6.2: Seri Seyreltmeler ve Kaplama: Mikrobiyal Sayım

1. Kurulum

1. Tüm materyalleri, aşamalı deney protokolünü ve malzemeleri atma yöntemini listeleyen bir akış şeması bir laboratuvar defterine yazılmalı ve deney çalışma alanının yakınında tutulmalıdır.
2. Çalışma alanları uygun bir antiseptik (%70 etanol) ile sterilize edilmeli ve deneyci, onları maruziyet anormalliklerinden de koruyan temiz laboratuvar giysileri giyerek kontaminasyon riskini azaltmalıdır. Uygun giysiler arasında laboratuvar önlüğü, lateks veya nitril eldivenler, gözlükler, solunum maskeleri ve kapalı ayakkabılar bulunur ancak bunlarla sınırlı değildir. Her zaman aseptik tekniği korumak çok önemlidir.
3. 90 mL% 0.45 tuzlu su hazırlayın. Temiz dereceli bir silindir kullanarak, 90 mL steril su ölçün ve % 0.45 tuzlu su etiketli temiz bir Erlenmeyer şişesine aktarın. .405 g sodyum klorür (Sigma-Aldrich NaCl S9888) tartın ve %0.45 salin etiketli şişeye ekleyin. Hiçbir çözünen madde kalmayana kadar art arda döndürün.
4. Tamamlandıktan sonra, deneyci tüm yüzeyleri yeniden sterilize etmeli ve istenmeyen organizmaları, seyreltici stokları, petri kaplarını veya tek kullanımlık aşılama döngülerini OSHA yönergelerine göre atmalıdır. Laboratuvar giysileri eller yıkanmadan önce çıkarılabilir.

2. Medya Hazırlığı

1. İstenilen bir organizmanın yetiştirilmesi için uygun ortamı seçin. Çoğu senaryoda, bir et suyu yeterli bakteri üremesini sağlayacaktır. Burada bir Winogradsky protokolünden organizmalar istendiğinden, kalsiyum karbonat, kükürt, selüloz ve çamurdan oluşan bir sütun monte edildi ve 7 gün boyunca bozulmadan bırakıldı. Yukarıda belirtilen sütun aerobik, mikroaerofilik ve anaerobik bölümlere ayrılmıştır.
2. İlgilenilen organizmayı kaplamak için uygun bir ortam seçin. Sıvı ortamın mikrobiyoloji dereceli agar ile takviyesi tipik olarak katılaştırıcı bir ajan olarak kullanılır. Yukarıda belirtilen sütunun aerobik, mikroaerofilik ve anaerobik bölgelerinden numuneler toplanırken LB medium/agar yeterlidir. Not: Bu prosedür için mikroaerofilik bölgeden örnekler alınmamıştır. Bununla birlikte, bu organizmalar mum kavanozlarında yetiştirilmelidir. Sızdırmazlıktan önce bu yetiştirme odasına bir mum eklemek, mikroaerofilik çoğalma için uygun olan düşük oksijenli bir ortam yaratır.
3. 250 mL hazırlamak istediğimizden, otoklavlama sırasında kaynamayı önlemek için 500 mL (veya daha büyük) Erlenmeyer şişeleri kullanın. Birini "Et suyu" ve diğerini "Agar" olarak etiketleyin
4. Üreticinin konsantrasyon önerilerini takip ederek her bir çözeltiyi oluşturmak için gereken ortam miktarını belirleyin. Burada kullanılan LB Agar, 25g/L ile ultra saf suyun birleştirilmesiyle hazırlanır. 250 mL'lik hacmimiz 6,25 LB Agar/250 mL su çözeltisi gerektirir. Benzer şekilde LB Broth da aynı oranda LB Broth ve suyun birleştirilmesiyle hazırlanır. Katılaştırıcı bir madde ile desteklenmediğinden, soğutulduğunda sertleşmez.
5. Ortamı tartın ve üretici tavsiyelerine uygun oranlarda suyla karıştırın. "Agar" etiketli bir şişeye 6.25 g LB Agar ve "Et suyu" etiketli bir şişeye 6.25 g LB Suyu ekleyin. Her şişeye 250 mL ultra saf su ekleyin.
6. Her şişenin üzerine alüminyum folyo sarın ve ortamı 121 ° C, 15 psi'de en az 15 dakika sterilize etmek için bir otoklav kullanın.
7. Isıya dayanıklı bir eldiven veya ped kullanarak, döngü tamamlandığında şişeleri otoklavdan çıkarın ve 40-50°C'lik bir su banyosuna koyun.
8. Uygun sıcaklığa ulaşıldığında, "Et suyu" etiketli şişenin içeriğini 250 mL'lik bir Erlenmeyer'e veya yuvarlak tabanlı şişeye dökün. 250 mL'lik şişeyi "solution₀" olarak etiketleyin.
9. 10, 100 mm x 15 mm steril petri kapları alın ve bunları tarih, isim, kullanılan ortam türü ve organizmaların hasat edileceği Winogradsky sütun bölgesi ile etiketleyin.
10. "Agar" etiketli matarayı su banyosundan çıkarın ve 10 petri kabının her birine dökmeye başlayın. Her yemeğe 15 mL'den fazla eklenmemelidir. Bu, doğruluğu artırmak için bir pipetleyici ve 25 mL serolojik pipet ile de gerçekleştirilebilir. Mevcut kabarcıkları çıkarmak için steril bir pipet ucu kullanın ve ardından plaka kapaklarıyla örtün ve gece boyunca katılaşmaya bırakın.

