16S rRNA Dizilimi: Bakteri Türlerini Tanımlamak için PCR Tabanlı Bir Teknik

1. Kurulum

1. Mikroorganizmaları işlerken, iyi mikrobiyolojik uygulamaları takip etmek gerekir. Tüm mikroorganizmalar, özellikle bilinmeyen numuneler, potansiyel patojenler olarak ele alınmalıdır. Numuneleri, araştırmacıları veya laboratuvarı kontamine etmekten kaçınmak için aseptik tekniği izleyin. Bakterilere dokunmadan önce ve sonra ellerinizi yıkayın, eldiven kullanın ve koruyucu giysiler giyin.
2. Genomik DNA izolasyonu ve PCR ürün saflaştırması için deneysel protokol için bir risk değerlendirmesi yapın. Bazı reaktifler zararlı olabilir!
3. 16S rRNA dizilimi için saf kültür şarttır. Genomik DNA'nın izolasyonuna geçmeden önce, başlangıç materyalinin tamamen saf olduğundan emin olun. Bu, tek tek kolonileri izole etmek için çizgi kaplama ile yapılabilir. Bunlar, ayrı ayrı plakalara veya gerekirse et suyunda çizgili olarak daha da büyütülebilir.
4. Gerekli laboratuvar ekipmanları:
   1. PCR için termal döngüleyici. Termal döngüleyicinin işlevi, ayarlanmış bir programa göre sıcaklığı yükseltmek ve düşürmektir. Programı oluştururken, her PCR adımı için sıcaklık ve zaman değerlerinin yanı sıra toplam döngü sayısını girmeniz istenecektir.
   2. Agaroz jel elektroforez sistemi. DNA parçalarını boyutlarına ve yüklerine göre ayırmak için kullanılır. Bu protokolde, izole genomik DNA ve PCR ürünlerinin kalitesini görselleştirmek için agaroz jel elektroforezi kullanılacaktır.

2. Protokol

Not: Gösterilen protokol, saf bir bakteri kültüründen 16S rRNA gen dizilimi için geçerlidir. Metagenomik çalışmalar için geçerli değildir.

