5.9: İmmünopresipitasyona Dayalı Teknikler: Agarozlu Boncuklar Kullanılarak Endojen Proteinlerin Saflaştırılması

1. Protein A/G PLUS Agaroz Boncukları kullanılarak immünopresipitasyon

Hücre Lizat Hazırlama

1. 10⁸ timositi 13.000 rpm'de 3 dakika boyunca bir mikrosantrifüjde santrifüjleyin ve süpernatanı çıkarın.
   Not: Hücre sayısı, istenen proteinin ekspresyon seviyelerine ve seçilen hücre tipine bağlı olarak değişecektir.
2. Hücreleri PMSF ile 500 μL'lik lizis tamponu RIPA içinde yeniden süspanse edin.
3. Bir girdap ile birkaç hızlı darbe kullanarak hücreleri parçalayın ve ardından bir şırıngaya bağlı 25 G'lık bir iğne ile lizatı birkaç kez aspire edin.
   Not: Baloncuk oluşturmaktan kaçının. Daha büyük hücre tipleri için 21G iğne gibi daha büyük bir iğne kullanın.
4. Hücre lizatını buz üzerinde 10 dakika inkübe edin.
5. Lizatı 13.000 rpm'de 4°C'de 15 dakika santrifüjleyin.
6. Süpernatanı taze, etiketli bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın.

Ön temizleme

7. Lizata 20 μL Protein A/G PLUS agaroz boncukları ve 1 μg izotip kontrol antikoru (burada fare IgG1 izotip kontrol antikoru kullanılır) ekleyin.
   Not: Kullanılan izotip antikor seçimi, aşağı çekme adımında daha sonra kullanılan proteine özgü antikora bağlı olacaktır.
8. Lizat karışımını soğuk odada (4°C) bir santrifüj döndürücü üzerinde 30 dakika inkübe edin.
9. Numuneyi 3200 rpm'de 4°C'de 30 saniye santrifüjleyin.
10. Önceden temizlenmiş süpernatanı taze, etiketli, 1.5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Peleti atın.

Protein Konsantrasyonu Tayini

11. Bir Bradford Testi yaparak hücre lizatının protein konsantrasyonunu belirleyin.
12. 1000 μL Bradford Reaktifini 7 mikrosantrifüj tüpüne ekleyin.
13. Aşağıdaki miktarlarda BSA protein standardını (2 mg / mL) tüplerin 6'sına ekleyin (Tablo 1).

Tablo 1: BSA protein standart miktarları

14. 7^th tüpe 1 μL önceden temizlenmiş lizat ekleyin.
    Not: Numune konsantrasyonunun tahlil tespit aralığında olduğundan emin olmak için, 1:2 veya 1:5 lizat seyreltmesini de hazırlayın ve analiz edin.
15. 7 tüpün her birinden 200 μL'yi düz tabanlı, 96 oyuklu bir plakanın ayrı oyuklarına yerleştirin ve her numuneyi üç nüsha halinde tekrarlayın.
16. 595 nm'de bir plaka okuyucuda plakayı okuyun.
17. Excel'de standart eğriyi oluşturun ve önceden temizlenmiş lizatın protein konsantrasyonunu hesaplayın.