3. Seyreltici Hazırlama

1. Bir rafta 20 mL veya daha fazla depolayabilen on test tüpü hazırlayın ve bunları T1-T10 olarak etiketleyin. Her tüp numarası, karşılık geldiği seyreltme faktörü ile tutarlıdır (yani, T4 = 1x10^-4 veya 0.0001 veya stok konsantrasyonunun 1/10.000'i).
2. 10 test tüpünün her birine 9 mL% 0.45 salin pipetleyin.
3. Tuzlu su boşlukları artık otoklav ile sterilize edilmeye hazırdır. 10 test tüpünün her birini kaplamak için alüminyum folyo kullanın ve ardından bunları otoklav uyumlu bir test tüpü rafına aktarın. 121 ° C, 15 psi'de en az 15 dakika sterilize edin.
4. Isıya dayanıklı eldivenler kullanarak boşlukları çıkarın ve soğumaya bırakın. Tüpler oda sıcaklığına ulaştığında veya dokunulamayacak kadar soğuduğunda ihtiyaç duyulana kadar örtün ve 4°C'de saklayın.

4. Hedef Organizmanın Yetiştirilmesi

1. "Çözelti₀" yi daha önce çizgili bir plakadan veya 50 μL donmuş bir stoktan tek bir koloni ile aşılayın. Aşılanmış "çözelti₀" yi gece boyunca çalkalayarak (gerekirse) 37 ° C'lik bir inkübatöre yerleştirerek hedef organizmanın çoğalmasına izin verin. (Not: Kontaminasyonu önlemek için şişenin üzeri kapatılmalıdır. Hedef organizma aerobik ise, kontaminasyonu önlemek için steril gazlı bez ve pamuklu tıkaçlar kullanın. Winogradsky kolonunun bölgelerini değerlendiriyorsanız, istenen her bölgeden (bu çalışmanın amaçları için aerobik ve anaerobik) 1 gram çıkarın ve adım 5.3'e geçmeden önce T1'de yeniden süspanse edin.