1. Genomik DNA'nın (gDNA) izolasyonu için bakteri kültürü.
   1. Mikroorganizmanızı uygun bir ortamda büyütün. Bu adımda hem sıvı hem de katı ortam kullanılabilir. En iyi büyümeyi sağlayan koşulları seçin. Deneyi planlarken, yavaş büyüyen bakterilerin geç log/durağan büyüme aşamasına ulaşması için birkaç güne ihtiyaç duyabileceğini unutmayın. Bu protokolde, Bacillus subtilis 168, 200 rpm, 37 ° C'de ayarlanmış bir çalkalama inkübatörde gece boyunca lizojen suyu (LB) içinde büyütüldü.
2. gDNA'nın izolasyonu.
   1. Bakteriler katı ortamda ürediyse, steril bir halka kullanarak bazı hücreleri kazıyın ve 1 mL damıtılmış su içinde yeniden süspanse edin
   2. Bakteriler sıvı ortamda büyüdüyse, yaklaşık 1.5 mL gece boyunca kültür kullanın.
   3. Hücreleri santrifüjleme (1 dakika, 12.000 - 16.000 × g) ile peletleyin, süpernatanı çıkarın ve hücreleri ticari bir kit veya standart protokoller kullanarak gDNA izolasyonu için kullanın [örneğin, CTAB toplam DNA hazırlığı (13) veya fenol-kloroform ekstraksiyonu (14)]. Burada, 1.5 mL B. subtilis 168 gece kültüründen gDNA'yı izole etmek için ticari bir kit kullanıldı, OD₆₀₀ = 1.5.
      Notlar 1: Bazı Gram-negatif bakteriler için bu adım atlanabilir ve kaynatma yoluyla hücrelerden DNA'nın basit bir şekilde salınmasıyla değiştirilebilir. Bakteri peletini damıtılmış suda yeniden süspanse edin ve 100 °C'ye ayarlanmış bir ısıtma bloğunda 10 dakika inkübe edin.
      Notlar 2: Gram pozitif bakteri hücrelerinin parçalanması zordur. Bu nedenle, bu bakteri grubundan izolasyona adanmış bir gDNA izolasyon yöntemi veya kiti seçilmesi önerilir.
3. gDNA kalite kontrolü.
   1. Agaroz jel elektroforezi ile izole edilen gDNA'nın kalitesini kontrol edin. İlk olarak, 5 μL izole edilmiş gDNA'yı 1 μL yükleme boyası (6x) ile karıştırın ve numuneyi bir DNA boyama reaktifi içeren% 0.8'lik bir agaroz jeli üzerine yükleyin.
   2. Bir moleküler kütle standardı yükleyin ve boya cephesi jelin dibine ulaşana kadar elektroforezi çalıştırın.
   3. Elektroforez tamamlandıktan sonra, jeli uygun bir transilluminatör (UV veya mavi ışık) üzerinde görselleştirin. gDNA, kalın bir yüksek moleküler bant olarak görünür (10 kb'nin üzerinde). gDNA kalite kontrolünün bir örneği Şekil 3'te gösterilmiştir.
   4. gDNA kalite kontrolünden geçerse (yani yüksek moleküler bant mevcutsa ve gDNA'da çok az bulaşma var veya hiç bulaşmıyor), önce 3 mikrosantrifüj tüpünü şu şekilde etiketleyerek gDNA'nızı seri olarak seyreltin: "10x", "100x" ve "1000x".
   5. 3 tüpün her birine 90 μL steril damıtılmış su pipetleyin.
   6. 10 μL gDNA solüsyonu alın ve "10x" ile işaretlenmiş tüpe ekleyin.
   7. Çözeltinin eşit şekilde karıştığından emin olmak için tüm hacmi (yani 100 μL) yukarı ve aşağı iyice pipetleyin. Daha sonra bu tüpten 10 μL solüsyon alın ve "100x" işaretli tüpe aktarın.
   8. Daha önce tarif edildiği gibi karıştırın ve 10 μL çözeltiyi "100x" tüpünden "1000x" tüpüne aktararak aynı işlemi tekrarlayın. Bu seyreltmeler, PCR reaksiyonunda şablon olarak kullanılacaktır.

Şekil 3: Bacillus subtilis'ten izole edilen gDNA'nın agaroz jel elektroforezi. Şerit 1: M - moleküler kütle işaretleyici (yukarıdan aşağıya: 10000 bp, 8000 bp, 6000 bp, 5000 bp, 4000 bp, 3500 bp, 3000 bp, 2500 bp, 2000 bp, 1500 bp, 1000 bp). Şerit 2: gDNA - Bacillus subtilis'ten izole edilen genomik DNA. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