Aşağı çekin

18. İki taze 1.5 mL mikrosantrifüj tüpünü etiketleyin - biri 'kontrol' ve diğeri 'test' olarak, bu örnekte c-myc'dir.
19. Bu tüplerin her birine 500 μg önceden temizlenmiş lizat yerleştirin.
    Not: Burada kullanılan protein miktarı, saflaştırılması istenen protein miktarına bağlı olacaktır.
20. Lizis tamponu kullanarak her tüp için toplam hacmi 500 μL'ye kadar yükseltin.
21. Test grubu tüpüne 2 μg anti-c-myc antikoru ve kontrol grubuna 2 μg fare IgG1 izotip kontrol antikoru ekleyin.
    Not: Antikor miktarı, antikor etkinliğine ve hedef proteinin miktarına bağlı olacaktır.
22. Tüpleri soğuk odada (4°C) bir döndürücü üzerinde 2 saat
inkübe edin
23. Her tüpe 20 μL Protein A/G PLUS agaroz boncukları ekleyin.
    Not: Boncukların zarar görmesini önlemek için pipet uçlarının ucu kesilmiş olarak kullanılması tavsiye edilir.
24. Gece boyunca soğuk odada (4 ° C) bir döndürücü üzerinde inkübe edin.
    Not: Hedef proteine ve antikor etkinliğine bağlı olarak, bu adım 1 saatten bir geceye kadar değişebilir.
25. Boncukları aşağı çekmek için tüpleri 3200 rpm'de 30 s 4°C'de santrifüjleyin.
26. Süpernatanı her tüpten aspire edin.
    Not: Hedef protein artık boncuklara bağlanmıştır.
27. Boncukları 500 μL 1X Dulbecco'nun PBS'sini kullanarak iki kez yıkayın.
28. Tüpleri 3200 rpm'de 30 s 4°C'de santrifüjleyin.
    Not: Daha sıkı yıkama için RIPA gibi daha sıkı tamponlar kullanın.
29. Tamponu her tüpten aspire edin. Jel yükleme uçlarını kullanarak, boncuklardan kalan tamponu çıkarın ve proteini çıkarmak için boncukları buz üzerinde tutun.
    Not: Bu örnekte, protein, Western blot analizi için boncuklar kaynatılarak SDS-PAGE çalışma tamponuna ayrıştırılır. Bu yaklaşım, IP sonuçlarını doğrulamak veya protein-protein etkileşimlerini incelemek için uygundur. Yapısal veya enzimatik analiz için proteinlerin saflaştırılması gibi diğer alt uygulamalar için, antikorun ilgilenilen protein ile elüsyonunu önlemek için epitop etiketleri (bayrak etiketi veya myc-etiketi) gibi daha karmaşık sistemler kullanılır.

2. Western Blot analizi ile IP doğrulaması

SDS-PAGE Elektroforezi:

1. Boncukları β-merkapto-etonol içeren 20 μL SDS-PAGE yükleme boyasında yeniden süspanse edin.
2. Numuneleri 95 °C'de 5 dakika kaynatın.
3. Boncukları oda sıcaklığında 10 saniye boyunca 13.000 rpm'de santrifüjleyin.
4. Jel yükleme uçlarını kullanarak, boncuklardan elde edilen numuneleri dikkatlice pipetleyin ve bunları %4-15 gradyanlı SDS-PAGE jel kuyularına yükleyin.
5. Numunelere ek olarak, bir protein merdiveni olan bir şeridin yanı sıra bir yükleme kontrolü görevi görmesi için önceden temizlenmiş lizat içeren bir şerit yükleyin.
6. Boya cephesi jelin dibine ulaşana kadar (~ 1 saat) 100 V'ta çalıştırın.

Batı Blot Analizi:

7. PVDF membranının jel ve kırmızı katot arasında olduğundan emin olarak Western blot sandviçi yapın.
8. 100 V'ta 1 saat aktarın.
9. Spesifik olmayan protein bağlanma bölgelerini bloke etmek için membranı oda sıcaklığında 5 mL bloke edici tampona 1 saat boyunca düşük ayarda bir külbütör üzerine yerleştirin.
   Not: Daha büyük boyutlu lekeler için bloke edici tampon, birincil antikor, ikincil antikor ve yıkama hacimlerinin artırılması gerekebilir.
10. Lekeyi 5 mL anti-c-myc antikoru ile bloke edici tamponda gece boyunca 4 ° C'de düşük bir ayarda külbütör üzerinde inkübe edin.
    Not: Burada kullanılan antikor, aşağı çekme adımında kullanılandan farklı olmalıdır.
11. Lekeyi 5 mL TBST kullanarak 3-6 kez yıkayın, her yıkama oda sıcaklığında 5 dakika olacak şekilde düşük ayarda bir külbütör üzerinde olacaktır.
12. Lekeyi, HRP etiketli tavşan önleyici hafif zincir ikincil antikoru ile blokaj tamponunda, oda sıcaklığında 1 saat boyunca düşük bir ayarda külbütörde inkübe edin.
    Not: İkincil antikor seçimi, Western blot için kullanılan birincil antikora bağlı olacaktır. Ek olarak, protokolde hafif zincire özgü bir ikincil kullanılır, çünkü hedef protein moleküler ağırlık olarak antikorun ağır zincirine yakındır. Hedef protein 50kDa'ya yakınsa, hafif zincire özgü bir ikincil protein kullanın. Hedef protein 25kDa'ya yakınsa, ağır zincire özgü ikincil kullanın.
13. Lekeyi 5 mL TBST kullanarak 3-6 kez yıkayın, her yıkama oda sıcaklığında 5 dakika olacak şekilde düşük ayarda bir külbütör üzerinde olacaktır.
14. Lekeden sıvıyı çıkarın ve fazla sıvıyı çıkarmak için lekenin kenarını laboratuvar mendillerine sürün.
15. Lekeyi 1x kemilüminesan tespit reaktifi ile örtün ve 1 dakika inkübe edin.
    Not: Algılama reaktifi hafif ve zamana duyarlı olduğundan aşağıdaki adımlar hızlı bir şekilde art arda yapılmalıdır.
16. Fazla tespit reaktifini çıkarmak için lekenin kenarını laboratuvar mendillerine sürün.
17. Lekeyi Görüntüleyici tepsisinin görüntüleme yüzeyine yerleştirin.
    Not: Kemilüminesan lekeler film kullanılarak da görselleştirilebilir.
18. 10 saniyeden 5 dakikaya kadar birden çok zaman noktasını yakalamak için 'Kemilüminesan Programı' kullanan görüntü.
    Not: En uygun zaman, protein miktarına ve antikorun kalitesine bağlı olarak değişebilir.
19. En iyi bant görünürlüğüne sahip bir görüntü seçin ve ardından bu görüntüyü dışa aktarın.
20. Lekeyi hareket ettirmeden önce, merdivenin konumunu yakalamak için görüntüleyiciyi kullanarak lekenin fotoğrafını çekin. Ardından, bu görüntüyü de dışa aktarın.
21. Bir slayt hazırlama yazılımı (PowerPoint gibi) kullanarak, bantları ve merdiven görüntülerini tek bir görüntü oluşturacak şekilde hizalayın.

İmmünopresipitasyon veya IP, protein karakterizasyonu için bir hücre veya doku lizatından veya bir vücut sıvısından ilgilenilen bir proteini izole etmek veya protein-protein etkileşimlerini araştırmak için yaygın olarak kullanılan bir tekniktir.

İşlem, hedef protein için yüksek bir afiniteye ve özgüllüğe sahip bir antikorla başlar. Bu antikor, numune ile karıştırılarak antikor-hedef komplekslerinin oluşmasına izin verir. Hedef proteine bağlı herhangi bir protein, işlem sırasında dolaylı olarak antikora da bağlanır. Daha sonra, çözelti, sabit antikor bölgesi için güçlü bir afiniteye sahip olan bir bakteri proteinine konjuge edilmiş agaroz boncukları ile inkübe edilir. Bakteri proteini antikora bağlanır ve antikor-hedef komplekslerini boncuklara bağlar. Daha sonra, çözelti boncukları çökeltmek için santrifüjlenir, böylece bağlayıcı antikor, hedef protein ve herhangi bir etkileşimli proteini içeren tüm kompleks ekstrakte edilir. Son olarak, bağlı proteinler boncuklardan ekstrakte edilir ve birbirlerinden salınır ve Western blotlama gibi tekniklerle daha ileri analizler için kullanılır.

Bu tekniğin farklı bölümlerinin çeşitli varyasyonları, ön temizleme, peptit etiketleri veya manyetik boncuklar kullanma veya diğer protein olmayan bağlayıcı ortakları analiz etme gibi yaygın olarak kullanılır. IP'den önce, numunedeki spesifik olmayan antikor bağlayıcı proteinleri çıkarmak ve arka planı en aza indirmek için bir ön temizleme adımı gelebilir. Bu, önce numunenin izotip kontrol antikorları ile inkübe edilmesini, bu proteinlere bağlanmalarına izin verilmesini ve daha sonra kompleksleri çökeltmek için agaroz boncuklarının kullanılmasını içerir. Örnek daha sonra gerçek IP'ye ilerlemeye hazırdır.

