Hücre Ölümü Testi: Sitotoksik Yeteneğin Krom Salınım Testi

Prosedüre Genel Bakış

Hücre ölümünü ölçmek için tipik ⁵¹Cr salınımlı test aşağıdaki adımları içerir:

1. İlk olarak, hedef hücreler Na₂ [⁵¹Cr] O₄ ile etiketlenir. Bu, onları tahlildeki efektör hücrelerden ayırır.
2. Hedef hücreler etiketlenirken, efektör hücreler toplanır ve seri seyreltme tekniği kullanılarak, efektör hücrelerin azalan bir titrasyonu, yuvarlak tabanlı 96 oyuklu bir tahlil plakasında oluşturulur.
3. Hedef hücre etiketlemesinin sonunda, hücreler önce yıkanır ve daha sonra bir dizi efektör hücre seyreltmesi içeren tahlil plakasına sabit sayıda hücre eklenir.
4. Daha sonra, hedef-efektör hücre karışımı, hücre lizizine aracılık etmek için hedef hücrelerle yeterli hücre etkileşimine izin vermek için belirli bir süre boyunca inkübe edilir.
5. Son olarak, kültür süpernatantları hasat edilir ve tüplere toplanır. ⁵¹Cr miktarı, bir gama sayacı kullanılarak ölçülür.
6. Sonunda, veriler toplanır ve hedef hücrelerin "yüzde spesifik hücre lizizini" hesaplamak için kullanılır.

1. Hedef Hücreleri ⁵¹Cr ile Etiketleme

1. Başlamak için, hedef hücreleri (burada insan melanom hücre hattı WM793) tek hücreli bir süspansiyona hazırlayın.
2. Bunu yapmak için, önce ortamı doku kültürü şişesinden çıkarın.
3. Ardından, hücreleri 5 mL 1X PBS ile yıkayın.
4. Plakaya ~ 2 dakika boyunca 1 mL tripsin ekleyerek hücreleri tripsinize edin.
5. Şişenin yüzeyindeki hücreleri gevşetmek için şişeye hafifçe vurun.
6. Şişeye 5 mL RPMI ortamı ekleyin ve hücreleri ayırmak için ortamı yukarı ve aşağı pipetleyin.
7. Hücre süspansiyonunu 15 mL'lik bir konik tüpe toplayın ve hücre süspansiyonunu 1200 rpm'de 5 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı boşaltın.
8. Peletin içine 10 mL besiyeri ekleyin ve hücreleri süspansiyona getirmek için besiyerini nazikçe yukarı ve aşağı pipetleyin.
9. Bir hemositometre kullanarak hücre konsantrasyonunu belirleyin.
10. 1x10⁶ hücreyi yeni bir 15 mL konik tüpe aktarın.
11. Hücre süspansiyonunu 1200 rpm'de 5 dakika santrifüjleyin ve süpernatanı boşaltın.
12. Hücre peletini geride kalan küçük hacimdeki ortamda yeniden süspanse etmek için tüpü kısaca girdaplayın.
13. 100 μCi ⁵¹Cr'yi doğrudan WM793 hedef hücre süspansiyonuna ekleyin.
    Not: Belirli bir radyoaktivite için kurulmuş özel bir laboratuvar alanı olmalıdır. Ek olarak, tüm adımlar sırasında ⁵¹Cr'nin güvenli bir şekilde saklanması ve kullanılması için yeterli kurşun koruması ve ⁵¹Cr'li numunelerin nerede tutulduğunu gösteren uygun işaretler bulunmalıdır. Olası kontaminasyon alanını araştırmak için gözleme probu ile donatılmış bir Geiger sayacı da gereklidir.
14. Tüpün artık radyoaktif olduğunu belirtmek için tüpe küçük bir parça radyoaktif bant ekleyin.
15. Tüpü kurşun kalkanlı 37 ° C'lik bir inkübatöre yerleştirin ve 1 saat inkübe edin. Kromun hedef hücre alımını artırmak için tüpü her 15-20 dakikada bir hafifçe vurun.
16. İnkübasyon süresinden sonra, fazla ⁵¹Cr'yi çıkarmak için hedef hücreleri 5 mL FBS ile yıkayın.
17. Hücreleri 1200 rpm'de 5 dakika santrifüjleyin. Radyoaktif FBS yıkamasını uygun atık kabına boşaltın.
18. Peleti tekrar süspanse edin ve FBS ile ikinci kez yıkayın. Bir Geiger sayacı kullanarak peleti birleşik radyoaktivite açısından kontrol edin.
19. Peletleri 10 mL tam ortamda yeniden süspanse ederek 10⁵ hücre/mL.
    hücre konsantrasyonu elde edin Not: ⁵¹Cr etiketlemesinden sonraki hücre sayma adımı, büyük ölçüde güvenlik nedenleriyle burada atlanmıştır. WM793 hücre konsantrasyonunun, ⁵¹Cr etiketlemesinden öncekiyle aynı olduğu varsayılabilir.

