$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Evlat edinen hücre transferi, ilgilenilen hücreleri bir organizmaya sokmak için bir yöntemdir. Belirli bağışıklık hücresi sınıflarının etkisi de dahil olmak üzere çeşitli biyolojik mekanizmaları incelemek için güçlü bir tekniktir. Ek olarak, evlat edinme transferi, kemik iliği nakli veya hastanın kendi T hücrelerinin çıkarılabildiği, kanserli hücreleri tanımak ve yok etmek için değiştirilebildiği ve daha sonra tümörlerle savaşmak için vücuda geri gönderilebildiği kanser tedavileri gibi çok sayıda durum için umut verici yeni bir tedavidir.
Laboratuvarda, evlat edinme transferini incelemek için genellikle hayvan modelleri kullanılır. Örneğin, CD45.1 Rag gama-c nakavt fareleri, hematopoietik kök hücrelerin lenfositlere normal farklılaşması için gerekli olan birçok sitokin için temel reseptörlerden yoksundur. Sonuç olarak, nakavt fareler tehlikeye atılmış bir lenfosit gelişimine sahiptir ve doğal öldürücü veya NK hücrelerine, T hücrelerine veya B hücrelerine sahip değildir.
Evlat edinme transferi, önce dalak gibi yüksek konsantrasyonlarda bağışıklık hücreleri içeren donör fare dokusunu toplayarak, eksik bağışıklık hücrelerini bu tehlikeye atılmış farelere sokmak için kullanılabilir. Doku daha sonra ayrışır ve bağışıklık hücreleri de dahil olmak üzere çeşitli dalak hücreleri izole edilir. Daha sonra, istenmeyen eritrositler veya kırmızı kan hücreleri, amonyum klorür potasyum parçalama tamponu ilavesiyle parçalanabilir ve kalan beyaz kan hücreleri veya splenositler daha sonra santrifüjleme kullanılarak hücre kalıntılarından ayrılır.
Son olarak, saflaştırılmış splenositler, bağışıklığı baskılanmış farelere enjekte edilir ve bu hücrelerin işlevlerinin ayrıntılı çalışmalarını kolaylaştırır. Birkaç gün sonra, evlat edinen bağışıklık hücresi transferinin başarısı, önce konakçı splenonsitlerin donör doku ile aynı şekilde izole edilmesi ve hazırlanmasıyla doğrulanabilir. Daha sonra, bu hücreler, donör bağışıklık hücresi belirteçlerine karşı etiketli antikorlar kullanılarak boyanır, böylece FACS kullanılarak doğrulanabilir ve sıralanabilirler.
Başlamak için laboratuvar eldivenleri ve uygun koruyucu ekipman giyin. Daha sonra, bir çift forseps ve diseksiyon makasını önce bir deterjanla ve sonra% 70 etanol ile yıkayın ve ardından temiz bir kağıt havluyla kurulayın. 50 mililitrelik bir tüpte bir mililitre FCS'yi 49 mililitre HBSS ile birleştirerek% 2 Fetal Buzağı Serumu veya FCS ile 50 mililitre Hank'in Dengeli Tuz Çözeltisi veya HBSS hazırlayın. Solüsyonu yaklaşık 10 kez hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyerek karıştırın.
Ötenazi uygulanmış fareyi inceleyin ve dalak B lenfositlerinin ayrılması için JoVE video protokolü FACS teknolojisinde gösterildiği gibi dalağını çıkarın. Bağışıklık hücrelerini izole etmek için önce dalağı bir petri kabındaki 40 mikrometrelik bir hücre süzgecine yerleştirin. Dalağı tabağa ayırmak için bir pistonla ezin. Pistonu ve süzgeci 1 mililitre HBSS% 2 FCS ile durulayarak yapışan hücreleri geri kazanın. Ardından, ayrışmış dalağı ve sıvıyı petri kabından 50 mililitrelik bir santrifüj tüpüne pipetleyin. Petri kabını 5 mililitre HBSS% 2 FCS ile yıkayın ve sıvıyı 15 mililitrelik tüpe aktarın.
Tüpü 10 santigrat derecede yedi dakika boyunca 370 kez g'de santrifüjleyin ve ardından peleti rahatsız etmemek için tüpü dikkatlice geri alın. Şimdi, peleti rahatsız etmeden süpernatanı çıkarın ve sıvıyı uygun bir atık kabına atın. Ardından, santrifüj tüpüne iki mililitre amonyum klorür potasyum parçalama tamponu ekleyin ve peleti yeniden süspanse etmek ve eritrositleri parçalamak için yukarı ve aşağı pipetleyin. İki dakika bekleyin ve ardından toplam 2 mililitre değeri elde etmek için yeniden askıya alınan pelete HBSS% 14 FCS ekleyin. Santrifüjlemeyi tekrarlayın. Tüpü dikkatlice alın ve süpernatanı atın. Ardından, peleti yukarı ve aşağı pipetleyerek 5 mililitre HBSS %2 FCS'de yeniden süspanse edin. Ardından, askıya alınan hücreleri sayın. Beş mikrolitre hücre süspansiyonuna beş mikrolitre tripan mavisi ekleyin ve pipetleyerek iyice karıştırın. Ardından, kapak camı ile Malassez lamı arasına beş mikrolitrelik bir seyreltilmiş hücre süspansiyonu damlasını nazikçe bırakın. Mikroskop 40X büyütmeye ayarlıyken, hücre sayısını sayın. Uygun hacimde HBSS% 2 FCS ekleyerek hücre konsantrasyonunu mililitrede yedi hücreye 10 ila 10 olarak ayarlayın.
