Hücre Ölümü Testi: Sitotoksik Yeteneğin Krom Salınım Testi

Bu videoda, krom salınım testinin nasıl gerçekleştirileceğini gözlemleyecek ve efektör hücrelerin sitotoksik potansiyelinin nasıl belirleneceğini göreceksiniz.

Bağışıklık hücreleri, bağışıklık tepkisinin ayrılmaz bir parçası olan kanser veya virüsle enfekte olmuş hücreler gibi potansiyel olarak zararlı hücrelerin vücuttan tanımlanmasından ve uzaklaştırılmasından sorumludur. T hücreleri ve NK hücreleri gibi çeşitli bağışıklık hücreleri, hedef hücreleri tanımlama ve bu hedef hücrelerin protein bozulmasına, parçalanmasına ve ölümüne neden olan proteinleri salgılama yeteneği olan sitotoksik potansiyel olarak bilinen bir özelliğe sahiptir. Sitotoksik potansiyelin ölçülmesi, bağışıklık hücresi aktivasyonunu ve gücünü ölçmek için kritik öneme sahiptir ve krom salınım testi bu amaç için yaygın olarak kullanılır.

Bu yöntem, kullanıcıların farklı koşullar altında belirli bağışıklık hücresi türleri tarafından indüklenen sitoksisiteyi karşılaştırmasını sağlar, bu da kanser immünoterapisi ve bağışıklıkla ilgili hastalıkları incelemek için değerlidir. Başlamak için, hedef hücreler, kanser hücreleri gibi, hücreler tarafından alınan radyoaktif bir izotop olan krom 51 ile inkübe edilir. Daha sonra, bu radyo etiketli hücreler, iki hücre tipi arasındaki etkileşimi kolaylaştırmak için yuvarlak tabanlı, 96 oyuklu bir plaka içinde, efektör hücreler olarak da adlandırılan izole edilmiş bağışıklık hücreleri ile birlikte kültürlenir.

Testin genel kurulumu, uygun kontrollerle birlikte farklı bağışıklık hücresi konsantrasyonları ile belirli sayıda hedef hücrenin inkübe edilmesini içerir. Ko-kültür, efektör hücrelerin hedef hücrelerde apoptoz ve lizisi indüklemesine izin verir, bu da hücre içi krom 51'in süpernatana salınmasına neden olur. Daha sonra, önceden optimize edilmiş bir zaman noktasında, salınan kromu içeren süpernatant tüm kuyucuklardan hasat edilir. Radyoaktif olan krom 51, gama radyasyonu yaymak için kendiliğinden radyoaktif bozunmaya uğrar. Tahlil plakasındaki tüm kuyucuklardan gelen süpernatantlardaki gama radyasyon seviyeleri, hedef hücrelerin parçalanmasının ölçülebilir bir çıktısını temsil eder. Bu, daha sonra bağışıklık hücrelerinin sitotoksik potansiyelini belirlemek için kullanılan bir gama sayacı kullanılarak ölçülür.

Başlamak için, hedef hücreler, bu örnekte insan melanom hücre hattı WM793, tek hücreli bir süspansiyon halinde hazırlanır. Bunu yapmak için, önce ortamı doku kültürü şişesinden çıkarın ve hücreleri beş mililitre 1X PBS ile yıkayın. PBS'yi boşaltın ve ardından yaklaşık iki dakika boyunca plakaya bir mililitre tripsin ekleyin. Şişenin yüzeyindeki hücreleri gevşetmek için şişeye hafifçe vurun ve ardından şişeye beş mililitre RPMI ortamı ekleyin. Hücreleri toplamak için ortamı yukarı ve aşağı pipetleyin ve bu süspansiyonu 15 mililitrelik konik bir tüpe ekleyin.

Tüpü 1200 RPM'de beş dakika boyunca santrifüje yerleştirin. Sonraki, hücre peletini bozmamaya dikkat ederek ortamı tüpten çıkarın. Hücre peletini bozmak için tüpün altını hafifçe vurun ve tüpe 10 mililitre ortam ekleyin. Ardından, hücreleri süspansiyon haline getirmek için ortamı nazikçe yukarı ve aşağı pipetleyin. Daha sonra, bir hemositometre kullanarak hücre konsantrasyonunu belirleyin ve orijinal hücre süspansiyonunun iki mililitresini yeni bir 15 mililitrelik konik tüpe aktarın. Tüpü bir santrifüje yerleştirin ve hücreleri beş dakika boyunca 12 yüz RPM'de peletleyin. Santrifüjlemeden sonra, fazla ortamı tüpten bir atık kabına dökün. Hücre peletini geride kalan küçük hacimdeki ortamda yeniden süspanse etmek için tüpü kısaca girdaplayın.