Peptit etiketleri, IP için spesifik bir antikor mevcut değilse yararlıdır. Burada, hedef protein, bir peptit epitop etiketi içerecek şekilde genetik olarak değiştirilebilir ve etikete karşı bir antikor, ilgilenilen proteini dışarı çekebilir. Hedefi çökeltmek için genellikle agaroz yerine manyetik boncuklar kullanılır. Antikor-hedef kompleksine bağlandıktan sonra, numune tüpü, boncukları çözeltiden çıkaran güçlü bir manyetik alana yerleştirilir. Bu, santrifüjleme ihtiyacını ortadan kaldırır ve hızı ve rahatlığı artırır.

İmmünopresipitasyon ayrıca DNA veya RNA bağlayıcı proteinleri incelemek için kullanılır ve sırasıyla kromatin immünopresipitasyonu ve RNA immünopresipitasyonu olarak bilinir. Bu varyasyonlar, farklı deneysel uygulamalar için yöntemin sorun giderilmesi ve uyarlanması için kullanışlıdır. Bu videoda, bir hücre lizatının nasıl önceden temizleneceğini ve ilgilenilen bir proteini çıkarmak için immünopresipitasyonun nasıl gerçekleştirileceğini ve ardından deneyi doğrulamak için Western blot analizinin nasıl yapıldığını gözlemleyeceksiniz.

Başlamak için, önceden toplanmış hücreleri bir mikrosantrifüje yerleştirin ve üç dakika boyunca 13 bin rpm'de döndürün. Döndürmeyi takiben, süpernatanı çıkarın ve daha sonra hücreleri PMSF ile 500 mikrolitre lizis tamponu RIPA içinde yeniden süspanse edin. Şimdi, bir girdap ile birkaç hızlı darbe kullanarak hücreleri parçalayın ve ardından bir şırıngaya bağlı 25 gauge bir iğne ile lizatı birkaç kez aspire edin ve kabarcıklar oluşturmamaya dikkat edin. Hücreleri 15 dakika boyunca buzun üzerine yerleştirin. Numuneleri buz üzerinde inkübe ettikten sonra, lizatı dört santigrat derecede 15 dakika santrifüjleyin.

Yeni bir 1.5 mililitrelik mikrosantrifüj tüpünü etiketleyin. Döndürmenin ardından, süpernatanı yeni etiketlenmiş tüpe aktarın ve peleti atın. Daha sonra, lizata 20 mikrolitre Protein A/G PLUS-agaroz boncukları ve bir mikrogram izotip kontrol antikoru ekleyerek agaroz boncuklarına veya birincil antikora spesifik olmayan bir şekilde bağlanan kirleticilerin lizatını önceden temizleyin, bu örnekte bir fare IgG1 izotip kontrolüdür. Tüpü soğuk bir odada 30 dakika boyunca bir döndürücü üzerinde inkübe edin. Lizatı soğuk odada 30 dakika döndürdükten sonra, numuneyi 3200 rpm'de 30 saniye boyunca dört santigrat derecede santrifüjleyin. Tüpü santrifüjden çıkarın ve önceden temizlenmiş süpernatanı yeni etiketli 1.5 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Peleti atın.

Şimdi, bir Bradford testi yaparak hücre lizatının protein konsantrasyonunu belirleyin. Etiket yedi 1. 5 mililitrelik mikrosantrifüj tüpleri birden altıya kadar ve her tüpe 1000 mikrolitre Bradford reaktifinden numune alın ve alın. Tüplerin altısı, her tüpe çeşitli miktarlarda bilinen BSA ekleyerek standart bir eğri oluşturmak için kullanılacaktır. Eklenecek tutarlar bu tabloda listelenmiştir. Yedinci numune tüpüne, önceden temizlenmiş lizattan bir mikrolitre ekleyin. Yedi tüpün her birinden 200 mikrolitreyi düz tabanlı 96 oyuklu bir plakanın ayrı oyuklarına yerleştirin ve her bir numuneyi üç nüsha halinde tekrarlayın, böylece yedi numuneden oluşan üç sütun olur. Plakayı 595 nanometre dalga boyu kullanarak bir plaka okuyucuda okuyun. Excel'de standart bir eğri oluşturduktan sonra, önceden temizlenmiş lizatın protein konsantrasyonunu hesaplayın.

