Evlat Edinen Hücre Transferi: Donör fare splenositlerinin bir konakçı fareye tanıtılması ve FACS ile başarının değerlendirilmesi
Kaynak: Meunier Sylvain1,2,3, Perchet Thibaut1,2,3, Sophie Novault4, Rachel Golub1,2,3
1 Lenfopoez Ünitesi, İmmünoloji Anabilim Dalı, Pasteur Enstitüs…
1. Hazırlık
- Başlamadan önce laboratuvar eldivenleri ve uygun koruyucu giysiler giyin.
- Tüm diseksiyon aletlerini önce bir deterjanla ve ardından %70 etanol ile sterilize edin ve ardından iyice kurulayın.
- % 2 fetal buzağı serumu (FCS) içeren 50 mL Hank'in dengeli tuz çözeltisi (HBSS) hazırlayın.
2. Diseksiyon
- Bir karbondioksit dağıtım sistemi kullanarak, fareyi hipoksi ile ötenazi yapın. Ötenazi fareyi sırtüstü pozisyonda bir diseksiyon plakasına sabitleyin ve makas ve forseps kullanarak uzunlamasına laparotomi yapın.
- Forseps kullanarak, mide ve dalağı ortaya çıkarmak için bağırsakları ve mideyi karnın sağ tarafında hareket ettirin. Dalak mideye yapışıktır.
- Forseps kullanarak dalağı mideden dikkatlice ayırın ve 5 mL HBSS% 2 FCS içeren Petri kabına yerleştirin.
3. Bağışıklık Hücresi İzolasyonu
- Dalağı Petri kabının üzerine 40 μm'lik bir hücre süzgecine yerleştirin. Dalağı ayırmak için bir pistonla ezin.
- Pistonu ve süzgeci 1 mL HBSS %2 FCS ile durulayarak yapışan hücreleri geri kazanın.
- Ayrışmış dalağı ve sıvıyı 15 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın.
- Petri kabını 5 mililitre HBSS% 2 FCS ile yıkayın ve sıvıyı 15 mL'lik tüpe aktarın.
- Tüpü 370 x g sıcaklıkta 10°C'de 7 dakika santrifüjleyin ve peletten kaçınarak süpernatanı atın.
- Peletleri yeniden süspanse etmek ve eritrositleri parçalamak için peleti 2 mL potasyum amonyum klorür pipetinde yukarı ve aşağı yeniden süspanse edin.
- 2 dakika bekleyin ve 2 mL'ye kadar hacim elde etmek için yeniden askıya alınan pelete HBSS% 14 FCS ekleyin.
- Tüpü 370 x g'de 10°C'de 7 dakika boyunca tekrar santrifüjleyin. Süpernatanı atın ve peleti yukarı ve aşağı pipetleyerek 5 mL HBSS %2 FCS'de yeniden süspanse edin.
- Tripan mavisi boyama testi kullanarak hücreleri sayın ve uygun hacimde HBSS% 2 FCS kullanarak nihai hücre konsantrasyonunu 10 7 hücre / mL'ye ayarlayın.
4. Evlat Edinme Transferi
- 5 mL'lik bir toplama tüpünde elde edilen 2 mL hücre süspansiyonunu aktarın.
- Tüpü 370 x g'de 10°C'de 7 dakika santrifüjleyin ve ardından süpernatanı atın.
- Peleti 2 mL PBS'de yeniden süspanse edin ve tüpü 370 x g'de 10°C'de 7 dakika santrifüjleyin.
- Süpernatanı atın ve peleti 200 μL PBS'de yeniden süspanse edin.
- 29G iğneli 0.5 mL'lik bir şırınga kullanarak, deneysel fareye intravenöz olarak retro-orbital kan sinüsüne 200 μL hücre süspansiyonu enjekte edin.
- Kontrol olarak, aynı kan sinüsüne 200 μL fosfat tamponlu salin ile ikinci bir fare enjekte edin.
5. Hücre Hasadı ve Boyama
- Evlat edinme transferinden dört gün sonra, farelere ötenazi yapın ve dalağı çıkarın.
- Splenositleri bölüm 3'te anlatıldığı gibi hasat edin.