5. Seri Seyreltme

1. Kuluçka makinesinden "Besin suyu" etiketli şişeyi alın ve kuvvetlice çalkalayın.
2. 1 mL "çözelti₀" pipetini T1 etiketli test tüpüne uygulayın. Girdap T1. Winogradsky eksplantlarını değerlendiriyorsanız, istenen bölgenin 1 gramını tartın ve girdaplamadan önce T1'e ekleyin. (Not: Basitlik için burada 1 mL kullanılmıştır - daha küçük veya daha büyük hacimlerde seyreltici de kullanılabilir).
3. Test tüpü T1'den 1 mL çıkarın ve test tüpü T2'ye ekleyin. Girdap T2.
4. Test tüpü T2'den 1 mL çıkarın ve test tüpü T3'e ekleyin. Girdap T3.
5. Test tüpü T3'ten 1 mL çıkarın ve test tüpü T4'e ekleyin. Girdap T4.
6. Test tüpü T4'ten 1 mL çıkarın ve test tüpü T5'e ekleyin. Girdap T5.
7. Test tüpü T5'ten 1 mL çıkarın ve test tüpü T6'ya ekleyin. Girdap T6.
8. Test tüpü T6'dan 1 mL çıkarın ve test tüpü T7'ye ekleyin. Girdap T7.
9. Test tüpü T7'den 1 mL çıkarın ve test tüpü T8'e ekleyin. Girdap T8.
10. Test tüpü T8'den 1 mL çıkarın ve test tüpü T9'a ekleyin. Girdap T9.
11. Test tüpü T9'dan 1 mL çıkarın ve test tüpü T10'a ekleyin.

6. Yayılmış Kaplama

1. T1'den 100 μL seyreltilmiş bir numuneyi doğrudan bir petri kabına pipetleyin. Bu adım her tüp için tekrarlanabilir, ancak tekrarlanması gerekmez.
2. Steril, tek kullanımlık bir yayma çubuğu edinin veya bir cam yayma çubuğunu alevle sterilize edin. Saat yönünde/saat yönünün tersine hareketlerle, numuneyi petri kabı içinde eşit olarak dağıtmak için yayma çubuğunun yatay kısmını kaydırın.
3. Winogradsky sütununun değerlendirilecek her bölgesi için tekrarlayın.
4. Plakaları 37°C'lik bir inkübatörde 24 saat inkübe edin. Anaerobik organizmalar için anaerobik bir oda kullanın.

7. Çizgi

1. Hedef organizmanızın uygun bir seyreltmesini seçin. Örneğin, ₄ çözeltisi, başlangıç konsantrasyonunuzun 1/10.000'inci seyreltmesini verecektir. Tipik olarak, 1/1.000^inci (T3/Çözelti), 1/1.000.000^inci (T6/Çözüm₆) ve 1/1.000.000.000^inci (T9/Çözüm₉) seyreltmeleri mikropları numaralandırmak için değerlendirilir.
2. Plastik steril tek kullanımlık bir aşılama halkası veya en az 10 saniye boyunca ateş altında kalmış yeniden kullanılabilir bir metal aşılama halkası kullanarak, 5. adımdan itibaren istenen çözeltiye daldırın. Kalibre edilmiş aşılama döngüleri 0.01 mL transfer etmelidir. (Dikkat: Isıdan çıkardıktan hemen sonra alevli halkanın bakterilerle temas etmesine izin vermeyin)
3. Bir taraftaki petri kabı kapağını hafifçe kaldırın, böylece sadece aşılama halkası agar'a erişebilir. Agardan ödün vermemeye dikkat ederek aşılama halkasını medyanın üst kısmında zikzak şeklinde kaydırın. Petri kabı kapağını indirin.
4. Yeni bir tek kullanımlık aşılama halkası kullanın veya yeniden kullanılabilir döngünüzü yeniden sterilize edin.
5. Plakayı kabaca 1/3^rd (~118°) döndürün ve zikzak hareketinin sıklığını azaltın.
6. Yine, son bir kez döndürmeden önce yeni bir tek kullanımlık halka kullanın veya metal bir halkayı yeniden sterilize edin ve zikzak frekansını bir kez daha azaltın. Petri kabı kapağını indirin.
7. 7.2 - 7.6 arasındaki adımları, yeni bir tek kullanımlık döngü kullanarak veya yeniden kullanılabilir bir döngüyü yeniden alevlendirerek üç farklı seyreltme için en az üç petri kabı çizilene kadar tekrarlayın (Şekil 2).
8. Çizgili petri kaplarını gece boyunca 37°C'lik bir inkübatöre koyun. Anaerobik organizmalar için anerobik bir oda kullanın.