Ardından, bu özel radyoaktivite için ayrılmış bir laboratuvar alanına geçerek Chromium 51'i kullanmaya hazırlanın. Tüm adımlar sırasında Chromium 51'in güvenli bir şekilde saklanması ve kullanılması için yeterli kurşun korumanın yanı sıra Chromium 51 içeren numunelerin nerede tutulduğunu gösteren uygun işaretler bulunmalıdır. Olası kontaminasyon için alanda hizmet vermek için gözleme probu ile donatılmış bir Geiger sayacı da gereklidir.

Radyoaktivitenin uygun kullanımı için ayarlandıktan sonra, doğrudan hedef hücre süspansiyonuna 100 mikroküri Krom 51 ekleyin. Ardından, numunenin ve tüpün artık radyoaktif olduğunu belirtmek için tüpe küçük bir parça radyoaktif bant ekleyin. Tüpü kurşun kalkanlı 37 santigrat derecelik bir inkübatöre yerleştirin ve tüpü her 15 ila 20 dakikada bir fiske vurarak bir saat inkübe edin.

Hedef hücreler etiketlenirken, efektör hücrelerin tek hücreli bir süspansiyonunu hazırlayın. Bu örnekte, insan periferik kan mono nükleer hücreleri veya PDMC'ler, standart yoğunluk gradyan santrifüjlemesi ile 5 kez 10 ila 6'lık bir konsantrasyona kadar tam kandan izole edildi. Bu efektör hücre süspansiyonunu tek kullanımlık bir reaktif rezervuarına aktarın ve ardından bu süspansiyondan 200 mikrolitreyi 96 oyuklu yuvarlak tabanlı bir plakada B sırasının her bir oyuğuna ekleyin. Daha sonra, plakanın C'den G'ye kadar olan satırındaki her bir oyuğa 100 mikrolitre RPMI ekleyin.

Şimdi, önce B satırındaki kuyucuklardaki hücrelerin 100 mikrolitresini çıkararak ve bunu C satırına ekleyerek, bir dizi efektör hücre numarasına sahip olmak için PBMC'lerin seri seyreltmelerini gerçekleştirmeye başlayın. Ardından, 100 mikrolitre hücreyi C satırından D satırına aktararak efektör hücreleri daha da seyreltin. Seri seyreltmeye devam edin. G sırasına ulaşıldığında, o sıradaki her bir kuyucukta 100 mikrolitrelik bir son hacim bırakmak için kuyulardan 100 mikrolitre hareket ettirin. Daha sonra, Krom 51'in hedef hücrelerden kendiliğinden salınması için bir kontrol görevi görmek üzere A sırasındaki kuyucuklara 100 mikrolitre doku kültürü ortamı ekleyin, çünkü bu sıraya hiçbir efektör hücre eklenmemelidir. Ardından, hedef hücreler eklenmeye hazır olana kadar 37 santigrat derecelik bir inkübatöre bir plaka yerleştirin.

Kuluçka süresinden sonra, hedef hücreleri inkübatörden çıkarın ve fazla Chromium 51'i çıkarmak için 5 mililitre FBS ile yıkayın. Ardından, tüpü belirlenmiş bir santrifüje yerleştirin ve 5 dakika boyunca 1200 rpm'de döndürün. Radyoaktif FBS yıkamasını uygun bir atık kabına çıkarın ve peleti taze 5 mililitre FBS içinde yeniden süspanse ederek yıkama adımını tekrarlayın. Tüpü belirlenmiş bir santrifüje yerleştirin ve hücreleri 5 dakika boyunca 1200 rpm'de tekrar döndürün. İkinci yıkamayı çıkarın ve bir Geiger sayacı kullanarak peletin dahil radyoaktivite olup olmadığını kontrol edin. Son olarak, peleti 10 mililitre tam ortamda yeniden süspanse edin ve Chromium 51 etiketli, hedef hücre süspansiyonunu tek kullanımlık bir reaktif rezervuarına dökün. Ardından, bu etiketli hedef hücrelerden 100 mikrolitreyi 96 oyuklu efektör hücre plakasının her bir oyuğuna ekleyin. Daha sonra, her sıradaki tüm hedef hücreleri parçalamak için H sırasındaki kuyucuklara 100 mikrolitre% 1 NP-40 su ekleyin. Bu kuyular, dakika başına toplam sayımları veya cpm'yi belirlemek için bir kontrol olarak kullanılacaktır.