Evlat edinme transferine başlamak için, hücre süspansiyonunun iki mililitresini beş mililitrelik bir toplama tüpüne aktarın. Tüpü 10 santigrat derecede yedi dakika boyunca 370 kez g'de santrifüjleyin ve ardından süpernatanı atın. Daha sonra, peleti iki mililitre fosfat tamponlu salin içinde yeniden süspanse edin ve tüpü 10 santigrat derecede yedi dakika boyunca 370 kez g'de santrifüjleyin. Süpernatanı atın. Ardından, peleti 200 mikrolitre fosfat tamponlu tuzlu su içinde yeniden süspanse edin. 29 gauge iğne ile 0.5 mililitrelik bir şırınga kullanarak, deneysel fareye intravenöz olarak retro-orbital kan sinüsüne 200 mikrolitre hücre süspansiyonu enjekte edin.
Evlat edinme transferinden dört gün sonra, farelere ötenazi yapın ve dalakları çıkarın. Ardından, bağışıklık hücrelerini üçüncü bölümde anlatıldığı gibi hasat edin. Daha sonra, her fareden 100 mikrolitre hücre süspansiyonunu kontrol etiketli ve aktarılan iki FACS tüpüne aktarın. Tüpleri 10 santigrat derecede yedi dakika boyunca 370 kez g'de santrifüjleyin ve ardından süpernatanları atın. Şimdi, tablo bir'de listelenen seyreltmede dört antikoru içeren bir karışım hazırlayın. Her tüpe 100 mikrolitre karışım ekleyin ve ardından karanlıkta buz üzerinde 20 dakika inkübe edin. Daha sonra, her tüpe bir mililitre HBSS% 2 FCS ekleyin ve ardından tüpleri 10 santigrat derecede üç dakika boyunca 370 kez g'de santrifüjleyin. Süpernatanları atın ve ardından peletleri 200 mikrolitre HBSS %2 FCS içinde yeniden süspanse edin. Yeniden süspanse edilmiş hücreleri yeni etiketli FACS tüplerine aktarın. Şimdi, CD45'in varlığını değerlendirmek için FACS protokolünde gösterildiği gibi akış sitometrisini kullanın. 2 pozitif lenfosit.
Şimdi CD45'ten izole edilen CD45.2 lenfositlerinin varlığını belirleyeceğiz. 1 konak dalak. Başlamak için FlowJo simgesine çift tıklayın ve tüm örnek penceresindeki her tüp için dosyaları sürükleyin. Ardından, bu örnekten kaydedilen hücreleri, x ekseninde ileri saçılma FSCA'sını ve y ekseninde yan saçılma SSCA'sını görüntüleyen bir nokta grafiğinde görüntülemek için aktarılan dosyaya çift tıklayın. Lenfosit popülasyonlarını daire içine almak için çokgene tıklayın. Yeni bir alt nüfus tanımlama penceresi görüntülenir. Tamam'a tıklayın. Şimdi, y eksenini FSC-W ve x eksenini FSC-A olarak ayarlayın. Daha önce gösterildiği gibi çokgen aracıyla tek hücre popülasyonunu seçin.
Ardından, seçilen hücreler için yeni bir pencere oluşturmak için daire içine alınmış popülasyona çift tıklayın. Yeni pencerede, Y'de CD45.2'yi ve X'te CD45.1'i seçin. T simgesine tıklayın ve grafiği büyütmek için ekseni özelleştirin. Ardından, CD45.2 pozitif hücrelerini daire içine almak için çokgene tıklayın. Alt popülasyon tanımlama penceresinde, hücre popülasyonu aktarılan hücrelere bir ad verin ve Tamam'a tıklayın. Aynı pencerede, CD45.2 negatif hücrelerini seçmek için dikdörtgene tıklayın. Alt popülasyon tanımlama penceresinde, hücre popülasyonunuzu konak hücreleri olarak adlandırın ve Tamam'ı tıklatın. Ardından, seçilen hücreler için yeni bir pencere oluşturmak için CD45.2 daire içine alınmış popülasyona, aktarılan popülasyona çift tıklayın. Yeni pencerede, Y'de CD3'ü ve X'te CD4'ü seçin.
Ardından, CD4 CD3 pozitif hücrelerini daire içine almak için çokgene tıklayın. Bu alt popülasyon tanımlama penceresinde, hücre popülasyonu aktarılan CD4 hücrelerinizi adlandırın. Ardından, kontrol faresi dosyasıyla önceki analiz adımlarını tekrarlayın. Son olarak, hücre popülasyonlarınızı görselleştirmek için Düzen Düzenleyici'ye tıklayın. Aktarılan hücreleri ve aktarılan CD4 hücre popülasyonunu, aktarılan ve kontrol dosyalarından Düzen Düzenleyicisi sekmesine sürükleyin. CD45.2 pozitif hücreleri ve CD4 lenfositlerini temsil eden bir nokta grafiği görünecektir. CD45 olarak adlandırılır. 2 Aktarılan hücreler yalnızca aktarılan fare nokta grafiğinde görünmelidir.