- Her fareden 100 μL hücre süspansiyonunu "kontrol" ve "aktarıldı" olarak etiketlenmiş iki FACS tüpüne aktarın.
- Tüpü 370 x g'de 10°C'de 7 dakika santrifüjleyin ve ardından süpernatanları atın.
- Tablo 1'de listelenen seyreltmelerde dört antikoru içeren bir karışım hazırlayın.
| Antikorlar | Florokrom | Seyreltme |
| CD45.1 | BV711 | 1/200 |
| CD45.2 | APCCy7 | 1/400 |
| CD4 | BV786 | 1/1600 |
| CD3 | BV421 | 1/200 |
Tablo 1: Antikorlar karışım bileşimi. Konsantre antikor-floresan konjugatlar ve HBSS kullanılarak dört antikor kokteyli hazırlanması.
- Her tüpe 100 μL karışım ekleyin ve ardından karanlıkta buz üzerinde 20 dakika inkübe edin.
- 1 mL HBSS %2 FCS ekleyin ve ardından tüpleri 370 x g'da 10°C'de 3 dakika santrifüjleyin.
- Süpernatanları atın ve peletleri 200 μL HBSS %2 FCS'de yeniden süspanse edin.
- Yeniden süspanse edilmiş hücreleri yeni, etiketli FACS tüplerine aktarın.
- FACS protokolünde gösterildiği gibi akış sitometrisi kullanarak, CD45.2 pozitif lenfositlerin varlığını değerlendirin.
6. Veri Analizi
- "FlowJo" yazılımını açın ve her tüp için dosyaları "All sample" penceresine sürükleyin.
- "transferred" dosyasına çift tıklayarak bu örnekten kaydedilen hücreleri, Y ekseninde ileri saçılma "SSC-A" ve X ekseninde "FSC-A" yan saçılımı görüntüleyen bir nokta grafiğinde görüntüleyin.
- "poligon" üzerine tıklayın ve lenfositleri seçmek için bir geçit stratejisi oluşturun, ardından hücre yüzey belirteçlerini (CD45.1, CD45.2) kullanarak donör ve konakçı hücreleri ayırt edin ve ardından CD45.2+ hücre popülasyonunu (CD3, CD4) karakterize edin.
- Analiz adımlarını "control mouse" dosyası ile tekrarlayın.
- Bir hücre popülasyonunu görselleştirmek için "Layout editor" üzerine tıklayın.
- "aktarılan" ve "control" dosyalarından "aktarılan hücreler" ve "aktarılan CD4 hücreleri}" popülasyonunu " Düzen Düzenleyici sekmesi" içine sürükleyin.
- CD45.2+ hücrelerini ve CD4 lenfositlerini temsil eden bir nokta grafiği görünecektir.
- CD45.2 aktarılan hücreler yalnızca " aktarılan fare" nokta grafiğinde görünmelidir.
Evlat edinen hücre transferi, ilgilenilen hücreleri bir organizmaya sokmak için bir yöntemdir. Belirli bağışıklık hücresi sınıflarının etkisi de dahil olmak üzere çeşitli biyolojik mekanizmaları incelemek için güçlü bir tekniktir. Ek olarak, evlat edinme transferi, kemik iliği nakli veya hastanın kendi T hücrelerinin çıkarılabildiği, kanserli hücreleri tanımak ve yok etmek için değiştirilebildiği ve daha sonra tümörlerle savaşmak için vücuda geri gönderilebildiği kanser tedavileri gibi çok sayıda durum için umut verici yeni bir tedavidir.
Laboratuvarda, evlat edinme transferini incelemek için genellikle hayvan modelleri kullanılır. Örneğin, CD45.1 Rag gama-c nakavt fareleri, hematopoietik kök hücrelerin lenfositlere normal farklılaşması için gerekli olan birçok sitokin için temel reseptörlerden yoksundur. Sonuç olarak, nakavt fareler tehlikeye atılmış bir lenfosit gelişimine sahiptir ve doğal öldürücü veya NK hücrelerine, T hücrelerine veya B hücrelerine sahip değildir.