2. Efektör Hücrelerin Hazırlanması

1. İnsan veya fare T hücreleri ve NK hücreleri gibi çeşitli efektör hücreler kullanılabilir. Bu örnekte, standart yoğunluk gradyan santrifüjleme (5x10⁶ konsantrasyona kadar) ile tam kandan izole edilen PBMC'ler kullanılmıştır.
2. Başlamak için, 96 oyuklu yuvarlak tabanlı bir plakanın sıralarından birinin (burada satır A, Bkz. Tablo 1) her bir oyuğuna 100 μL doku kültürü ortamı ekleyin. Burada, hiçbir efektör hücre eklenmez ve hedef hücrelerden "minimum / spontan ⁵¹Cr salınımını" belirlemek için 'boş' olarak görev yaparlar.

Tablo 1: ⁵¹Cr serbest bırakma tahlil düzeni: Satır A- Yalnızca ortamla inkübe edilen hedef hücreler (10⁴ hücre / 100 μL) ("minimum/spontan ⁵¹Cr salınımını" belirlemek için 'boş' oluşturur). Farklı efektör içeren B ila C kuyuları: 50:1 ile 1,5:1 arasında değişen hedef hücre (E:T) oranları. Sıra H- hedef hücreler (10^{4 hücre} / 100 μL)% 1 NP-40 ile inkübe edilmiştir (NP-40, hedef hücreleri parçalayarak "maksimum veya toplam ⁵¹Cr salınımı" üretir). Her E: T oranı, her deney koşulu için üç nüsha olarak test edilir. Sütun 1-3- uyarılmamış PBMC'ler ve sütun 4-6- CpG ile uyarılmış PBMC'ler.

1. Daha sonra, 5x10⁵ ila 15.625 hücre/100 μL ortam arasında değişen bir efektör hücre konsantrasyonu elde etmek için PBMC'lerin 2X seri hücre seyreltmesini (her deneysel koşul için üç kopya halinde) oluşturun (burada B ila G satırları).
   Not: Bu örnekte, başlangıç efektörü: hedef hücre (E: T) oranı 50: 1'dir. Bununla birlikte, bu oran deneysel özelliklere bağlı olarak ayarlanabilir.
2. Bu kuyucuklara herhangi bir efektör hücre eklemeyerek son satırı (burada H satırı) boş bırakın. (Bu satır, "toplam sayım/dk veya (c. p. m)" veya "maksimum ⁵¹Cr sürümü" oluşturmak için kullanılacaktır).
3. Hedef hücreler eklenmeye hazır olana kadar plakayı 37 ° C inkübatöre yerleştirin.