8. Veri Analizi ve Sonuçlar

1. Kültürler, 7 günlük bir Winogradsky sütununun oksik ve anoksik bölgelerinden toplandı. Bu bölgeler sırasıyla heterotrofik ve demir oksitleyici anaeroblar için uygundur.
2. Kolon eksplantları, LB Agar plakaları üzerinde çizgilenmeden veya yayılmadan önce seri olarak seyreltildi.
3. Çizgi, değerlendirilen Winogradsky bölgelerinin her birinden karışık bir popülasyon ortaya çıkardı. Yayılmış plakalar da benzer sonuçlar verdi.
4. CFU/mL veya CFU/g'yi hesaplamak için, üç plakadan sayılan koloni sayısının ortalamasını alın. Ortalama koloni sayısını seyreltme faktörü ile çarpın ve alıntılanan miktara bölün. Örneğin, 0.1 mL çözelti₆ (T6) ile aşılanmış plakalarda ortalama 65 koloni sayılırsa, daha önce açıklanan formül 650.000.000 CFU/mL'ye eşit olacaktır.
5. İzole edilmiş koloniler artık tür kimliğini belirlemek için zenginleştirme tahlillerinde kullanılmak üzere her plakadan seçilebilir.

Bazen, bakterileri tanımlamak ve incelemek için önce onları bir numuneden izole etmemiz ve zenginleştirmemiz gerekir. Örneğin, bir Winogradsky Sütunundan elde edilen örnekler karışıktır, yani birden fazla bakteri türü veya türü içerirler, bu nedenle tek bir bakteriyi incelemek veya mevcut farklı türleri numaralandırmak zor olabilir. Bu amaçla, bakteri yükünü güvenilir bir şekilde ölçmek ve tek tek kolonileri izole etmek için tipik olarak seri seyreltme ve kaplama teknikleri kullanılır.

Seri seyreltme, bir organizmanın, bu örnekteki bakterilerin konsantrasyonunun, sabit hacimlerde sıvı seyreltici içinde ardışık yeniden süspansiyon yoluyla sistematik olarak azaltıldığı bir işlemdir. Genellikle seyrelticinin hacmi, numune organizmasının logaritmik indirgenmesini kolaylaştırmak için 10'un katıdır. Örneğin, bir gram tortu önce Winogradsky'nin ilgilendiği bölgeden çıkarılır ve 10 mililitre uygun bir sıvı ortama eklenir. Daha sonra, bu ilk seyreltmenin bir mililitresi, dokuz mililitre ortam içeren başka bir tüpe eklenir. İşlem, birkaç farklı bakteri konsantrasyonu hazırlanana kadar tekrarlanabilir. Seri seyreltme, bu örnekteki bakterilerin sayımının anahtarıdır, çünkü bir Winogradsky Sütunundan alınan karışık örnekler bilinmeyen, genellikle büyük sayıda bakteri içerir.

Daha sonra, çizgi kaplama ve yayılmış kaplama, sırasıyla bir numune içindeki bakterilerin izolasyonunu ve sayımını sağlar. Çizgileme, seyreltilmiş bir numunenin, besin maddesi ile takviye edilmiş katı ortamın üçe bölünen bir bölümüne sokulmasıyla gerçekleştirilir. Bu aşı daha sonra zikzak şeklinde plakanın her üçte birine yayılır. Plakanın farklı bölümleri, önceki numuneden yalnızca bir kez geçecek şekilde çizgili olduğundan, numune daha ince yayılır. Bu, sonraki bölümlerde tek tek koloniler elde etmek için yalnızca bir seyreltmeden çizgi çekmeniz gerekebileceği anlamına gelir. İnkübasyondan sonra, çizgili plakalar, farklı bakteri türleri arasında ayrım yapmaya yardımcı olabilecek bilgiler olan koloni morfolojisinin gözlemlenmesine izin verir.