Evlat edinme transferi, önce dalak gibi yüksek konsantrasyonlarda bağışıklık hücreleri içeren donör fare dokusunu toplayarak, eksik bağışıklık hücrelerini bu tehlikeye atılmış farelere sokmak için kullanılabilir. Doku daha sonra ayrışır ve bağışıklık hücreleri de dahil olmak üzere çeşitli dalak hücreleri izole edilir. Daha sonra, istenmeyen eritrositler veya kırmızı kan hücreleri, amonyum klorür potasyum parçalama tamponu ilavesiyle parçalanabilir ve kalan beyaz kan hücreleri veya splenositler daha sonra santrifüjleme kullanılarak hücre kalıntılarından ayrılır.
Son olarak, saflaştırılmış splenositler, bağışıklığı baskılanmış farelere enjekte edilir ve bu hücrelerin işlevlerinin ayrıntılı çalışmalarını kolaylaştırır. Birkaç gün sonra, evlat edinen bağışıklık hücresi transferinin başarısı, önce konakçı splenonsitlerin donör doku ile aynı şekilde izole edilmesi ve hazırlanmasıyla doğrulanabilir. Daha sonra, bu hücreler, donör bağışıklık hücresi belirteçlerine karşı etiketli antikorlar kullanılarak boyanır, böylece FACS kullanılarak doğrulanabilir ve sıralanabilirler.
Başlamak için laboratuvar eldivenleri ve uygun koruyucu ekipman giyin. Daha sonra, bir çift forseps ve diseksiyon makasını önce bir deterjanla ve sonra% 70 etanol ile yıkayın ve ardından temiz bir kağıt havluyla kurulayın. 50 mililitrelik bir tüpte bir mililitre FCS'yi 49 mililitre HBSS ile birleştirerek% 2 Fetal Buzağı Serumu veya FCS ile 50 mililitre Hank'in Dengeli Tuz Çözeltisi veya HBSS hazırlayın. Solüsyonu yaklaşık 10 kez hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyerek karıştırın.
Ötenazi uygulanmış fareyi inceleyin ve dalak B lenfositlerinin ayrılması için JoVE video protokolü FACS teknolojisinde gösterildiği gibi dalağını çıkarın. Bağışıklık hücrelerini izole etmek için önce dalağı bir petri kabındaki 40 mikrometrelik bir hücre süzgecine yerleştirin. Dalağı tabağa ayırmak için bir pistonla ezin. Pistonu ve süzgeci 1 mililitre HBSS% 2 FCS ile durulayarak yapışan hücreleri geri kazanın. Ardından, ayrışmış dalağı ve sıvıyı petri kabından 50 mililitrelik bir santrifüj tüpüne pipetleyin. Petri kabını 5 mililitre HBSS% 2 FCS ile yıkayın ve sıvıyı 15 mililitrelik tüpe aktarın.
Tüpü 10 santigrat derecede yedi dakika boyunca 370 kez g'de santrifüjleyin ve ardından peleti rahatsız etmemek için tüpü dikkatlice geri alın. Şimdi, peleti rahatsız etmeden süpernatanı çıkarın ve sıvıyı uygun bir atık kabına atın. Ardından, santrifüj tüpüne iki mililitre amonyum klorür potasyum parçalama tamponu ekleyin ve peleti yeniden süspanse etmek ve eritrositleri parçalamak için yukarı ve aşağı pipetleyin. İki dakika bekleyin ve ardından toplam 2 mililitre değeri elde etmek için yeniden askıya alınan pelete HBSS% 14 FCS ekleyin. Santrifüjlemeyi tekrarlayın. Tüpü dikkatlice alın ve süpernatanı atın. Ardından, peleti yukarı ve aşağı pipetleyerek 5 mililitre HBSS %2 FCS'de yeniden süspanse edin. Ardından, askıya alınan hücreleri sayın. Beş mikrolitre hücre süspansiyonuna beş mikrolitre tripan mavisi ekleyin ve pipetleyerek iyice karıştırın. Ardından, kapak camı ile Malassez lamı arasına beş mikrolitrelik bir seyreltilmiş hücre süspansiyonu damlasını nazikçe bırakın. Mikroskop 40X büyütmeye ayarlıyken, hücre sayısını sayın. Uygun hacimde HBSS% 2 FCS ekleyerek hücre konsantrasyonunu mililitrede yedi hücreye 10 ila 10 olarak ayarlayın.