1. 16S rRNA geninin PCR ile amplifikasyonu.
   not: Aşağıdaki PCR protokolü, belirli bir DNA polimeraz ve primer çifti 8F - 1492R için optimize edilmiştir (bakınız Tablo 1). Her polimeraz ve primer çifti için protokolün optimizasyonu gereklidir.
   1. Tüm reaktifleri buz üzerinde çözün.
   2. PCR ana karışımını Tablo 2'de gösterildiği gibi hazırlayın. DNA polimeraz oda sıcaklığında aktif olduğundan, reaksiyon kurulumu buz üzerinde, yani PCR tüpleri üzerinde yapılmalı ve reaksiyon bileşenleri her zaman buz üzerinde tutulmalıdır. Her gDNA numunesi için bir reaksiyon ve negatif kontrol için bir reaksiyon hazırlayın. Negatif kontrol, gDNA şablonu olmayan bir PCR karışımıdır ve reaksiyonun diğer bileşenlerinin kontamine olmamasını sağlamak için kullanılır.
      not: Birden fazla numune olması durumunda, genellikle bir ana karışım hazırlanır. Ana karışım, şablon dışındaki tüm reaksiyon bileşenlerini içeren bir çözeltidir. Tekrarlanan pipetlemeyi ortadan kaldırmaya, pipetleme hatasını önlemeye yardımcı olur ve numuneler arasında yüksek tutarlılık sağlar. Ana karışımı hazırlamak için, her bir bileşenin hacmini (DNA şablonu hariç) test edilen numune sayısıyla çarpın. Tüm bileşenleri mikrosantrifüj tüpünde karıştırın ve tüm hacmi birkaç kez yukarı ve aşağı pipetleyin.
   3. Ana karışımın 49 μL'sini ayrı PCR tüplerine ekleyin.
   4. Ana karışım ile tüplere 1 μL şablon ekleyin. Negatif kontrol için 1 μL steril su ekleyin. Bileşenlerin iyi karıştığından emin olmak için, karışımı 30-50μL'ye ayarlanmış bir pipetle ~10 kez yukarı ve aşağı nazikçe pipetleyin.
   5. PCR makinesini Tablo 3'te gösterilen programla ayarlayın.
   6. Tüpleri PCR makinesine koyun ve programı başlatın.
   7. Program tamamlandıktan sonra, PCR ürününüzün kalitesini agaroz jel elektroforezi ile inceleyin.
   8. 8F-1492R primer çifti kullanılarak başarılı bir PCR reaksiyonu, yaklaşık 1,5 kb'lık tek bir bant verir (Şekil 4). Başka bantlar (yani spesifik olmayan ürünler) varsa, tavlama sıcaklığını ayarlayarak PCR programını optimize edin. Beklenen boyutta tek bir bant varsa, bir sonraki adıma geçin. Burada, 100x seyreltilmiş gDNA şablonu ile PCR reaksiyonu, beklenen boyutta keskin bir banda sahip olduğu ve spesifik olmayan ürünlerden yoksun olduğu için en iyi ürünü verdi. Bu nedenle saflaştırılmak ve dizileme için gönderilmek üzere seçildi.
   9. Dizilemeden önce ürün, PCR reaksiyonunda bulunan kalıntı primerlerden, deoksiribonükleotidlerden, polimerazdan ve tampondan temizlenmelidir. PCR ürünleri, ticari bir PCR saflaştırma kiti kullanılarak izole edilebilir. PCR reaksiyonu, bir DNA bağlama matrisi içeren bir kolona yüklenir. PCR ürünü kolona bağlanırken, diğer bileşenler kolondan akar. Kolon daha sonra yıkama tamponu kullanılarak yıkanır ve son olarak DNA, tercih edilen tamponda ayrıştırılır. Kit ile desteklenen elüsyon tamponunun dizileme ile uyumlu olduğunu onaylayın.
   10. Saflaştırılmış PCR ürününü DNA dizilimi için gönderin. Seçilen dizileme tesisinde sıralama örneklerinin sunulması için yönergeleri izleyin. En iyi dizi kapsamı için, sıralama primerleri olarak PCR amplifikasyon primerlerini (bölüm 2.4.1'de kullanılanla aynı) kullanın. Burada, PCR ürününü sıralamak için 8F ve 1492R primerleri kullanıldı.

parça	Son konsantrasyon	Reaksiyon başına hacim	x reaksiyon başına hacim (ana karışım)
5x reaksiyon tamponu	1 katı	10 μL	10 μL × x
10 mM dNTP'ler	200 μM	1 μL	1 μL × x
10 μM Astar 8F	0,5 μM	2,5 μL	2,5 μL × x
10 μM Astar 1492R	0,5 μM	2,5 μL	2,5 μL × x
Phusion polimeraz	1 birim	0,5 μL	0,5 μL × x
Şablon DNA *	-	1 μL	-
ddH2O	-	32,5 μL	32,5 μL × x
Toplam hacim		50 μL	49 μL × x

Tablo 2: PCR reaksiyon bileşenleri. * Adım 2.3'teki 10x, 100x veya 1000x seyreltilmiş gDNA'yı kullanın.

adım	sıcaklık	Saat	Döngü
İlk denatürasyon	98°C	30 saniye
denatürasyon	98°C	10 saniye	25-30
Tavlama	60°C	30 saniye
uzantı	72°C	45 saniye
Son uzatma	72°C	7 dk
tutmak	4°C	∞

Tablo 3: 16S rRNA geninin amplifikasyonu için PCR programı.