Daha sonra, iki adet 1.5 mililitrelik mikrosantrifüj tüpünü etiketleyin - biri kontrol ve diğeri test olarak, bu örnekte c-myc antikoru olacaktır. Bu tüplerin her birine 500 mikrogram önceden temizlenmiş lizat yerleştirin ve daha sonra lizis tamponu kullanarak her tüp için toplam hacmi 500 mikrolitreye getirin. Daha sonra, test grubu tüpüne iki mikrogram anti-c-myc antikoru ekleyin. Kontrol için, iki mikrogram fare IgG1 izotip kontrol antikoru ekleyin. Antikorlar tüplere eklendikten sonra, numuneleri soğuk bir odada bir döndürücüye yerleştirin ve iki saat inkübe edin. Şimdi agaroz boncuklarını ekleyin. Bunu yapmak için, bir pipet ucunun ucunu kesmeniz ve ardından bu modifiye ucu kullanarak her tüpe 200 mikrolitre Protein A/G PLUS-agaroz boncuk eklemeniz önerilir. Tüpleri gece boyunca soğuk odada bir döndürücü üzerinde inkübe edin.

İnkübasyonun ardından, tüpleri döndürücüden çıkarın ve boncukları aşağı çekmek için lizatları mikrosantrifüjde döndürün. Sıkma işlemi tamamlandıktan sonra, tüpleri santrifüjden çıkarın ve süpernatanı her tüpten aspire edin. Ardından, boncukları 500 mikrolitre 1X Dulbecco'nun PBS'sini kullanarak yıkayın. Tüpleri bir mikrosantrifüje yerleştirin ve dört santigrat derecede 30 saniye döndürün. Bunu takiben, süpernatanı çıkarın. Yıkama ve santrifüj adımlarını toplam iki kez olmak üzere bir kez daha tekrarlayın. Tüpleri mikrosantrifüjden çıkarın ve tamponu her tüpten aspire edin. Jel yükleme uçlarını kullanarak, boncuklardan kalan tamponu çıkarın ve bağlı proteini çıkarmak için boncukları buz üzerinde tutun.

Bu örnekte, protein, Western blot analizi için kaynatılarak SDS-PAGE çalışma tamponuna ayrıştırılır. Bunu yapmak için, boncukları beta-merkaptoetanol veya BME içeren 20 mikrolitre SDS-PAGE yükleme boyası içinde yeniden süspanse edin. İmmünokompleksleri boncuklardan ayırmak için numuneleri 95 santigrat derecede beş dakika kaynatın. Ardından, boncukları oda sıcaklığında 10 saniye boyunca maksimum hızda santrifüjleyin. Tüpleri mikrosantrifüjden çıkarın ve oda sıcaklığında bir rafta tutun. Jel yükleme uçlarını kullanarak, numuneleri boncuklardan dikkatlice pipetleyin ve bunları %4 ila 15 gradyanlı SDS-PAGE jelin kuyularına yükleyin. Numunelere ek olarak, bir protein merdiveni olan bir şeridin yanı sıra bir yükleme kontrolü görevi görmesi için önceden temizlenmiş lizat içeren bir şerit yükleyin. Jel yüklendikten sonra jeli 100 voltta çalıştırın.

Boya cephesi jelin dibine ulaştıktan sonra, bu yaklaşık bir saat sürmelidir, jeli durdurun ve PVDF zarının jel ile katot arasında olduğundan emin olarak bir Western blot sandviçi yapın. Western blot sandviçini transfer aparatına yerleştirin ve jel üzerindeki proteinleri 100 voltta bir saat boyunca zara aktarın. Transfer tamamlandıktan sonra, antikorların zara spesifik olmayan bir şekilde bağlanmasını önlemek için zarı beş mililitrelik bloğa yerleştirin. Oda sıcaklığında bir saat boyunca düşük ayarda sallayın. Zamanlayıcı çaldığında, engelleme arabelleğini çıkarın. Membrana tespit antikoru ile beş mililitre bloke edici tampon ekleyin. Burada, aşağı çekme için kullanılandan farklı bir anti-c-myc antikoru kullanılır.

