Seri Seyreltmeler ve Kaplama: Mikrobiyal Sayım

1. Kurulum

1. Tüm materyalleri, aşamalı deney protokolünü ve malzemeleri atma yöntemini listeleyen bir akış şeması bir laboratuvar defterine yazılmalı ve deney çalışma alanının yakınında tutulmalıdır.
2. Çalışma alanları uygun bir antiseptik (%70 etanol) ile sterilize edilmeli ve deneyci, onları maruziyet anormalliklerinden de koruyan temiz laboratuvar giysileri giyerek kontaminasyon riskini azaltmalıdır. Uygun giysiler arasında laboratuvar önlüğü, lateks veya nitril eldivenler, gözlükler, solunum maskeleri ve kapalı ayakkabılar bulunur ancak bunlarla sınırlı değildir. Her zaman aseptik tekniği korumak çok önemlidir.
3. 90 mL% 0.45 tuzlu su hazırlayın. Temiz dereceli bir silindir kullanarak, 90 mL steril su ölçün ve % 0.45 tuzlu su etiketli temiz bir Erlenmeyer şişesine aktarın. .405 g sodyum klorür (Sigma-Aldrich NaCl S9888) tartın ve %0.45 salin etiketli şişeye ekleyin. Hiçbir çözünen madde kalmayana kadar art arda döndürün.
4. Tamamlandıktan sonra, deneyci tüm yüzeyleri yeniden sterilize etmeli ve istenmeyen organizmaları, seyreltici stokları, petri kaplarını veya tek kullanımlık aşılama döngülerini OSHA yönergelerine göre atmalıdır. Laboratuvar giysileri eller yıkanmadan önce çıkarılabilir.

2. Medya Hazırlığı

1. İstenilen bir organizmanın yetiştirilmesi için uygun ortamı seçin. Çoğu senaryoda, bir et suyu yeterli bakteri üremesini sağlayacaktır. Burada bir Winogradsky protokolünden organizmalar istendiğinden, kalsiyum karbonat, kükürt, selüloz ve çamurdan oluşan bir sütun monte edildi ve 7 gün boyunca bozulmadan bırakıldı. Yukarıda belirtilen sütun aerobik, mikroaerofilik ve anaerobik bölümlere ayrılmıştır.
2. İlgilenilen organizmayı kaplamak için uygun bir ortam seçin. Sıvı ortamın mikrobiyoloji dereceli agar ile takviyesi tipik olarak katılaştırıcı bir ajan olarak kullanılır. Yukarıda belirtilen sütunun aerobik, mikroaerofilik ve anaerobik bölgelerinden numuneler toplanırken LB medium/agar yeterlidir. Not: Bu prosedür için mikroaerofilik bölgeden örnekler alınmamıştır. Bununla birlikte, bu organizmalar mum kavanozlarında yetiştirilmelidir. Sızdırmazlıktan önce bu yetiştirme odasına bir mum eklemek, mikroaerofilik çoğalma için uygun olan düşük oksijenli bir ortam yaratır.
3. 250 mL hazırlamak istediğimizden, otoklavlama sırasında kaynamayı önlemek için 500 mL (veya daha büyük) Erlenmeyer şişeleri kullanın. Birini "Et suyu" ve diğerini "Agar" olarak etiketleyin
4. Üreticinin konsantrasyon önerilerini takip ederek her bir çözeltiyi oluşturmak için gereken ortam miktarını belirleyin. Burada kullanılan LB Agar, 25g/L ile ultra saf suyun birleştirilmesiyle hazırlanır. 250 mL'lik hacmimiz 6,25 LB Agar/250 mL su çözeltisi gerektirir. Benzer şekilde LB Broth da aynı oranda LB Broth ve suyun birleştirilmesiyle hazırlanır. Katılaştırıcı bir madde ile desteklenmediğinden, soğutulduğunda sertleşmez.
5. Ortamı tartın ve üretici tavsiyelerine uygun oranlarda suyla karıştırın. "Agar" etiketli bir şişeye 6.25 g LB Agar ve "Et suyu" etiketli bir şişeye 6.25 g LB Suyu ekleyin. Her şişeye 250 mL ultra saf su ekleyin.
6. Her şişenin üzerine alüminyum folyo sarın ve ortamı 121 ° C, 15 psi'de en az 15 dakika sterilize etmek için bir otoklav kullanın.
7. Isıya dayanıklı bir eldiven veya ped kullanarak, döngü tamamlandığında şişeleri otoklavdan çıkarın ve 40-50°C'lik bir su banyosuna koyun.
8. Uygun sıcaklığa ulaşıldığında, "Et suyu" etiketli şişenin içeriğini 250 mL'lik bir Erlenmeyer'e veya yuvarlak tabanlı şişeye dökün. 250 mL'lik şişeyi "solution₀" olarak etiketleyin.
9. 10, 100 mm x 15 mm steril petri kapları alın ve bunları tarih, isim, kullanılan ortam türü ve organizmaların hasat edileceği Winogradsky sütun bölgesi ile etiketleyin.
10. "Agar" etiketli matarayı su banyosundan çıkarın ve 10 petri kabının her birine dökmeye başlayın. Her yemeğe 15 mL'den fazla eklenmemelidir. Bu, doğruluğu artırmak için bir pipetleyici ve 25 mL serolojik pipet ile de gerçekleştirilebilir. Mevcut kabarcıkları çıkarmak için steril bir pipet ucu kullanın ve ardından plaka kapaklarıyla örtün ve gece boyunca katılaşmaya bırakın.