Şekil 4: PCR ürünlerinin agaroz jel elektroforezi, şablon olarak 8F ve 1492R primerleri ve gDNA kullanılarak amplifiye edilir. B. subtilis'ten alınan gDNA örneği (bkz. Şekil 3), en iyi sonucu test etmek için 10, 100 ve 1000 kez seyreltildi. Şerit 1: M - moleküler kütle belirteci (yukarıdan aşağıya: 10000 bp, 8000 bp, 6000 bp, 5000 bp, 4000 bp, 3500 bp, 3000 bp, 2500 bp, 2000 bp, 1500 bp, 1000bp, 750 bp, 500 bp, 250 bp). Şerit 2: 10x seyreltilmiş şablon ile PCR reaksiyonu. Şerit 3: 100x seyreltilmiş şablon ile PCR reaksiyonu. Şerit 4: 1000x seyreltilmiş şablon ile PCR reaksiyonu. Şerit 5: (C-) - negatif kontrol (DNA şablonu olmadan reaksiyon). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

3. Veri analizi ve sonuçları

Not: PCR ürünü, ileri (burada 8F) ve geri (burada 1492R) primerler kullanılarak sıralanır. Bu nedenle, biri ileri ve diğeri geri astar için olmak üzere iki veri dizisi seti oluşturulur. Her dizi için en az iki tür dosya oluşturulur: i) DNA dizisini içeren bir metin dosyası ve ii) dizileme çalışmasının kalitesini gösteren bir DNA kromatogramı.

1. İleri astar için kromatogramı açın ve sırayı dikkatlice inceleyin. Kaliteli bir dizi için ideal bir kromatogram, eşit aralıklı tepelere sahip olmalı ve çok az arka plan sinyaline sahip olmalı veya hiç olmamalıdır (Şekil 5A).
2. Kromatogram yüksek kalitede değilse, dizi atılmalı veya dizi metin dosyası aşağıdakilere göre revize edilmelidir:
   1. Kromatogram boyunca çift tepe noktalarının varlığı, çoklu DNA şablonlarının varlığını gösterir. Bakteri kültürü saf değilse bu durum söz konusu olabilir. Böyle bir dizi atılmalıdır (Şekil 5B).
   2. Belirsiz bir kromatogram, aynı yerde farklı renkli tepelerin varlığından kaynaklanabilir. En yaygın hatalardan biri, aynı konumda iki farklı renkli tepe noktasının bulunması ve tabanların sıralama yazılımı tarafından yanlış atanmasıdır (Şekil 5C). Yanlış atanmış nükleotidleri manuel olarak düzeltin ve bunları metin dosyasında düzenleyin.
   3. Düşük çözünürlüklü kromatogramlar, genellikle bu bölgelerdeki nükleotidlerin yanlış sayılmasına neden olan "geniş tepelere" neden olabilir (Şekil 5D). Bu hatanın düzeltilmesi zordur ve bu nedenle sonraki hizalama adımındaki olası uyumsuzluklar güvenilir olarak ele alınmamalıdır.
   4. Düşük kromatogram okuma kalitesi ve çoklu tepe noktalarının varlığı genellikle dizinin 5' ve 3' uçlarında görülür. Bazı sıralayıcı yazılımlar bu düşük kaliteli parçaları otomatik olarak kaldırır (Şekil 5E) ve nükleotidler metin dosyasına dahil edilmez. Diziniz otomatik olarak kesilmediyse, uçlardaki düşük kaliteli parçaları (örn. zayıf sinyal, üst üste binen tepeler, çözünürlük kaybı) belirleyin ve ilgili tabanları metin dosyasından kaldırın.

Şekil 5: DNA dizilimi sorun giderme örnekleri. A) Kaliteli bir kromatogram dizisi örneği (eşit aralıklı, belirsiz olmayan tepeler). B) Genellikle kromatogramın başında meydana gelen düşük kaliteli dizi. Gri bölge alanı düşük kalite olarak kabul edilir ve sıralama yazılımı tarafından otomatik olarak kaldırılır. Daha fazla taban manuel olarak kesilebilir. C) Çift tepelerin varlığı (oklarla gösterilir). Kırmızı okla gösterilen bir nükleotid, sıralayıcı tarafından "T" (kırmızı tepe) olarak okunmuştur, ancak mavi tepe daha güçlüdür ve ayrıca "C" olarak da yorumlanabilir. D) Örtüşen tepeler DNA kontaminasyonunu gösterir (yani birden fazla şablon). E) Çözünürlük kaybı ve güvenilir taban çağrısını engelleyen "geniş tepeler" (dikdörtgenle işaretlenmiş) olarak adlandırılır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