Lekeyi gece boyunca, düşük ayarda bir külbütör üzerinde dört santigrat derecede inkübe edin. İnkübasyonun ardından, antikoru ve bloke edici tamponu çıkarın. Lekeyi, oda sıcaklığında beş dakika boyunca beş mililitre TBST kullanarak, düşük ayarda bir külbütör üzerinde yıkayın. Bu yıkama adımı, her yıkama için taze TBST kullanılarak toplam üç ila altı yıkama için iki ila beş kez tekrarlanmalıdır. Lekeye bir ila 1000 sekonder antikordan beş mililitre ve bloke edici tampon ekleyin. Bu durumda, ikincil antikor, HRP etiketli anti-tavşan hafif zinciridir. Lekeyi bir külbütör üzerinde düşük bir ayarda oda sıcaklığında bir tane için inkübe edin. Ardından, tamponu çıkarın ve lekeyi beş mililitre TBST ile yıkayın. Bu yıkamayı bir külbütör üzerinde düşük bir ayarda oda sıcaklığında beş dakika boyunca inkübe edin. Bu yıkamayı, her biri taze beş mililitre TBST ile toplam altı ila 12 yıkama için tekrarlayın. Önce sıvıyı lekeden dökerek son yıkamayı çıkarın. Ardından, cımbız kullanarak, fazla sıvıyı çıkarmak için lekenin kenarını bir laboratuvar mendilinin üzerine sürün ve ardından lekeyi yeni bir kaba koyun. Ardından, lekeyi 1X Kemilüminesan Tespit Reaktifi ile örtün ve bir dakika inkübe edin.

Hızlı bir şekilde çalışarak, fazla algılama reaktifini çıkarmak için lekenin kenarını bir laboratuvar mendilinin üzerine sürün ve ardından lekeyi Görüntüleyici tepsisinin görüntüleme yüzeyine yerleştirin. 10 ila 30 saniye arasında birden fazla zaman noktasını yakalamak için Kemilüminesan programını kullanarak görüntü. Leke görüntülendikten sonra, en uygun bant görünürlüğüne sahip bir görüntü seçin ve ardından bu görüntüyü dışa aktarın. Lekeyi hareket ettirmeden önce, merdivenin konumunu yakalamak için lekenin fotoğrafını çekmek için Görüntüleyiciyi kullanın. Ardından, bu görüntüyü de dışa aktarın. Son olarak, PowerPoint gibi bir slayt hazırlama yazılımı kullanarak, bantları ve merdiven görüntülerini tek bir görüntü oluşturacak şekilde hizalayın.

Bu görüntü, timosit hücrelerinden c-myc proteininin immünopresipitasyonu için Western blot sonucunu göstermektedir. Soldan sağa, şeritler izotip kontrolünü, c-myc IP'yi ve önceden temizlenmiş lizat girişini temsil eder. En sağdaki şerit, moleküler ağırlık merdiveninin birleştirilmiş bir görüntüsüdür. Yaklaşık 25 kilodaltonluk güçlü bant, hafif zincirden ve 50 kilodaltondaki bant, bağlayıcı antikorun ağır zincirinden gelir ve IP'ye veya numunelere spesifik değildir. C-myc, Batı lekeleri üzerinde yaklaşık 67 kilodalton çalışır ve genellikle 75 kilodalton merdiven bandının hemen altında görülebilir. Bu lekede, c-myc bandı ikinci şeritte görünür, ancak birinci şeritte yoktur, bu da IP antikorunun c-myc'yi başarıyla aşağı çektiğini gösterir. Önceden temizlenmiş lizat şeridinde görünür bir bant yoktur, bu da bu proteinin düşük endojen ekspresyon seviyelerine sahip olduğunu düşündürür.