3. Teste ⁵¹Cr etiketli WM793 hedef hücresi eklenmesi

1. Kuluçka süresinden sonra, hedef hücreleri inkübatörden çıkarın ve fazla ⁵¹Cr'yi çıkarmak için 5 mL FBS ile yıkayın.
2. Belirlenmiş bir santrifüj kullanarak hücreleri 1200 rpm'de 5 dakika
santrifüjleyin.
3. FBS yıkamasını (radyoaktif süpernatan) uygun bir atık kabına çıkarın.
4. Peleti 5 mL'lik taze bir FBS içinde yeniden süspanse ederek yıkama adımını tekrarlayın.
5. Hücreleri tekrar 1200 rpm'de 5 dakika santrifüjleyin.
6. Son olarak, peleti 10 mL tam ortamda yeniden süspanse edin.
7. ⁵¹Cr etiketli WM793 hücre süspansiyonunu (10⁵ hücre / mL) tek kullanımlık bir reaktif haznesine dökün.
8. Ardından, çok kanallı bir pipet kullanarak 96 oyuklu efektör hücre plakasının her bir oyuğuna bu etiketli hedef hücrelerden 100 μL ekleyin.
9. Daha sonra, herhangi bir efektör hücreden yoksun kuyucuk sırasına (burada H satırı) 100 μL% 1 NP-40 (su içinde) ekleyin. % 1 NP-40 hedef hücreleri parçalayacak ve böylece bu kuyucuklar "toplam sayım / dak veya (c. p. m)" veya maksimum ⁵¹Cr salınımını belirlemek için kontrol görevi görecektir.
10. Plakanın her iki tarafına küçük bir parça gaz geçirgen bant ekleyerek kapağı plakaya sabitleyin ve ⁵¹Cr içerdiğini belirtmek için kapağın üzerine bir parça radyoaktif bant yerleştirin.
11. Kısaca, plakayı 1200 rpm'de santrifüjleyin. Yalnızca bir deney plakası kullanılıyorsa, santrifüje bir denge plakası ekleyin.
    Not: Radyoaktif numuneleri işlemek için işaretlenmiş bir santrifüj kullanmak önemlidir.
12. Plakayı santrifüjden çıkarın.
13. Ek güvenlik için plakayı 37 ° C'lik bir inkübatöre yerleştirin ve plakanın üzerinde küçük bir kurşun koruma parçası bulun. Hedef hücre lizizine izin vermek için 16 saat inkübe edin.
    Not: Kuluçka süresi, kullanılan efektör hücrelere ve kullanılan potansiyel öldürme mekanizmasına bağlı olarak 4 ila 18 saat arasında değişebilir.

4. Süpernatanları Hasat Etmek

1. Kuluçka süresinin sonunda, plakanın kenarındaki bandı dikkatlice çıkarın ve kapağı çıkarın.
2. Ardından, hasat çerçevesini plakaya yerleştirin ve pamuk tapalarının her biri için küçük filtre disklerinin yerinde olduğundan emin olun. Bu, hücresiz bir süpernatantın toplanmasını sağlayacaktır.
3. Şimdi, pamuk tapalarını yavaşça ve nazikçe kuyucuklara bastırın.
4. Yaklaşık 10 saniye sonra, pamuk tapaları üzerindeki basıncı boşaltın ve ardından pamuk tapaları tüp şeritlerine aktarın.
5. Bu tüplerin her birini ikincil bir FACS tüpüne yerleştirin.
6. Son olarak, FACS tüplerini gama sayacına yükleyin ve her koşulda salınan ⁵¹Cr miktarını ölçmek için numuneleri çalıştırın. Numuneler tipik olarak 1 dakika boyunca ölçülür ve bu da "sayım/dakika" nın kolay bir şekilde belirlenmesine olanak tanır.
7. Dikkatlice, tüplerin tezgaha yüklenme sırasını kaydedin.

5. Veri Analizi

1. Burada, ilk üç sütuna uyarılmamış PBMC'ler eklendi ve CpG ile uyarılan PBMC'ler (CpG ODN, (24 saat boyunca 1 μg/mL)) sütun 4-6'ya eklendi. Tablo 2'ye bakın.

· Yılı Yılı numaralı telefondan temin edilmiştir. Yılında Yılında sayılı Kanun Hükmünde Kararname Haber Kaynağı Yılında Adet Yapımı Yılında Adet adet Yılında Adet Yılı Yapımı Adet Yapımı Yılı Adet

	1	2	3	4	5	6	7	8
Bir	1251	1157	1086	917	1118	1140
B	1832	1986	1971	7629	7913	8180
Ç	1677	1739	1428	5454	5055	5268
D	1638	1552	1734	4239	3582	3786
E	1658	1580	1339	2818	2623	2750
F	1579	1472	1483	2028	1779	1769
G	1326	1325	1184	1801	1654	1565
H	9220	9367	8067	8774	9647	8236
ben	A1,A2,A3 ortalaması ->		1164,67	Spontan c.p.m		1058,33
J	B1,B2,B3 ortalaması ->		1929,67	%9,91		7907,33

3.