Saf Kültürler ve Çizgi Kaplama: Karışık Bir Numuneden Tek Bakteri Kolonilerinin İzolasyonu

1. Kurulum

1. Tüm mikroplara tehlikeliymiş gibi davranılmalıdır. Daima bir laboratuvar önlüğü ve eldiven giyin, uzun saçları arkaya bağlayın ve yaraların özellikle iyi korunduğundan emin olun.
2. Çalışma alanını %70 etanol kullanarak sterilize ederek hazırlayın.
3. Agar plakalarının, numune solüsyonlarının ve bir kutu önceden sterilize edilmiş plastik aşılama halkalarının veya bir metal halka artı bir Bunsen alevinin elinizin altında olduğundan emin olun. Tek kullanımlık, plastik halkalar tipik olarak önceden sterilize edilir. Metal halkalar% 70 etanole batırılmalı ve daha sonra bir Bunsen alevinin mavi alanının yakınında tutulmalı ve ateşli sıcak olana kadar ısıtılmalıdır. Plakanın kapağını kaldırarak (kirlenmeyi önlemek için sadece biraz) ve katılaşmış ortama vurarak telin soğumasını bekleyin.
4. Her prosedürü, çalışma alanının tekrar tekrar sterilizasyonu ve ellerin ve bileklerin kapsamlı bir şekilde yıkanması/sterilizasyonu ile bitirin.

2. Protokol

1. Medyanın hazırlanması
   1. Kullanılan bakteri türünü/türünü sürdürecek katı bir ortam (tipik olarak %1,5 (a/h) agar içeren) tanımlayın ve hazırlayın. Otoklavlama sırasında taşmayı önlemek için ortamı son hacmin iki katı tutabilen bir şişede karıştırın.
   2. Şişeyi yarı sıkı bir kapakla 20 dakika boyunca 121°C'ye ayarlanmış bir otoklava yerleştirerek ortamı sterilize edin.
   3. Şişe otoklavdan çıkarılır çıkarılmaz kapağı düzgün bir şekilde kapatın. Ortam kısa bir süre kullanılacaksa, şişeyi sıvı halde tutmak için 45°C'ye ayarlanmış bir su banyosuna koyun. Aksi takdirde agar 32-40 ° C'den daha düşük bir sıcaklıkta katılaşır ve daha sonra 85 ° C'de bir erime noktasına kadar (tipik olarak bir mikrodalga kullanılarak) yeniden ısıtılabilir.
2. Kültür plakalarının hazırlanması
   1. Steril Petri kaplarının tabanını (tipik olarak 100 x 15 mm) yan veya alt kısımda deneycinin adı, tarih ve ortam türü ile işaretleyin.
   2. Etiketli plakaların her birine 20-25 mL 45 ° C agar kültür ortamını (önceden hazırlanmış) dökün. Kenarlarda köpük oluşursa, bu normal bir pipet ve steril bir uç kullanılarak hızlı bir şekilde çıkarılmalıdır.
   3. Kontaminasyonu önlemek için tüm kapakları hemen bulaşıkların üzerine yerleştirin.
   4. Agarın oda sıcaklığında yaklaşık 2 saat veya gece boyunca 4°C'de katılaşmasına izin verin. Ayarlandıktan sonra, bakteri kültürü plakaları, orta yüzeydeki yoğuşmayı en aza indirmek için 4°C'de baş aşağı saklanmalıdır.
3. Çizgi kaplama
   1. Steril bir halkayı istenen inokuluma daldırın ve toplanan numuneyi zikzak hareketi kullanarak plakanın ilk çeyreğine hemen dağıtın (Şekil 1, I).
   2. Kapağı kapatın ve aşılama halkasını yeniden sterilize edin veya yeni bir steril tek kullanımlık halka toplayın.
   3. Birinci kadrandan (nispeten yoğun bir bakteri popülasyonu içeren) plakanın ikinci çeyreğine doğru yayılan 3-4 vuruş yapın (Şekil 1, II).
   4. Kapağı kapatın ve aşılama halkasını yeniden sterilize edin veya tek kullanımlık halkayı atın ve yeni bir steril tane alın.
   5. İkinci kadrandan üçüncü çeyreğe ve ardından üçüncü kadrandan dördüncü çeyreğe kadar bu 3-4 vuruşluk çizgiyi, her seferinde steril bir döngü kullanarak tekrarlayın (Şekil 1, III - IV).
   6. Steril bir halka kullanarak, dördüncü kadrandan plakanın ortasına doğru zikzak şeklinde son bir vuruş yapın (Şekil 1, V). Bu alanda bakteri prevalansı daha düşük olacak ve ideal olarak tek ve canlı bir ana hücreden bireysel kolonilerin kurulmasına izin verecektir.
   7. Kapağı kapatın ve (bakteri türü gerektiriyorsa) hava akışını önlemek için parafilm ile kapatın.
   8. Bakteri türüne/suşuna bağlı olarak, kültür plakasını uygun bir ortama baş aşağı yerleştirin ve bakteri kolonileri görünene kadar inkübe edin (başlangıç konsantrasyonu değişebileceğinden, plakanın her iki bölgesinde de ayrılmış koloniler görünebilir).
   9. Klonal bir bakteri popülasyonu oluşturmak için, orijinal plakanın tek bir kolonisinden izole edilen hücreler için orijinal plaka üzerine kaplanmış aşıyı değiştirerek başka bir plaka çizin.