın ve "tarama sayısı"na tıklayın.
3. Tepsinin makineden uzaması için "çıkar" düğmesine basın. Ardından plastik adaptörü çıkarın ve ELISPOT plakası ve adaptör üzerindeki "A" sırasını hizalayın.
4. Kaydedilecek dosya için bir dosya adı ve konumu seçin ve plakayı tepsiye yükleyin.
5. Ardından, yazılımdaki "yükle"ye tıklayın ve makinenin yan tarafındaki kapıyı kapatın.
6. Saydıktan sonra "başlat- tuşuna basın." Dosyanın kaydedildiğinden emin olun ve ardından verileri analiz etmek ve nokta sayısını saymak için kalite kontrol "QC" yazılımını açın.

Notlar:

1. Minimum hücre sayısı ön deneylerde belirlenmelidir. En uygun nokta sayısı ~ 50 / kuyudur. Çok fazla hücre yüklenirse, farklı noktaları tespit etmek zor olacaktır. Ek olarak, hücreler üst üste binecek ve zar üzerinde bir tek tabaka oluşturmayabilir, bu nedenle tespit seviyesi azalabilir.
2. Deneyi optimize ederken, hedef proteinin beklenen ekspresyon seviyesini göz önünde bulundurun. İfade ne kadar düşükse, kuyucuk başına gereken hücre sayısı o kadar yüksek olur.
3. ELISA'dan farklı olarak, plaka yıkayıcı kullanmak yerine plakayı elde yıkamak daha iyidir. ELISPOT plakaları daha hassastır ve PVDF membranının delinmesinden kaçınılmalıdır.
4. Kuluçka süresi boyunca plakanın hareketi sınırlandırılmalıdır, çünkü lekelerin bulaşmasına neden olabilir.
5. Doğrudan ışığa maruz kalmak lekelerin solmasına neden olduğu için plakalar karanlıkta saklanmalıdır.