İmmünopresipitasyona Dayalı Teknikler: Agarozlu Boncuklar Kullanılarak Endojen Proteinlerin Saflaştırılması

1. Protein A/G PLUS Agaroz Boncukları kullanılarak immünopresipitasyon

Hücre Lizat Hazırlama

1. 10⁸ timositi 13.000 rpm'de 3 dakika boyunca bir mikrosantrifüjde santrifüjleyin ve süpernatanı çıkarın.
   Not: Hücre sayısı, istenen proteinin ekspresyon seviyelerine ve seçilen hücre tipine bağlı olarak değişecektir.
2. Hücreleri PMSF ile 500 μL'lik lizis tamponu RIPA içinde yeniden süspanse edin.
3. Bir girdap ile birkaç hızlı darbe kullanarak hücreleri parçalayın ve ardından bir şırıngaya bağlı 25 G'lık bir iğne ile lizatı birkaç kez aspire edin.
   Not: Baloncuk oluşturmaktan kaçının. Daha büyük hücre tipleri için 21G iğne gibi daha büyük bir iğne kullanın.
4. Hücre lizatını buz üzerinde 10 dakika inkübe edin.
5. Lizatı 13.000 rpm'de 4°C'de 15 dakika santrifüjleyin.
6. Süpernatanı taze, etiketli bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın.

Ön temizleme

7. Lizata 20 μL Protein A/G PLUS agaroz boncukları ve 1 μg izotip kontrol antikoru (burada fare IgG1 izotip kontrol antikoru kullanılır) ekleyin.
   Not: Kullanılan izotip antikor seçimi, aşağı çekme adımında daha sonra kullanılan proteine özgü antikora bağlı olacaktır.
8. Lizat karışımını soğuk odada (4°C) bir santrifüj döndürücü üzerinde 30 dakika inkübe edin.
9. Numuneyi 3200 rpm'de 4°C'de 30 saniye santrifüjleyin.
10. Önceden temizlenmiş süpernatanı taze, etiketli, 1.5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Peleti atın.

Protein Konsantrasyonu Tayini

11. Bir Bradford Testi yaparak hücre lizatının protein konsantrasyonunu belirleyin.
12. 1000 μL Bradford Reaktifini 7 mikrosantrifüj tüpüne ekleyin.
13. Aşağıdaki miktarlarda BSA protein standardını (2 mg / mL) tüplerin 6'sına ekleyin (Tablo 1).

Tüp Numarası	BSA Hacmi (μL) (2 mg/mL)	Protein Konsantrasyonu (μg/μL)
1	0	0
2	1	2
3	2	4
4	3	6
5	4	8
6	5	10

Tablo 1: BSA protein standart miktarları

14. 7^th tüpe 1 μL önceden temizlenmiş lizat ekleyin.
    Not: Numune konsantrasyonunun tahlil tespit aralığında olduğundan emin olmak için, 1:2 veya 1:5 lizat seyreltmesini de hazırlayın ve analiz edin.
15. 7 tüpün her birinden 200 μL'yi düz tabanlı, 96 oyuklu bir plakanın ayrı oyuklarına yerleştirin ve her numuneyi üç nüsha halinde tekrarlayın.
16. 595 nm'de bir plaka okuyucuda plakayı okuyun.
17. Excel'de standart eğriyi oluşturun ve önceden temizlenmiş lizatın protein konsantrasyonunu hesaplayın.

Aşağı çekin

18. İki taze 1.5 mL mikrosantrifüj tüpünü etiketleyin - biri 'kontrol' ve diğeri 'test' olarak, bu örnekte c-myc'dir.
19. Bu tüplerin her birine 500 μg önceden temizlenmiş lizat yerleştirin.
    Not: Burada kullanılan protein miktarı, saflaştırılması istenen protein miktarına bağlı olacaktır.
20. Lizis tamponu kullanarak her tüp için toplam hacmi 500 μL'ye kadar yükseltin.
21. Test grubu tüpüne 2 μg anti-c-myc antikoru ve kontrol grubuna 2 μg fare IgG1 izotip kontrol antikoru ekleyin.
    Not: Antikor miktarı, antikor etkinliğine ve hedef proteinin miktarına bağlı olacaktır.
22. Tüpleri soğuk odada (4°C) bir döndürücü üzerinde 2 saat
inkübe edin
23. Her tüpe 20 μL Protein A/G PLUS agaroz boncukları ekleyin.
    Not: Boncukların zarar görmesini önlemek için pipet uçlarının ucu kesilmiş olarak kullanılması tavsiye edilir.
24. Gece boyunca soğuk odada (4 ° C) bir döndürücü üzerinde inkübe edin.
    Not: Hedef proteine ve antikor etkinliğine bağlı olarak, bu adım 1 saatten bir geceye kadar değişebilir.
25. Boncukları aşağı çekmek için tüpleri 3200 rpm'de 30 s 4°C'de santrifüjleyin.
26. Süpernatanı her tüpten aspire edin.
    Not: Hedef protein artık boncuklara bağlanmıştır.
27. Boncukları 500 μL 1X Dulbecco'nun PBS'sini kullanarak iki kez yıkayın.
28. Tüpleri 3200 rpm'de 30 s 4°C'de santrifüjleyin.
    Not: Daha sıkı yıkama için RIPA gibi daha sıkı tamponlar kullanın.
29. Tamponu her tüpten aspire edin. Jel yükleme uçlarını kullanarak, boncuklardan kalan tamponu çıkarın ve proteini çıkarmak için boncukları buz üzerinde tutun.
    Not: Bu örnekte, protein, Western blot analizi için boncuklar kaynatılarak SDS-PAGE çalışma tamponuna ayrıştırılır. Bu yaklaşım, IP sonuçlarını doğrulamak veya protein-protein etkileşimlerini incelemek için uygundur. Yapısal veya enzimatik analiz için proteinlerin saflaştırılması gibi diğer alt uygulamalar için, antikorun ilgilenilen protein ile elüsyonunu önlemek için epitop etiketleri (bayrak etiketi veya myc-etiketi) gibi daha karmaşık sistemler kullanılır.