1. Ters astar için 3.1 ve 3.2'yi tekrarlayın.
2. Son olarak, ileri ve geri dizileri tek bir bitişik dizide birleştirin. İyi bir sıralama çalışması, 1100 bp'ye kadar bir dizi verir. PCR ürününün ~1500 bp uzunluğunda olduğu göz önüne alındığında, ileri ve geri primerler kullanılarak elde edilen diziler kısmen örtüşmelidir.
   1. DNA dizisi birleştirme programını, örneğin CAP3 (http://doua.prabi.fr/software/cap3) (15) gibi ücretsiz bir aracı kullanarak iki diziyi birleştirin.
   2. İki diziyi FASTA formatında belirtilen kutuya yerleştirin. "Gönder" düğmesini tıklayın ve sonuçların geri dönmesini bekleyin.
   3. Birleştirilmiş sırayı görüntülemek için sonuç sekmesinde "Contigs" tuşuna basın. Hizalama ayrıntılarını görüntülemek için "Montaj detayları"na basın.
      Notlar 1: Contig montajı için CAP3 yazılımı kullanılıyorsa, ters astar dizisini ters tamamlayıcıya dönüştürmeye gerek yoktur; Ancak, başka bir program kullanılıyorsa bu adım gerekebilir.
      Notlar 2: FASTA formatı, nükleotid dizisini temsil eden metin tabanlı bir formattır. Bir FASTA dosyasındaki ilk satır (açıklama satırı) ">" simgesiyle başlar ve ardından dizinin adı veya benzersiz bir tanımlayıcısı gelir. Açıklama satırını takip eden nükleotid dizisidir. Dizilerinizi aşağıdaki biçimde yapıştırın:
      
      >sequence_frw_primer
      Dizinizi metin dosyasından buraya yapıştırın
      >sequence_rvs_primer
      Dizinizi metin dosyasından buraya yapıştırın
3. Temel Yerel Hizalama Arama Aracı (BLAST; https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) web sitesini ziyaret ederek bir veritabanı araması yapın.
   1. Dizinizi veritabanıyla karşılaştırmak için "Nucleotide BLAST" aracını seçin.
   2. Dizinizi (3.5'te bir araya getirilen contig) "Sorgu dizisi" metin kutusuna girin, ardından aşağı kaydırma menüsünde "16S rRNA dizileri (Bakteri ve Arkea)" veritabanını seçin.
   3. Sayfanın altındaki "BLAST" düğmesine basın. En benzer diziler döndürülür. Örnek bir BLAST sonucu Şekil 6'da gösterilmiştir. Sunulan deneyde en iyi isabet, BLAST veritabanında bulunan diziyle 0 özdeşlik gösteren B. subtilis suşu 168'dir.
   4. En üstteki isabet 0 kimlik göstermiyorsa, hizalamaya gidin ve uyumsuzluk olup olmadığını kontrol edin. En üstteki vuruşa tıkladığınızda, hizalamanın ayrıntılarına yönlendirileceksiniz. Hizalanmış nükleotidler kısa dikey çizgilerle birleştirilirken, uyumsuz nükleotidler arasında bir boşluk vardır. Dizileme şirketinden aldığınız kromatograma geri dönün ve eşleşmeyen bölgeye odaklanarak diziyi bir kez daha gözden geçirin. Herhangi bir ek hata bulunursa sırayı düzeltin. Düzeltilmiş sırayı kullanarak BLAST'ı yeniden çalıştırın.

Şekil 6: Nükleotid BLAST sonucunun örneği. Sorgu dizisi olarak B. subtilis 168'in saf kültüründen elde edilen 16S rRNA gen dizisi kullanıldı. En üstteki vuruş, beklendiği gibi B. subtilis suşu 168'in 0 özdeşliğini (altı çizili) gösterir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.