Artık plaka hazırlandığına göre, plakanın her iki tarafına küçük bir parça bant ekleyerek kapağı sabitleyin ve krom 51 içerdiğini belirtmek için kapağın üzerine bir parça radyoaktif bant yerleştirin. Ardından, plakayı radyoaktif numuneleri işlemek için işaretlenmiş bir santrifüje yerleştirin. Yalnızca bir deney plakası kullanılıyorsa, santrifüje bir denge plakası ekleyin. Santrifüjü 1200 rpm'ye ayarlayın ve plakayı hızlandırın. Hıza ulaştığınızda makineyi durdurun. Plakayı santrifüjden çıkarın. Ardından, ek güvenlik için plakayı 37 santigrat derece inkübatöre yerleştirin ve plakanın üzerinde küçük bir kurşun koruma parçası bulun. Hedef hücrelerin parçalanmasına izin vermek için 16 saat inkübe edin.

Kuluçka süresinin sonunda, plakanın kenarındaki bandı dikkatlice çıkarın ve kapağı çıkarın. Ardından, pamuk tapalarının her biri için küçük filtre disklerinin yerinde olduğundan emin olarak hasat çerçevesini plakaya yerleştirin. Şimdi, pamuk tapalarını yavaşça ve nazikçe kuyucuklara bastırın. Yaklaşık on saniye sonra, pamuk tapaları üzerindeki basıncı boşaltın ve ardından pamuk tapaları tüp şeritlerine aktarın. Bu tüplerin her birini ikincil bir FACS tüpüne yerleştirin. Son olarak, FACS tüplerini bir gama sayacına yükleyin ve her koşulda salınan krom 51 miktarını ölçmek için numuneleri çalıştırın. Tüplerin tezgaha yüklenme sırasını dikkatlice kaydedin.

Burada, uyarılmamış PBMC'ler ilk 3 şeride eklendi ve CPG ile uyarılmış PMBC'ler 4 ila 6 numaralı şeritlere eklendi. Bu örnekte, dakikadaki sayımlar, numunelerin orijinal plakaya yerleştirildiği şekilde bir elektronik tablonun hücrelerine girildi ve üçlülerin ortalamaları hesaplandı. Örneğin, ilk koşul için, A1, A2 ve A3 hücrelerinin I3 hücresinde ortalaması alındı. Ortalamalar belirlendikten sonra, her bir koşul için spesifik lizis yüzdesi bu formül kullanılarak hesaplanabilir. Örneğin, hedef hücrelere 50'ye 1 efektör hücre oranına sahip olan uyarılmamış hücreler için spesifik lizis yüzdesini hesaplamak için, bu örnekte 1164.67 olan spontan CPM, deneysel CPM, 1129'dan çıkarıldı. 67. Bu sayı daha sonra maksimum BGBM ile spontan BGBM arasındaki farka bölünebilir ve ardından yüzde spesifik lizisi vermek için 100 ile çarpılabilir. Bu daha sonra her koşul için hesaplanır. Bu veriler daha sonra hem uyarılmamış PBMC'ler hem de CPG ile uyarılmış PBMC'ler için E-T oranının yüzde spesifik lizis ile karşılaştırılmasını göstermek için grafiklendirilebilir. Bu örnekte, CPG ile uyarılan efektör hücreler, efektör hücrelerin hedef hücrelere oranı arttıkça hedef hücreleri daha etkili bir şekilde öldürdü. Bu artış, uyarılmamış PBMC'lerde gözlenmedi, bu da hedef hücre lizizinde gözlenen artış için CPG stimülasyonunun gerekli olduğunu gösteriyor.