2. Western Blot analizi ile IP doğrulaması

SDS-PAGE Elektroforezi:

1. Boncukları β-merkapto-etonol içeren 20 μL SDS-PAGE yükleme boyasında yeniden süspanse edin.
2. Numuneleri 95 °C'de 5 dakika kaynatın.
3. Boncukları oda sıcaklığında 10 saniye boyunca 13.000 rpm'de santrifüjleyin.
4. Jel yükleme uçlarını kullanarak, boncuklardan elde edilen numuneleri dikkatlice pipetleyin ve bunları %4-15 gradyanlı SDS-PAGE jel kuyularına yükleyin.
5. Numunelere ek olarak, bir protein merdiveni olan bir şeridin yanı sıra bir yükleme kontrolü görevi görmesi için önceden temizlenmiş lizat içeren bir şerit yükleyin.
6. Boya cephesi jelin dibine ulaşana kadar (~ 1 saat) 100 V'ta çalıştırın.

Batı Blot Analizi:

7. PVDF membranının jel ve kırmızı katot arasında olduğundan emin olarak Western blot sandviçi yapın.
8. 100 V'ta 1 saat aktarın.
9. Spesifik olmayan protein bağlanma bölgelerini bloke etmek için membranı oda sıcaklığında 5 mL bloke edici tampona 1 saat boyunca düşük ayarda bir külbütör üzerine yerleştirin.
   Not: Daha büyük boyutlu lekeler için bloke edici tampon, birincil antikor, ikincil antikor ve yıkama hacimlerinin artırılması gerekebilir.
10. Lekeyi 5 mL anti-c-myc antikoru ile bloke edici tamponda gece boyunca 4 ° C'de düşük bir ayarda külbütör üzerinde inkübe edin.
    Not: Burada kullanılan antikor, aşağı çekme adımında kullanılandan farklı olmalıdır.
11. Lekeyi 5 mL TBST kullanarak 3-6 kez yıkayın, her yıkama oda sıcaklığında 5 dakika olacak şekilde düşük ayarda bir külbütör üzerinde olacaktır.
12. Lekeyi, HRP etiketli tavşan önleyici hafif zincir ikincil antikoru ile blokaj tamponunda, oda sıcaklığında 1 saat boyunca düşük bir ayarda külbütörde inkübe edin.
    Not: İkincil antikor seçimi, Western blot için kullanılan birincil antikora bağlı olacaktır. Ek olarak, protokolde hafif zincire özgü bir ikincil kullanılır, çünkü hedef protein moleküler ağırlık olarak antikorun ağır zincirine yakındır. Hedef protein 50kDa'ya yakınsa, hafif zincire özgü bir ikincil protein kullanın. Hedef protein 25kDa'ya yakınsa, ağır zincire özgü ikincil kullanın.
13. Lekeyi 5 mL TBST kullanarak 3-6 kez yıkayın, her yıkama oda sıcaklığında 5 dakika olacak şekilde düşük ayarda bir külbütör üzerinde olacaktır.
14. Lekeden sıvıyı çıkarın ve fazla sıvıyı çıkarmak için lekenin kenarını laboratuvar mendillerine sürün.
15. Lekeyi 1x kemilüminesan tespit reaktifi ile örtün ve 1 dakika inkübe edin.
    Not: Algılama reaktifi hafif ve zamana duyarlı olduğundan aşağıdaki adımlar hızlı bir şekilde art arda yapılmalıdır.
16. Fazla tespit reaktifini çıkarmak için lekenin kenarını laboratuvar mendillerine sürün.
17. Lekeyi Görüntüleyici tepsisinin görüntüleme yüzeyine yerleştirin.
    Not: Kemilüminesan lekeler film kullanılarak da görselleştirilebilir.
18. 10 saniyeden 5 dakikaya kadar birden çok zaman noktasını yakalamak için 'Kemilüminesan Programı' kullanan görüntü.
    Not: En uygun zaman, protein miktarına ve antikorun kalitesine bağlı olarak değişebilir.
19. En iyi bant görünürlüğüne sahip bir görüntü seçin ve ardından bu görüntüyü dışa aktarın.
20. Lekeyi hareket ettirmeden önce, merdivenin konumunu yakalamak için görüntüleyiciyi kullanarak lekenin fotoğrafını çekin. Ardından, bu görüntüyü de dışa aktarın.
21. Bir slayt hazırlama yazılımı (PowerPoint gibi) kullanarak, bantları ve merdiven görüntülerini tek bir görüntü oluşturacak şekilde hizalayın.