3. Seyreltici Hazırlama

1. Bir rafta 20 mL veya daha fazla depolayabilen on test tüpü hazırlayın ve bunları T1-T10 olarak etiketleyin. Her tüp numarası, karşılık geldiği seyreltme faktörü ile tutarlıdır (yani, T4 = 1x10^-4 veya 0.0001 veya stok konsantrasyonunun 1/10.000'i).
2. 10 test tüpünün her birine 9 mL% 0.45 salin pipetleyin.
3. Tuzlu su boşlukları artık otoklav ile sterilize edilmeye hazırdır. 10 test tüpünün her birini kaplamak için alüminyum folyo kullanın ve ardından bunları otoklav uyumlu bir test tüpü rafına aktarın. 121 ° C, 15 psi'de en az 15 dakika sterilize edin.
4. Isıya dayanıklı eldivenler kullanarak boşlukları çıkarın ve soğumaya bırakın. Tüpler oda sıcaklığına ulaştığında veya dokunulamayacak kadar soğuduğunda ihtiyaç duyulana kadar örtün ve 4°C'de saklayın.

4. Hedef Organizmanın Yetiştirilmesi

1. "Çözelti₀" yi daha önce çizgili bir plakadan veya 50 μL donmuş bir stoktan tek bir koloni ile aşılayın. Aşılanmış "çözelti₀" yi gece boyunca çalkalayarak (gerekirse) 37 ° C'lik bir inkübatöre yerleştirerek hedef organizmanın çoğalmasına izin verin. (Not: Kontaminasyonu önlemek için şişenin üzeri kapatılmalıdır. Hedef organizma aerobik ise, kontaminasyonu önlemek için steril gazlı bez ve pamuklu tıkaçlar kullanın. Winogradsky kolonunun bölgelerini değerlendiriyorsanız, istenen her bölgeden (bu çalışmanın amaçları için aerobik ve anaerobik) 1 gram çıkarın ve adım 5.3'e geçmeden önce T1'de yeniden süspanse edin.

5. Seri Seyreltme

1. Kuluçka makinesinden "Besin suyu" etiketli şişeyi alın ve kuvvetlice çalkalayın.
2. 1 mL "çözelti₀" pipetini T1 etiketli test tüpüne uygulayın. Girdap T1. Winogradsky eksplantlarını değerlendiriyorsanız, istenen bölgenin 1 gramını tartın ve girdaplamadan önce T1'e ekleyin. (Not: Basitlik için burada 1 mL kullanılmıştır - daha küçük veya daha büyük hacimlerde seyreltici de kullanılabilir).
3. Test tüpü T1'den 1 mL çıkarın ve test tüpü T2'ye ekleyin. Girdap T2.
4. Test tüpü T2'den 1 mL çıkarın ve test tüpü T3'e ekleyin. Girdap T3.
5. Test tüpü T3'ten 1 mL çıkarın ve test tüpü T4'e ekleyin. Girdap T4.
6. Test tüpü T4'ten 1 mL çıkarın ve test tüpü T5'e ekleyin. Girdap T5.
7. Test tüpü T5'ten 1 mL çıkarın ve test tüpü T6'ya ekleyin. Girdap T6.
8. Test tüpü T6'dan 1 mL çıkarın ve test tüpü T7'ye ekleyin. Girdap T7.
9. Test tüpü T7'den 1 mL çıkarın ve test tüpü T8'e ekleyin. Girdap T8.
10. Test tüpü T8'den 1 mL çıkarın ve test tüpü T9'a ekleyin. Girdap T9.
11. Test tüpü T9'dan 1 mL çıkarın ve test tüpü T10'a ekleyin.