Alternatif olarak, asıl amaç numunedeki bakterilerin sayımı ise, yayılmış kaplama kullanılabilir. Yayılmış kaplamada, tek bir numunenin bir alikotu katı ortamın tüm yüzeyine eşit olarak yayılır. Tipik olarak, karışık numunedeki bakteri sayılarını bilmediğimiz için, seyreltmelerin her biri veya bunların temsili bir numunesi için bir yayma plakası yapılır. İnkübasyondan sonra, bu yayılmış plakalar kullanılarak numaralandırma yapılabilir. Koloni sayısı 30'dan az olan plakalar atılmalıdır, çünkü küçük sayımlar daha büyük hatalara maruz kalır. Benzer şekilde, 300'ün üzerindeki herhangi bir sayım atılmalıdır, çünkü koloni kalabalıklaşması ve üst üste binmesi koloni sayısının hafife alınmasına yol açabilir. Kalan bu çanakların her birinin koloni sayıları kaydedilir ve seyreltme faktörü ile çarpılırsa ve daha sonra kaplanan hacme bölünürse, bu, mililitre süspansiyon başına koloni oluşturan birimleri veya CFU'ları verir. Bu videoda, bilinen bir bakteri içeren bir numuneyi ve bir Winogradsky Sütununun çeşitli bölgelerinde bulunan mikrobiyal toplulukları seri seyreltme, yayılmış kaplama ve çizgi kaplama yoluyla kalitatif ve kantitatif olarak nasıl değerlendireceğinizi öğreneceksiniz.

İlk olarak, laboratuvar önlüğü, eldiven ve gözlük dahil olmak üzere uygun kişisel koruyucu ekipmanı giyin. Ardından, çalışma alanını% 70 etanol ile sterilize edin ve yüzeyi silin. Ardından, iki adet 500 mililitrelik Erlenmeyer şişesi toplayın ve bir et suyunu ve diğerini agar olarak etiketleyin. LB agar solüsyonu hazırlamak için, agar etiketli şişede yaklaşık 6.25 gram LB agar, üç gram teknik agar ve 250 mililitre damıtılmış suyu karıştırın.

Daha sonra 2'yi birleştirerek LB suyunu hazırlayın. Et suyu etiketli şişede 5 gram LB ortamı ve 100 mililitre damıtılmış su. Şişeleri otoklavladıktan sonra, şişeleri otoklavdan çıkarmak için ısıya dayanıklı bir eldiven kullanın ve 40 ila 50 santigrat derece su banyosuna yerleştirin. Şişeler 50 santigrat dereceye ulaştığında, et suyu çözeltisinin üç adet 100 mililitrelik alikotunu dikkatlice hazırlayın ve her bir alikot çözeltisini sıfır olarak etiketleyin. Daha sonra, 10 steril petri kabı toplayın ve bunları tarih, isim, kullanılan ortam türü ve organizmaların hasat edileceği Winogradsky Sütunu bölgesi ile etiketleyin. Agar şişesinden 15 mililitre agarı her bir petri kabına pipetleyin. Ardından, kabarcıkları çıkarmak için pipet ucunu kullanın, plaka kapaklarını yerine takın ve gece boyunca tezgah üstünde katılaşmalarına izin verin.

Ertesi gün, tezgah üstünü %70 etanol ile silin. Ardından, 10 adet 20 mililitrelik test tüpünü T1'den T10'a kadar etiketleyin ve bir rafa yerleştirin. Her tüpe dokuz mililitre% .45 salin pipetleyin. Şimdi, 10 test tüpünün her birini kapaklarıyla gevşek bir şekilde kapatın ve bunları otoklav uyumlu bir test tüpü rafına aktarın. Döngü tamamlandıktan sonra, ısıya dayanıklı eldivenler kullanarak tuzlu su boşluklarını çıkarın ve soğumalarını bekleyin. Tüpleri yaklaşık 22 santigrat dereceye ulaşana kadar oda sıcaklığında saklayın.