Evlat edinme transferine başlamak için, hücre süspansiyonunun iki mililitresini beş mililitrelik bir toplama tüpüne aktarın. Tüpü 10 santigrat derecede yedi dakika boyunca 370 kez g'de santrifüjleyin ve ardından süpernatanı atın. Daha sonra, peleti iki mililitre fosfat tamponlu salin içinde yeniden süspanse edin ve tüpü 10 santigrat derecede yedi dakika boyunca 370 kez g'de santrifüjleyin. Süpernatanı atın. Ardından, peleti 200 mikrolitre fosfat tamponlu tuzlu su içinde yeniden süspanse edin. 29 gauge iğne ile 0.5 mililitrelik bir şırınga kullanarak, deneysel fareye intravenöz olarak retro-orbital kan sinüsüne 200 mikrolitre hücre süspansiyonu enjekte edin.
Evlat edinme transferinden dört gün sonra, farelere ötenazi yapın ve dalakları çıkarın. Ardından, bağışıklık hücrelerini üçüncü bölümde anlatıldığı gibi hasat edin. Daha sonra, her fareden 100 mikrolitre hücre süspansiyonunu kontrol etiketli ve aktarılan iki FACS tüpüne aktarın. Tüpleri 10 santigrat derecede yedi dakika boyunca 370 kez g'de santrifüjleyin ve ardından süpernatanları atın. Şimdi, tablo bir'de listelenen seyreltmede dört antikoru içeren bir karışım hazırlayın. Her tüpe 100 mikrolitre karışım ekleyin ve ardından karanlıkta buz üzerinde 20 dakika inkübe edin. Daha sonra, her tüpe bir mililitre HBSS% 2 FCS ekleyin ve ardından tüpleri 10 santigrat derecede üç dakika boyunca 370 kez g'de santrifüjleyin. Süpernatanları atın ve ardından peletleri 200 mikrolitre HBSS %2 FCS içinde yeniden süspanse edin. Yeniden süspanse edilmiş hücreleri yeni etiketli FACS tüplerine aktarın. Şimdi, CD45'in varlığını değerlendirmek için FACS protokolünde gösterildiği gibi akış sitometrisini kullanın. 2 pozitif lenfosit.
Şimdi CD45'ten izole edilen CD45.2 lenfositlerinin varlığını belirleyeceğiz. 1 konak dalak. Başlamak için FlowJo simgesine çift tıklayın ve tüm örnek penceresindeki her tüp için dosyaları sürükleyin. Ardından, bu örnekten kaydedilen hücreleri, x ekseninde ileri saçılma FSCA'sını ve y ekseninde yan saçılma SSCA'sını görüntüleyen bir nokta grafiğinde görüntülemek için aktarılan dosyaya çift tıklayın. Lenfosit popülasyonlarını daire içine almak için çokgene tıklayın. Yeni bir alt nüfus tanımlama penceresi görüntülenir. Tamam'a tıklayın. Şimdi, y eksenini FSC-W ve x eksenini FSC-A olarak ayarlayın. Daha önce gösterildiği gibi çokgen aracıyla tek hücre popülasyonunu seçin.
Ardından, seçilen hücreler için yeni bir pencere oluşturmak için daire içine alınmış popülasyona çift tıklayın. Yeni pencerede, Y'de CD45.2'yi ve X'te CD45.1'i seçin. T simgesine tıklayın ve grafiği büyütmek için ekseni özelleştirin. Ardından, CD45.2 pozitif hücrelerini daire içine almak için çokgene tıklayın. Alt popülasyon tanımlama penceresinde, hücre popülasyonu aktarılan hücrelere bir ad verin ve Tamam'a tıklayın. Aynı pencerede, CD45.2 negatif hücrelerini seçmek için dikdörtgene tıklayın. Alt popülasyon tanımlama penceresinde, hücre popülasyonunuzu konak hücreleri olarak adlandırın ve Tamam'ı tıklatın. Ardından, seçilen hücreler için yeni bir pencere oluşturmak için CD45.2 daire içine alınmış popülasyona, aktarılan popülasyona çift tıklayın. Yeni pencerede, Y'de CD3'ü ve X'te CD4'ü seçin.