6. Yayılmış Kaplama

1. T1'den 100 μL seyreltilmiş bir numuneyi doğrudan bir petri kabına pipetleyin. Bu adım her tüp için tekrarlanabilir, ancak tekrarlanması gerekmez.
2. Steril, tek kullanımlık bir yayma çubuğu edinin veya bir cam yayma çubuğunu alevle sterilize edin. Saat yönünde/saat yönünün tersine hareketlerle, numuneyi petri kabı içinde eşit olarak dağıtmak için yayma çubuğunun yatay kısmını kaydırın.
3. Winogradsky sütununun değerlendirilecek her bölgesi için tekrarlayın.
4. Plakaları 37°C'lik bir inkübatörde 24 saat inkübe edin. Anaerobik organizmalar için anaerobik bir oda kullanın.

7. Çizgi

1. Hedef organizmanızın uygun bir seyreltmesini seçin. Örneğin, ₄ çözeltisi, başlangıç konsantrasyonunuzun 1/10.000'inci seyreltmesini verecektir. Tipik olarak, 1/1.000^inci (T3/Çözelti), 1/1.000.000^inci (T6/Çözüm₆) ve 1/1.000.000.000^inci (T9/Çözüm₉) seyreltmeleri mikropları numaralandırmak için değerlendirilir.
2. Plastik steril tek kullanımlık bir aşılama halkası veya en az 10 saniye boyunca ateş altında kalmış yeniden kullanılabilir bir metal aşılama halkası kullanarak, 5. adımdan itibaren istenen çözeltiye daldırın. Kalibre edilmiş aşılama döngüleri 0.01 mL transfer etmelidir. (Dikkat: Isıdan çıkardıktan hemen sonra alevli halkanın bakterilerle temas etmesine izin vermeyin)
3. Bir taraftaki petri kabı kapağını hafifçe kaldırın, böylece sadece aşılama halkası agar'a erişebilir. Agardan ödün vermemeye dikkat ederek aşılama halkasını medyanın üst kısmında zikzak şeklinde kaydırın. Petri kabı kapağını indirin.
4. Yeni bir tek kullanımlık aşılama halkası kullanın veya yeniden kullanılabilir döngünüzü yeniden sterilize edin.
5. Plakayı kabaca 1/3^rd (~118°) döndürün ve zikzak hareketinin sıklığını azaltın.
6. Yine, son bir kez döndürmeden önce yeni bir tek kullanımlık halka kullanın veya metal bir halkayı yeniden sterilize edin ve zikzak frekansını bir kez daha azaltın. Petri kabı kapağını indirin.
7. 7.2 - 7.6 arasındaki adımları, yeni bir tek kullanımlık döngü kullanarak veya yeniden kullanılabilir bir döngüyü yeniden alevlendirerek üç farklı seyreltme için en az üç petri kabı çizilene kadar tekrarlayın (Şekil 2).
8. Çizgili petri kaplarını gece boyunca 37°C'lik bir inkübatöre koyun. Anaerobik organizmalar için anerobik bir oda kullanın.

8. Veri Analizi ve Sonuçlar

1. Kültürler, 7 günlük bir Winogradsky sütununun oksik ve anoksik bölgelerinden toplandı. Bu bölgeler sırasıyla heterotrofik ve demir oksitleyici anaeroblar için uygundur.
2. Kolon eksplantları, LB Agar plakaları üzerinde çizgilenmeden veya yayılmadan önce seri olarak seyreltildi.
3. Çizgi, değerlendirilen Winogradsky bölgelerinin her birinden karışık bir popülasyon ortaya çıkardı. Yayılmış plakalar da benzer sonuçlar verdi.
4. CFU/mL veya CFU/g'yi hesaplamak için, üç plakadan sayılan koloni sayısının ortalamasını alın. Ortalama koloni sayısını seyreltme faktörü ile çarpın ve alıntılanan miktara bölün. Örneğin, 0.1 mL çözelti₆ (T6) ile aşılanmış plakalarda ortalama 65 koloni sayılırsa, daha önce açıklanan formül 650.000.000 CFU/mL'ye eşit olacaktır.
5. İzole edilmiş koloniler artık tür kimliğini belirlemek için zenginleştirme tahlillerinde kullanılmak üzere her plakadan seçilebilir.