Bilinen bir hedef organizmayı yetiştirmek için, bu örnekte E. coli, daha önce çizgili bir plakadan tek bir koloni ile 100 mililitre çözelti sıfırını aşılayın. Ardından, tüpü örtün ve gece boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Bir Winogradsky Sütununun bölgelerini değerlendirmek için, aerobik bölgeden T1'e yaklaşık bir gram malzeme ekleyin ve girdaplama ile yeniden süspanse edin. Ardından, bu işlemi anaerobik bölgeden bir gram malzeme ile tekrarlayın.

E. coli ile aşılanmış sıfır çözelti içeren tüpü inkübatörden çıkarın ve çalkalayın. Ardından, çözeltinin bir mililitresini bir T1 test tüpüne pipetleyin ve karıştırmak için girdap yapın. T1'den bir mililitre çözelti çıkarın ve karıştırmak için girdap yaparak T2'ye aktarın. Bu işlemi T10 tüpü ile tekrarlayın. Winogradsky Sütununun aerobik ve anaerobik bölgelerini değerlendirmek için, önceden hazırlanmış T1 tüplerinin her birinden bir mililitre çözelti çıkarın ve uygun T2 tüplerine aktarın. Ardından, daha önce gösterildiği gibi T10 tüplerinden seri seyreltmelere devam edin.

Plakayı yaymak için, her bir T3 tüpünden 100 mikrolitre seyreltilmiş numuneyi ilgili petri kabına pipetleyin. Ardından, numuneyi petri kabına nazikçe dağıtmak için steril bir yayma çubuğu kullanın ve plaka kapağını değiştirin. Daha önce gösterildiği gibi T6 ve T9 dilüsyonları için bu işlemi tekrarlayın. Aerobik organizmalar içeren plakaları 37 santigrat derece inkübatörde 24 saat inkübe edin. Anaerobik organizmalar içeren plakaları 24 saat boyunca 37 santigrat dereceye ayarlanmış anaerobik bir odada inkübe edin. Ertesi gün T3, T6 ve T9 seyreltme plakalarını inkübatörden ve anaerobik odadan çıkarın ve tezgah üstüne aktarın. Her seferinde bir plaka ile çalışarak, steril bir aşılama halkasını ortamın üst kısmı boyunca zikzak şeklinde kaydırın. Ardından, petri kabı kapağını değiştirin. Ardından, plakayı 1/3 oranında döndürün ve önceden yapılmış zikzak deseninin frekansını azaltmak için halkayı sterilize edin. Yine ilmeği sterilize ettikten sonra plakayı 1/3 oranında döndürün, zikzak deseninin sıklığını son bir kez azaltın ve kapağı yerine takın. Daha önce gösterildiği gibi kalan plakalar için bu çizgi yöntemini tekrarlayın. Ardından, aerobik organizmalar içeren çizgili plakaları gece boyunca 37 santigrat derece inkübatöre ve anaerobik organizmalar içeren çizgili plakaları gece boyunca 37 santigrat dereceye ayarlanmış anaerobik bir odaya yerleştirin.

Kültürler, yedi günlük bir Winogradsky Sütunu'nun aerobik ve anaerobik bölgelerinden toplandı. Daha sonra kültürler, LB agar plakaları üzerinde çizgilenmeden ve yayılmadan önce seri olarak seyreltildi. Çizgi, değerlendirilen Winogradsky bölgelerinin her birinden karışık bir popülasyon ortaya çıkardı ve yayılma plakaları benzer sonuçlar verdi. Karışık bir popülasyondan çizgili bir plaka, farklı şekil, boyut, doku ve renklerde bakteri kolonileri ile sonuçlanacaktır. Buna karşılık, bilinen organizma olan E. coli'yi içeren çizgili ve yayılmış plakalar homolog bir popülasyon gösterdi. Genel olarak, aynı numune ve seyreltme faktörü ile yayılmış üç plakanın ortalama koloni sayısını kullanarak mililitre başına CFU'ları hesaplamak en iyisidir. Ortalama koloni sayısını seyreltme faktörü ile çarpın ve alıntılanan miktara bölün. Son olarak, her bir plakadan seçilen izole koloniler, tür kimliğini belirlemek için daha fazla zenginleştirme tahlillerinde kullanılabilir.