Ardından, CD4 CD3 pozitif hücrelerini daire içine almak için çokgene tıklayın. Bu alt popülasyon tanımlama penceresinde, hücre popülasyonu aktarılan CD4 hücrelerinizi adlandırın. Ardından, kontrol faresi dosyasıyla önceki analiz adımlarını tekrarlayın. Son olarak, hücre popülasyonlarınızı görselleştirmek için Düzen Düzenleyici'ye tıklayın. Aktarılan hücreleri ve aktarılan CD4 hücre popülasyonunu, aktarılan ve kontrol dosyalarından Düzen Düzenleyicisi sekmesine sürükleyin. CD45.2 pozitif hücreleri ve CD4 lenfositlerini temsil eden bir nokta grafiği görünecektir. CD45 olarak adlandırılır. 2 Aktarılan hücreler yalnızca aktarılan fare nokta grafiğinde görünmelidir.
View the full transcript and gain access to JoVE Science Education videos
Q1: What is adoptive cell transfer and why is it used in research?
Adoptive cell transfer is a method for introducing cells into an organism to study biological mechanisms or treat disease. It enables researchers to examine specific immune cell functions, study hematopoiesis, and test novel therapies like cancer treatments where patient T-cells are extracted, modified to recognize tumors, and returned to fight cancer. Animal models allow detailed investigation of transferred cell behavior and efficacy.
Q2: Why are CD45.1 Rag gamma-c knockout mice used in adoptive transfer studies?
CD45.1 Rag gamma-c knockout mice lack fundamental cytokine receptors essential for normal lymphocyte development, resulting in compromised immune systems without natural killer cells, T-cells, or B-cells. These immunocompromised mice serve as ideal recipients for adoptive transfer because they allow researchers to study how donor immune cells establish and function in a lymphocyte-deficient host.
Q3: How are splenocytes isolated and purified from donor tissue?
The spleen is dissociated using a cell strainer and plunger to release cells into suspension. Unwanted erythrocytes are lysed using ammonium chloride potassium lysing buffer, and centrifugation separates white blood cells from debris. The resulting purified splenocytes are counted using trypan blue and adjusted to the desired concentration before transfer into recipient mice.
Q4: What is the role of flow cytometry in confirming successful adoptive transfer?
Flow cytometry using fluorescence-activated cell sorting (FACS) confirms transfer success by detecting donor cells in the host spleen. Labeled antibodies against donor markers like CD45.2 distinguish transferred cells from host cells. The technique allows researchers to identify specific lymphocyte populations, such as CD4 T-cells, and verify their presence and distribution in recipient mice.
Q5: How is the cell suspension prepared before intravenous injection into recipient mice?
The cell suspension is centrifuged and resuspended in phosphate buffered saline through two sequential wash steps. The final pellet is resuspended in 200 microliters of phosphate buffered saline. Using a 0.5 milliliter syringe with a 29-gauge needle, 200 microliters of this purified cell suspension is injected intravenously into the retro-orbital blood sinus of the recipient mouse.
Q6: What does the FACS analysis reveal about transferred versus host lymphocytes?
FACS analysis distinguishes CD45.2 positive transferred cells from CD45.1 positive host cells using dot plots. Transferred cells appear only in the transferred mouse sample, not in control mice receiving phosphate buffered saline alone. Further analysis identifies specific transferred lymphocyte subsets, such as CD4 T-cells, demonstrating both successful engraftment and the phenotype of donor cells within the host.
Q7: What compatibility factors must be considered before performing adoptive cell transfer?
Host and donor compatibility is crucial to ensure cell adoption without rejection. In this protocol, CD45.2 donor splenocytes are transferred into CD45.1 Rag gamma-c recipient mice, allowing discrimination between donor and host cells. This genetic distinction enables researchers to track transferred cells and assess their integration, survival, and function within the immunocompromised host environment.